PL228171B1

PL228171B1 - N -sulfonowa pochodna polialliloaminy (NSPAH) do zastosowania w terapii i profilaktyce infekcji wywołanych przez ludzkie metapneumowirusy hMPV

Info

Publication number: PL228171B1
Application number: PL409015A
Authority: PL
Inventors: Maria Nowakowska; Krzysztof Szczubiałka; Krzysztof Pyrć; Krzysztof Pyrc; Justyna Ciejka; Aleksandra Milewska
Original assignee: Univ Jagielloński
Priority date: 2014-07-29
Filing date: 2014-07-29
Publication date: 2018-02-28
Also published as: PL409015A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest N-sulfonowa pochodna polialliloaminy (NSPAH) o wzorze 1, w którym R oznacza -SO3 albo -H, a n oznacza liczbę całkowitą od 150 do 15000, zastosowanie N-sulfonowej pochodnej polialliloaminy jako leku, zwłaszcza do profilaktyki i leczenia infekcji dróg oddechowych, wywołanych ludzkim metapneumowirusem (hMPV) oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca N-sulfonową pochodną polialliloaminy i jej zastosowanie.

Description

Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowana anionowo polialliloamina, N-sulfonowa pochodna polialliloaminy (NSPAH), do zastosowania w terapii i profilaktyce infekcji wywołanych przez ludzkie metapneumowirusy hMPV.

Ludzki metapneumowirus (hMPV) po raz pierwszy opisany w 2001 roku należy do rodziny Paramyxoviridae, podrodziny Pneumovinae z rodzaju Pneumovirus. Podobnie jak wirus grypy czy ludzki wirus RS (Humań Respiratory Syncytial Virus, hRSV) powoduje choroby układu oddechowego, jednakże o łagodniejszym przebiegu. hMPV odpowiedzialny jest za 7-8% wirusowych chorób układu oddechowego wśród dzieci i 2-3% wśród dorosłych [1], atakując urzęsione komórki nabłonka dróg oddechowych. Choroba wywołana ludzkim metapneumowirusem objawia się symptomami grypopodobnymi (katar, kaszel, gorączka). Wirus ten jest rozpowszechniony na wszystkich kontynentach, a najwyższą częstość występowania obserwuje się w okresie zimowym i wiosennym. Infekcja następuje drogą kropelkową [2], Cięższe objawy, włączając w to ciężkie zakażenia dolnych dróg oddechowych, stwierdza się głównie u dzieci i niemowląt poniżej piątego roku życia [1][2], oraz u ludzi starszych powyżej 60 roku życia i u osób z obniżonym poziomem odporności [2],

Jak podaje American Lung Association oraz najnowsze publikacje przeglądowe na ten temat, do tej pory nie został zatwierdzony do stosowania żaden lek, który by hamował lub zapobiegał infekcjom wywołanym przez hMPV [1,2,3,4,5]. Do 2012 roku jedynie rybawiryna ((Ι-β-D-ribofuranosyl1,2,4-triazole-3-carboxamide) - nukleozyd, analog guanozyny - wykazujący szeroki zakres działania przeciwko różnym wirusom (RNA, DNA) układu oddechowego [2,4,5] oraz immunoglobuliny [2,5] były stosowane do leczenia bardzo ostrych, ciężkich infekcji wywołanych wirusem hMPV wśród pacjentów po przeszczepie płuc. Jednakże były one stosowane wyłącznie w przypadkach krytycznych, ze względu na działania niepożądane i potencjalne działanie teratogenne [2,4],

Do tej pory ujawniono metodę hamowania replikacji hMPV dzięki działaniu peptydów, które wykazują silne powinowactwo do wirusowego białka fuzyjnego F, blokując tym samym cykl życiowy ludzkiego metapneumowirusa już na etapie fuzji do komórek gospodarza (zgłoszenie patentowe US20040229219A1, Method of inhibiting human metapneumovirus and human coronavirus in the prevention and treatment of severe acute respiratory syndrome (SARS), 2004r.). Inne dokumenty patentowe dotyczą zapobiegania i hamowania hMPV dzięki zastosowaniu odpowiednich przeciwciał lub rekombinowanych ludzkich metapneumowirusów (zastosowanie jako szczepionki).

Celem niniejszego wynalazku było opracowanie substancji hamującej replikację ludzkiego metapneumowirusa (hMPV), która znajdzie zastosowanie w profilaktyce czy też terapii infekcji wywołanych przez te wirusy w organizmach ludzi.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że cel ten realizuje N-sulfonowa pochodna polialliloaminy (NSPAH) o wzorze 1

HN-R

Wzór 1 w którym każdy R jest niezależnie wybrany spośród -SO3- i -H i co najmniej jeden R oznacza grupę -SO3-, a n oznacza liczbę całkowitą od 150 do 15000.

