PL225045B1

PL225045B1 - Zastosowanie polimeru chitozanowego do wytwarzania leków do leczenia i profilaktyki infekcji wywołanych przez koronawirusy

Info

Publication number: PL225045B1
Application number: PL399246A
Authority: PL
Inventors: Krzysztof Pyrć; Aleksandra Milewska; Maria Nowakowska; Krzysztof Szczubiałka; Kamil Kamiński
Original assignee: Univ Jagielloński
Priority date: 2012-05-18
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2017-02-28
Also published as: PL399246A1; CN104321063A; JP6177893B2; WO2013172725A1; DK2849763T3; EP2849763A1; US20150164938A1; ES2655674T3; KR20150013526A; CA2873171A1; EP2849763B1; JP2015520755A

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polimeru chitozanowego do wytwarzania leków do leczenia infekcji wywołanych przez koronawirusy poprzez hamowanie ich replikacji. Wirusy należące do rodziny Coronaviridae u ludzi wywołują m.in. infekcje dróg oddechowych, objawiające się niewydolnością i upośledzeniem prawidłowych czynności oddechowych u ludzi. Wirusy te mogą również zakażać liczne gatunki zwierząt (m.in. nietoperze, myszy, szczury, koty, psy, króliki, konie, bydło, kurczaki, indyki i dzikie ptactwo), wywołując szeroką gamę schorzeń, włączając w to schorzenia układu oddechowego, układu trawiennego, wątroby, układu sercowo-naczyniowego czy układu nerwowego.

W szczególności wynalazek obejmuje zastosowanie polimeru chitozanowego do wytwarzania leków do leczenia infekcji górnych dróg oddechowych, infekcji dolnych dróg oddechowych, dławca, zakażeń układu pokarmowego, zakażeń układu nerwowego, zakażeń wątroby, zakażeń układu sercowo-naczyniowego oraz choroby Kawasaki'ego u ludzi i zwierząt.

Koronawirusy są opłaszczonymi wirusami posiadającymi genom w postaci pojedynczej nici RNA o dodatniej polarności. Początkowo rodzina koronawirusów została podzielona w oparciu o m etody serologiczne na trzy grupy. Po wprowadzeniu technik molekularnych dokonano ponownego podziału rodziny i w chwili obecnej wyróżnia się alfa, beta, gamma oraz delta koronawirusy. Do alfakor onawirusów zalicza się liczne patogeny zwierzęce (m.in. wirus zapalenia otrzewnej kotów, świński wirus epidemii biegunki) oraz dwa ludzkie koronawirusy (HCoV-229E oraz HCoV-NL63). Do betakoronawirusów zalicza się wirusy zwierzęce, takie jak mysi wirus zapalenia wątroby (MHV), koński i psi kor onawirus oraz trzy ludzkie koronawirusy (HCoV-OC43, HCoV-HKU1 oraz SARS-CoV). Do gamma oraz delta koronawirusów zalicza się patogeny zakażające ptaki.

Znana ze stanu techniki jest zdolność chitozanu i jego pochodnych do wiązania wirusów oraz hamowania ich replikacji. Na przykład wiadomo, że pochodne cukrowe chitozanu mają zdolność do wiązania wirusa grypy, poprzez białko hemaglutyninę, będącą typowym białkiem wirusa grypy zdolnym do wiązania reszt cukrowych (Li X. et al. (2011).

Biomacromolecules, 12: 3962-3969; Kalashnikova I. et al. (2008). Anal Chem 80: 2188-2198; Makimura Y. et al. (2006). Carbohydr Res 341: 1803-1808; US 6680054]. Podobnie niemodyfikowany chitozan w formie mikrogranulek byt wykorzystywany do hamowania rozwoju zakażenia wirusa pryszczycy (FMDV). Wykazano, że podanie chitozanu w formie mikrogranulek oseskom myszy prowadziło do redukcji objawów chorobowych (Li D. (2010). Virol J 7: 125.). Wykazano również, że sulfonowane pochodne chitozanu wykazują działanie przeciwwirusowe, hamując replikację wirusa HIV-1, prawdopodobnie poprzez blokowanie oddziaływania białka wirusowego gp120 z receptorem znajdującym się na powierzchni komórek wrażliwych na zakażenie (CD4) (Artan M. et al. (2010). Carbohydr Res 345: 656-662). Znane są z literatury doniesienia, iż sulfonowe pochodne chitozanu mogą wykazywać aktywność przeciwko innym retrowirusom oraz członkom rodziny herpesviridae (US 2009286757, US 2005209189, EP 0497988, DE 4242813 oraz Ishihara C. et al. (1993). Vaccine 11: 670-674). Podobnie, niskocząsteczkowy chitozan wykazuje działanie przeciwwirusowe przeciwko kociemu kaliciwirusowi oraz mysiemu norowirusowi (Su X. et al. (2009). J Food Prot 72: 2623-2628). Istnieją również zgłoszenia patentowe, jak również patenty dotyczące aktywności przeciwwirusowej chitozanu i pochodnych chitozanu.

