CN1946392A - 含有单乙酰基二酰基甘油衍生物的免疫调节剂、抗癌剂和健康食品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了从鹿角中提取的单乙酰基二酰基甘油衍生物用于免疫调节剂。还公开了含有单乙酰基二酰基甘油衍生物作为有效成分的医疗用品和健康食品。单乙酰基二酰基甘油衍生物表现出了明显的免疫调节作用，包括免疫增强作用。对于通过注射癌症细胞系在仓鼠中诱导癌症的情况，通过激活对于促进免疫力具有重要作用的淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞使得癌症的发展得以延迟，而通过提升免疫细胞对癌症细胞的细胞毒性则诱导了癌症细胞的调亡。同样，对于诱导败血症性休克的小鼠情况，通过控制免疫功能和抑制凋亡的作用甚至在120小时之后还有100％的存活率。因此，本发明的单乙酰基二酰基甘油衍生物可有效地用于免疫调节剂、败血症治疗剂、癌症治疗剂和健康食品，用于免疫调节或预防癌症。

Description

含有单乙酰基二酰基甘油衍生物的免疫调节剂、抗癌剂和健康食品
背景技术
本发明涉及从鹿角中提取的含有单乙酰基二酰基甘油衍生物作为有效成分的免疫调节剂、医疗用品和健康食品的使用。
鹿角(在拉丁文中为Cervi parvum cornu)是从任意鹿科动物收集和干燥得到的未钙化的角。在韩国的传统东方医学中，鹿角和人参都由于其多种良好的医疗效果而得到广泛地使用。鹿角被传统使用的鹿科动物仅限于Cervus Nippon Temminick var.mantchuricus Swinhoe(以下称为C.N.)和Cervus elaphus L.。鹿角被认为具有众多医疗效果。公知其可用作滋补剂，在促进生长和发育、促进造血功能、治疗神经崩溃、治疗心脏供血不足，并一般性地改善五脏六腑的功能(Dong-euibogam，韩国传统医疗文献)。在涉及鹿角效用的其他传统医药文献中，也报道了其滋补效果，营养效果，增强体力效果，包括改善心脏功能、缓解虚弱和增强免疫力。已进行了诸多尝试来阐明令人好奇的鹿角的化学组成。结果发现其含有诸多活性成分，例如游离氨基酸、痕量(金属)元素、己糖、戊糖、己糖胺、糖醛酸、唾液酸、粘多糖(例如，透明质酸，软骨素A)、多种脂肪酸和前列腺素。据报道在鹿角的提取物中检测到了糖脂、磷脂、胆固醇、次黄嘌呤、胆甾-5-烯-3β，7α-二醇、胆固醇脂和多胺。其他人报道了雌素酮和雌二醇受体的存在(report ofNIH Korea，Vol.22，p359，1985；Korean Biochem.J，Vol.9，No.3，p153，1976；Korean Biochem.J.Vol.9，No.4；p215，1976；Korean Biochem.J，Vol.10，No.1，p1，1977；Shoykugaku Zasshi，43(2)，p173，1989)。
免疫力是保护活体免于各种病原体侵袭的防御机制。免疫缺陷是由于免疫系统的组分缺陷而导致，说明该免疫系统不能对各种抗原产生应答。免疫缺陷主要分成先天的或原发性免疫缺陷以及获得性或继发性免疫缺陷。在先天性免疫缺陷的情况中，B-细胞或T-细胞并非天然存在，所以可仅通过基因治疗、抗体插入和骨髓移植来进行治疗。在另一方面，在获得性免疫缺陷的情况下，所有免疫相关因子都是天然存在的，但却在免疫应答中机能不良，所以可通过促进免疫因子的功能来对其进行改善。近来诸如关节炎、遗传性过敏症、痴呆和败血症的自身免疫性疾病的发作有所上升。自身免疫性疾病是由于免疫功能的过度增强而引起。可使用免疫抑制剂来治疗自身免疫性疾病，但免疫抑制剂也经常会导致免疫力下降。根据对免疫机理的了解，已进行了诸多尝试来开发对免疫力进行控制的免疫调节剂。这些尝试的目的在于通过以能够非特异性地刺激免疫细胞的免疫调节物控制免疫功能的促进或抑制来提高活体对病原体的防御能力和最小化副作用。免疫调节剂可以治疗大多数活体疾病，例如癌症、败血症、退行性关节炎、感染、痴呆、衰老、糖尿病、贫血、皮肤疾病、哮喘、遗传性过敏症、应激、神经崩溃、怠堕、慢性疲劳综合征以及骨质疏松。到目前为止，化合物、微生物组合物、生物制品等等已被用作免疫调节剂。由于其大多都只有一种效果(要么免疫促进要么免疫抑制)，所以大多数这些免疫调节物的使用都是具有局限性的。因此，它们可引起副作用且其本身就具有毒性。为了克服上述问题，无毒食品、提取自天然来源的有效成分和传统草药是开发免疫调节剂的主要对象，而检验其作为药物的效果的实验也已进行。但是这些免疫调节物依然是要么具有免疫促进效果要么具有免疫抑制效果。
在韩国，癌症是首要死亡原因，并且逐年增加。对癌症进行的化疗或放疗在杀死癌症细胞的同时也破坏了正常的骨髓细胞，尤其是调节免疫和造血作用的造血细胞，从而导致了免疫系统和造血器官的机能不良(Korean J.BRM.，1，p23，1993；Korean J.BRM.，4，p47，1994；Crit Rev Oncol Hematol.1，p227，1984)。败血症是由导致系统性炎症反应的严重系统感染引起的严重疾病，致死率超过45％。其通常发生在受感染的宿主对来自革兰氏阴性细菌的内毒素产生过度反应时。然而，尽管抗生素、类固醇或Xigris(Eli Lilly公司)已被用作败血症性休克的治疗剂，但由于抗生素、类固醇或Xigris对于败血症效果不明显，所以败血症性休克的致死率依然居高不下。
因此，本发明人从可作为民间验方的具有极佳药效的C.N.鹿角中分离了多种成分，并进一步观察到C.N.鹿角的这些有效成分中的一种，单乙酰基二酰基甘油，在体内表现出了明显的免疫调节活性。作为免疫调节效果的结果，C.N.鹿角有可能被用作败血症性休克的治疗剂和抗癌剂而不会在体内引起毒性。由此，本发明人通过确认本发明的单乙酰基二酰基甘油可用作安全的免疫增强剂、免疫调节剂、败血症性休克治疗剂和抗癌剂而完成了本发明。
发明的公开
技术问题
因此，本发明的目的在于提供含有单乙酰基二酰基甘油衍生物作为有效成分的免疫调节剂、败血症性休克治疗剂、抗癌剂和健康食品。健康食品用于调节免疫、预防或治疗败血症性休克和癌症。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了含有单乙酰基二酰基甘油衍生物作为有效成分的免疫调节剂，其中所述单乙酰基二酰基甘油衍生物如式1所示，
【式1】
其中，R1/R2是9-十八碳烯酰基(油酰基)/十六酰基(棕榈酰基)、十六酰基(棕榈酰基)/9-十八碳烯酰基(油酰基)、十六酰基(棕榈酰基)/9，12-十八碳二烯酰基(亚油酰基)、十六酰基(棕榈酰基)/9，12，15-十八碳三烯酰基(亚麻酰基)或十六酰基(棕榈酰基)/5，8，11，14-二十碳四烯酰基(花生四烯酰基)。
此时，由式2表示的上述单乙酰基二酰基甘油衍生物是优选的。
【式2】
Figure A20058001291400071
本发明还提供了含有式1的单乙酰基二酰基甘油衍生物作为有效成分的AIDS治疗剂、败血症治疗剂和抗癌剂。本发明还提供了含有式1的单乙酰基二酰基甘油衍生物作为有效成分用于免疫调节或预防癌症的健康食品。
附图说明
图1为一组照片，显示对照组、IL-2处理组(20ng/ml)和化合物3处理组(1μg/ml)的T-细胞(T-4和T-8)活性。每一数字表示俘获了IL-2特异性抗体的点的数量。
图2显示当用化合物3激活T淋巴细胞时细胞因子的释放，
(1)对照组：抗-CD3，抗-CD28处理，
(2)实验组：抗-CD3，抗-CD28和化合物3(0.1、1μg/ml)处理。
图3为一组照片，显示用GM-CSF(20ng/ml)、IL-4(20ng/ml)和TNF-α(5ng/ml)处理后，来自小鼠骨髓细胞的小鼠树突状细胞的形态。
A：以1×106细胞/ml的密度接种小鼠骨髓细胞后立即拍摄的显微镜照片(×100)。
B：显示培养三天后的圆形骨髓干细胞的显微镜照片。这些细胞成串，生长于细胞培养板小孔的底部(×400)。
C：培养第6天或第7天时成串的生长的成熟树突状细胞的显微镜照片(×400)，小照片是特定细胞的放大照片(×2)。
