PL229352B1 - Zastosowanie modyfikowanej anionowo polialliloaminy jako leku do blokowania replikacji ludzkiego rinowirusa (HRV) oraz profilaktyki i leczenia wywołanych nim infekcji dróg oddechowych - Google Patents
Zastosowanie modyfikowanej anionowo polialliloaminy jako leku do blokowania replikacji ludzkiego rinowirusa (HRV) oraz profilaktyki i leczenia wywołanych nim infekcji dróg oddechowychInfo
- Publication number
- PL229352B1 PL229352B1 PL413055A PL41305515A PL229352B1 PL 229352 B1 PL229352 B1 PL 229352B1 PL 413055 A PL413055 A PL 413055A PL 41305515 A PL41305515 A PL 41305515A PL 229352 B1 PL229352 B1 PL 229352B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hrv
- human rhinovirus
- treatment
- anionically modified
- derivative
- Prior art date
Links
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 title claims abstract description 47
- 229920000083 poly(allylamine) Polymers 0.000 title claims abstract description 39
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 title claims description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 title description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 7
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 title 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 title 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 22
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000004483 ATR-FTIR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 229920002518 Polyallylamine hydrochloride Polymers 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 2
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCHIOGFOPPOUJC-UHFFFAOYSA-N (methylpyridazine piperidine ethyloxyphenyl)ethylacetate Chemical compound C1=CC(C(=O)OCC)=CC=C1OCCC1CCN(C=2N=NC(C)=CC=2)CC1 KCHIOGFOPPOUJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFBVWCHTNQHZLT-UHFFFAOYSA-N 4-methoxy-5-[3-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-(phenylcarbamoyl)tetrazol-3-ium-2-yl]-2-nitrobenzenesulfonate Chemical compound COC1=CC([N+]([O-])=O)=C(S([O-])(=O)=O)C=C1N1[N+](C=2C(=CC(=C(C=2)S(O)(=O)=O)[N+]([O-])=O)OC)=NC(C(=O)NC=2C=CC=CC=2)=N1 CFBVWCHTNQHZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VVJKKWFAADXIJK-UHFFFAOYSA-N Allylamine Chemical group NCC=C VVJKKWFAADXIJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037874 Asthma exacerbation Diseases 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000015271 Intercellular Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 208000037656 Respiratory Sounds Diseases 0.000 description 1
- 206010061494 Rhinovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010047924 Wheezing Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002128 anti-rhinoviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000000959 ear middle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical class N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- DXASQZJWWGZNSF-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylmethanamine;sulfur trioxide Chemical compound CN(C)C.O=S(=O)=O DXASQZJWWGZNSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009057 passive transport Effects 0.000 description 1
- 229950011136 pirodavir Drugs 0.000 description 1
- KQOXLKOJHVFTRN-UHFFFAOYSA-N pleconaril Chemical compound O1N=C(C)C=C1CCCOC1=C(C)C=C(C=2N=C(ON=2)C(F)(F)F)C=C1C KQOXLKOJHVFTRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000471 pleconaril Drugs 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- -1 small molecule compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000001174 sulfone group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest modyfikowana anionowo pochodna polialliloaminy (NSPAH) o wzorze 1, w którym każdy podstawnik R jest niezależnie wybrany spośród takich jak -SO3 - i -H i co najmniej jeden podstawnik R oznacza grupę -SO3 -, a n oznacza liczbę całkowitą od 150 do 15000, do zastosowania jako lek do profilaktyki i/lub leczenia infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzkiego rinowirusa (HRV). Ujawniono również kompozycję farmaceutyczną zawierającą modyfikowaną anionowo pochodną polialliloaminy i jej zastosowanie.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie modyfikowanej anionowo polialliloaminy (ang. N-sulfate poly(allylamine)), jako leku do hamowania replikacji ludzkiego rinowirusa (HRV), który powoduje infekcje dróg oddechowych, oraz profilaktyki i leczenia wywołanych nim infekcji dróg oddechowych.
