PL229352B1 - Zastosowanie modyfikowanej anionowo polialliloaminy jako leku do blokowania replikacji ludzkiego rinowirusa (HRV) oraz profilaktyki i leczenia wywołanych nim infekcji dróg oddechowych - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest modyfikowana anionowo pochodna polialliloaminy (NSPAH) o wzorze 1, w którym każdy podstawnik R jest niezależnie wybrany spośród takich jak -SO3 - i -H i co najmniej jeden podstawnik R oznacza grupę -SO3 -, a n oznacza liczbę całkowitą od 150 do 15000, do zastosowania jako lek do profilaktyki i/lub leczenia infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzkiego rinowirusa (HRV). Ujawniono również kompozycję farmaceutyczną zawierającą modyfikowaną anionowo pochodną polialliloaminy i jej zastosowanie.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie modyfikowanej anionowo polialliloaminy (ang. N-sulfate poly(allylamine)), jako leku do hamowania replikacji ludzkiego rinowirusa (HRV), który powoduje infekcje dróg oddechowych, oraz profilaktyki i leczenia wywołanych nim infekcji dróg oddechowych.

Ludzki rinowirus (Humań Rhinovirus, HRV) należy do rodziny Picornaviridae. Wirusy te nie posiadają otoczki glikoproteinowej, a ich materiał genetyczny stanowi pojedyncza nić RNA o dodatniej polarności. Wriony HRV stanowią jedne z najmniejszych znanych wirusów, a ich średnica nie przekracza 30 nm. W ciągu roku, zwłaszcza w okresie jesieni i wiosny, wywołują u ludzi infekcje górnych dróg oddechowych, objawiające się przeziębieniem. Jak podaje portal medyczny Medscape, są przyczyną aż 25-80% wszystkich przypadków zachorowań. Mimo iż kojarzone głównie z przeziębieniem, rinowirusy wywołują również zapalenie ucha środkowego, zatok, dolnych dróg oddechowych, w tym oskrzelików, oskrzeli i płuc¹. U dzieci mogą powodować również świszczący oddech i zaostrzenia astmy¹².

Mimo iż wirusy te są przyczyną tak częstych infekcji górnych dróg oddechowych u ludzi, nie jest możliwe opracowanie skutecznej szczepionki, która zapobiegałaby zakażeniom wywołanym przez te wirusy. Problem stanowi fakt, iż ludzkie rinowirusy występują w bardzo wielu serotypach (znanych jest ponad 100 serotypów HRV³). Obecnie nie są też znane komercyjnie dostępne leki, które hamowałyby replikację ludzkich rinowirusów. Literatura wskazuje możliwość stosowania interferonu a-2b - glikoproteiny, której działanie opiera się na wzmocnieniu odpowiedzi immunologicznej organizmu, lub rekombinowanego białka ICAM-1, będącego syntetycznym analogiem receptorów na powierzchni komórek gospodarza, które wirusy wykorzystują do przyłączenia się do tych komórek⁴. Najbardziej obiecującymi inhibitorami replikacji HRV wydawały się być syntetyczne związki małocząsteczkowe: Pleconaril i Pirodavir⁵. Związki te przyłączały się do hydrofobowej części kapsydu wirionów HRV, co uniemożliwiało późniejsze uwolnienie wirusowego RNA, a tym samym rozpoczęcie cyklu replikacji wirusa. Niestety ze względu na skutki uboczne, które wywoływały, substancje te nie zostały zaakceptowane przez Agencję Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) do doustnego leczenia przeziębień⁶. Grassauer i wsp. w swojej pracy wykazali, że aktywność przeciwrinowirusową wykazuje iota-karagen, który należy do grupy polisacharydów zawierających grupy siarczanowe. Autorzy ci w swojej pracy sugerują, że iota-karagen mógłby znaleźć zastosowanie również w profilaktyce i leczeniu przeziębień wywołanych rinowirusami⁷, jednakże ze względu na silną tendencję do tworzenia żeli i wynikającą z niej słabą rozpuszczalność, przydatność karagenanów jako środków przeciwrinowirusowych wydaje się być ograniczona.