Jednakże rozpuszczalny chitozan, jak również pochodne sulfonowe chitozanu, nie wykazuje aktywności przeciw koronawirusom. Podobnie wykorzystanie innych polimerów modyfikowanych kationowo nie prowadziło do zahamowania replikacji wirusa w warunkach in vitro. Opracowany polimer, w przeciwieństwie do opisanych powyżej, nie wykazywał aktywności przeciwko innym wirusom ludzkim, takim jak ludzki metapneumowirus, enterowirusy, wirusy grypy typu A i B oraz ludzki herpeswirus typu 1.

Celem wynalazku jest zastosowanie polimeru chitozanowego do wytwarzania leków do leczenia i profilaktyki infekcji wywołanych przez koronawirusy poprzez hamowanie ich replikacji.

Istotą wynalazku jest zastosowanie polimeru chitozanowego, tj. HTCC (N-(2-hydroxy)-propyl-3-trimethylammonium chitosan chloride) lub HM-HTCC (hydrophobically-modified HTCC) o wzorze I, w którym R oznacza H₂- lub/i COCH₃ lub/i grupę hydrofobową będącą grupą alifatyczną o liczbie atomów węgla w zakresie od 8 do 16; do wytwarzania leków do leczenia i profilaktyki infekcji wywołanych przez koronawirusy.

Korzystnie, gdy polimer służy do wytwarzania leków do leczenia i profilaktyki infekcji wywołanych przez alfakoronawirusy, a szczególnie korzystnie w przypadku infekcji wywołanych przez HCoV-NL63.

PL 225 045 B1

Korzystnie, gdy polimer służy do wytwarzania leków do leczenia i profilaktyki infekcji wywołanych przez betakoronawirusy, a szczególnie korzystnie w przypadku infekcji wywołanych przez m ysiego koronawirusa MHV.

Korzystne jest również zastosowanie polimeru według wynalazku do wytwarzania leków do leczenia i profilaktyki infekcji dróg oddechowych objawiających się niewydolnością i upośledzeniem prawidłowych czynności oddechowych u ludzi lub zwierząt, w tym szczególnie korzystnie do wytw arzania leków do leczenia i profilaktyki infekcji wybranych z grupy: infekcji górnych dróg oddechowych, infekcji dolnych dróg oddechowych, dławca u dzieci, zakażeń układu pokarmowego, zakażeń układu nerwowego choroby Kawasaki'ego.

Korzystnie, gdy grupami hydrofobowymi są grupy n-dodecylowe.

Korzystnie, gdy polimery chitozanowe według wynalazku stosuje się w postaci płynu lub aerozolu podawanego miejscowo do górnych dróg oddechowych (gardło, nos, drzewo układu oddechowego), doustnie do układu pokarmowego lub dożylnie w leczeniu ogólnoustrojowym w celu wytwarzania leków do leczenia i zapobiegania zachorowaniom na choroby wywołane przez koronawirusy.

Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach stosowania oraz na załączonym rysunku, na którym:

Wzór I przedstawia polimer według wynalazku, w którym R oznacza H lub/i COCH₃, lub/i grupę alkilową CnH₂n+1, gdzie n=8-16,

Wzór II przedstawia polimer według wynalazku, w który część monomerów jest podstawiona podstawnikiem hydrofobowym w postaci Ci₂H₂₅,

Fig. 1 ilustruje znaną ze stanu techniki reakcję otrzymywania HTCC,

Fig. 2 ilustruje widma FTIR potwierdzające strukturę kationowo zmodyfikowanego chitozanu,

Fig. 3 ilustruje widma H-NMR niezmodyfikowanego chitozanu,

Fig. 4 ilustruje widma ¹H-NMR HTCC,

Fig. 5-9 ilustrują wyniki badanie cytotoksyczności oraz wpływu polimerów HTCC i HM-HTCC na zahamowanie efektu cytopatycznego oraz replikację alfakoronawirusów, na przykładzie ludzkiego koronawirusa NL63.