Ludzki rinowirus (Humań Rhinovirus, HRV) należy do rodziny Picornaviridae. Wirusy te nie posiadają otoczki glikoproteinowej, a ich materiał genetyczny stanowi pojedyncza nić RNA o dodatniej polarności. Wriony HRV stanowią jedne z najmniejszych znanych wirusów, a ich średnica nie przekracza 30 nm. W ciągu roku, zwłaszcza w okresie jesieni i wiosny, wywołują u ludzi infekcje górnych dróg oddechowych, objawiające się przeziębieniem. Jak podaje portal medyczny Medscape, są przyczyną aż 25-80% wszystkich przypadków zachorowań. Mimo iż kojarzone głównie z przeziębieniem, rinowirusy wywołują również zapalenie ucha środkowego, zatok, dolnych dróg oddechowych, w tym oskrzelików, oskrzeli i płuc1. U dzieci mogą powodować również świszczący oddech i zaostrzenia astmy12.
Mimo iż wirusy te są przyczyną tak częstych infekcji górnych dróg oddechowych u ludzi, nie jest możliwe opracowanie skutecznej szczepionki, która zapobiegałaby zakażeniom wywołanym przez te wirusy. Problem stanowi fakt, iż ludzkie rinowirusy występują w bardzo wielu serotypach (znanych jest ponad 100 serotypów HRV3). Obecnie nie są też znane komercyjnie dostępne leki, które hamowałyby replikację ludzkich rinowirusów. Literatura wskazuje możliwość stosowania interferonu a-2b - glikoproteiny, której działanie opiera się na wzmocnieniu odpowiedzi immunologicznej organizmu, lub rekombinowanego białka ICAM-1, będącego syntetycznym analogiem receptorów na powierzchni komórek gospodarza, które wirusy wykorzystują do przyłączenia się do tych komórek4. Najbardziej obiecującymi inhibitorami replikacji HRV wydawały się być syntetyczne związki małocząsteczkowe: Pleconaril i Pirodavir5. Związki te przyłączały się do hydrofobowej części kapsydu wirionów HRV, co uniemożliwiało późniejsze uwolnienie wirusowego RNA, a tym samym rozpoczęcie cyklu replikacji wirusa. Niestety ze względu na skutki uboczne, które wywoływały, substancje te nie zostały zaakceptowane przez Agencję Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) do doustnego leczenia przeziębień6. Grassauer i wsp. w swojej pracy wykazali, że aktywność przeciwrinowirusową wykazuje iota-karagen, który należy do grupy polisacharydów zawierających grupy siarczanowe. Autorzy ci w swojej pracy sugerują, że iota-karagen mógłby znaleźć zastosowanie również w profilaktyce i leczeniu przeziębień wywołanych rinowirusami7, jednakże ze względu na silną tendencję do tworzenia żeli i wynikającą z niej słabą rozpuszczalność, przydatność karagenanów jako środków przeciwrinowirusowych wydaje się być ograniczona.
Celem niniejszego wynalazku było opracowanie substancji hamującej replikację ludzkiego rinowirusa (HRV), która znajdzie zastosowanie w profilaktyce lub terapii infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzkie rinowirusy (HRV).
Nieoczekiwanie stwierdzono, że cel ten realizuje modyfikowana anionowo poprzez podstawienie atomu wodoru w grupie aminowej grupą sulfonową pochodna polialliloaminy (NSPAH) o przedstawionym poniżej Wzorze 1.
HN---R
Wzór 1. Modyfikowana anionowo polialliloamina NSPAH w którym każdy podstawnik R jest niezależnie wybrany spośród takich jak -SOs i -H i co najmniej jeden podstawnik R oznacza grupę -SOs', a n oznacza liczbę całkowitą od 150 do 15000.
A zatem przedmiotem niniejszego wynalazku jest modyfikowana anionowo pochodna polialliloaminy (NSPAH) o Wzorze 1
PL 229 352 Β1
HN---R
Wzór 1 w którym każdy podstawnik R jest niezależnie wybrany spośród takich jak -SOs i -H i co najmniej jeden podstawnik R oznacza grupę -SOs', a n oznacza liczbę całkowitą od 150 do 15000, do zastosowania jako lek do profilaktyki i/lub leczenia infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzki rinowirus (HRV).
Korzystnie, modyfikowana anionowo pochodna polialliloaminy ma postać soli sodowej.
Następnie, przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że jako substancję czynną zawiera modyfikowaną anionowo pochodną polialliloaminy, do zastosowania jako lek do profilaktyki i/lub leczenia infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzki rinowirus (HRV).
