PL228503B1 - N-sulfonowa pochodna polialliloaminy (NSPAH) do zastosowania w terapii i profilaktyce infekcji wywołanych przez wirusy grypy typu A - Google Patents

Description

(21) Numer zgłoszenia: 409016 A61K 31/795 (2006.01)

A61P 31/16 (2006.01)

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 29.07.2014

N-sulfonowa pochodna polialliloaminy (NSPAH) do zastosowania w terapii i profilaktyce infekcji wywołanych przez wirusy grypy typu A (73) Uprawniony z patentu:

UNIWERSYTET JAGIELLOŃSKI, Kraków, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono:

01.02.2016 BUP 03/16 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.04.2018 WUP 04/18 (72) Twórca(y) wynalazku:

MARIA NOWAKOWSKA, Kraków, PL KRZYSZTOF SZCZUBIAŁKA, Krzywaczka, PL KRZYSZTOF PYRĆ, Kraków, PL

JUSTYNA CIEJKA, Mogilany, PL MAGDALENA WYTRWAŁ, Kraków, PL (74) Pełnomocnik:

rzecz, pat. Włodzimierz Gałązkiewicz co m

co

CM

CM

Q_

PL 228 503 Β1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowana anionowo polialliloamina, N-sulfonowa pochodna poiialliloaminy (NSPAH), do zastosowania w terapii i profilaktyce infekcji wywołanych przez wirusy grypy typu A.

Wirus grypy typu A (IAV) wywołuje infekcje dróg oddechowych o ostrym i ciężkim przebiegu. Jest to jeden z najbardziej istotnych klinicznie patogenów układu oddechowego. Infekcje wirusem grypy występują najczęściej w okresie zimowym (grypa sezonowa, największa zachorowalność w miesiącach styczeń-luty [1]). Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) szacuje zachorowania na grypę na 3-5 milionów przypadków rocznie, z czego umiera 250-500 tysięcy osób [2,3], Najcięższe zakażenia rozwijają się u dzieci poniżej drugiego roku życia, osób starszych powyżej 65 roku życia oraz osób o obniżonym poziomie odporności. WHO zaleca szczepienia przeciwko wirusowi grypy, jako najbardziej efektywny sposób zapobiegania zakażeniom [4], Pojawianie się nowych typów wirusa może prowadzić do rozwoju epidemii lub pandemii. Duża zmienność wirusa, trudności w szybkim uzyskaniu dostatecznej liczby szczepionek przed nadejściem fali epidemicznej oraz nie zawsze zadowalająca skuteczność szczepionki sprawiają, że w dalszym ciągu choroba ta stanowi ważny problem medyczny i epidemiologiczny.

Obecnie stosowane leki przeciwgrypowe wpływają na jeden z dwóch etapów cyklu replikacyjnego wirusa grypy, a mianowicie zaburzają etap usuwania otoczki białkowej wirusa po jego wniknięciu do komórki, poprzez blokowanie kanałów jonowych białka M2 (amantadyna i rimantadyna) lub hamują uwalnianie nowych cząstek wirusa z zainfekowanej komórki poprzez oddziaływanie na neuraminidazę (NA), białko otoczki wirusowej odpowiedzialne przede wszystkim za uwalnianie nowo powstałych cząstek wirusa grypy z zakażonych komórek (zanamivir i oseltamivir) [5-9], W osłonce wirusa grypy znajduje się również hemaglutynina (HA), glikoproteina, która odpowiada przede wszystkim za proces przyłączania i wnikania wirionów do wnętrza komórek nabłonkowych w drogach oddechowych, a zatem za inicjowanie infekcji. Do leków przeciwgrypowych blokujących hemaglutyninę należą leki wielkocząsteczkowe - peptydy i białka, np. peptyd EB (z ang. entry blocker), który specyficznie przyłącza się do HA, zapobiegając ponownemu zakażeniu. Peptyd NDFRSKT wykazuje silne działanie antywirusowe i, podobnie jak peptyd EB, hamuje aktywność HA. Zasada działania kolejnego peptydu, FLUDASE, jest inna, gdyż hamowanie odbywa się poprzez usunięcie receptora (reszty kwasu sial owego) z powierzchni komórek gospodarza, uniemożliwiając tym samym przyłączanie i wnikanie wirionów do komórki [9],

