CN104321063A - 壳聚糖聚合物用于治疗和预防冠状病毒引起的感染的用途 - Google Patents

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Abstract

式（I）的壳聚糖聚合物HTCC和HM-TCC，其中R选自H，COCH3（HTCC）或选自H，COCH3，C12H25（HM-HTCC），具有用于治疗和预防冠状病毒引起的感染的用途。

Description

壳聚糖聚合物用于治疗和预防冠状病毒引起的感染的用途
本发明涉及壳聚糖聚合物通过抑制冠状病毒的复制而用于治疗其引起的感染的用途。属于冠状病毒家族的人类病毒引起的呼吸道感染表现为正确的呼吸功能的不足和损伤。一些冠状病毒也可以感染许多动物物种（包括蝙蝠，小鼠，大鼠，猫，狗，兔，马，牛，鸡，火鸡和野生鸟类），引起了广泛的疾病，其中影响呼吸系统、消化道、肝、心血管系统和中枢神经系统。
具体地，本发明包括壳聚糖聚合物，具有用于治疗人与动物的上呼吸道感染、下呼吸道感染、哮吼、胃肠感染、神经系统感染、肝感染、心血管系统感染和川崎病的用途。
冠状病毒是具有一个正义单链RNA形式的基因组的有包膜病毒。最初，根据血清学方法将冠状病毒家族分成三组。
随着分子技术的实施，该病毒家族被重新组织，目前它由α-，β-，γ-和δ冠状病毒组成。
α冠状病毒包括多种动物病原体（例如，猫腹膜炎病毒、猪流行性腹泻病毒）与两种人类冠状病毒（HCoV-229E和HCoV-NL63）。β冠状病毒包括动物病毒，如鼠肝炎病毒（MHV），马冠状病毒，犬冠状病毒，和三种人类冠状病毒（HCoV-OC43、HCoV-HKU1和SARS-CoV）。γ-和δ-冠状病毒包括感染鸟类和海洋哺乳动物的病原体。
现有技术已知壳聚糖及其衍生物具有结合病毒并抑制其复制的能力。例如，已知壳聚糖的糖衍生物具有通过血凝素蛋白结合流感病毒的能力，该血凝素蛋白是流感病毒的典型蛋白具有结合糖残基的能力(李 X.等 (2011). 生物大分子，12: 3962 -3969；卡拉什尼科娃 I. 等 (2008). 分析化学 80: 2188-2198，牧村 Y. 等 (2006). 碳水化合物研究 341: 1803 - 1808, U.S. 6,680,054]。
类似地，微粒状未修饰壳聚糖用于抑制口蹄疫（FMDV）感染的复制。已证明，对乳鼠施用以微粒状壳聚糖，能够使其疾病症状减少(李 D. (2010). 病毒学杂志 7: 125)。
也已证明磺化壳聚糖衍生物具有抑制HIV-1病毒复制的抗病毒活性，其可能是通过阻断gp120病毒蛋白与其定位于易感细胞(CD4)表面的受体之间的相互作用实现（阿尔坦 M.等（2010）碳水化合物研究 345：656 - 662）。有文献报道，壳聚糖的磺酸衍生物能够抑制其它逆转录病毒和疱疹病毒家族的成员的复制（US2009286757，US2005209189，EP0497988，DE4242813和C 石原等（1993）疫苗11：670 - 674）。类似地，低分子量的壳聚糖具有对抗猫杯状病毒和小鼠诺罗病毒的抗病毒活性（苏X.等（2009）食品保护杂志72：2623 - 2628）。还有关于壳聚糖和壳聚糖衍生物的抗病毒活性的专利申请和专利。
然而，可溶性壳聚糖以及壳聚糖的磺酸衍生物，未表现出抗冠状病毒的活性。类似地，在体外条件下使用其它阳离子修饰的聚合物不具有抑制病毒复制的效果。已研发的聚合物，相对于上述的那些，表现出对其他人类病毒没有活性，如人类偏肺病毒，肠道病毒，流感病毒A和B，和人疱疹病毒1型。
本发明的目的是应用壳聚糖通过抑制冠状病毒的复制，治疗和预防冠状病毒引起的感染。
本发明的实质是应用式I的壳聚糖聚合物，其中R选自H或COCH3（HTCC），或式I的壳聚糖聚合物，其中R选自H，COCH3，或C12H25（HM-HTCC），治疗和预防冠状病毒引起的感染。
优选地，该聚合物用于治疗和预防α冠状病毒引起的感染，且特别优选的是HCoV-NL63引起的感染的情况。
优选地，该聚合物用于治疗和预防β冠状病毒引起的感染，且特别优选的是鼠冠状病毒MHV引起的感染的情况。
优选地，本发明的聚合物用于治疗和预防人或动物的症状表现为呼吸功能不足和损伤的呼吸道感染，特别优选的治疗和预防的感染为：上呼吸道感染，下呼吸道感染，儿童哮吼，胃肠感染，神经系统感染，以及川崎病。