D：培养第9天时形成了特异的小且长的突出的树突状细胞的显微镜照片(×1000)，小照片是特定细胞的放大照片(×2)。
图4为显示在分离自Balb/c AnN小鼠的骨髓细胞培养第11天时，对树突状细胞特异性标记物、单核细胞特异性标记物和颗粒细胞特异性标记物的表达进行FACS分析的结果的一组图。(在这里，对针对仓鼠IgG和大鼠IgG2a的异构体对照的染色用于设定标记物线(直线))。
使用了以下的标记物：
作为共刺激特异性标记物的CD80和CD86，
作为树突状细胞特异性标记物的CD11c和DEC-205，
作为单核细胞/巨噬细胞特异性标记物的CD14和F4/80，
作为颗粒细胞特异性标记物的Gr-1。
图5为显示化合物3对树突状细胞在粘附分子表达方面的影响的电泳图。
泳道1：Vcam-1  泳道2：Icam-1  泳道3：Icam-2
泳道4：VLA-4   泳道5：VLA-5   泳道6：LFA-1
泳道7：GAPDH
(+)：化合物3处理组
(-)：对照组
图6为一组照片，显示在肿瘤(KIGB-5)i.v.注射和用不同的条件处理4周后，在注射位点附近肿瘤形成的结果。
A：RPMI对照组                 B：BMSC处理组
C：BMSC+Ad/ΔE1处理组
图7为一组照片，显示在肿瘤(KIGB-5)i.v.注射和用不同的条件处理8周后，在注射位点附近肿瘤形成的结果。
A：RPMI对照组
B：BMSC(2.5×106细胞/天)处理组
C：BMSC(2.5×106细胞/天)+Ad/ΔE1(50MOI)处理组
D：树突状细胞(5×106细胞/天)+肿瘤裂解物处理组
E：BMSC(2.5×106细胞/天)+Ad/IL-2(50MOI)处理组
F：化合物3(50mg/kg/天)处理组。
图8和图9各为一组照片，显示i.v.注射肿瘤(KIGB-5)8周后，对各组转移性肺损伤的总的情况和显微观察结果。
在图8中，
A：RPMI对照组
B：BMSC(2.5×106细胞/天)处理组
C：BMSC(2.5×106细胞/天)+Ad/ΔE1(50MOI)处理组
D：BMSC(2.5×106细胞/天)+Ad/IL-2(50MOI)处理组。
在图9中，
A：RPMI对照组
B：树突状细胞(5×106细胞/天)+肿瘤裂解物处理组
C：化合物3(25mg/kg/天)处理组。
图10为一组照片，显示s.c(皮下)注射肿瘤(KIGB-5)12周后，各组肺肿瘤及其大小的照片。
A：RPMI对照组
B：BMSC(2.5×106细胞/天)+Ad/ΔE1(50MOI)处理组
C：BMSC(2.5×106细胞/天)处理组
D：DC(5×106细胞/天)+肿瘤裂解物处理组
E：BMSC(2.5×106细胞/天)+Ad/IL-2(50MOI)处理组
F：BMSC(2.5×106细胞/天)+Ad/IL-2(50MOI)+化合物3(25mg/kg/天)处理组
G：化合物3(25mg/kg/天)处理组。
图11为一组照片，显示在胆管癌细胞(5×105细胞)注射8周后，用不同剂量化合物3处理的各组叙利亚金仓鼠的转移性肺损伤的肉眼观察结果。
A：PBS对照组
B：化合物3(10mg/kg/天)处理组
C：化合物3(25mg/kg/天)处理组
D：化合物3(50mg/kg/天)处理组。
图12为一组照片，显示在胆管癌细胞(5×105细胞)注射8周后，用不同剂量化合物3处理的各组叙利亚金仓鼠的转移性肺损伤的显微观察结果。
A：PBS对照组
B：化合物3(10mg/kg/天)处理组
C：化合物3(25mg/kg/天)处理组
D：化合物3(50mg/kg/天)处理组。
图13为一组照片，显示黑素瘤细胞(2×104细胞)i.v.注射4周后，接受各种处理的各个C57B1/6小鼠转移性肺损伤的肉眼观察结果。
A：PBS对照组
B：树突状细胞(4×105细胞/天)+肿瘤裂解物处理组
C：化合物3(50mg/kg/天)处理组。
图14为一组照片，显示黑素瘤细胞(2×104细胞)i.v.注射4周后，接受各种处理的各个C57B1/6小鼠转移性肺损伤的显微观察结果。
A：PBS对照组
B：树突状细胞(4×105细胞/天)+肿瘤裂解物处理组
C：化合物3(50mg/kg/天)处理组。
图15为黑素瘤细胞(2×104细胞)i.v.注射后6周内各处理组存活率的示意图。
(1)RPMI对照组
(2)树突状细胞(5×105细胞/天)+肿瘤裂解物处理组
(3)化合物3(50mg/kg/天)处理组。
图16为化合物3激活的T淋巴细胞对黑素瘤细胞的细胞毒性的示意图
(1)对照1：抗-CD3，抗-CD28处理组
(2)对照2：抗-CD3，抗-CD28和IL-2(20ng/ml)处理组
(3)实验组：抗-CD3，抗-CD28和化合物3(1μg/ml)处理组。
发明实施方式
下文将对本发明进行详细描述。
本发明提供了含有如式1所示的单乙酰基二酰基甘油衍生物作为有效成分的免疫调节剂、AIDS治疗剂、败血症治疗剂和抗癌剂。由式1所示的本发明化合物是下列5种化合物中的一种：
1)1-油酰-2-棕榈酰-3-乙酰甘油(R1/R2＝9-十八碳烯酰基/十六酰基，下文中称为“化合物1”)
2)1-棕榈酰-2-油酰-3-乙酰甘油(R1/R2＝十六酰基/9-十八碳烯酰基，下文中称为“化合物2”)
3)1-棕榈酰-2-亚油酰-3-乙酰甘油(R1/R2＝十六酰基/9，12-十八碳二烯酰基，下文中称为“化合物3”)
4)1-棕榈酰-2-亚麻酰-3-乙酰甘油(R1/R2＝十六酰基/9，12，15-十八碳三烯酰基，下文中称为“化合物4”)
5)1-棕榈酰-2-花生四烯酰-3-乙酰甘油(R1/R2＝十六酰基/5，8，11，14-二十碳四烯酰基，下文中称为“化合物5”)。
由式2所示的任何单乙酰基二酰基甘油衍生物都是可利用的，特别地，优选化合物3。本发明的化合物是从C.N.鹿角提取出来或通过常规有机合成方法制备。示例性的提取方法具有以下步骤。具体地，先用己烷对C.N.鹿角进行提取，然后再用氯仿对己烷提取的剩余物进行提取，以得到C.N.鹿角的氯仿提取物。用于这一提取过程中的己烷和氯仿的量是足以浸透鹿角。一般地，所使用的己烷和氯仿的比例为4～5L/1kg C.N.鹿角。通过一系列的硅胶柱层析和TLC(薄层层析)对从这一提取过程获得的C.N.鹿角的氯仿提取物进行分离和纯化。随后提取步骤中的洗脱液选自氯仿/甲醇，己烷/乙酸乙酯。为了化学地合成单乙酰基二酰基甘油衍生物，例如，可从甘油与棕榈酸反应的产物中分离出1-棕榈酰甘油。可通过以诸如乙酸和亚油酸的羧酸化合物酯化1-棕榈酰甘油，并在必要时进行纯化来合成目标单乙酰基二酰基甘油。另一合成单乙酰基二酰基甘油衍生物的方法是磷脂酰胆碱的乙酰解。
本发明的单乙酰基二酰基甘油化合物可用于免疫调节剂。免疫调节包括增强不正常地恶化的免疫力或保持不正常地增加的免疫力的平衡。因此，本发明中单乙酰基二酰基甘油化合物不仅具有预防和治疗由恶化的免疫系统和癌症引起的各种疾病的作用，还能够抑制、预防和治疗由自身免疫反应引起的诸如关节炎、遗传性过敏症、痴呆和败血症的自身免疫性疾病。
在免疫功能的调节中，最重要的不是增加负责免疫力的T细胞，而是T细胞活化的程度、T4与T8细胞的比例以及T4与T8细胞所分泌细胞因子的种类。本发明人使用单乙酰基二酰基甘油衍生物处理T-4和T-8淋巴细胞，来研究本发明单乙酰基二酰基甘油衍生物的免疫调节作用。结果证实了在这些细胞中，有一种细胞因子，即IL-2的分泌有所升高(参见图1)。在使用本发明的化合物3处理细胞之后，通过用在同一时间能够测定大量细胞因子的Bio-plex，对T-细胞中细胞因子的分泌进行了测定。结果是IL-2、IL-4和IL-5在化合物3处理组中的分泌远远高于在对照组中的分泌(参见图2)。升高最明显的细胞因子IL-4，是称为抗炎症细胞因子的多功能细胞因子，其是从由T4细胞分化的Th2中分泌出来。因为抑制了T4向Th1的分化，通过对于抗癌作用和免疫应答调节发挥重要作用，IL-4可以抑制由于自身免疫反应而导致的细胞损伤(Annu.Rev.Immunol.1999.17：701～738)。本发明的化合物不仅具有通过刺激IL-2分泌而获得的免疫力增强作用，还具有通过刺激IL-4分泌而获得的免疫力调节作用。与此同时，本发明的所述化合物还能够通过增加和激活T4和T8细胞毒性免疫细胞来维持正常的T4与T8的比例。因此，可有效地处理副作用和治疗由于免疫系统的异常升高或降低所产生的疾病。在败血症性休克模型中，这些免疫增强效果可直接刺激IL-4分泌和抑制细胞调亡。其结果是败血症的致死率明显降低。因为这些化合物增加了IL-4分泌，因此，本发明的单乙酰基二酰基甘油衍生物可有效地治疗自身免疫性疾病，例如预防和治疗败血症。