Celem niniejszego wynalazku było opracowanie substancji hamującej replikację ludzkiego rinowirusa (HRV), która znajdzie zastosowanie w profilaktyce lub terapii infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzkie rinowirusy (HRV).

Nieoczekiwanie stwierdzono, że cel ten realizuje modyfikowana anionowo poprzez podstawienie atomu wodoru w grupie aminowej grupą sulfonową pochodna polialliloaminy (NSPAH) o przedstawionym poniżej Wzorze 1.

HN---R

Wzór 1. Modyfikowana anionowo polialliloamina NSPAH w którym każdy podstawnik R jest niezależnie wybrany spośród takich jak -SOs i -H i co najmniej jeden podstawnik R oznacza grupę -SOs', a n oznacza liczbę całkowitą od 150 do 15000.

A zatem przedmiotem niniejszego wynalazku jest modyfikowana anionowo pochodna polialliloaminy (NSPAH) o Wzorze 1

PL 229 352 Β1

HN---R

Wzór 1 w którym każdy podstawnik R jest niezależnie wybrany spośród takich jak -SOs i -H i co najmniej jeden podstawnik R oznacza grupę -SOs', a n oznacza liczbę całkowitą od 150 do 15000, do zastosowania jako lek do profilaktyki i/lub leczenia infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzki rinowirus (HRV).

Korzystnie, modyfikowana anionowo pochodna polialliloaminy ma postać soli sodowej.

Następnie, przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że jako substancję czynną zawiera modyfikowaną anionowo pochodną polialliloaminy, do zastosowania jako lek do profilaktyki i/lub leczenia infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzki rinowirus (HRV).

Korzystnie, wyżej wymieniona kompozycja ma postać roztworu lub aerozolu podawanego do górnych dróg oddechowych.

Wynalazek dotyczy także zastosowania modyfikowanej anionowo pochodnej polialliloaminy według wynalazku do wytwarzania leku do profilaktyki i/lub leczenia infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzki rinowirus (HRV).

Korzystnie, modyfikowaną anionowo pochodną polialliloaminy według wynalazku stosuje się do wytwarzania leku w postaci roztworu lub aerozolu podawanego do górnych dróg oddechowych.

Zwięzły opis figur rysunku

Na fig. 1 Widma FTIR-ATR polialliloaminy przed (PAH-15-0 - linia ciągła) i po modyfikacji grupami sulfonowymi (NSPAH-15-95, NSPAH-56-98 oraz NSPAH-65-89 - linie przerywane).

Na fig. 2 przedstawiono cytotoksyczność modyfikowanych anionowo polialliloamin wobec komórek MDCK (komórki nerki psa).

Na fig. 3 przedstawiono hamowanie replikacji ludzkiego rinowirusa (HRV) przez modyfikowane anionowo pochodne polialliloamin, zależne od stężenia oraz masy cząsteczkowej badanych polimerów.

Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach stosowania.

Przykład 1.

Synteza i charakterystyka fizykochemiczna anionowej pochodnej polialliloaminy (NSPAH)

Reakcja modyfikacji polialliloaminy, przedstawiona na poniższym schemacie była stosowana wcześniej do otrzymania N-sulfonowej pochodnej chitozanu⁸.

nh₂ hn.........R r = soj or — H

Reakcja otrzymywania N-sulfonowej pochodnej polialliloaminy (NSPAH).

g chlorowodorku polialliloaminy (PA-15-0) o masie cząsteczkowej Mw ~15 kDa lub 2,45 ml 20% roztworu polialliloaminy (PA-65-0) o masie cząsteczkowej Mw ~65 kDa odpowiednio rozpuszczono lub zmieszano z 25 ml wody destylowanej, a następnie dodano 1,85 g węglanu sodu i mieszano mieszadłem magnetycznym przez 45 min w celu odblokowania grup aminowych. W tym czasie mieszaninę odgazowano przepuszczając przez nią azot, po czym dodano odpowiednią ilość (tabela 1) kompleksu trójtlenku siarki i trimetyloaminy (STTC). Reakcję prowadzono przez 48 h w temperaturze 55 °C mieszając mieszaninę reakcyjną przy użyciu mieszadła magnetycznego. Po upływie tego czasu mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury pokojowej i dializowano względem wody przez 7 dni. Otrzymane polimery wyizolowano z roztworów poprzez wymrażanie w liofilizatorze przez 48 godzin.