Niestety wysoka zmienność genetyczna prowadzi do szybkiej adaptacji patogenu do środowiska i pojawianie się szczepów odpornych na terapię. Przykładowo, inhibitory białka M2 praktycznie są już nieskuteczne i niestosowane. Podobnie, pojawiły się już szczepy wirusa grypy, które są odporne na dotychczas stosowane leki blokujące neuraminidazę, tj. oseltamivir i zanamivir. W związku z tym w Japonii i Korei Południowej pojawiły się niedawno w użyciu nowe inhibitory neurminidazy - laninamivir, favipiravir oraz peramivir. Laninamivir podawany wyłącznie wziewnie efektywnie hamuje infekcję wywołaną wirusami odpornymi na działanie oseltamiviru, natomiast peramivir podawany dożylnie, jest szczególnie użyteczny w leczeniu pacjentów zainfekowanych szczepem wirusa grypy odpornym na oseltamivir, którzy nie mogą przyjmować zanamiviru (np. pacjenci chorzy na astmę) [9],

W literaturze znaleźć można informacje, że również karageniany, oddziałują bezpośrednio z cząstkami wirusa grypy, uniemożliwiając jego adsorpcję i wniknięcie do komórek [8,10,11,12], Celem niniejszego wynalazku było opracowanie substancji hamującej replikację wirusa grypy A (IAV), która może znaleźć zastosowanie w profilaktyce czy też terapii infekcji wywołanych przez wirusy grypy u ludzi.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że cel ten realizuje N-sulfonowa pochodna polialliloaminy (NSPAH) o przedstawionym poniżej Wzorze 1.

HN-R

Wzór 1. N-sulfonowa polialliloamina NSPAH w którym każdy R jest niezależnie wybrany spośród -SO3- i -H i co najmniej jeden R oznacza grupę -SO3-, a n oznacza liczbę całkowitą od 150 do 15000.

Korzystnie, N-sulfonowa pochodna polialliloaminy według wynalazku ma postać soli sodowej.

PL 228 503 Β1

Korzystnie, N-sulfonowa pochodna polialliloaminy według wynalazku ma postać roztworu lub aerozolu podawanego do górnych dróg oddechowych.

Przedmiot wynalazku jest uwidoczniony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia widma FTIR-ATR polialliloaminy przed (ΡΑΗ-15-linia ciągła) i po modyfikacji (NSPAH-15-30, NSPAH-15-95, NSPAH65-75, NSPAH-65-89 - linie przerywane), fig. 2a, 2b, 2c i 2d przedstawiają wyniki badania cytotoksyczności odpowiednio polimerów NSPAH-15-30, NSPAH-15-95, NSPAH-65-75 i NSPAH-65-89 na linii komórkowej MDCK (psie komórki nerkowe Madin-Darby'ego) wykonanego za pomocą testu ΧΤΤ oraz NR, a fig. 3 przedstawia hamowanie replikacji wirusa grypy typu A (IAV) przez N-sulfonowe pochodne polialliloamin, zależne od stężenia, stopnia podstawienia grupami sulfonowymi oraz masy cząsteczkowej badanych polimerów.

Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony na poniższych przykładach.

Przykład 1

Synteza i charakterystyka fizykochemiczna anionowej pochodnej polialliloaminy (NSPAH) Reakcja modyfikacji polialliloaminy, przedstawiona na Schemacie 1, była stosowana wcześniej

do otrzymania N-sulfonowej pochodnej chitozanu [13],

Schemat 1. Reakcja otrzymywania N-sulfonowej pochodnej polialliloaminy (NSPAH).

0,5 g chlorowodorku polialliloaminy (PAH-15) o masie cząsteczkowej Mw ~15 kDa lub 2,45 ml 20% roztworu polialliloaminy (PAH-65) o masie cząsteczkowej Mw ~65 kDa rozpuszczono w 25 ml wody destylowanej, a następnie dodano 1,85 g węglanu sodu i mieszano mieszadłem magnetycznym przez 45 minut w celu odblokowania grup aminowych. W tym czasie mieszaninę odgazowano przepuszczając przez układ azot, po czym dodano odpowiednią ilość (tabela 1) kompleksu trójtlenku siarki i trimetyloaminy (STTC). Reakcję prowadzono przez 48 godzin w temperaturze 55°C mieszając mieszaninę reakcyjną przy użyciu mieszadła magnetycznego. Po upływie tego czasu mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury pokojowej i dializowano względem wody przez 7 dni. Otrzymane polimery wyizolowano z roztworów poprzez wymrażanie w liofilizatorze przez 48 godzin.