公知在刺激多种造血细胞的细胞和免疫细胞之间的相互作用，尤其是树突状细胞在免疫系统中是相当重要的。本发明人研究了单乙酰基二酰基甘油衍生物对分离和诱导的树突状细胞以及TCR(T-细胞受体)之间相互作用的作用。为了进行该研究，对化合物3处理的DC(树突状细胞)进行了RT-PCR，来测定介导DC和TCR间相互作用的粘附分子的表达。结果是，与对照相比，诸如Vcam-1、Icam-1、Icam-2、VLA-4、VLA-5和LFA-1的粘附分子的表达都有所升高(参见图5)。根据以上结果，证实了本发明的单乙酰基二酰基甘油衍生物不仅对T-细胞的活化效果有作用，而且还通过激活使得T-细胞能够识别癌症细胞抗原的树突状细胞而具有特异的抗癌作用。
根据以上结果，通过激活T-细胞来增加细胞因子的分泌以及通过增加细胞内粘附分子的表达促进造血细胞和免疫细胞的增殖和刺激，证实了本发明的单乙酰基二酰基甘油衍生物具有免疫增强作用。结果，证实了这些化合物有可能被用作针对多种疾病的免疫治疗剂。例如，本发明的单乙酰基二酰基甘油衍生物可由于其对于T4和T8细胞的增殖作用而被用作治疗剂或健康食品，以在人类AIDS患者中增强免疫力。在AIDS患者的早期，T4有所减少但并未出现严重的发作。在另一方面，在AIDS患者的晚期，T8有所减少并出现严重的发作。因此，T4与T8的比率是一个重要的因子，且T4和T8的绝对数量也是一个重要的因子。进而，本发明确证了通过增加IL-4的分泌对免疫功能进行的调节对多种自身免疫性疾病是行之有效的。为了检测本发明所述化合物在败血症性休克的预防和治疗中的用途，进行了小鼠的CLP(盲肠结扎和穿刺)检测。结果是所有被测小鼠都存活至120小时。因此，证实了本发明的单乙酰基二酰基甘油衍生物对败血症的预防和治疗是行之有效的。根据以上结果，确证了本发明的单乙酰基二酰基甘油衍生物是具有免疫增强作用和具有免疫功能调节作用的理想的免疫调节剂。
进而，为了研究本发明所述化合物在癌症的预防和治疗中的用途，本发明人了研究了所述化合物对已知为不可治愈的癌症胆管癌和恶性黑素瘤的抗癌作用。首先，本发明人通过对仓鼠静脉内或皮下注射胆管癌细胞系KING-5来诱导癌症。然后向仓鼠注射RPMI、BMSC、腺病毒/ΔE1、树突状细胞+肿瘤裂解物、化合物3、腺病毒/IL-2及其混合物。实验进行4周后观察结果。其结果是，当用裸眼或显微镜进行观察时，树突状细胞+肿瘤裂解物、化合物3和腺病毒/IL-2处理组未形成肿瘤(参见图6)。进而，静脉内注射肿瘤细胞并在实验8周后观察结果。其结果是，在除了BMSC+腺病毒/IL-2处理组之外的所有组中都形成了转移性肺损伤。根据活体解剖，在树突状细胞+肿瘤裂解物处理组和化合物3处理组中仅观察到了少量的损伤(参见图7、图8和图9)。再进而，静脉内注射肿瘤细胞并在实验12周后观察结果。其结果是，在除了BMSC+腺病毒/hIL-2处理组和BMSC+Ad/hIL-2+化合物3之外的所有组中都形成了肿瘤(参见图10)。肿瘤的形成被化合物3剂量依赖性地抑制(参见图11和图12)。正如在之前所阐述的，本发明人通过注射胆管癌细胞(KIBG)在仓鼠中诱导转移性癌症，并用本发明的单乙酰基二酰基甘油衍生物对所述仓鼠进行治疗。其结果证实了癌症发展由于本发明的这些化合物的处理而得到了明显地抑制。
对小鼠的尾巴静脉注射恶性黑素瘤细胞来诱导癌症。然后，用单独的RPMI、树突状细胞(DC)、肿瘤裂解物和化合物3或其混合物进行处理。其结果是在用RPMI处理的对照组中形成了转移性肺损伤，而在用化合物3以及树突状细胞+肿瘤裂解物处理的组中则未观察到损伤(参见图13和图14)。此外，在肿瘤注射后6周对化合物3处理组和以及树突状细胞+肿瘤裂解物处理组进行观察，发现其具有90％的存活率(参见图15)。根据以上结果，本发明人证实了化合物3激活了T-细胞(T4和T8)，这意味着其具有抗癌作用。因此，本发明人在体外进行了由化合物3激活的T-细胞对于恶性黑素瘤的细胞毒性检测。其结果是当用化合物3处理T-细胞时比不用化合物3处理T-细胞时细胞毒性大大增加，且细胞毒性也随着T-细胞数量的增加而增加(参见图16)。正如以上所解释的，证实了本发明的单乙酰基二酰基甘油衍生物通过激活T-细胞抑制了癌症发展并对癌症细胞表现出细胞毒性，说明本发明的所述化合物可有效地用作抗癌剂。用本发明的产物作为抗癌剂对胆道癌、肾癌和黑素瘤进行治疗是有前途的，而对其他形式恶性疾病的治疗还有待探索。
此后，本发明人通过制备含有单乙酰基二酰基甘油衍生物作为有效成分的试验性胶囊和片剂完成了本发明。本发明的免疫调节剂、AIDS治疗剂、败血症治疗剂和抗癌剂优选包括20-100％总化合物重量比的单乙酰基二酰基甘油衍生物，优选为30-100％重量比。如果单乙酰基二酰基甘油衍生物量过高或过低，则服药困难且不具有优势。对败血症治疗剂、抗癌剂和免疫调节剂而言，优选是以50mg/kg的剂量口服给药，每天1-3次或每天1-4次。除有效成分之外，本发明的所述化合物可在所配置的药物形式中另外地包括一种或多种药物可接收的载体。所述载体可选自盐水、缓冲的盐水、水、甘油和乙醇，且不仅局限于此。本领域中公知的任意可接收的药物制剂都是可利用的(Remingtons Pharmaceutical Science(最新版)，Mack Publishing Company，Easton PA)。本发明的组合物可口服给药并可以制药制剂的通用形式使用。可通过与常规使用的填充剂、膨胀剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、诸如表面活性剂的稀释剂或赋型剂混合，以使本发明所述组合物制备成用于口服给药。可根据年龄、性别、健康状况、活性成分的吸收、失活速率、排泄以及其他共同使用的药物来确定本发明所述组合物的有效剂量。例如，口服给药的剂量可以是0.2-9.0g/天，但不仅限于此。本发明还包括了剂量单位的药物制剂。这意味着所述制剂可以单个部分的形式呈现，例如，片剂、有包衣的片剂、胶囊、药丸、栓剂和安瓿，其中的活性化合物含量对应于个人剂量的一部分或其倍数。剂量单位例如可包含1、2、3或4倍的个人剂量或1/2、1/3或1/4的个人剂量。个人剂量优选地含有一次给药中使用的活性化合物量，其通常对应于每日剂量的全部、1/2、1/31/4。口服给药的固体制剂是片剂、药丸、扑粉和胶囊，用于口服给药的液体制剂是混悬液、溶液、乳剂和糖浆，上述制剂在诸如水和液体石蜡的简单稀释剂之外，还可包括各种赋型剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。本发明的所述化合物不仅可应用于口服给药的制剂中，还可应用于注射的制剂中。例如，可使用分散剂、湿润剂或乳剂根据已知的方法制备用于无菌注射的水性或油性混悬液。任意可接收的药物溶剂包括水、林格氏溶液或等渗的NaCl溶液。无菌的硬化油(fixing oil)可用作溶剂或分散介质并可包括非刺激性硬化油，包括甘油单酯、甘油二酯和聚丙二醇以及诸如油酸的脂肪酸。