壳聚糖聚合物HTCC是通过壳聚糖与氯化缩水甘油基三甲基铵反应而得到的。HTCC可以通过用疏水性基团取代进一步修饰，特别优选的是当所述疏水性基团是正十二烷基，给出了HM-HTCC。
这些聚合物优选地用作溶液，以液体或气雾剂的形式局部给药于上呼吸道（喉，鼻腔，呼吸道树），口服至胃肠系统，或静脉注射治疗和预防冠状病毒引起的疾病。
本发明的主题还可以是将式I的壳聚糖聚合物，用作溶液以液体或气雾剂的形式向呼吸道给药；其中式I的壳聚糖聚合物的R选自H或COCH3（HTCC），或式I的壳聚糖聚合物的R选自H，COCH3，或C12H25（HM-HTCC）。
本发明通过应用实施例作更详细的说明。
实施例1.壳聚糖衍生物HTCC的合成。
该聚合物的修饰基于先前在文献中描述的方法进行（卡明斯基K.等（2010）医学化学杂志 53：4141-4147）。如图1中所示反应获得HTCC，将2.5g壳聚糖分散在100ml的蒸馏水中，然后加入10ml 0.5％的醋酸溶液并将该混合物搅拌30分钟。在下一步骤中滴入6.9ml的氯化缩水甘油基三甲基铵（GTMAC）。
该反应在55℃下进行18小时，同时用磁力搅拌器进行混合。该时间之后，将反应混合物以4000rpm速度离心10分钟以除去悬浮的未修饰的壳聚糖。然后，将上清液倾入过量的丙酮中，将所得悬浮液以4000 rpm速度离心20分钟。
倾出上清液，将沉淀物预先在空气中干燥后溶解在水中。将所得溶液再次离心，并用一个新的批次的丙酮使溶解在上清液中的该聚合物析出。该溶解和析出的循环重复再进行2次。最终析出的产物在真空烘箱中干燥24小时即获得HTCC。获得修饰度63％的该聚合物，修饰度定义为GTMAC取代的葡萄糖单位的百分比。
阳离子修饰的壳聚糖HTCC的结构由图2所示的FTIR傅立叶变换红外光谱证实，其中暗线表示壳聚糖修饰之前的光谱，以及亮线表示壳聚糖修饰之后（即HTCC）的光谱。
FTIR中的修饰后壳聚糖的两个频带，能够在1520 cm-1区别于其他的是甲基基团的特征，其存在于修饰后壳聚糖中，而不存在于未修饰壳聚糖中，以及在1595 cm-1的频带是伯胺的特征，该伯胺的特征可以在未修饰壳聚糖的光谱中观察到，但不存在于修饰后壳聚糖的光谱中。两种情况下都能观察到在1650 cm-1的一个频带，来源于乙酰氨基中存在的伯酰胺键C = O。
修饰后壳聚糖（HTCC）的结构也被使用1 H-NMR核磁共振氢谱证实。在D2O和CD3COOD的混合物中进行1 H NMR测定。在该聚合物修饰后的波谱中的一个频带出现在3.2 ppm，其是甲基的质子与季胺氮键合连接的特征。未修饰壳聚糖的1H-NMR谱如图3中所示以及HTCC的1H-NMR谱如图4中所示。
实施例2.壳聚糖衍生物HM-HTCC的合成。
HTCC (1 g，3mmol葡萄糖单位) 溶解于甲醇与1％乙酸溶液（pH= 5.5）的比例为1：1的混合物中。0.3mmol N-十二烷基醛和1.2568g（20mmol）氰基硼氢化钠（NaCNBH）溶解在20ml甲醇中，并加入到HTCC溶液内。将反应混合物在20℃搅拌36小时直至形成溶胶。在反应完成后，将聚合物用甲醇和乙醚的50：50 体积比的混合物进行沉淀。沉淀的聚合物用甲醇和乙醚洗涤并真空干燥。所得到的产物（HM - HTCC）的结构通过测定其1 H NMR频谱证实。
实施例3.聚合物HTCC和HM-HTCC的细胞毒性及其抗α冠状病毒活性的研究，以人类冠状病毒NL63为例。
研究聚合物HTCC和HM-HTCC细胞毒性，通过使用对HCoV-NL63病毒感染敏感的LLC-MK2细胞（ATCC CCL-7；来自猕猴肾上皮细胞衍生的细胞系）和A549细胞（ATCC CCL-185细胞系来自于肺癌细胞，智人）（范德胡克L.等（2004） 自然医学10：368-373；希尔德根 O等（2006） 病毒学方法杂志138：207 - 210）。
细胞毒性使用两个试验测定。首先，进行一个比色测试，该比色测试是基于线粒体酶（琥珀酸脱氢酶）减小XTT染料（2,3-双- (2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰基苯胺）着色甲酸盐的能力。
由于细胞活力和染料形成量之间有直接的关系，通过测定这个特定染料最大吸光度对应波长处的吸光度，能够评估细胞的状态。还使用了中性红染料对细胞活力进行评估。
中性红（NR）被动输送到活细胞的细胞质中并累积于溶酶体。活细胞的数目和它们的状态的分析是通过对样品随着细胞裂解的色度的评估。