PL 229 352 Β1

Strukturę anionowo zmodyfikowanych polialliloamin potwierdzają widma FTIR-ATR (fig. 1). Wartości stopni podstawienia (DS) zestawiono w tabeli 1.

W widmach FTIR-ATR zmodyfikowanych polialliloamin pojawiają się pasma przy 631662, 1044-1086 i 1211-1198 cm¹, charakterystyczne dla drgań rozciągających grup sulfonowych obecnych w zmodyfikowanej polialliloaminie.

Stopień podstawienia grupami sulfonowymi obliczono na podstawie wyników analizy elementarnej. Stopień podstawienia oraz potencjał zeta otrzymanych polimerów podano w tabeli 1.

Tabela 1. Warunki reakcji, skład oraz charakterystyka fizykochemiczna zsyntetyzowanych N-sulfonowych polialliloamin o wysokim stopniu podstawienia grupami sulfonowymi

Polimer8	Stosunek molowy STTC/grupy aminowe	DS [%]b	potencjał zeta [mV]c bufor PBS pH-7.4	potencjał zeta [mV]c pożywka 0% DMEM
-	-	-	-	-5.1 + 0.5
PAH-15-0	-	0	+26.4 ±1.4	+7.0 ±0.6
PAH-65-0		0	+4.3 ± 0.5
NSPAH-15-95	5,0	95	-11.510.4	-15.2 + 0.6
NSPAH-56-98	5,0	98	-13.6 + 2.2	-24.4 ± 1.6
NSPAH-65-89	5,0	89	-16.7 ± 0.8	-30.0 ± 0.7

^a Stopień podstawienia grupami sulfonowymi obliczony na podstawie analizy elementarnej. ^b DS oznacza liczbę grup sulfonowych na jednostkę alliloaminową ^c stężenie polimeru 0,5 mg/ml, temperatura 25 °C; średnia z 5 pomiarów

Przykład 2.

Cytotoksyczność badanych polimerów

Zbadano cytotoksyczność modyfikowanych anionowo polialliloamin wobec komórek LLC-MK2 (komórki nerki małpy Macaca mulatta) oraz komórek MDCK (komórki nerki psa) (fig. 2).

Cytotoksyczność określano na podstawie dwóch testów. Jednym z nich był test kolorymetryczny, którego zasada opiera się na zdolności enzymów mitochondrialnych (dehydrogenazy bursztynianowej) do redukcji barwnika ΧΤΤ (ang. (2,3-bis-(2-methoxy- 4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) do barwnych soli formazanu. Określenie liczby i kondycji komórek jest możliwe na postawie istnienia bezpośredniej zależności pomiędzy żywotnością komórek a ilością powstałego barwnika, którą 20 oblicza się poprzez pomiar absorbancji w maksimum absorpcji (450 nm) (fig. 2).

Ocenę żywotności komórek przeprowadzono również z wykorzystaniem czerwieni obojętnej (NR - neutral red). Test ten opiera się na zdolności przechodzenia czerwieni obojętnej do cytoplazmy na drodze transportu biernego. Barwnik ten ulega akumulacji w lizosomach żywych komórek. Odsetek żywych komórek obliczany jest po przeprowadzeniu lizy komórek i wykonaniu pomiarów absorpcji powstałych roztworów przy długości fali 540 nm (fig· 2).

W badaniach komórki LLC-MK2 inkubowano przez 6 dni w pożywce zdefiniowanej DMEM z dodatkiem surowicy, zawierającej badane sulfonowe pochodne polialliloaminy we wzrastających stężeniach.