本发明还提供了含有单乙酰基二酰基甘油衍生物作为有效成分的免疫调节性和抗癌健康食品。在本发明中，“健康食品”包括用于治疗或预防多种疾病以及维持机体功能平衡的食品、营养品和健康增补剂。在本发明中制备的健康食品包含0.02-100％重量比的单乙酰基二酰基甘油。在将本发明所述化合物用作健康食品时，可根据常规方法使用所述化合物，例如，使用原样的化合物或使用与其他食品或食品成分混合的化合物。所述化合物混合物的有效量随其使用目的不同(预防，保健或治疗性处理)而改变。在用作预防的情况下，优选的单乙酰基二酰基甘油衍生物的量为总健康食品量的0.02-2％重量比，优选为0.2-0.6％重量比。如果单乙酰基二酰基甘油的量过高或过低，健康食品都难以食用且不具有优势。由细胞毒性检测所支持，所述有效成分对旨在控制或保持健康的长期食用而言也是安全的。可制成含有本发明组合物的任意种类的食品而没有限制。例如，肉香肠、面包、汤、饮料、茶、酒、酒精饮料和维生素复合物是可被制成含有本发明所述组合物的健康食品的食品。出于治疗或预防疾病的目的，在所述健康食品被用作营养成分或健康增补剂时，优选的单乙酰基二酰基甘油衍生物的量为总健康食品量的20-100％重量比，优选为30-100％重量比，更有选为35-95％重量比。摄入量可为0.18-9.0g/天，但不仅限于此。制剂包括片剂和胶囊。
如上所解释的那样，本发明的单乙酰基二酰基甘油衍生物可激活T-细胞从而促进细胞因子的分泌，增加细胞间粘附分子的表达从而刺激造血细胞和免疫细胞，以至于不仅改善免疫力而且还可预防和治疗自身免疫性疾病和癌症。
为了更好地理解本发明，以下提供了的优选实施例。然而，本发明并不仅限于以下实验性实施例。
[实验性实施例1]单乙酰基二酰基甘油衍生物对T-细胞和单核细胞增殖的作用
[实验性实施例1-1]单乙酰基二酰基甘油衍生物对T-细胞增殖的作用
从C57BL/6小鼠(由韩国首尔的生命科学动物实验室Asan研究所(Asan Institute for Life Sciences Animal Lab.)提供)的脾脏采集脾细胞。然后通过反复吸取和冲洗获得单细胞悬液。使用氯化铵去除红细胞，并通过尼龙棉(nylon wool)去除碎屑和团块。使用含有抗山羊IgG(MACS小珠，Miltenyi Biotec，bergich gladbach，Germany)或抗小鼠CD4(MACS小珠，Miltenyi Biotec，bergich gladbach，Germany)或抗鼠CD8抗体(MACS小珠，Miltenyi Biotec，bergich gladbach，Germany)的磁珠(MACS小珠，Miltenyi Biotec，bergich gladbach，Germany)来纯化T-细胞(Turner和Dockrell(1996)Immunology，87：339-342)。
将T细胞悬液悬浮于添加了10％胎牛血清(下文中称为“FBS”)(Gibco，Grand Island，NY)的Isocove改良的Dulbecco培养基(IMDM，Gibco，Grand Island，NY)中。在含有1μg/ml化合物1、化合物2、化合物4和化合物5，0.01、0.1、1μg/ml化合物3(由韩国首尔Ewha女子大学化学系合成并提供)或20ng/ml IL-2的96孔板中，以每孔5×104活性细胞进行培养。在第6天，用1μCi 3H-胸腺嘧啶核苷/孔将细胞孵育24小时。在第7天，收获细胞，采用数学公式1计算整合系数(下文中称为“SI”)。
[数学公式1]
SI＝实验组小孔吸收的3H-胸腺嘧啶核苷(样品中的CPM)/对照组小孔吸收的3H-胸腺嘧啶核苷(对照中的CPM)
结果是，单乙酰基二酰基甘油衍生物处理组在T-细胞吸收胸腺嘧啶核苷方面具有升高的SI，2.05，其类似于IL-2处理组的情况(表1)。
【表1】
  处理组   SI
  IL-2(20ng/ml)*   2.05±0.24
  化合物1(1μg/ml)*   2.01±0.43
  化合物2(1μg/ml)*   2.03±0.54
  化合物3(0.01μg/ml)**   1.83±0.32
  化合物3(0.1μg/ml)*   1.96±0.18
  化合物3(1μg/ml)*   2.05±0.64
  化合物4(1μg/ml)*   1.98±0.26
  化合物5(1μg/ml)*   2.02±0.38
*P＜0.05，**P＜0.005。所有检测都一式三份并重复三次。
[实验性实施例1-2]单乙酰基二酰基甘油衍生物对单核细胞增殖的作用
使用Histopaque 1077从人的全血中分离出单核细胞。随后，在5％CO2培养箱中使单核细胞(5×106细胞/ml)对组织培养瓶进行3小时吸附。3小时之后，去除未吸附的细胞，并将吸附的细胞放置于含有添加了10％FBS的RPMI 1640培养基(Gibco，Grand Island，NY)的96孔板中。在含有1μg/ml化合物1～5的96孔板中，以每孔5×104活细胞进行培养。在第6天，用1μCi 3H-胸腺嘧啶核苷/孔将细胞孵育24小时。在第7天，收获细胞并计算3H-胸腺嘧啶核苷的整合。采用上述的公式1计算SI。其结果是与对照相比，化合物1～5处理组具有升高的单核细胞SI 10.68，说明所述化合物刺激了单核细胞的增殖(表2)。
【表2】
  处理组   SI(±S.E)
  未处理的对照   1
  化合物1(1μg/ml)*   9.97±0.10
  化合物2(1μg/ml)*   10.42±0.15
  化合物3(1μg/ml)*   10.68±0.13
  化合物4(1μg/ml)*   10.21±0.18
  化合物5(1μg/ml)*   9.75±0.09
*P＜0.001。所有检测都一式三份并重复两次。
[实验性实施例2]化合物3对T细胞活性的作用
[实验性实施例2-1]通过Elispot测定细胞因子
因为用于该分析中的Elispot板的每一小孔底部都预先包被了细胞因子特异性的抗体，所以Elispot生物分析(ESAT-6酶联免疫点分析)是检测与膜结合的细胞因子的非常灵敏的定量分析法。因此可使用Elispot分析来测定T细胞活性。以2×106细胞向无菌的组织培养板(Nunc，Denmark)的每一孔中接种T细胞，然后用0.01、0.1、1μg/ml浓度的化合物3或IL-2(20ng/ml)对其进行处理。在第7天，收获细胞并将该细胞以5×105细胞/ml接种于包被有不同初级抗体(小鼠IL-2)的多重-检测板(Elispot系统试剂盒，AID，Straberg，Germany)中。将所述培养板在5％CO2培养箱中孵育24小时之后，所述细胞开始分泌细胞因子，所述细胞因子为初级抗体(小鼠IL-2)所俘获，这通过使用可购得的小鼠IL-2 Elispot试剂盒根据制造商的说明书进行Elispot而测定。每个样品测定两次。使用Elispot读数器(AID Elispot Reader System)完成通过Elispot对产生IL-2细胞的计数。其结果说明，与对照组相比，化合物3处理组具有1.52倍升高的T-4活性，以及1.46倍升高的T-8活性(图1)。
[实验性实施例2-2]通过Bio-plex测定细胞因子
Bio-plex可在小孔中同时对大量的细胞因子进行测定。因此，Bio-plex试剂盒用来对Th1/Th2途径的8种细胞因子进行定量，这些细胞因子是在T-细胞被激活是分泌的。用抗-CD3和抗-CD28处理无菌的24孔组织培养板(Nunc，Denmark)进行。然后，以2×106细胞/ml在该培养板上接种T细胞。为了激活T-细胞，向其中加入0.1、1μg/ml化合物3进行处理，随后培养5天。在第5天，将不同阶段的培养液回收，然后进行离心。收集上清液，然后按照制造商的说明书(Bio-rad)使用Bio-plex试剂盒对其中分泌出的细胞因子进行定量。其结果是在使用化合物3处理组中，分泌出了8种细胞因子(IL-2，IL-4和IL-5，IL-10，IL-12，INF-γ，GM-CSF，TNF-α)中的3种(IL-2，IL-4和IL-5)，且其数量也比未使用化合物3进行处理的对照组的数量要高(图2)。
[实验性实施例3]T细胞增殖分析