在研究中LLC-MK2或A549细胞在有汉克和厄尔盐补充有3％牛血清的最小必需培养基（MEM）中培养6天，以增加HTCC或HM-HTCC聚合物的浓度。在该时间后，对细胞毒性使用上述两种方法进行评估。另外，用相差显微镜检查细胞对病毒特异性改变的细胞形态的存在。该结果表示在表1中。
表1细胞毒性和细胞病变的测试结果。
细胞系 HTCC CC50 ab HTCC CC50 ac HM-HTCC CC50 ab HM-HTCC CC50 ac
LLC-MK2 161,25 μg/ml 191,92 μg/ml 220,09 μg/ml 215,23 μg/ml
A549 143,83 μg/ml 156,46 μg/ml 96,29 μg/ml 96,13 μg/ml
aCC50表示聚合物的浓度，导致细胞活力减少50％。
b结果用XTT测试取得。 c结果用中性红测试取得。
进行测量的结果与细胞中的形态学变化的观察是一致的。简单地说，对于两种聚合物CC 50浓度是相似的（LLC-MK2细胞~200μg/ml和A549细胞100~150μg/ml）。
评估HTCC和HM-HTCC聚合物对人体冠状病毒NL63复制的抑制。该实验是在聚合物浓度逐渐增加的情况下的被HCoV-NL63感染的敏感细胞（LLC -MK2）上进行的。整个实验中细胞培养在有汉克和厄尔盐补充有3％牛血清的MEM培养基里。
随着感染（细胞在病毒悬浮液培养两小时）更换含有特定浓度的HTCC或HM-HTCC聚合物的培养基（有汉克和厄尔盐、3％牛血清的MEM）。在感染后6天使用相差显微镜进行形态学变化的评估。在HTCC聚合物（10μg/ml）的存在下观察到病毒复制的抑制情况，且将没有与病毒复制相关的细胞病变效应进行记录。类似地，在HM-HTCC聚合物（50μg/ml）的存在下，可以观察到病毒复制的抑制和无细胞病变效应（图5）。
与此相反，在使用未修饰的壳聚糖进行的分析显示HCoV-NL63的复制未被这种聚合物抑制。类似地，其它聚合物（如葡聚糖或聚烯丙基胺）的阳离子衍生物没有显示出可见的、抗冠状病毒的抑制活性。
HTCC和HM-HTCC对HCoV-NL63复制的影响还使用了实时定量RT-PCR分析。为了这个目的使用了先前描述的定量方法（彼拉斯 K等（2006）抗菌剂和化学疗法50: 2000-2008）。在研究中LLC-MK2或A549细胞在有汉克和厄尔盐、补充有3％牛血清的MEM中培养6天。细胞在用病毒悬浮液培养两小时后，在感染情况下，将培养基去除，细胞用无菌磷酸盐缓冲液洗涤并用含有特定浓度的HTCC或HM-HTCC聚合物的新鲜培养基（含有汉克和厄尔盐、3％牛血清的MEM）覆盖。培养后，将总RNA从细胞上清液中分离，接着作为定量PCR进行逆转录反应的模板。
该实验在聚合物浓度逐渐增加条件下进行。该结果表示在图6和图7以及表2中。据观察，HTCC和HM-HTCC聚合物引起HCoV-NL63复制的抑制，而在参照样中病毒复制。在表2中也包括细胞毒性（CC50）和抗病毒活性（IC 50）的数据分析，该数据分析能够进行选择性指数的评估。
图6和图7中分别图解说明了HTCC聚合物或HM-HTCC聚合物的浓度依赖性的细胞毒性和病毒复制的抑制。
表2. HTCC和HM-HTCC聚合物对HCoV-NL63病毒复制的抑制。
聚合物 IC50 选择性指数 SI50
HTCC 2,75 1,18 μg/ml [13,41 nM] 58,64
HM-HTCC 68,52  μg/ml [308,65 nM] 3,21
显而易见，HTCC聚合物在明显较低的浓度下显示活性，并产生了更好的选择性指数。在结构层面上，HTCC和HM-HTCC是相似的，除了在HM-HTCC聚合物表达的特定的疏水性基团以外。因此，可能这些基团的连接限制了HTCC核心的易接近性或改变了它的特性。
实施例4. 对聚合物HTCC和HM-HTCC的细胞毒性及其抗α冠状病毒活性的研究，以利用完全分化的人类呼吸道上皮细胞（HAE）培养物的人类冠状病毒NL63为例。