Korzystnie, wyżej wymieniona kompozycja ma postać roztworu lub aerozolu podawanego do górnych dróg oddechowych.
Wynalazek dotyczy także zastosowania modyfikowanej anionowo pochodnej polialliloaminy według wynalazku do wytwarzania leku do profilaktyki i/lub leczenia infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzki rinowirus (HRV).
Korzystnie, modyfikowaną anionowo pochodną polialliloaminy według wynalazku stosuje się do wytwarzania leku w postaci roztworu lub aerozolu podawanego do górnych dróg oddechowych.
Zwięzły opis figur rysunku
Na fig. 1 Widma FTIR-ATR polialliloaminy przed (PAH-15-0 - linia ciągła) i po modyfikacji grupami sulfonowymi (NSPAH-15-95, NSPAH-56-98 oraz NSPAH-65-89 - linie przerywane).
Na fig. 2 przedstawiono cytotoksyczność modyfikowanych anionowo polialliloamin wobec komórek MDCK (komórki nerki psa).
Na fig. 3 przedstawiono hamowanie replikacji ludzkiego rinowirusa (HRV) przez modyfikowane anionowo pochodne polialliloamin, zależne od stężenia oraz masy cząsteczkowej badanych polimerów.
Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach stosowania.
Przykład 1.
Synteza i charakterystyka fizykochemiczna anionowej pochodnej polialliloaminy (NSPAH)
Reakcja modyfikacji polialliloaminy, przedstawiona na poniższym schemacie była stosowana wcześniej do otrzymania N-sulfonowej pochodnej chitozanu8.
nh2 hn.........R r = soj or — H
Reakcja otrzymywania N-sulfonowej pochodnej polialliloaminy (NSPAH).
g chlorowodorku polialliloaminy (PA-15-0) o masie cząsteczkowej Mw ~15 kDa lub 2,45 ml 20% roztworu polialliloaminy (PA-65-0) o masie cząsteczkowej Mw ~65 kDa odpowiednio rozpuszczono lub zmieszano z 25 ml wody destylowanej, a następnie dodano 1,85 g węglanu sodu i mieszano mieszadłem magnetycznym przez 45 min w celu odblokowania grup aminowych. W tym czasie mieszaninę odgazowano przepuszczając przez nią azot, po czym dodano odpowiednią ilość (tabela 1) kompleksu trójtlenku siarki i trimetyloaminy (STTC). Reakcję prowadzono przez 48 h w temperaturze 55 °C mieszając mieszaninę reakcyjną przy użyciu mieszadła magnetycznego. Po upływie tego czasu mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury pokojowej i dializowano względem wody przez 7 dni. Otrzymane polimery wyizolowano z roztworów poprzez wymrażanie w liofilizatorze przez 48 godzin.
PL 229 352 Β1
Strukturę anionowo zmodyfikowanych polialliloamin potwierdzają widma FTIR-ATR (fig. 1). Wartości stopni podstawienia (DS) zestawiono w tabeli 1.
W widmach FTIR-ATR zmodyfikowanych polialliloamin pojawiają się pasma przy 631662, 1044-1086 i 1211-1198 cm1, charakterystyczne dla drgań rozciągających grup sulfonowych obecnych w zmodyfikowanej polialliloaminie.
Stopień podstawienia grupami sulfonowymi obliczono na podstawie wyników analizy elementarnej. Stopień podstawienia oraz potencjał zeta otrzymanych polimerów podano w tabeli 1.
Tabela 1. Warunki reakcji, skład oraz charakterystyka fizykochemiczna zsyntetyzowanych N-sulfonowych polialliloamin o wysokim stopniu podstawienia grupami sulfonowymi
| Polimer8 | Stosunek molowy STTC/grupy aminowe | DS [%]b | potencjał zeta [mV]c bufor PBS pH-7.4 | potencjał zeta [mV]c pożywka 0% DMEM |
| - | - | - | - | -5.1 + 0.5 |
| PAH-15-0 | - | 0 | +26.4 ±1.4 | +7.0 ±0.6 |
| PAH-65-0 | 0 | +4.3 ± 0.5 | ||
| NSPAH-15-95 | 5,0 | 95 | -11.510.4 | -15.2 + 0.6 |
| NSPAH-56-98 | 5,0 | 98 | -13.6 + 2.2 | -24.4 ± 1.6 |
| NSPAH-65-89 | 5,0 | 89 | -16.7 ± 0.8 | -30.0 ± 0.7 |
a Stopień podstawienia grupami sulfonowymi obliczony na podstawie analizy elementarnej. b DS oznacza liczbę grup sulfonowych na jednostkę alliloaminową c stężenie polimeru 0,5 mg/ml, temperatura 25 °C; średnia z 5 pomiarów
Przykład 2.