进行以下实验来确认化合物3对AIDS患者免疫细胞的作用。首先，通过Hisopaque 1077从AIDS患者的外周血中获得人单核细胞。使用氯化铵去除红细胞，并随后通过尼龙棉去除碎屑和团块。使用磁珠(抗人CD3)(MACS小珠，Miltenyi Biotec，bergich gladbach，Germany)来纯化T-细胞。将T细胞悬液悬浮于添加了10％胎牛血清(下文中称为“FBS”)(Gibco，Grand Island，NY)的Isocove改良的Dulbecco培养基(IMDM，Gibco，Grand Island，NY)中。在含有0.01、0.1、1μg/ml浓度的化合物3或IL-2(20ng/ml)的96孔板中，以每孔5×104活细胞进行培养(一式三份)。在第6天，用1μCi 3H-胸腺嘧啶核苷/孔将细胞孵育24小时。在第7天，收获细胞，计算3H-胸腺嘧啶核苷的整合。根据上述公式1计算SI(刺激系数)。结果是，在AIDS患者中，T细胞增殖分析说明，与对照相比，化合物3处理组在全部患者(4个中的4个)的胸腺嘧啶核苷摄入方面具有1.5-3.9倍升高的T-细胞刺激系数，如表3所示。化合物3刺激的结果与IL-2刺激的结果总体上相当。
【表3】
  刺激系数(SI)
  1   2   3   4
  IL-2(20ng/ml)   1.41   4.17   1.29   6.54
  化合物3(1μg/ml)   2.23   3.87   1.48   3.49
[实验性实施例4]化合物3对树突状细胞粘附分子表达的作用
[实验性实施例4-1]树突状细胞培养物
从Balb/c AnN小鼠的大腿骨和胫骨获得骨髓细胞(Park，J.et al.(2003)J.Korean Med.Sci.，18：372-380)。将细胞在RPMI中洗涤3次，收集单个核细胞。然后使这些单个核细胞在RPMI和10％FBS中对组织培养瓶吸附3小时。孵育后，去除吸附的细胞(单核细胞)，将未吸附的细胞以1×105细胞/ml的浓度置于含有添加有20ng/ml鼠rGM-CSF(R & D Systems，Minneapolis，MN，USA)，10ng/ml鼠IL-4(R & D Systems)和2.5ng/ml鼠TNF-α(R & D Systems)的RPMI加10％FBS培养基的100mm组织培养皿中。每3天向培养皿中添加一次培养液。在培养的第6天加入鼠TNF-α(R& D Systems)。之后每3天加入一次鼠TNF-α(R & D Systems)，直到第11天。收集成熟的树突状细胞用于对粘附分子进行RT-PCR研究。结果是，圆形的颗粒细胞在培养三天之后，这些细胞形成串，在细胞培养板小孔的底部生长，而在培养的第6或第7天成熟的树突状细胞成簇出现。在培养的第9天，树突状细胞形成了小但是具有特异性长突出(图3)。
[实验性实施例4-2]树突状细胞表型的确定
对那些个体较大且对台盼蓝染色呈阴性的细胞进行计数，并对其中的每一个的形态都进行研究。以1×106细胞/ml进行细胞培养然后洗涤，再用1％多聚甲醛溶液固定。使用FACScan(Beckton Dickinson，MountainView，CA，U.S.A)对固定的细胞进行流式细胞分析，使用针对如下标记物的抗体确定其表型；这些标记物有针对仓鼠IgG，大鼠IgG2a的同种型对照，DC标记物：DEC205(NLDC-145)和CD 11C，共刺激/粘附分子：CD80(B7-1)和CD86(B7-2)，巨噬细胞标记物：CD14和F4/80，颗粒细胞标记物：Gr-1(Pharmingen，Hamburg，Germany)。其结果是共刺激特异性分子标记物CD80和C86以及树突状细胞特异性标记CD11C和DEC-205的水平较高。相反，单核细胞特异性标记物CD14和F4/80以及颗粒细胞特异性标记物Gr-1的水平较低。该结果说明本发明中分离的树突状细胞具有树突状细胞的确切表型且纯度为97-98％(图4)。
[实验性实施例4-3]粘附分子的处理和表达
公知在对各种造血细胞和免疫细胞进行的刺激都涉及到了细胞-细胞之间的相互作用。因此，本发明人试图确认化合物3是否影响了所涉及细胞的各种粘附分子。具体地，用1μg/ml化合物3对培养于上述实施例中的树突状细胞进行处理，然后进行RT-PCR分析。
使用以下引物进行了RT-PCR分析，这些引物是Icam-1(SEQ.ID.No1和No 2)，Icam-2(SEQ.ID.No 3和No 4)，Vcam-1(SEQ.ID.No 5和No6)，VLA-4(SEQ.ID.No 7和No 8)，VLA-5(SEQ.ID.No 9和No 10)，LFA-1(SEQ.ID.No 11和No 12)和GAPDH(SEQ.ID.No 13和No 14)。在此使用的反应组合是2μl DNA、10x缓冲溶液、1.5μl MgCl2、2μl dNTPs，0.5μl正向引物、0.5μl反向引物、0.2μl聚合酶以及15.8μl蒸馏水的混合溶液。
对从树突状细胞和MS-5、低密度细胞中分离的总RNA使用寡聚(dT)引物培养进行逆转录，在94℃30秒，65℃30秒和72℃50秒进行PCR。PCR总共重复34次，且每次PCR产物都加倍。通过RT-PCR验证了诸如Vcam-1、Icam-1、Icam-2、VLA-4、VLA-5和LFA-1的粘附分子的表达。为了定量，使用GAPDH进行PCR来确认对应的cDNA。其结果说明，与对照相比，化合物3处理的树突状细胞对粘附分子Icam-2、VLA-5、LFA-1的表达具有明显的增加(图5)。
[实验性实施例5]通过皮下注射(局部模型)和静脉注射(系统模型)对化合物3的抗癌作用进行研究
[实验性实施例5-1]胆管癌的仓鼠模型
将6周龄的雌性叙利亚金色仓鼠(Harlan，Indianapolis，India，USA)饲养于无特定病原菌的环境中。通过股静脉静脉注射悬浮于100μl RPMI1640无血清培养基中的5×105KIBG-5细胞(Molecular therapy，Vol.3，No.4，pp431-437)。并将悬浮于100μl无血清RPMI培养基中的5×105KIBG-5细胞皮下注射入仓鼠的侧腹。将注射了KIBG-5细胞的仓鼠分成7组；
1)用RPMI培养基处理的对照组，
2)用未修饰的BMSC细胞(2.5×106)处理的实验组(Leukemia &Lymphoma，Vol.44，No.11，pp1973-1978)，
3)用Ad/ΔE1 50MOI修饰的BMSC细胞处理的实验组(Leukemia& Lymphoma，Vol.44，No.11，pp1973-1978)，
4)用DC+肿瘤裂解物(5×106)处理的实验组，
5)用Ad/hIL-250MOI修饰的BMSC细胞处理的实验组(Leukemia& Lymphoma，Vol.44，No.11，pp1973-1978)，
6)用Ad/hIL-250MOI修饰的BMSC细胞处理的实验组+用化合物3(25mg/kg/天)处理的实验组，
7)用化合物3(25mg/kg/天)处理的实验组。
在向仓鼠(BMSC处理组)注射癌症细胞一周之后，向每一只仓鼠再次注射2.5×106BMSC细胞。对于DC+肿瘤裂解物处理组，在第1、2、3、4、6、8周向每一只仓鼠注射(皮下注射或静脉注射)5×106DC细胞和肿瘤裂解物，然后在12周后进行观察。对于化合物3处理组，在KIBG-5细胞注射前一周，通过P.O以持续2周中断1周的方式以化合物3给药(25mg/kg/天)，进行8周。
结果是，在癌症细胞注射4周后，在作为对照的RPMI处理组、BMSC处理组和BMSC+Ad/ΔE1处理组中形成了肿瘤，而在DC+肿瘤裂解物处理组、化合物3处理组和BMSC+Ad/IL-2处理组中则未形成肿瘤(图6)。此外，在癌症细胞注射8周之后，在作为对照的RPMI处理组、BMSC处理组和BMSC+Ad/ΔE1处理组中发现了多处转移性肺损伤，而在DC+肿瘤裂解物处理组和化合物3处理组中仅发现有一处微小的肺损伤。但在BMSC+Ad/IL-2处理组中则未发现损伤(图7，图8，图9)。此外，在肿瘤细胞皮下注射12周之后，在作为对照的RPMI处理组、BMSC处理组、BMSC+Ad/ΔE1处理组和DC+肿瘤裂解物处理组中形成了肿瘤，在BMSC+Ad/IL-2处理组中仅在一只小鼠中发现了小于5mm大小的肿瘤，而在BMSC+Ad/IL-2+化合物3处理组中未发现肿瘤(图10)。