Przykład 1. Synteza pochodnej chitozanu

Modyfikację polimeru przeprowadzono w oparciu o metodę opisaną uprzednio w literaturze (Kaminski K. et al. (2010). J. Med Chem 53: 4141-4147.) w reakcji otrzymywania HTCC przedstawionej na fig. 1.

2,5 g chitozanu zdyspergowano w 100 ml wody destylowanej, a następnie dodano 10 ml 0,5% kwasu octowego i mieszano przez 30 min. W kolejnym etapie wkroplono 6,9 ml chlorku glicydylotrimetyloamoniowego (GTMAC). Otrzymano polimer o stopniu modyfikacji 63%, zdefiniowanym jako procent jednostek glukozowych podstawionych GTMAC. Reakcję prowadzono przez 18 h w temperaturze 55°C mieszając mieszaninę reakcyjną przy użyciu mieszadła magnetycznego. Po upływie tego czasu mieszaninę reakcyjną odwirowano z prędkością 4000 obrotów na minutę przez 10 minut w celu usunięcia zawieszonego niezmodyfikowanego chitozanu. Następnie supernatant wlano do nadmiaru acetonu, a uzyskaną w ten sposób zawiesinę odwirowano przy prędkości 4000 obrotów na minutę przez 20 min. Ciecz znad osadu zdekantowano, osad wstępnie osuszono w powietrzu, a następnie rozpus zczono w wodzie. Otrzymany roztwór ponownie odwirowano, a polimer rozpuszczony w supernatancie wytrącono przy pomocy nowej porcji acetonu. Sekwencję rozpuszczania i strącania powtórzono jes zcze dwa razy. Otrzymany po ostatnim strąceniu produkt suszono w suszarce próżniowej przez 24 godziny.

Strukturę kationowo zmodyfikowanego chitozanu potwierdzają widma FTIR przedstawione na fig. 2, gdzie linia niebieska pokazuje widmo chitozanu przed modyfikacją, a linia różowa pokazuje widmo chitozanu po modyfikacji.

W widmie FTIR zmodyfikowanego chitozanu można wyróżnić między innymi dwa pasma przy 1520 cm^- , charakterystyczne dla grup metylowych, obecnych w zmodyfikowanym chitozanie, nieobecnych natomiast w chitozanie niezmodyfikowanym, oraz charakterystyczne dla pierwszorzędo-1 wych amin pasmo przy 1595 cm^- , obserwowane w widmie niezmodyfikowanego chitozanu, nieobserwowane natomiast w widmie chitozanu zmodyfikowanego. W obydwu przypadkach obserwuje się natomiast pasmo przy 1650 cm^- , pochodzące od grupy C=O w l-rzędowym wiązaniu amidowym występującym w acetylowanych grupach aminowych.

₁

Strukturę zmodyfikowanego chitozanu potwierdzono również za pomocą widm H-NMR (fig. 3 ₁ i fig 4). Pomiary H NMR wykonano w mieszaninie D₂O i CD₃COOD. W widmie polimeru po modyfika4

PL 225 045 B1 cji pojawiło się pasmo przy 3,2 ppm, charakterystyczne dla protonów grup metylowych połączonych z azotem aminy IV-rzędowej. Na rysunku przedstawiono widma H-NMR niezmodyfikowanego chitozanu (fig. 3) i HTCC (fig. 4).

HTCC (1 g, 3 mmol jednostek glukozowych) rozpuszczono w mieszaninie metanolu i 1% roztworu kwasu octowego (pH=5,5) w stosunku 1:1. W 20 ml metanolu rozpuszczono 0,3 mmol N-aldehydu n-dodecylowego i 1,2568 g (20 mmol) cyjanoborowodorku sodowego (NaCNBH₄) i dodano do roztworu HTCC. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 36 h w 20°C aż do utworzenia zolu. Po zakończeniu reakcji strącono polimer 50:50 v/v mieszaniną metanolu i eteru dietylowego. Wytrącony polimer przemyto metanolem i eterem i wysuszono w próżni. Strukturę otrzymanego produktu potwierdzono ₁ mierząc widma H NMR.