Korzystnie, N-sulfonowa pochodna polialliloaminy według wynalazku ma postać soli sodowej.

Korzystnie, N-sulfonowa pochodna polialliloaminy według wynalazku ma postać roztworu lub aerozolu podawanego do górnych dróg oddechowych.

Przedmiot wynalazku jest uwidoczniony na rysunku, na którym :

fig. 1 przedstawia widma FTIR-ATR polialliloaminy przed (PAH-15 - linia ciągła) i po modyfikacji NSPAH-15-30, NSPAH-15-97, NSPAH65-75, NSPAH-65-89 - linie przerywane), fig. 2a, 2b, 2c i 2d przedstawiają wyniki badania cytotoksyczności odpowiednio polimerów NSPAH-15-30, NSPAH-15-97, NSPAH-65-75 i NSPAH-65-89 na linii komórkowej LLC-MK2 wykonanego za pomocą testu ΧΤΤ oraz NR, zaś

PL228 171 Β1 fig. 3 przedstawia hamowanie replikacji ludzkiego metapneumowirusa (hMPV) przez N-sulfonowe pochodne polialliloamin według wynalazku, zależne od stężenia, stopnia podstawienia grupami sulfonowymi oraz masy cząsteczkowej badanych polimerów.

Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach stosowania.

Przykład 1

Synteza i charakterystyka fizykochemiczna anionowej pochodnej polialliloaminy (NSPAH)

Reakcja modyfikacji polialliloaminy, przedstawiona na Schemacie 1, była stosowana wcześniej do otrzymania N-sulfonowej pochodnej chitozanu [6],

r = —sc; iub -h

Schemat 1. Reakcja otrzymywania N-sulfonowej pochodnej polialliloaminy (NSPA).

0,5 g chlorowodorku polialliloaminy (PA-15) o masie cząsteczkowej Mw ~15 kDa lub 2,45 ml 20% roztworu polialliloaminy (PA-65) o masie cząsteczkowej Mw ~65 kDa rozpuszczono w 25 ml wody destylowanej, a następnie dodano 1,85 g węglanu sodu i mieszano mieszadłem magnetycznym przez 45 minut w celu odblokowania grup aminowych. W tym czasie mieszaninę odgazowano przepuszczając przez układ azot, po czym dodano odpowiednią ilość (Tabela 1) kompleksu trójtlenku siarki i trimetyloaminy (STTC). Reakcję prowadzono przez 48 godzin w temperaturze 55°C, mieszając mieszaninę reakcyjną przy użyciu mieszadła magnetycznego. Po upływie tego czasu mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury pokojowej i dializowano względem wody przez 7 dni. Otrzymane polimery wyizolowano z roztworów poprzez wymrażanie w liofilizatorze przez 48 godzin.

Strukturę anionowo zmodyfikowanych polialliloamin potwierdzają widma FTIR-ATR (fig. 1). Wartości stopni podstawienia zestawiono w Tabeli 1.

W widmach FTIR-ATR zmodyfikowanych polialliloamin pojawiają się pasma przy 631-662, 1044-1086 i 1211-1198 cm¹, charakterystyczne dla drgań rozciągających grup sulfonowych obecnych w zmodyfikowanej polialliloaminie.

Stopień podstawienia (DS) grupami sulfonowymi obliczono na podstawie wyników analizy elementarnej. Stopień podstawienia oraz potencjał zeta otrzymanych polimerów podano w Tabeli 1.

Tabela 1

Warunki reakcji, skład oraz charakterystyka fizykochemiczna zsyntetyzowanych N-sulfonowych polialliloamin

Polimer	Stosunek molowy STTC/grupy aminowe	DS [%]^a	potencjał zeta [mV]^h
PAH-15		0	+26,4 ± 1,4
PAH-65		0	+4,3 ± 0,5
NSPAH-15-30	0,8	30	-10,7 + 0,7
NSPAH-J5-97	5,0	95	-11,5 + 0,4
NSPAH65-75	1,8	75	-15,4 + 0,7
NSPAH-65-89	5,0	89	-16,7 + 0,8

^a Stopień podstawienia grupami sulfonowymi obliczony na podstawie analizy elementarnej. DS oznacza procent liczby grup aminowych podstawionych przez grupę sulfonową na jednostkę alliloaminową, a zatem np. DS = 30% oznacza, że w 30% grup aminowych w jednostkach alliloaminowych jeden atom H został zastąpiony grupą SO₃'.