在另一方面，将6周龄的雌性叙利亚金色仓鼠饲养于无特定病原菌的环境中。通过股静脉静脉注射悬浮于100μl RPMI 1640无血清培养基中的KIBG-5细胞(5×105)。将仓鼠分成4组：1)PBS对照组，2)化合物3(10mg/kg/天)处理组，3)化合物3(25mg/kg/天)处理组，4)化合物3(50mg/kg/天)处理组。在肿瘤细胞注射前一周，通过P.O以持续2周中断1周的方式以化合物3给药(10，25或50mg/kg/天)，进行12周。将每组的动物在4、8、12周处死进行病理检验。在第4周进行肉眼检查发现，在对照组的注射部位上有肿瘤发展，而化合物3(10、25或50mg/kg/天)处理组则没有肿瘤出现的迹象。在第8周，在对照组中的双肺中都观察到了多处转移性损伤。用裸眼观察在化合物3(25或50mg/kg/天)处理组中未表现出任何转移性肺损伤，而用显微镜观察则在化合物3(25mg/kg/天)处理组中发现有一处微小损伤。在化合物3(10mg/kg/天)处理组的左肺中发现有肿瘤(图11和图12)。
[实验性实施例5-2]黑素瘤的小鼠(C57BL/6)模型
将6周龄的雌性C57BL/6小鼠(由韩国首尔生命科学动物实验室Asan研究所提供)饲养于无特定病原菌的环境中。
通过尾静脉静脉注射悬浮于100μl RPMI 1640无血清培养基中的B16F10细胞(2×104)。在肿瘤注射前1周，对下面的三组进行处理。
1)RPMI对照组
2)树突状细胞(DC)(5×105细胞/天)+肿瘤裂解物处理组
3)化合物3(50mg/kg/天)处理组。
对于DC+肿瘤裂解物处理组，在黑素瘤注射前1周，每一周都将混合有肿瘤裂解物的5×105DC细胞注射入腹腔中。对于化合物3处理组，用化合物3以50mg/kg/天处理每只小鼠。在黑素瘤(B16F10)注射前1周，通过P.O以持续2周中断1周的方式以化合物3给药(50mg/kg/天)，进行6周。其结果是，在第4周进行肉眼检查时发现，在对照组的双肺中均观察到了多处转移性损伤。在黑素瘤(B16F10)注射后6周的观察中发现，化合物3处理组和DC+肿瘤裂解物处理组未表现出在肺中存在疾病的迹象(图13和图14)并表现出90％的存活率(图15)。
基于化合物3的抗癌作用归结于化合物3对T-细胞的激活这一假设，研究了由化合物3激活的T-细胞对恶性黑素瘤细胞的细胞毒性。其结果是，当由化合物3激活的T-细胞与黑素瘤细胞的比率为100∶1时，细胞毒性增加了42％(图16)。
[实验性实施例6]化合物3的毒性检测
将合成的化合物3溶解于5％乙醇溶液中，其以0.1ml/20g的剂量口服给药。饲养于SPF设施中的IRC小鼠用作测试动物。对照组用5％乙醇溶液进行处理。在给药前使动物禁食一天，之后自由饮水和摄食。将8-10只25-35g重的ICR小鼠分成一组。以从62.5mg/kg、125mg/kg、250mg/kg、500mg/kg、1.0g/kg至2.0g/kg逐渐升高的剂量通过口服以检测试剂给药一次。从给药当天开始，用裸眼对存活数量和任何异常体症进行观察，持续14天。通过Lichfield-Wilcoxon方法计算LD50(白須、泰彦、吐山、豐秋：新毒性试验法-方法与评价-acute toxicity test(急性毒性试验)，Realize Inc.，Tokyo，1988)，并根据以下数学公式计算重量变化。
[数学公式2]
重量增加率(％)＝{第14天的重量-第0天的重量}÷{第0天的重量}×100
结果如表4所示。使用62.5mg/kg～2g/kg的化合物3未观察到毒性。这一观察说明LD50高于2g/kg。使用裸眼在给药后14天未观察到任意异常体症。处理组和对照组动物的重量都稳步增长。如表5所示，未观察到明显的、处理特异性的重量变化(增加或减少)。
【表4】化合物3处理的死亡率(％)
  化合物3的剂量(mg/kg)   0   62.5   125   250   500   1000   2000
  死亡小鼠数/口服给药小鼠数   0/10   1/8   0/8   1/8   2/9   0/9   0/9
  LD50   0   12.5   30   12.5   22.2   0   0
【表5】化合物3口服给药14天后增加的重量
  化合物3的剂量(mg/kg)   0   63   125   250   500   1000   2000
  给药14天后的重量(g)   38.7±1.1   34.3±0.1   38.1±1.3   35.6±1.4   36.5±1.9   35.5±1.1   35.9±2.7
  重量增长率(％)   16.9   11.9   17.3   11.2   10.1   9.5   14.4
对化合物3剂量为100mg/kg体重/天，通过P.O给药持续4周的大鼠进行了长期肝毒性检测，还观察了肝功能测试、脂类情况和细胞色素C-450活性。在第4周末观察了肝脏的组织学情况。没有观察到明显的不良作用。
[实验性实施例7]CLP(盲肠结扎和穿刺)检测
进行CLP检测是为了验证化合物3对于预防和治疗败血症性休克的作用。将10只7-10周龄的雄性近交C3H/HeN小鼠(20-25g重)分成一组。在通过口服以50mg/kg/天以化合物3对这些小鼠给药两周然后中断1周之后，用80mg/kg克他命和16mg/kg甲苯噻嗪(rompun)麻醉小鼠。在麻醉的小鼠中通过CLP模型诱导败血症性休克。在败血症性休克诱导1小时之后，用50mg/kg的化合物3进行处理，然后，每24小时进行相同的处理，持续3天。对照组口服给予PBS+5％乙醇溶液。化合物3处理组与对照组的存活率随时间的变化如表6所示。甚至在120小时之后化合物3处理组依然具有100％的存活率。
【表6】在败血症性休克中的存活率
  随时间变化的存活率   0小时存活率  24小时存活率   48小时存活率   72小时存活率   96小时存活率   120小时存活率
  PBS处理组(对照)   100％  60％   40％   40％   40％   40％
  化合物3(50mg/kg)   100％  100％   100％   100％   100％   100％
[生产性实施例1]含有化合物3作为有效成分的医疗用品的制备
在通过以上实验验证了化合物3具有极好的免疫调节和抗癌活性之后，本发明人制备了含有化合物3作为有效成分的治疗剂。此外，含有化合物3作为有效成分的以下生产性实施例不仅可应用于制备治疗剂，还可以应用于制备健康食品。如果没有特别指出，在以下生产性实施例中符号％是指重量％。
[生产性实施例1-1]软明胶胶囊的制备
[生产性实施例1-1-1]
化合物3                                  30％
维生素C                                  4.5％
维生素D3                                 0.001％
硫酸锰                                   0.1％
蜡                                       10％
棕榈油                                   25％
红花油(Carthamus tinctorius)             30.399％
[生产性实施例1-1-2]
化合物3                                  31.25％
月见草籽油                               59.75％
大豆油                                   6.7％
维生素E乙酸酯(DL-α-生育酚乙酸酯)        2.1％
大豆卵磷脂                               0.2％
[生产性实施例1-1-3]