为确定所观察到的抗α冠状病毒效果是否是细胞特异性的，聚合物的抑制活性在一个更自然的环境中进行了评估；出于该目的，使用了模仿天然传导气道上皮细胞、HAE培养物。HAE培养物是多层的、完全分化的初始人类呼吸道上皮细胞生长在空气/液体界面的胶原包被的塑料上形成的。简单地说，将人的气管支气管上皮细胞，在塑料上进行膨胀，形成1代细胞并以3 × 105每孔的密度接种在渗透支持的Transwell小室（6.5mm直径）。人类气道上皮细胞（HAE）培养物通过提供一个空气-液体界面用6~8周形成分化良好的，类似于在体的假复层纤毛上皮的极化的培养物而产生。
HAE培养物通过在其顶面接种感染物而感染HCoV-NL63。然后在32℃培养2小时，未结合的病毒通过1 × PBS洗涤除去（两次，每次100 μl）且使HAE培养物保持在空气-液体界面上用于实验的其余部分。进一步地，HCoV-NL63感染和模拟感染的HAE培养物的顶面每隔24小时用100 μl 含有一个给定抑制剂的培养漂洗。
细胞毒性使用一个比色测试确定其基于线粒体酶（琥珀酸脱氢酶）减小XTT染料（2,3-双- (2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰基苯胺）着色甲酸盐的能力。
为了分析HCoV-NL63的复制，在32℃的培养，感染72小时后，将100 μl的1 × PBS施加到HAE培养物的顶面，并在接下来的10分钟后收集上述100 μl的1 × PBS。
图8和图9中分别图解说明了HTCC聚合物或HM-HTCC聚合物对病毒复制的抑制和HAE培养物上聚合物的细胞毒性（按XTT分析法测定）。
实施例5.聚合物HTCC和HM-HTCC的细胞毒性及其抗β冠状病毒活性的研究，以鼠肝炎病毒（MHV）为例。
HTCC和HM-HTCC聚合物的细胞毒性已在容易受到MHV病毒感染的LR7细胞上分析过(郭 L等(2000)病毒学杂志 74: 1393-1406；罗森J.W. 等(1996). 病毒学 224: 345-351 )。细胞毒性使用一个比色测试确定，该比色测试是基于线粒体酶（琥珀酸脱氢酶）减小XTT染料（2,3-双- (2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰基苯胺）着色甲酸盐的能力。
由于细胞活力和染料形成量之间有直接的关系，通过测定这个特定染料最大吸光度对应波长处的吸光度，能够评估细胞的状态。还使用了中性红染料对细胞活力进行评估。 
在研究中，LR7细胞用逐渐增加浓度的HTCC或HM-HTCC聚合物，在限定的补充有3％牛血清的杜尔贝克改良的厄尔培养基（DMEM）中培养48小时。在该时间后，根据上述描述对细胞毒性进行评估。另外，可以使用相差显微镜检查细胞的形态学变化。
取得的结果表示在表3中。
表3.HTCC和HM-HTCC聚合物的细胞毒性。
细胞系 HTCC CC50 ab HM-HTCC CC50 ac
LR-7 > 100 μg/ml > 100 μg/ml
aCC50表示聚合物的浓度，导致细胞活力减少50％。
b结果用XTT测试取得。 c结果用中性红测试取得。
使用HTCC和HM-HTCC聚合物分析冠状病毒MHV复制的抑制。该实验通过在聚合物的存在下用MHV病毒感染敏感细胞（LR7）进行。在测定的整个持续时间，细胞维持在补充有3％牛血清的DMEM培养基中。用病毒培养细胞两小时后，除去培养基，细胞用无菌磷酸盐缓冲液洗涤并用含有HTCC或HM-HTCC聚合物的新鲜培养基（有3％牛血清的DMEM）覆盖。
在感染后48小时，使用相差显微镜检查可见细胞形态的改变（图10）。HTCC和HM-HTCC聚合物对MHV病毒复制的影响还通过实时RT-PCR分析使用培养基中RNA拷贝数据的计算进行分析。该定量方法的进行使用了5'MHV_NF TGG CCG AAG AAA TTG CTG CTC TTG，3' MHV_NR GCC TGA CTT CTT TGG TGG CAC TTT GCT 引物和FAM / TAMRA MHV_Np TTT GGC TAA GCT CGG TAA AGA TGC CG 荧光探针。
该反应在先前描述的同样条件下进行(彼拉斯 K等（2006）抗菌剂和化学疗法50: 2000-2008)。
该实验在聚合物浓度逐渐增加条件下进行。其结果表示在图11和图12以及表3中。据观察，HTCC和HM-HTCC聚合物引起HCoV-NL63的复制的抑制，而在参照样本中病毒复制。
分别表示在图11和图12中的图解说明浓度依赖性的细胞毒性，以及通过HTCC聚合物或HM-HTCC聚合物对病毒复制的抑制。
实施例6. HTCC聚合物和冠状病毒HCoV-NL63突起蛋白（Se-NL63）的相互作用。