^b stężenie polimeru 0,5 mg/ml, bufor PBS o pH = 7,4, temperatura 25°C; średnia z 5 pomiarów.

PL228 171 Β1

Przykład 2

Cytotoksyczność badanych polimerów

Zbadano cytotoksyczność N-sulfonowych polialliloamin na komórkach LLC-MK2 (komórki nabłonkowe z nerki małpy Macaca mulattó), które są wrażliwe na infekcję ludzkim metapneumowirusem (hMPV).

Cytotoksyczność określano na podstawie dwóch testów. Jednym z nich był test kolorymetryczny, którego działanie opiera się na zdolności enzymów mitochondrialnych (dehydrogenazy bursztynianowej) do redukcji barwnika ΧΤΤ (ang. (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) do barwnych soli formazanu. Określenie żywotności komórek jest możliwe na postawie względnej ilości powstałego barwnika, którą otrzymuje się poprzez pomiar absorbancji przy maksimum absorpcji (450 nm).

Ocenę żywotności komórek przeprowadzono również z wykorzystaniem czerwieni obojętnej. Test ten opiera się na zdolności przechodzenia czerwieni obojętnej (NR - neutral red) do cytoplazmy żywych komórek na drodze transportu biernego. Barwnik ten ulega akumulacji w lizosomach żywych komórek. Ocena żywotności komórek opiera się na analizie względnej ilości barwnika, który został przez żywe komórki wchłonięty, z wykorzystaniem pomiarów spektrofotometrycznych (absorbancja przy λ=540 nm).

W badaniach hodowano komórki LLC-MK2 przez 6 dni w pożywce zdefiniowanej DMEM bez dodatku surowicy, ale z dodatkiem trypsyny, zawierającej badane sulfonowe poliallioloaminy we wzrastających stężeniach. Po tym czasie efekt cytotoksyczności badanych substancji określony został zgodnie z wyżej opisanymi metodami. Ponadto, przeprowadzono obserwację zmian morfologicznych komórek w obecności polimerów z wykorzystaniem mikroskopu kontrastowo-fazowego. Dla żadnego z badanych polimerów nie osiągnięto cytotoksyczności na poziomie 50% dla zastosowanych stężeń tj. 5000, 2500, 1250 oraz 625 pg/ml. Innymi słowy badane sulfonowe polialliloaminy nie są toksyczne dla komórek LLC-MK2.

Na fig. 2a, 2b, 2c i 2d przedstawiono wyniki badania cytotoksyczności odpowiednio polimerów NSPAH-15-30, NSPAH-15-97, NSPAH-65-75 i NSPAH-65-89 na linii komórkowej LLC-MK2 wykonanego za pomocą testu ΧΤΤ oraz NR.

Wyniki uzyskane z przeprowadzonych pomiaru były spójne z obserwacjami dotyczącymi braku zmian morfologii komórek.

Przykład 3

Wpływ badanych polimerów na zahamowanie efektu cytopatycznego wywoływanego przez replikację ludzkiego metapneumowirusa (hMPV)

Zbadano zahamowanie replikacji ludzkiego metapneumowirusa przez sulfonowe polialliloaminy, przy czym zaobserwowano, że działanie antywirusowe było tym silniejsze, im wyższy był stopień podstawienia polialliloaminy grupami sulfonowymi oraz wyższa masa cząsteczkowa polimeru. Eksperyment przeprowadzono poprzez zakażenie komórek wrażliwych - linia LLC-MK2 - ludzkim metapneumowirusem w obecności polimerów we wzrastających stężeniach. Komórki przez cały czas znajdowały się w pożywce zdefiniowanej DMEM bez dodatku surowicy bydlęcej z dodatkiem trypsyny. Po dwóch godzinach inkubacji w temperaturze 37°C niezwiązane wiriony zostały odpłukane poprzez 3-krotnie przemycie komórek roztworem PBS, a następnie nałożone zostały roztwory polimerów w odpowiednich stężeniach. Zainfekowane komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 6 dni.

Po zadanym czasie inkubacji, obserwację zmian morfologicznych przeprowadzono z wykorzystaniem mikroskopu kontrastowo-fazowego. Zahamowanie replikacji wirusa IVA i hMPV oraz brak efektu cytopatycznego zaobserwowano przy stężeniach polimerów zebranych w Tabeli 2.

Tabela 2

Wartości stężeń polimerów, powyżej których zaobserwowano zahamowanie replikacji wirusa IVA i brak CPE.

Wirus	Polimer	Stężenie polimeru, przy którym nie obserwowano CPE ipg/mlj
hMPV	NSPAH-15-30	>2000
NSPAH-15-95	1000
NSPAH-65-75	500
NSPAH-65-89	500

PL228 171 Β1

Przykład 4

Badanie wpływu sulfonowych polialliloamin na replikację wirusa hMPV w komórkach LLC-MK2 z wykorzystaniem analizy RT-PCR z analizą w czasie rzeczywistym.