Po tym czasie efekt cytotoksyczności badanych substancji określony został zgodnie z wyżej opisanymi metodami. Ponadto przeprowadzono obserwację zmian morfologicznych komórek w obecności polimerów z wykorzystaniem mikroskopu kontrastowo-fazowego. Dla żadnego z badanych polimerów nie osiągnięto cytotoksyczności na poziomie 50% dla zastosowanych stężeń tj. 5000, 2500, 1250 oraz

PL 229 352 Β1

625 pg/ml. Oznacza to, że badane sulfonowe polialliloaminy nie są toksyczne dla komórek LLC-MK2 ani MDCKw badanym zakresie stężeń.

Wyniki uzyskane z przeprowadzonych pomiarów były spójne z obserwowanym brakiem zmian w morfologii komórek.

Przykład 3.

Wpływ badanych polimerów na zahamowanie efektu cytopatycznego (CPE) wywoływanego przez replikację ludzkiego rinowirusa (HRV)

Zbadano zahamowanie replikacji rinowirusa przez modyfikowane anionowo polialliloaminy o masach cząsteczkowych 15 kDa, 56 kDa oraz 65 kDa i wysokim stopniu podstawienia grupami sulfonowymi, odpowiednio 95%, 98% oraz 89%.

Eksperyment przeprowadzono poprzez zakażenie komórek wrażliwych - linia HeLa - rinowirusem w obecności polimerów we wzrastających stężeniach. Komórki przez cały czas znajdowały się w pożywce zdefiniowanej DMEM bez dodatku surowicy. Po dwóch godzinach inkubacji w temperaturze 32°C niezwiązane wiriony zostały odpłukane poprzez 3-krotnie przemycie komórek roztworem PBS, a następnie nałożone zostały roztwory polimerów w odpowiednich stężeniach. Zainfekowane komórki inkubowano w temperaturze 32°C przez 2 dni aż do pojawienia się CPE na skutek zakażenia wirusem HRV.

Po zadanym czasie inkubacji obserwację zmian morfologicznych przeprowadzono z wykorzystaniem mikroskopu kontrastowo-fazowego. Zahamowanie replikacji wirusa HRV objawiające się nieobecnością CPE zaobserwowano przy stężeniach polimerów równych 1,0 mg/ml (tabela 2).

Tabela 2.Wartości stężeń polimerów, powyżej których zaobserwowano zahamowanie replikacji wirusa HRV objawiające się nieobecnością CPE.

Wirus	Polimer	Stężenie polimeru, powyżej którego | nie obserwowano CPE [mg/ml]
	NSPAH-15-95	1.0
HRV	NSPAH-56-98	I 1.0
	NSPAH-65-89	I 1.0

Badanie wpływu modyfikowanych anionowo polialliloamin na replikację wirusa HRV w komórkach HeLa z wykorzystaniem analizy RT-qPCR z analizą w czasie rzeczywistym.

Zbadano wpływ modyfikowanych anionowo polialliloamin na replikację wirusa HRV z wykorzystaniem pomiaru liczby kopii RNA w pożywce poprzez analizę RT-qPCR w czasie rzeczywistym (ang. reverse transcription quantitative polymerase Chain reaction). W badaniu inkubowano komórki HeLa przez 2 dni w medium zdefiniowanym DMEM bez dodatku surowicy. Komórki zakażono wirusem HRV w dawce TClDso = 400 w obecności polimerów. Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 32°C, pożywka została ściągnięta, komórki przemyto trzykrotnie roztworem PBS, a następnie nałożona została świeża pożywka zawierająca polimery w odpowiednich stężeniach. Kontynuowano inkubację przez 2 dni w temperaturze 32°C, po czym RNA zostało wyizolowane z nadsączów komórkowych. Po reakcji odwrotnej transkrypcji RNA wykorzystano jako matrycę dla reakcji PCR.