Przykład 2. Badanie cytotoksyczności, oraz wpływu polimerów HTCC i HM-HTCC na zahamowanie efektu cytopatycznego oraz replikację alfakoronawirusów, na przykładzie ludzkiego koronawirusa NL63

Zbadano cytotoksyczność polimerów HTCC oraz HM-HTCC na komórkach LLC-MK2 (ATCC: CCL-7; linia komórkowa wywodząca się z komórek epitelium nerki Macaca mulatta) wrażliwych na infekcje wirusem HCoV-NL63 oraz komórek A549 (ATCC: CCL-185; linia komórkowa wywodząca się z komórek nowotworowych płuc, Homo sapiens) (van der Hoek L. et al. (2004). Nat Med 10: 368-373; Schildgen O. et al. (2006). J Virol Methods 138: 207-210). Cytotoksyczność określano za pomocą dwóch testów. Jako pierwszy zastosowano test kolorymetryczny, którego działanie opiera się na zdolności enzymów mitochondrialnych (dehydrogenazy bursztynianowej) do redukcji barwnika XTT (ang. (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) do barwnych soli formazanu.

Ponieważ istnieje bezpośrednia zależność pomiędzy żywotnością komórek a ilością powstałego barwnika, poprzez pomiar absorbancji przy maksimum absorpcji barwnika możliwe jest określenie ilości oraz kondycji komórek. Ocenę żywotności komórek przeprowadzono również z wykorzystaniem czerwieni obojętnej. Czerwień obojętna (NR, ang. neutral red) przechodzi na drodze transportu biernego do cytoplazmy jedynie komórek żywych i ulega akumulacji w lizosomach. Analiza ilości żywych komórek oraz ich stanu przeprowadzana jest poprzez lizę komórek, a następnie analizę kolorymetryczną powstałego roztworu.

W badaniu inkubowano komórki LLC-MK2 lub A549 przez 6 dni w pożywce zdefiniowanej MEM z solami Hanks'a oraz Earle'a z dodatkiem 3% surowicy bydlęcej, ze wzrastającymi stężeniami polimeru HTCC lub HM-HTCC. Po tym czasie efekt cytotoksyczności określony został zgodnie z powyższym opisem obydwiema metodami. Ponadto przeprowadzono obserwację zmian morfologicznych komórek w obecności polimeru z wykorzystaniem mikroskopu kontrastowo-fazowego. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 1.

T a b e l a 1

Wyniki testów cytotoksyczności i cytopatyczności

Linia komórkowa	HTCC CC50^ab	HTCC CC50^ac	HM-HTCC CC50^ab	HM-HTCC CC50^ac
LLC-MK2	161,25 pg/ml	191,92 pg/ml	220,09 pg/ml	215,23 pg /ml
A549	143,83 pg/ml	156,46 pg/ml	96,29 pg/ml	96,13 pg/ml

° CC₅₀ oznacza cytotoksyczność polimeru na poziomie 50% dla zastosowanego stężenia. ^b wyniki uzyskane z wykorzystaniem testu XTT.

^c wyniki uzyskane z wykorzystaniem testu opartego na zastosowaniu czerwieni obojętnej.

Wyniki uzyskane z przeprowadzonego pomiaru byty spójne z obserwacjami dotyczącymi zmian morfologii komórek.

Zbadano zahamowanie replikacji ludzkiego koronawirusa NL63 za pomocą polimerów HTCC oraz HM-HTCC. Eksperyment przeprowadzono poprzez zakażenie komórek wrażliwych (linia LLCMK2) wirusem HCoV-NL63 w obecności polimerów o wzrastających stężeniach.

Komórki przez cały czas znajdowały się w pożywce zdefiniowanej MEM z solami Hanks'a oraz Earle'a z dodatkiem 3% surowicy bydlęcej. Po dwóch godzinach inkubacji komórek z wirusem pożywka została ściągnięta, a następnie nałożona została świeża pożywka (MEM z solami Hanks'a oraz Earle'a z dodatkiem 3% surowicy bydlęcej) zawierająca polimer HTCC lub HM-HTCC w określonym stężeniu. Obserwację zmian morfologicznych przeprowadzono z wykorzystaniem mikroskopu kontrastowo-fazowego po 6 dniach inkubacji. W obecności polimeru HTCC w stężeniu 10 μg/ml zaobserwowano zahamowanie replikacji wirusa i brak efektu cytopatycznego. Podobnie dla polimeru HM-HTCC

PL 225 045 B1 o stężeniu 50 pg/ml zaobserwowano zahamowanie replikacji wirusa i brak efektu cytopatycznego (fig. 5). Analiza wpływu niemodyfikowanego chitozanu na replikację wirusa HCoV-NL63 wykazała brak wpływu hamującego tego polimeru. Podobnie nie zaobserwowano wpływu kationowych pochodnych innych polimerów (np. dekstranu lub PAH).