Strukturę anionowo zmodyfikowanych polialliloamin potwierdzają widma FTIR-ATR (fig. 1). Wartości stopni podstawienia zestawiono w tabeli 1.

W widmach FTIR-ATR zmodyfikowanych polialliloamin pojawiają się pasma przy 631-662, 1044-1086 i 1211-1198 cm¹, charakterystyczne dla drgań rozciągających grup sulfonowych obecnych w zmodyfikowanej polialliloaminie.

Stopień podstawienia (DS) grupami sulfonowymi obliczono na podstawie wyników analizy elementarnej. Stopień podstawienia oraz potencjał zeta otrzymanych polimerów podano w tabeli 1.

Tabela 1. Warunki reakcji, skład oraz charakterystyka fizykochemiczna zsyntetyzowanych N-sulfonowych polialliloamin

Polimer	Stosunek molowy STTC/grupy aminowe	DS [%]a	Potencjał zeta [mV]b
PAH-15		0	+26,4 ± 1,4
PAH-65		0	+4,3 ± 0,5
NSPAH-15-30	0,8	30	-10,7 + 0,7
NSPAH-15-95	5,0	95	-11,5 + 0,4
NSPAH-65-75	1,8	75	-15,4 + 0,7
NSPAH-65-89	5,0	89	-16,7 + 0,8

PL 228 503 B1 ^a Stopień podstawienia grupami sulfonowymi obliczony na podstawie analizy elementarnej. DS oznacza procent liczby grup aminowych podstawionych przez grupę sulfonową na jednostkę alliloaminową, a zatem np. DS = 30% oznacza, że w 30% grup aminowych jeden atom H został zastąpiony grupą -SO3·.

^b stężenie polimeru 0,5 mg/ml, bufor PBS o pH = 7,4, temperatura 25 °C; średnia z 5 pomiarów.

P r z y k ł a d 2.

Cytotoksyczność badanych polimerów

Zbadano cytotoksyczność N-sulfonowych polialliloamin na komórkach MDCK (psie komórki nabłonkowe z nerki Madin-Darby'ego) wrażliwych na infekcję wirusem grypy typu A (IAV). Cytotoksyczność określano na podstawie dwóch testów. Jednym z nich był test kolorymetryczny, którego działanie opiera się na zdolności enzymów mitochondrialnych (dehydrogenazy bursztynianowej) do redukcji barwnika XTT (ang. (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) do barwnych soli formazanu. Określenie żywotności komórek jest możliwe na postawie względnej ilości powstałego barwnika, którą określa się poprzez pomiar absorbancji przy długości fali 450 nm.

Ocenę żywotności komórek przeprowadzono również z wykorzystaniem czerwieni obojętnej. Test ten opiera się na zdolności przechodzenia czerwieni obojętnej (NR - neutral red) do cytoplazmy żywych komórek na drodze transportu biernego. Barwnik ten ulega akumulacji w lizosomach żywych komórek. Ocena żywotności komórek opiera się na analizie względnej ilości barwnika, który został przez żywe komórki wchłonięty, z wykorzystaniem pomiarów spektrofotometrycznych (absorbancja przy λ=540 nm).

W badaniach inkubowano komórki MDCK przez 2 dni w pożywce zdefiniowanej DMEM bez dodatku surowicy zawierającej badane N-sulfonowe pochodne polialliloaminy we wzrastających stężeniach. Po tym czasie cytotoksyczność badanych substancji określona została przy użyciu wyżej opisanych metod. Ponadto, przeprowadzono obserwację zmian morfologicznych komórek w obecności polimerów z wykorzystaniem mikroskopu kontrastowo-fazowego. Dla żadnego z badanych polimerów nie osiągnięto 50% poziomu cytotoksyczności w zakresie stężeń 625-5000 pg/ml. Wykazano więc, że badane N-sulfonowe pochodne polialliloaminy nie są toksyczne dla komórek MDCK.