化合物3                                  98.0％
维生素E乙酸酯(DL-α-生育酚乙酸酯)        2.0％
[生产性实施例1-2]片剂的制备
化合物3                                  30％
维生素C                                   10％
维生素D3                                  0.001％
硫酸锰                                    0.1％
结晶纤维素                                25.0％
乳糖                                      32.399％
硬脂酸镁                                  2％
[生产性实施例1-3]注射制剂的制备
化合物3                                   2％
丙二醇                                    35％
甘油一酯                                  8％
乙醇                                      5％
水                                        50％
采用上述组合物和含量通过常规方法制备注射制剂。
[生产性实施例2]含有化合物1、2、4和5作为有效成分的医疗用品的制备
可通过采用与以上描述的生产性实施例1相同的方法和组合物制备软明胶胶囊、片剂和注射悬液，除了用化合物1、2、4和5以相同的比率来替代化合物3。
[生产性实施例3]含有化合物3作为有效成分的健康食品的制备
在通过以上实施例验证了化合物3具有极好的免疫调节、抗败血症性休克和抗癌活性之后，本发明人制备了含有化合物3作为有效成分的健康食品。
[生产性实施例3-1]饮料的制备
蜂蜜                                      522mg
硫辛酰胺                                  5mg
尼克酰胺                                  10mg
盐酸核黄素钠                           3mg
盐酸吡哆醇                             2mg
肌醇                                   30mg
原酸                                   50mg
化合物3                                0.48～1.28mg
水                                     200ml
通过常规方法根据上述组合物和含量制备饮料。
[生产性实施例3-2]口香糖的制备
口香糖基质                             20％
糖                                     76.36～76.76％
化合物3                                0.24～0.64％
水果调味剂                             1％
水                                     2％
通过常规方法根据上述组合物和含量制备口香糖。
[生产性实施例3-3]糖果的制备
糖                                     50～60％
淀粉糖浆                               39.26～49.66％
化合物3                                0.24～0.64％
橘调味剂                               0.1％
通过常规方法根据上述组合物和含量制备糖果。
[生产性实施例3-4]饼干的制备
1级强力面粉                            88kg
1级制糕点用面粉                        76.4kg
精制糖                                 16.5kg
盐                                     2.5kg
葡萄糖                                 2.7kg
棕榈起酥油                             40.5kg
Ammo                                       5.3kg
发面苏打                                   0.6kg
硫酸氢钠                                   0.55kg
米粉                                       5.0kg
维生素B1                                   0.003kg
微生素B2                                   0.003kg
乳调味剂                                   0.16kg
水                                         71.1kg
全乳粉                                     4kg
替代乳粉(substitute milk power)            1kg
磷酸钙，一元的                             0.1kg
喷洒用盐                                   1kg
喷洒用乳                                   25kg
化合物3                                    0.2～0.5kg
通过常规方法根据上述组合物和含量制备饼干。
[生产性实施例3-5]冰淇淋的制备
乳脂                                       10.0％
无脂的乳固形物                             10.8％
糖                                         12.0％
淀粉糖浆                                   3.0％
乳化稳定剂(范围(span))                     0.5％
调味剂(草莓)                               0.15％
水                                         63.31～62.91％
化合物3                                    0.24～0.64％
通过常规方法根据上述组合物和含量制备冰淇淋。
[生产性实施例3-6]巧克力的制备
糖                                         34.36～34.76％
可可油                                     34％
Cocoa mat                                15％
可可粉                                   15％
卵磷脂                                   0.5％
香草调味剂                               0.5％
化合物3                                  0.24～0.64％