Eksperyment przeprowadzono dla wzrastających stężeń polimerów. Uzyskane wyniki przedstawiono na fig. 3. Spadek liczby kopii wirusowego RNA w próbce badanej względem próbki kontrolnej, LRV (z ang. Log Reduction Value), wyznaczono korzystając ze wzoru:

LVR = -log gdzie:

Ci - liczba kopii wirusowego RNA [kopie/ml] w próbce badanej dla danego stężenia badanego polimeru

Co - liczba kopii wirusowego RNA [kopie/ml] w próbce kontrolnej, tj. bez dodatku polimerowego inhibitora

PL 229 352 Β1

Na fig. 3 przedstawiono hamowanie replikacji ludzkiego rinowirusa (HRV) przez modyfikowane anionowo pochodne polialliloamin, zależne od stężenia oraz masy cząsteczkowej badanych polimerów.

Zaobserwowano, że sulfonowe polialliloaminy bardzo silnie hamują replikację ludzkiego rinowirusa (dawka polimerów w stężeniu 100 pg/ml powoduje spadek ilości wirusowego RNA w próbce do wartości niemierzalnie małej), podczas gdy w próbkach kontrolnych (bez dodatku polimerów) stwierdzono normalną replikację HRV.

Wykazano również zależność pomiędzy masą cząsteczkową N-sulfonowanych polialliloamin a ich działaniem antywirusowym wobec HRV. Z przeprowadzonych badań wynika, że działanie to jest tym silniejsze, im większa masa cząsteczkowa N- sulfonowej pochodnej polialliloaminy.

Literatura

1. Knipe, D. & Howley, P. Fields Virology. Sixth Edition. (2013).

2. Peltola, V. et ai. Clinical effects of rhinovirus infections. J. Clin. Virol. 43, 411414 (2008).

3. Rahamat-Langendoen, J. C., Riezebos-Brilman, a, Hak, E., Schólvinck, E. H. & Niesters, H. G. M. The significance of rhinovirus detection in hospitalized children: clinical, epidemiological and virological features. Clin. Microbiol. Infect. 19, E435-42 (2013).

4. Hayden, F. G. Advances in antivirals for non-influenza respiratory virus infections. Influenza OtherRespi. Viruses 7, 36-43 (2013).

5. Barnard, D. L. et ai. In Vitro Activity of Expanded-Spectrum Pyridazinyl Oxime Ethers Related to Pirodavir: Novel Capsid-Binding Inhibitors with Potent Antipicornavirus Activity. Antimicrob. Agents Chemother. 48,1766-1772 (2004).

6. Abed, Y. & Βοίνίη, G. Treatment of respiratory virus infections. AntMral Res. 70,1-16 (2006).

7. Grassauer, A. et al. lota-Carrageenan is a potent inhibitor of rhinovirus infection. Virol. J. 5, 107 (2008).

8. Holme, K. R. & Perlin, A. S. Chitosan N-sulfate. A water-soluble polyelectrolyte. Carbohydr. Res. 302, 7-12(1997).

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Modyfikowana anionowo pochodna polialliloaminy (NSPAH) o Wzorze 1

   Wzór 1 w którym każdy podstawnik R jest niezależnie wybrany spośród takich jak -SOs i -H i co najmniej jeden podstawnik R oznacza grupę -SOs', a n oznacza liczbę całkowitą od 150 do 15000, do zastosowania jako lek do profilaktyki i/lub leczenia infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzkiego rinowirusa (HRV).
2. 2. Modyfikowana anionowo pochodna polialliloaminy według zastrz. 1, która ma postać soli sodowej.
3. 3. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera zdefiniowaną w modyfikowaną anionowo pochodną polialliloaminyzdefiniowanej w zastrz. 1 do zastosowania jako lek do profilaktyki i/lub leczenia infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzkiego rinowirusa (HRV).
4. 4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że ma postać roztworu lub aerozolu podawanego do górnych dróg oddechowych.
5. 5. Zastosowanie N-sulfonowej pochodnej polialliloaminy zdefiniowanej w zastrz. 1 do wytwarzania leku do profilaktyki i/lub leczenia infekcji dróg oddechowych wywołanych przez ludzkiego rinowirusa (HRV).

   PL 229 352 Β1
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, w którym modyfikowaną anionowo pochodną polialliloaminy zdefiniowana w zastrz. 1 stosuje się do wytwarzania leku w postaci roztworu lub aerozolu podawanego do górnych dróg oddechowych.