Zbadano także wpływ polimerów HTCC oraz HM-HTCC na replikację wirusa HCoV-NL63 z wykorzystaniem pomiaru liczby kopii RNA w pożywce poprzez analizę RT-PCR w czasie rzeczywistym. Zastosowano w tym celu opisaną uprzednio metodę ilościową (Pyrc K. et al. (2006). Antimicrob Agents Chemother 50: 2000-2008). W badaniu inkubowano komórki LLC-MK2 przez 6 dni w medium zdefiniowanym MEM z solami Hanks'a oraz Earle'a z dodatkiem 3% surowicy bydlęcej. Przy zakażeniu, po 2 godzinach inkubacji komórek z wirusem pożywka została ściągnięta, a następnie nałożona została świeża pożywka (MEM z solami Hanks'a oraz Earle'a z dodatkiem 3% surowicy bydlęcej) zawierająca polimer HTCC lub HM-HTCC w odpowiednim stężeniu. Po zakończonej inkubacji całkowite RNA zostało wyizolowane z nadsączów komórkowych i po reakcji odwrotnej transkrypcji wykorzystane jako matryca dla reakcji PCR.

Eksperyment przeprowadzono dla wzrastających stężeń polimerów. Uzyskane wyniki przedst awiono na fig. 6 i fig. 7 oraz w tabeli 2. Zaobserwowano, że polimery HTCC oraz HM-HTCC spowodowały zahamowanie namnażania wirusa HCoV-NL63, podczas gdy w próbce kontrolnej stwierdzono normalną replikację. Powiązanie danych dotyczących cytotoksyczności (CC₅₀) oraz danych dotyczących wartości IC₅₀ pozwoliło oznaczyć indeksy selektywności, które również zostały ujęte w tabeli 2.

Na rysunku przedstawiono wykresy ilustrujące zależne od stężenia zahamowanie replikacji wirusa przez polimer HTCC (fig. 6) lub HM-HTCC (fig. 7).

T a b e l a 2

Hamowanie replikacji wirusa HCoV-NL63 przez polimery HTCC i HM-HTCC.

Polimer	IC50	Indeks selektywności Sl50
HTCC	6,11 pg/ml	26,39
HM-HTCC	135,38 pg/ml	1,63

Przykład 3. Badanie cytotoksyczności, oraz wpływu polimerów HTCC i HM-HTCC na zahamowanie efektu cytopatycznego oraz replikację betakoronawirusów na przykładzie mysiego koronawirusa MHV

Zbadano cytotoksyczność polimerów HTCC oraz HM-HTCC na komórkach LR7 wrażliwych na infekcje wirusem MHV (Kuo L. et al. (2000). J Virol 74: 1393-1406; Rossen J.W. et al. (1996). Virology 224: 345-351). Cytotoksyczność określano za pomocą testu kolorymetrycznego, którego działanie opiera się na zdolności enzymów mitochondrialnych (dehydrogenazy bursztynianowej) do redukcji barwnika XTT (ang. (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) do barwnych soli formazanu. Ponieważ istnieje bezpośrednia zależność pomiędzy żywotnością komórek a ilością powstałego barwnika, poprzez pomiar absorbancji przy maksimum absorpcji możliwe jest określenie ilości oraz kondycji komórek.

W badaniu inkubowano komórki LR7 przez 48 godzin w pożywce zdefiniowanej DMEM z dodatkiem 3% surowicy bydlęcej, ze wzrastającymi stężeniami polimeru HTCC lub HM-HTCC. Po tym czasie efekt cytotoksyczności określony został zgodnie z powyższym opisem. Ponadto przeprowadzono obserwację zmian morfologicznych komórek w obecności polimeru z wykorzystaniem mikroskopu kontrastowo-fazowego. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 3.

T a b e l a 3

Wyniki testów cytotoksyczności i cytopatyczności

Linia komórkowa	HTCC CC50^ab	HM-HTCC CC50^ac
LR-7	> 100 pg/ml	> 100 pg/ml

° CC₅₀ oznacza cytotoksyczność polimeru na poziomie 50% dla zastosowanego stężenia.

Wyniki uzyskane z przeprowadzonego pomiaru były spójne z obserwacjami dotyczącymi zmian morfologii komórek.