通过常规方法根据上述组合物和含量制备巧克力。
[生产性实施例4]含有化合物1、2、4和5作为有效成分的健康食品的制备
可通过与以上描述的生产性实施例3相同的方法和组合物制备饮料、口香糖、糖果、饼干、冰淇淋和巧克力，除了用化合物1、2、4和5以相同的比率来替代化合物3。
有益效果
如上文所解释的，含有化合物3的单乙酰基二酰基甘油衍生物表现出了明显的免疫调节作用，包括免疫增强作用。对于通过注射癌症细胞系在仓鼠中诱导癌症的情况，通过激活对于促进免疫力具有重要作用的淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞使得癌症的发展得以延迟，而通过提升免疫细胞对癌症细胞的细胞毒性则诱导了癌症细胞的调亡。同样，对于诱导败血症性休克的小鼠情况，通过控制免疫功能和对凋亡的抑制作用，甚至在时间120小时之后还有100％的存活率。因此，本发明的单乙酰基二酰基甘油衍生物可有效地用于免疫调节剂、败血症治疗剂、癌症治疗剂和健康食品，用于免疫调节或预防癌症。
                       序列表
<110>金尚姬
<120>含有单乙酰基二酰基甘油衍生物的免疫调节剂、抗癌剂和健康食品
<130>pd5013
<150>KR 10-2004-0028514
<151>2004-04-24
<150>KR 10-2004-0070650
<151>2004-09-04
<150>KR 10-2004-0109805
<151>2004-12-21
<160>14
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ICAM-1正向引物
<400>1
ccaactggaa gctgtttgag ct                            22
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ICAM-1反向引物
<400>2
ttctgtcgaa ctccacagtc a                             21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ICAM-2正向引物
<400>3
catatggtcc gagaagcaga t                             21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ICAM-2反向引物
<400>4
aagcatagca ggacagatgt c                             21
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VCAM-1正向引物
<400>5
ggttgggaag ccggtcacag tcaa                          24
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VCAM-1反向引物
<400>6
gcacacgtca gaacaaccga atcc                          24
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VLA-4正向引物
<400>7
ctcagatctc cttgttggag cagc                          24
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VLA-4反向引物
<400>8
tgaatgcctg gtgtgtccta  c                            21
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VLA-5正向引物
<400>9
cagtggtgat gacactgatg a                             21
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VLA-5反向引物
<400>10
agaagctaag gttgatgcag g                             21
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LFA-1正向引物
<400>11
tgacacttta cttgcgacca                               20
<210>12
<211>21
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<220>
<223>LFA-1反向引物
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gatgggtagt cgaactcatt g                             21
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GAPDH正向引物
<400>13
accacagtcc atgccatcac                               20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GAPDH反向引物
<400>14
tccaccaccc tgttgctgta                               20

Claims (13)

1.含有以下列式1表示的单乙酰基二酰基甘油衍生物作为有效成分的免疫调节剂，
式1
Figure A2005800129140002C1
其中，R1/R2是9-十八碳烯酰基(油酰基)/十六酰基(棕榈酰基)、十六酰基(棕榈酰基)/9-十八碳烯酰基(油酰基)、十六酰基(棕榈酰基)/9，12-十八碳二烯酰基(亚油酰基)、十六酰基(棕榈酰基)/9，12，15-十八碳三烯酰基(亚麻酰基)或十六酰基(棕榈酰基)/5，8，11，14-二十碳四烯酰基(花生四烯酰基)。
2.如权利要求1所述的免疫调节剂，其中以所述式1表示的所述单乙酰基二酰基甘油衍生物是以下列式2表示的单乙酰基二酰基甘油，
式2
Figure A2005800129140002C2
3.如权利要求1所述的免疫调节剂，其中所述单乙酰基二酰基甘油衍生物刺激选自T细胞中的IL-2、IL-4和IL-5的细胞因子的分泌。
4.如权利要求1所述的免疫调节剂，其中所述单乙酰基二酰基甘油衍生物抑制由自身免疫反应导致的细胞损伤。
5.如权利要求1所述的免疫调节剂，其中所述单乙酰基二酰基甘油衍生物刺激IL-4的分泌，并且起增殖和活化T4和T8细胞的作用。
6.如权利要求1所述的免疫调节剂，其中所述单乙酰基二酰基甘油衍生物占所述免疫调节剂的总重量的20％至100％重量比。
7.AIDS治疗剂，其含有以上述式1表示的单乙酰基二酰基甘油衍生物作为有效成分。
8.败血病治疗剂，其含有以上述式1表示的单乙酰基二酰基甘油衍生物作为有效成分。
9.抗癌剂，其含有以上述式1表示单乙酰基二酰基甘油衍生物作为有效成分。
10.如权利要求9所述的抗癌剂，其中所述抗癌剂用于治疗胆管癌、肾癌或恶性黑素瘤。
11.如权利要求9所述的抗癌剂，其中所述抗癌剂激活能使T细胞识别癌症细胞抗原的树突状细胞。
12.用于免疫调节或预防癌症的的健康食品，其含有以上述式1表示的单乙酰基二酰基甘油衍生物作为有效成分。
13.如权利要求12所述的健康食品，其中所述单乙酰基二酰基甘油衍生物占所述健康食品总重量％的0.02％至100％重量比。
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