Cytotoksyczność badanych polimerów
Zbadano cytotoksyczność modyfikowanych anionowo polialliloamin wobec komórek LLC-MK2 (komórki nerki małpy Macaca mulatta) oraz komórek MDCK (komórki nerki psa) (fig. 2).
Cytotoksyczność określano na podstawie dwóch testów. Jednym z nich był test kolorymetryczny, którego zasada opiera się na zdolności enzymów mitochondrialnych (dehydrogenazy bursztynianowej) do redukcji barwnika ΧΤΤ (ang. (2,3-bis-(2-methoxy- 4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) do barwnych soli formazanu. Określenie liczby i kondycji komórek jest możliwe na postawie istnienia bezpośredniej zależności pomiędzy żywotnością komórek a ilością powstałego barwnika, którą 20 oblicza się poprzez pomiar absorbancji w maksimum absorpcji (450 nm) (fig. 2).
Ocenę żywotności komórek przeprowadzono również z wykorzystaniem czerwieni obojętnej (NR - neutral red). Test ten opiera się na zdolności przechodzenia czerwieni obojętnej do cytoplazmy na drodze transportu biernego. Barwnik ten ulega akumulacji w lizosomach żywych komórek. Odsetek żywych komórek obliczany jest po przeprowadzeniu lizy komórek i wykonaniu pomiarów absorpcji powstałych roztworów przy długości fali 540 nm (fig· 2).
W badaniach komórki LLC-MK2 inkubowano przez 6 dni w pożywce zdefiniowanej DMEM z dodatkiem surowicy, zawierającej badane sulfonowe pochodne polialliloaminy we wzrastających stężeniach.
Po tym czasie efekt cytotoksyczności badanych substancji określony został zgodnie z wyżej opisanymi metodami. Ponadto przeprowadzono obserwację zmian morfologicznych komórek w obecności polimerów z wykorzystaniem mikroskopu kontrastowo-fazowego. Dla żadnego z badanych polimerów nie osiągnięto cytotoksyczności na poziomie 50% dla zastosowanych stężeń tj. 5000, 2500, 1250 oraz
PL 229 352 Β1
625 pg/ml. Oznacza to, że badane sulfonowe polialliloaminy nie są toksyczne dla komórek LLC-MK2 ani MDCKw badanym zakresie stężeń.
Wyniki uzyskane z przeprowadzonych pomiarów były spójne z obserwowanym brakiem zmian w morfologii komórek.
Przykład 3.
Wpływ badanych polimerów na zahamowanie efektu cytopatycznego (CPE) wywoływanego przez replikację ludzkiego rinowirusa (HRV)
Zbadano zahamowanie replikacji rinowirusa przez modyfikowane anionowo polialliloaminy o masach cząsteczkowych 15 kDa, 56 kDa oraz 65 kDa i wysokim stopniu podstawienia grupami sulfonowymi, odpowiednio 95%, 98% oraz 89%.
Eksperyment przeprowadzono poprzez zakażenie komórek wrażliwych - linia HeLa - rinowirusem w obecności polimerów we wzrastających stężeniach. Komórki przez cały czas znajdowały się w pożywce zdefiniowanej DMEM bez dodatku surowicy. Po dwóch godzinach inkubacji w temperaturze 32°C niezwiązane wiriony zostały odpłukane poprzez 3-krotnie przemycie komórek roztworem PBS, a następnie nałożone zostały roztwory polimerów w odpowiednich stężeniach. Zainfekowane komórki inkubowano w temperaturze 32°C przez 2 dni aż do pojawienia się CPE na skutek zakażenia wirusem HRV.
Po zadanym czasie inkubacji obserwację zmian morfologicznych przeprowadzono z wykorzystaniem mikroskopu kontrastowo-fazowego. Zahamowanie replikacji wirusa HRV objawiające się nieobecnością CPE zaobserwowano przy stężeniach polimerów równych 1,0 mg/ml (tabela 2).