为了研究Se-NL63和HTCC相互作用，该聚合物按照下面的步骤用荧光素标记。150mg的HTCC溶解在5.0ml蒸馏水和15.0mlDMSO的混合物中。五毫克异硫氰酸荧光素（FITC）溶解在1ml丙酮中，将该溶液加入到含有HTCC的样品中，并在暗处充分混合24小时。随后，将标记的聚合物（FITC-HTCC）用丙酮沉淀并以4000rpm速度离心分离5分钟。将沉淀物用丙酮洗涤，溶解在水中，并在水中透析2天，进一步用丙酮：水混合物（体积比1:4）透析1天，并冷冻干燥。 FITC-HTCC的取代度，定义为每HTCC的葡萄糖基的FITC基团的数目；基于UV-VIS光谱，FITC-HTCC的取代度发现为1.66％。
在一个对照样本和含有逐渐增加浓度的Se-NL63或牛血清白蛋白（BSA）样本中分析FITC-HTCC在水中的荧光光谱（在CFITC-HTCC = 0.5 g/ml）。该测定使用λex=494nm进行。经证明，Se-NL63蛋白和样品的其他组分在该激发波长处不吸收且不与FITC-HTCC的荧光强度相互干涉。
FITC-HTCC的荧光强度随Se-NL63的浓度增长而显著降低（图13和图14）。Se-NL63对FITC-HTCC的强淬灭表明Se-NL63和FITC-HTCC之间的强相互作用（复合物形成或结合）。在牛血清白蛋白（BSA）存在下观察到FITC-HTCC的荧光强度没有降低，表明BSA不与FITC-HTCC相互作用，因此，存在于Se-NL63和FITC-HTCC之间的相互作用有某些特异性。
图13和图14中分别图解说明了在0，1.0，2.0，和2.5 g/ml Se-NL63存在下的FITC-HTCC荧光光谱和在~λ=513nm的FITC-HTCC相对荧光强度（I/I0）与Se-NL63浓度的依赖性（λ~ex=494nm，CFITC-HTCC = 0.5 g/ml）。

Claims (11)

  1. 式I
      的壳聚糖聚合物HTCC 和HM-TCC，其中R选自H，COCH3（HTCC）或选自 H，COCH3，C12H25（HM-HTCC），其用于治疗和预防冠状病毒引起的感染的用途。
  2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的聚合物用于治疗和预防α冠状病毒引起的感染。
  3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的聚合物用于治疗和预防HCoV-NL63引起的感染。
  4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的聚合物用于治疗和预防β冠状病毒引起的感染。
  5. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的聚合物用于治疗和预防鼠冠状病毒MHV引起的感染。
  6. 如权利要求1至5所述的用途，其特征在于，所述的聚合物用于治疗和预防人或动物表现为呼吸功能的不足和损伤的呼吸道感染。
  7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的聚合物用于治疗和预防选自下组的感染：
    - 上呼吸道感染；
    - 下呼吸道感染；
    - 儿童哮吼；
    - 胃肠道感染；
    - 神经系统感染；
    - 川崎病。
  8. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的聚合物HTCC通过壳聚糖与氯化缩水甘油基三甲基铵反应获得。
  9. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的聚合物HTCC通过用疏水性基团取代进一步修饰得到HM-HTCC。
  10. 如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的疏水性基团是正十二烷基。
  11. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的壳聚糖聚合物用作一种溶液，以液体或气雾剂的形式向呼吸道给药。
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