Na fig. 2a, 2b, 2c i 2d przedstawiono wyniki badania cytotoksyczności odpowiednio polimerów NSPAH-15-30, NSPAH-15-95, NSPAH-65-75 i NSPAH-65-89 na linii komórkowej MDCK wykonane za pomocą testów XTT oraz NR.

Wyniki uzyskane z przeprowadzonych pomiarów były spójne z obserwacjami dotyczącymi braku zmian morfologii komórek.

P r z y k ł a d 3.

Wpływ badanych polimerów na efekt cytopatyczny wywoływany przez wirusa grypy typu A (IAV)

Wykazano zahamowanie replikacji wirusa grypy typu A przez N-sulfonowe pochodne polialliloaminy, przy czym zaobserwowano, że działanie antywirusowe było tym silniejsze, im wyższy był stopień podstawienia polialliloaminy grupami sulfonowymi oraz wyższa masa cząsteczkowa polimeru.

Eksperyment przeprowadzono poprzez zakażenie komórek wrażliwych (MDCK) w obecności wzrastających stężeń polimerów. Podczas infekcji wirusem IAV komórki znajdowały się w pożywce zdefiniowanej DMEM bez dodatku surowicy bydlęcej. Po dwóch godzinach inkubacji w temp. 37°C niezwiązane wiriony zostały odpłukane poprzez 3-krotnie przemycie komórek buforem PBS, a następnie nałożone na nie zostały roztwory polimerów w odpowiednich stężeniach. Zainfekowane komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 dni.

Po zadanym czasie inkubacji, obserwację zmian morfologicznych przeprowadzono z wykorzystaniem mikroskopu kontrastowo-fazowego. Zahamowanie replikacji wirusa IAV oraz brak efektu cytopatycznego (CPE, ang. cytopathic effecf) zaobserwowano już przy minimalnych stężeniach polimerów zebranych w tabeli 2.

T a b e l a 2. Wartości stężeń polimerów, powyżej których zaobserwowano zahamowanie replikacji wirusa IAY i brak CPE.

Polimer	Minimalne stężenie polimeru, przy którym znikał CPE [pg/ml]
NSPAH-15-30	1000
NSPAH-15-95	500
NSPAH-65-75	250
NSPAH-65-89	250

PL 228 503 B1

P r z y k ł a d 4.

Badanie wpływu N-sulfonowych pochodnych polialliloamin na replikację wirusów IAV w komórkach MDCK z wykorzystaniem analizy RT-PCR z analizą w czasie rzeczywistym. Zbadano wpływ N-sulfonowych pochodnych polialliloamin na replikację wirusów IAV z wykorzystaniem pomiaru liczby kopii RNA w pożywce poprzez analizę RT-qPCR w czasie rzeczywistym (ang. reverse transcription quantitative polymerase chain reaction). W badaniu inkubowano komórki MDCK w pożywce zdefiniowanej DMEM bez dodatku surowicy. Zakażenie zostało przeprowadzone w obecności polimeru; po 2 godzinach ściągnięto pożywkę, a następnie nałożona została świeża pożywka zawierająca polimery w odpowiednich stężeniach. Kontynuowano inkubację przez 2 dni. Po zakończonej inkubacji całkowite RNA zostało wyizolowane z nadsączów komórkowych. Po reakcji odwrotnej transkrypcji cDNA wykorzystywane było jako matryca dla reakcji PCR.

Eksperyment przeprowadzono dla wzrastających stężeń polimerów. Uzyskane wyniki przedstawiono na fig. 3, ilustrującej zahamowanie replikacji wirusa grypy typu A (IAV) przez N-sulfonowe pochodne polialliloamin, zależne od stężenia, stopnia podstawienia grupami sulfonowymi oraz masy cząsteczkowej badanych polimerów. Liczbę kopii wirusowego RNA wyrażono jako liczbę łańcuchów RNA w 1 ml próbki. Stężenia N-sulfonowych polialliloamin, przy których obserwowano 50% zahamowanie replikacji wirusa grypy typu A (tzw. IC50) zebrano w tabeli 3. Zaobserwowano, że N-sulfonowe pochodne polialliloaminy spowodowały zahamowanie replikacji wirusa grypy typu A, podczas gdy w próbkach kontrolnych (bez dodatku polimerów) stwierdzono normalną replikację. Wykazano zależność pomiędzy stopniem podstawienia grupami sulfonowymi i masą cząsteczkową N-sulfonowych pochodnych polialliloamin, a działaniem antywirusowym. Z przeprowadzonych badań wynika, że działanie to jest tym silniejsze, im wyższa masa cząsteczkowa i wyższy stopień podstawienia polimeru. Antywirusowych właściwości nie wykazywały niemodyfikowane polialliloaminy (PAH-15 oraz PAH-65), przy czym były silnie toksyczne dla komórek linii MDCK oraz LLC-MK2.