Tabela 2.Wartości stężeń polimerów, powyżej których zaobserwowano zahamowanie replikacji wirusa HRV objawiające się nieobecnością CPE.
| Wirus | Polimer | Stężenie polimeru, powyżej którego | nie obserwowano CPE [mg/ml] |
| NSPAH-15-95 | 1.0 | |
| HRV | NSPAH-56-98 | I 1.0 |
| NSPAH-65-89 | I 1.0 |
Badanie wpływu modyfikowanych anionowo polialliloamin na replikację wirusa HRV w komórkach HeLa z wykorzystaniem analizy RT-qPCR z analizą w czasie rzeczywistym.
Zbadano wpływ modyfikowanych anionowo polialliloamin na replikację wirusa HRV z wykorzystaniem pomiaru liczby kopii RNA w pożywce poprzez analizę RT-qPCR w czasie rzeczywistym (ang. reverse transcription quantitative polymerase Chain reaction). W badaniu inkubowano komórki HeLa przez 2 dni w medium zdefiniowanym DMEM bez dodatku surowicy. Komórki zakażono wirusem HRV w dawce TClDso = 400 w obecności polimerów. Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 32°C, pożywka została ściągnięta, komórki przemyto trzykrotnie roztworem PBS, a następnie nałożona została świeża pożywka zawierająca polimery w odpowiednich stężeniach. Kontynuowano inkubację przez 2 dni w temperaturze 32°C, po czym RNA zostało wyizolowane z nadsączów komórkowych. Po reakcji odwrotnej transkrypcji RNA wykorzystano jako matrycę dla reakcji PCR.
Eksperyment przeprowadzono dla wzrastających stężeń polimerów. Uzyskane wyniki przedstawiono na fig. 3. Spadek liczby kopii wirusowego RNA w próbce badanej względem próbki kontrolnej, LRV (z ang. Log Reduction Value), wyznaczono korzystając ze wzoru:
LVR = -log gdzie:
Ci - liczba kopii wirusowego RNA [kopie/ml] w próbce badanej dla danego stężenia badanego polimeru
Co - liczba kopii wirusowego RNA [kopie/ml] w próbce kontrolnej, tj. bez dodatku polimerowego inhibitora
PL 229 352 Β1
Na fig. 3 przedstawiono hamowanie replikacji ludzkiego rinowirusa (HRV) przez modyfikowane anionowo pochodne polialliloamin, zależne od stężenia oraz masy cząsteczkowej badanych polimerów.
Zaobserwowano, że sulfonowe polialliloaminy bardzo silnie hamują replikację ludzkiego rinowirusa (dawka polimerów w stężeniu 100 pg/ml powoduje spadek ilości wirusowego RNA w próbce do wartości niemierzalnie małej), podczas gdy w próbkach kontrolnych (bez dodatku polimerów) stwierdzono normalną replikację HRV.
Wykazano również zależność pomiędzy masą cząsteczkową N-sulfonowanych polialliloamin a ich działaniem antywirusowym wobec HRV. Z przeprowadzonych badań wynika, że działanie to jest tym silniejsze, im większa masa cząsteczkowa N- sulfonowej pochodnej polialliloaminy.
Literatura
1. Knipe, D. & Howley, P. Fields Virology. Sixth Edition. (2013).
2. Peltola, V. et ai. Clinical effects of rhinovirus infections. J. Clin. Virol. 43, 411414 (2008).
3. Rahamat-Langendoen, J. C., Riezebos-Brilman, a, Hak, E., Schólvinck, E. H. & Niesters, H. G. M. The significance of rhinovirus detection in hospitalized children: clinical, epidemiological and virological features. Clin. Microbiol. Infect. 19, E435-42 (2013).
4. Hayden, F. G. Advances in antivirals for non-influenza respiratory virus infections. Influenza OtherRespi. Viruses 7, 36-43 (2013).
5. Barnard, D. L. et ai. In Vitro Activity of Expanded-Spectrum Pyridazinyl Oxime Ethers Related to Pirodavir: Novel Capsid-Binding Inhibitors with Potent Antipicornavirus Activity. Antimicrob. Agents Chemother. 48,1766-1772 (2004).