Zbadano wpływ sulfonowych polialliloamin na replikację wirusów hMPV z wykorzystaniem pomiaru liczby kopii RNA w pożywce poprzez analizę RT-qPCR w czasie rzeczywistym (ang. reverse transcription quantitative polymerase chain reaction). V\i badaniu inkubowano komórki LLC-MK2 przez 6 dni w pożywce zdefiniowanej DMEM bez dodatku surowicy bydlęcej z dodatkiem trypsyny. Zakażenie zostało przeprowadzone w obecności polimeru; po 2 godzinach inkubacji komórek z wirusem pożywka została ściągnięta, a następnie nałożona została świeża pożywka zawierająca polimery w odpowiednich stężeniach. Kontynuowano inkubację przez 6 dni. Po zakończonej inkubacji całkowite RNA zostało wyizolowane z nadsączów komórkowych. Po reakcji odwrotnej transkrypcji cDNA wykorzystywane było jako matryca dla reakcji PCR. Eksperyment przeprowadzono dla wzrastających stężeń polimerów. Uzyskane wyniki przedstawiono na fig. 3, ilustrującej zahamowanie replikacji ludzkiego metapneumowirusa (hMPV) przez N-sulfonowe pochodne polialliloamin, zależne od stężenia, stopnia podstawienia grupami sulfonowymi oraz masy cząsteczkowej badanych polimerów. Liczbę kopii wirusowego RNA wyrażono jako liczbę kopii RNA w 1 ml próbki.

Na podstawie przedstawionych zależności wyznaczono wartości stężeń N-sulfonowych polialliloamin, dla których następuje 50% zahamowanie replikacji ludzkiego metapneumowirusa (tzw. IC50). Wartości te zebrano w Tabeli 3. Zaobserwowano, że sulfonowe polialliloaminy spowodowały zahamowanie replikacji ludzkiego metapneumowirusa, podczas gdy w próbkach kontrolnych (bez dodatku polimerów) stwierdzono normalną replikację. Wykazano zależność pomiędzy stopniem podstawienia grupami sulfonowymi i masą cząsteczkową polialliloamin, a działaniem antywirusowym. Z przeprowadzonych badań wynika, że działanie to jest tym silniejsze im wyższa masa cząsteczkowa i wyższy stopień podstawienia polimeru.

Tabela 4

Wartości IC50 wyznaczone na podstawie wyników analizy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

Polimer	Stężenie polimeru dla IC50 [pg/ml]
PA-15
PA-65
NSPAH-15-30	335.2 ± 1.21
NSPAH-15-95	239.0 ±1.20
NSPAH-65-75	20.2 ± 1.02
NSPAH-65-89	12.9 ± 1.01

Literatura cytowana w opisie

[1] Ison, M., Johnston, S., Openshaw, P., Murphy, B., Hayden, F., Current research on respiratory viral infections: Fifth International Symposium 1, Antiviral Research, 2004, 62,75-110

[2] Feuillet, F., Lina, B., Rosa-Calatrava, Μ., Βοίνίη, G., Ten years of human metapneumovirus research., Journal of clinical virology : the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology, 2012, 53: 97-105

[3] http://www.lung.org/lung-disease/human-metapneumovirus/

[4] Ison, M. G., Antiviral therapies for respiratory viral infections in lung transplant patients, Antiviral therapy, 2012, 17, 193-200

[5] Nichols, W.G., Peck C., Angela L, Boeckh, M., Respiratory viruses otherthan influenza virus: impact and therapeutic advances, Clinical microbiology reviews, 2008, 21,274-290

[6] Holme K.R., Perlin A.S., Chitosan N-sulfate (1997). A water-soluble polyelectrolyte. Carbohydrate Research. 302, 7-12

Claims

1. N-sulfonowa pochodna polialliloaminy (NSPAH) o wzorze 1

Wzór 1 w którym każdy R jest niezależnie wybrany spośród -SO3 -H i co najmniej jeden R oznacza grupę -SO3, a n oznacza liczbę całkowitą od 150 do 15000, do zastosowania w terapii i profilaktyce infekcji wywołanych przez ludzkie metapneumowirusy hMPV.

2. N-sulfonowa pochodna polialliloaminy do zastosowania według zastrz. 1, która ma postać soli sodowej.

3. N-sulfonowa pochodna polialliloaminy do zastosowania według zastrz. 1, która ma postać roztworu lub aerozolu podawanego do górnych dróg oddechowych.