T a b e l a 3. Wartości IC50 wyznaczone na podstawie wyników analizy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

Polimer	Stężenie polimeru dla IC50 [pg/ml]
PAH-15
PAH-65
NSPAH-15-30	53.4 ± 1.7
NSPAH-15-95	4.5 ±2.1
NSPAH-65-75	0.5 ± 1.2
NSPAH-65-89	0.6 ±1.1

Literatura cytowana w opisie

[1] Ison, M., Johnston, S., Openshaw, P., Murphy, B., Hayden, F., Current research on respiratory viral infections: Fifth International Symposiuml, Antiviral Research, 2004, 62 (3): 75-110

[2] Influenza (seasonal) (www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/), World Health Organization, April 2009, Retrieved 1.08.2012

[3] Ballinger M.N., Standiford T.J., Postinfluenza bacterial pneumonia: host defenses gone awry, Journal of Interferon & Cytokine Research. September 2010, 30(9): 643-652

[4] Vaccine virus selection for the 2012-2012 influenza season (http://www.cdc.gov/flu/about/sea- son/vaccine-selection.htm), CDC publication updated 2 July 2012, Retrieved 8 August 2012

[5] Quigley E., Influenza therapies: vaccines and antiviral drugs, Drug Discovery Today, 2006, 11: 478-480

[6] Abed Y., Boivin G., Treatment of respiratory virus infections, Antiviral Research, 2006, 70: 116

PL 228 503 Β1

[7] Dreitlein W.B., Maratos J., Brocavich J., Zanamivir and oseltamivir: two new options for the treatment and prevention of influenza, Clinical Therapeutics, 2001,23: 327-355

[8] Leibbrandt A., et ak, lota-carrageenan is a potent inhibitor of influenza A virus infection, PLoS ONE, 2010, 5 (12): 14320

[9] BankS., New treatments for influenza, BMC medicine, 2012, 10: 104

[10] Wei W., Zhang P., et ak, Preparation and anti-influenza A virus activity of k-carrageenan oligosaccharide and its sulphate derivatives, Food Chemistry, 2012, 133: 880-888

[11] Hosoya M. et al., Differential inhibitory effect of sulfated polysaccharides and polymers on the replication of various myxoviruses and retroviruses, depending on the composition of the target amino acid sequances of the viral envelope glycoproteins, Antimicrobial agents and chemotherapy, 1991,35 (12): 2515-2520

[12] Ikeda S., Neyts J., et al., In vitro and in vivo inhibition of Ortho- and paramyxovirus infections by a new class of sulfonie acid polymers interacting with virus-cell binding and/or fusion, Antimicrobial agents and chemotherapy, 1993, 38 (2): 256-259

[13] Holme K.R., Perlin A.S., Chitosan N-sulfate (1997). A water-soluble polyelectrolyte. Carbohydrate Research. 302, 7-12

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. N-sulfonowa pochodna polialliloaminy (NSPAH) o wzorze 1
2. 2. w którym każdy R jest niezależnie wybrany spośród -SO3· i -H i co najmniej jeden R oznacza grupę -SO3-, a n oznacza liczbę całkowitą od 150 do 15000, do zastosowania w terapii i profilaktyce infekcji wywołanych przez wirusy grypy typu A.
3. 3. N-sulfonowa pochodna polialliloaminy do zastosowania według zastrz. 1, która ma postać soli sodowej.
4. 4. N-sulfonowa pochodna polialliloaminy do zastosowania według zastrz. 1, która ma postać roztworu lub aerozolu podawanego do górnych dróg oddechowych.