6. Abed, Y. & Βοίνίη, G. Treatment of respiratory virus infections. AntMral Res. 70,1-16 (2006).
7. Grassauer, A. et al. lota-Carrageenan is a potent inhibitor of rhinovirus infection. Virol. J. 5, 107 (2008).
8. Holme, K. R. & Perlin, A. S. Chitosan N-sulfate. A water-soluble polyelectrolyte. Carbohydr. Res. 302, 7-12(1997).
Claims (6)
- Zastrzeżenia patentowe1. Modyfikowana anionowo pochodna polialliloaminy (NSPAH) o Wzorze 1Wzór 1 w którym każdy podstawnik R jest niezależnie wybrany spośród takich jak -SOs i -H i co najmniej jeden podstawnik R oznacza grupę -SOs', a n oznacza liczbę całkowitą od 150 do 15000, do zastosowania jako lek do profilaktyki i/lub leczenia infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzkiego rinowirusa (HRV).
- 2. Modyfikowana anionowo pochodna polialliloaminy według zastrz. 1, która ma postać soli sodowej.
- 3. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera zdefiniowaną w modyfikowaną anionowo pochodną polialliloaminyzdefiniowanej w zastrz. 1 do zastosowania jako lek do profilaktyki i/lub leczenia infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzkiego rinowirusa (HRV).
- 4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że ma postać roztworu lub aerozolu podawanego do górnych dróg oddechowych.
- 5. Zastosowanie N-sulfonowej pochodnej polialliloaminy zdefiniowanej w zastrz. 1 do wytwarzania leku do profilaktyki i/lub leczenia infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzkiego rinowirusa (HRV).PL 229 352 Β1
- 6. Zastosowanie według zastrz. 5, w którym modyfikowaną anionowo pochodną polialliloaminy zdefiniowana w zastrz. 1 stosuje się do wytwarzania leku w postaci roztworu lub aerozolu podawanego do górnych dróg oddechowych.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL413055A PL229352B1 (pl) | 2015-07-08 | 2015-07-08 | Zastosowanie modyfikowanej anionowo polialliloaminy jako leku do blokowania replikacji ludzkiego rinowirusa (HRV) oraz profilaktyki i leczenia wywołanych nim infekcji dróg oddechowych |
| EP15763979.0A EP3174908B1 (en) | 2014-07-29 | 2015-07-29 | Anionically modified n-sulfonic polyallylamine derivative, pharmaceutical composition comprising the n-sulfonic polyallylamine derivative as the active substance and use of the n-sulfonic polyallylamine derivative for the production of a medicine |
| US15/329,324 US20170216347A1 (en) | 2014-07-29 | 2015-07-29 | Anionically modified polyallylamine derivative, use of anionically modified polyallylamine derivative as medicine, particularly for propylaxis and treatment of infections of respiratory tract caused by human metapneumovirus (hmpv), human rhinoviruses (hrv), and infection by influenza virus type a (iav) and pharmaceutical composition comprising the anionically modified polyallylamine derivative |
| CA2955406A CA2955406A1 (en) | 2014-07-29 | 2015-07-29 | Anionically modified polyallylamine derivative, use of anionically modified polyallylamine derivative as medicine, particularly for propylaxis and treatment of infections of respiratory tract caused by human metapneumovirus (hmpv), human rhinoviruses (hrv), and infection by influenza virus type a (iav) and pharmaceutical composition comprising the... |
| PCT/IB2015/055727 WO2016016820A2 (en) | 2014-07-29 | 2015-07-29 | Anionically modified polyallylamine derivative, use of anionically modified polyallylamine derivative as medicine, particularly for propylaxis and treatment of infections of respiratory tract caused by human metapneumovirus (hmpv), human rhinoviruses (hrv), and infection by influenza virus type a (iav) and pharmaceutical composition comprising the anionically modified polyallylamine derivative |