Zbadano zahamowanie replikacji koronawirusa MHV za pomocą polimerów HTCC oraz HM-HTCC. Eksperyment przeprowadzono poprzez zakażenie komórek wrażliwych (linia LR7) wirusem MHV w obecności polimerów. Komórki przez cały czas znajdowały się w pożywce zdefiniowanej DMEM

PL 225 045 B1 z dodatkiem 3% surowicy bydlęcej. Po dwóch godzinach inkubacji komórek z wirusem pożywka została ściągnięta, a następnie nałożona została świeża pożywka (DMEM z dodatkiem 3% surowicy bydlęcej) zawierająca polimer HTCC lub HM-HTCC. Obserwację zmian morfologicznych przeprowadzono z wykorzystaniem mikroskopu kontrastowo-fazowego po 48 godzinach inkubacji. W obecności obu polimerów w stężeniu 100 μg/ml zaobserwowano zahamowanie replikacji wirusa i brak efektu cytopatycznego (fig. 8).

Zbadano także wpływ polimerów HTCC oraz HM-HTCC na replikację wirusa MHV z wykorzystaniem pomiaru liczby kopii RNA w pożywce poprzez analizę RT-PCR w czasie rzeczywistym. Zastosowano w tym celu metodę ilościową z wykorzystaniem starterów 5' MHV_NF TGG CCG AAG AAA TTG CTG CTC TTG, 3' MHV_NR GCC TGA CTT CTT TGG CAC TTT GCT oraz sondy fluorescencyjnej FAM/TAMRA MHV_Np TTT GGC TAA GCT CGG TAA AGA TGC CG. Reakcje przeprowadzono w warunkach identycznych do opisanych uprzednio (Pyrc K. et al. (2006). Antimicrob Agents Chemother 50: 2000-2008). W badaniu inkubowano komórki LR7 przez 48 godzin w medium zdefiniowanym DMEM z dodatkiem 3% surowicy bydlęcej. Przy zakażeniu, po 2 godzinach inkubacji komórek z wirusem pożywka została ściągnięta, a następnie nałożona została świeża pożywka (DMEM z dodatkiem 3% surowicy bydlęcej) zawierająca polimer HTCC lub HM-HTCC. Po zakończonej inkubacji całkowite RNA zostało wyizolowane z nadsączów komórkowych i po reakcji odwrotnej transkrypcji wykorzystane jako matryca dla reakcji PCR. Podobnie jak w przypadku analizy zahamowania efektu cytopatycznego wywoływanego przez replikację MHV, zaobserwowano, że polimery HTCC oraz HMHTCC spowodowały zahamowanie namnażania wirusa MHV, podczas gdy w próbce kontrolnej stwierdzono normalną replikację (fig. 9).

Claims

1. Zastosowanie polimeru chitozanowego o wzorze I, w którym R oznacza H lub/i COCH₃ lub/i grupę hydrofobową będącą grupą alifatyczną o liczbie atomów węgla w zakresie od 8 do 16, do w ytwarzania leków do leczenia i profilaktyki infekcji wywołanych przez koronawirusy.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że polimer służy do wytwarzania leków do leczenia i profilaktyki infekcji wywołanych przez alfakoronawirusy.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że polimer służy do wytwarzania leków do leczenia i profilaktyki infekcji wywołanych przez HCoV-NL63.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że polimer służy do wytwarzania leków do leczenia i profilaktyki infekcji wywołanych przez betakoronawirusów.

5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że polimer służy do wytwarzania leków do leczenia i profilaktyki infekcji wywołanych przez mysiego koronawirusa MHV.

6. Zastosowanie według zastrz. od 1 do 5, znamienne tym, że polimer służy do wytwarzania leków do leczenia i profilaktyki infekcji dróg oddechowych objawiających się niewydolnością i upośledzeniem prawidłowych czynności oddechowych u ludzi lub zwierząt.

7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że polimer służy do wytwarzania leków do leczenia i profilaktyki infekcji wybranych z grupy:

1) infekcji górnych dróg oddechowych,

2) infekcji dolnych dróg oddechowych,

3) dławca u dzieci,

4) zakażeń układu pokarmowego,

5) zakażeń układu nerwowego

6) choroby Kawasaki'ego.

8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że grupą hydrofobową jest grupa n-dodecylowa.

9. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że polimery chitozanowe stosuje się w postaci roztworu lub aerozolu podawanego do dróg oddechowych.