| US15/792,962 US9925215B1 (en) | 2014-07-29 | 2017-10-25 | Anionically modified polyallylamine derivative, use of anionically modified polyallylamine derivative as medicine, particularly for propylaxis and treatment of infections of respiratory tract caused by human metapneumovirus (hMPV), human rhinoviruses (HRV), and infection by influenza virus type A (IAV) and pharmaceutical composition comprising the anionically modified polyallylamine derivative |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL413055A PL229352B1 (pl) | 2015-07-08 | 2015-07-08 | Zastosowanie modyfikowanej anionowo polialliloaminy jako leku do blokowania replikacji ludzkiego rinowirusa (HRV) oraz profilaktyki i leczenia wywołanych nim infekcji dróg oddechowych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL413055A1 PL413055A1 (pl) | 2017-01-16 |
| PL229352B1 true PL229352B1 (pl) | 2018-07-31 |
Family
ID=57756494
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL413055A PL229352B1 (pl) | 2014-07-29 | 2015-07-08 | Zastosowanie modyfikowanej anionowo polialliloaminy jako leku do blokowania replikacji ludzkiego rinowirusa (HRV) oraz profilaktyki i leczenia wywołanych nim infekcji dróg oddechowych |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL229352B1 (pl) |
-
2015
- 2015-07-08 PL PL413055A patent/PL229352B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL413055A1 (pl) | 2017-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Milewska et al. | Novel polymeric inhibitors of HCoV-NL63 | |
| KR101571571B1 (ko) | 황화 폴리사카라이드를 포함하는 항바이러스 조성물 | |
| KR101437708B1 (ko) | 항바이러스 조성물과 이의 이용 방법 | |
| JP6177893B2 (ja) | コロナウイルスに起因する感染の治療及び予防におけるキトサンポリマーの使用 | |
| WO2023197791A1 (zh) | 一种环状碳酸酯核苷类化合物及其应用 | |
| EP3487508B1 (en) | Virucidal compounds and uses thereof | |
| Ikeda et al. | In vitro and in vivo inhibition of ortho-and paramyxovirus infections by a new class of sulfonic acid polymers interacting with virus-cell binding and/or fusion | |
| WO2014056304A1 (zh) | 顺铂配合物及其制备方法 | |
| CN113491700B (zh) | 牛磺罗定在抗病毒中的应用 | |
| CN114748466B (zh) | Napyradiomycin类化合物在制备猪伪狂犬病病毒抑制剂中的应用 | |
| PL229352B1 (pl) | Zastosowanie modyfikowanej anionowo polialliloaminy jako leku do blokowania replikacji ludzkiego rinowirusa (HRV) oraz profilaktyki i leczenia wywołanych nim infekcji dróg oddechowych | |
| Khodsiani et al. | Evaluation of the antiviral potential of gemini surfactants against influenza virus H1N1 | |
| EL Bagoury et al. | Green synthesis of silver nanoparticles using green tea extract and evaluation of their antiviral potential against foot-and-mouth disease virus Serotype O: an in-vitro study | |
| RS60172B1 (sr) | Farmaceutska kompozicija u obliku oralne suspenzije, koja uključuje flavonoidnu frakciju i ksantan gumu | |
| CN108514564A (zh) | 具有抗h1n1流感病毒活性的阿比朵尔功能化纳米硒及其制备与应用 | |
| Eropkin et al. | Synthesis and biological activity of water-soluble polymer complexes of arbidol | |
| Jung et al. | Anti‐aids active polyrotaxane‐azt conjugates with bioactive bulky stoppers and their nanoparticles | |
| US20250332116A1 (en) | Carbon-based anti viral nanoparticles | |
| EP3174908B1 (en) | Anionically modified n-sulfonic polyallylamine derivative, pharmaceutical composition comprising the n-sulfonic polyallylamine derivative as the active substance and use of the n-sulfonic polyallylamine derivative for the production of a medicine | |
| PL228171B1 (pl) | N -sulfonowa pochodna polialliloaminy (NSPAH) do zastosowania w terapii i profilaktyce infekcji wywołanych przez ludzkie metapneumowirusy hMPV | |
| CN101791301A (zh) | 二烯丙基二硫醚在制备广谱抗病毒药物中的应用 | |
| RU2394618C2 (ru) | Водорастворимые полимерные комплексы арбидола | |
| CN116367843A (zh) | 病毒抑制剂 | |
| CN104721221B (zh) | 琼枝麒麟菜多糖用于制备抗呼吸道病毒药物中的用途 | |
| PL228503B1 (pl) | N-sulfonowa pochodna polialliloaminy (NSPAH) do zastosowania w terapii i profilaktyce infekcji wywołanych przez wirusy grypy typu A |