CN113018296A

CN113018296A - 褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用

Info

Publication number: CN113018296A
Application number: CN202110327506.3A
Authority: CN
Inventors: 粟硕; 任文凯; 翟晓凤; 王宁宁; 焦厚琪
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2041-03-26
Also published as: CN113018296B

Abstract

本申请公开了褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用，其作用机制为褪黑素抑制病毒的入侵过程。本发明涉及的褪黑素在胞内水平上具有抑制猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪Delta冠状病毒（PDCoV）的作用。而且褪黑素具有价格低廉，纯天然无毒等优点。这开拓了褪黑素在抗病毒防治方向的新领域，从而为新型抗猪肠道冠状病毒药物的开发提供新的思路和方向。

Description

褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用。

背景技术

冠状病毒是一类具有囊膜（envelope）的单股正链RNA病毒，在系统分类上属于套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus），是自然界中广泛存在的一大类病毒。冠状病毒直径约为80~120 nm，基因组5’端具有甲基化的帽状结构，3’端具有poly（A）尾，基因组全长约为26-32 kb，是目前已知的基因组最大的RNA病毒。

冠状病毒可感染脊椎动物和人类并引起呼吸道感染和胃肠炎等多种临床症状。随着我国养猪业的不断发展，猪病毒性腹泻的流行和爆发日益增多，严重危害了我国养猪业的发展，造成巨大的经济损失。其中冠状病毒相关病原主要包括猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪δ冠状病毒（Porcinedeltacoronavirus，PDCoV）和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）。

PEDV属于冠状病毒科α冠状病毒属，最早于1971年发现，并在1978年在比利时从仔猪的腹泻病料中分离获得，基因组在28 kb左右。PEDV 造成我国养猪场中仔猪早期死亡的主要病原之一，仔猪感染PEDV后表现为呕吐、水样腹泻，甚至迅速脱水而死亡，治愈后的仔猪生长缓慢，成为僵猪，给养猪业带来巨大的经济损失。

PDCoV属于冠状病毒科δ冠状病毒属，首次于2012年在中国香港报道，在已知的冠状病毒中，其基因组最小，约为25.4 kb。PDCoV对不同日龄的猪只都具有较强的致病性，PDCoV感染可引起母猪和哺乳仔猪的呕吐、水样腹泻、脱水、严重可导致死亡，对养猪业发展带来巨大损失。

TGEV属于冠状病毒科冠状病毒亚科I型冠状病毒属，于1946年首次被报道，基因组全长约为28.6 kb。TGEV在首次感染的猪群中发展迅速且危害较大，短期内可感染各种年龄的猪，且日龄越小的猪病情越严重。猪只感染TGEV主要表现为严重腹泻、呕吐和脱水，最终导致死亡。该病不仅对全球养猪业造成极大影响，对动物和人类健康也是一个潜在的威胁。

褪黑素（melatonin，MT）即N-乙酰基-5-甲氧基色胺。1958年由耶鲁大学Lerner从牛的松果体中分离鉴定，发现它能使鱼类和两栖类动物的肤色变浅而被命名为“褪黑素”。褪黑素是一种重要的神经激素，具有调节动物繁殖机能、延缓衰老和调节昼夜节律等作用。同时作为自由基清除剂和抗氧化剂，保护机体免受环境和内在的氧化胁迫，提高机体自身免疫力。

褪黑素可以通过抑制过度先天免疫反应来促进获得性免疫反应，从而提高机体对病毒感染的耐受性，即褪黑素具有抗病毒功能。褪黑素具有很强的抗氧化功能，每个分子最多可结合10个自由基，线粒体产生的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）是褪黑素清除的主要靶标，褪黑素对线粒体功能具有保护作用，人类冠状病毒SARS-CoV则会引起机体氧化应激，褪黑素在一定程度上具有抗SARS-CoV的功能；褪黑素还具有抗炎症反应的特性，褪黑素是炎性小体NLRP3的抑制剂，而SARS-CoV-2会通过诱导细胞凋亡引起严重的肺部病变，产生炎症反应，因此褪黑素具有一定的抗SARS-CoV-2的功能。

目前褪黑素已被报道对多种病毒具有抑制作用，然而并没有研究报道褪黑素在猪冠状病毒复制中的作用。

发明内容

解决的技术问题：本申请提出褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用，解决现有的猪冠状病毒防治技术的缺陷和不足，褪黑素对猪冠状病毒PEDV、PDCoV、TGEV具有显著的抗病毒效果，并可以通知直接靶向病毒在复制早期发挥抗病毒功能。该类物质广泛存在于动植物中，合成工艺成熟，在生物医药领域有广泛的应用，比较安全，因此在制备开发针对猪冠状病毒的抗病毒药物方面具有很好的应用前景。

技术方案：

褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用。

作为本发明的一种优选技术方案：所述猪冠状病毒为引起猪腹泻类型的病毒，所述引起猪腹泻类型的病毒为猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PEDV和猪Delta冠状病毒PDCoV。

作为本发明的一种优选技术方案：所述褪黑素在胞内水平上的安全浓度大于1200ug/mL。

作为本发明的一种优选技术方案：所述褪黑素在PK-1和PK-15细胞上的安全浓度达1.8 mg/mL。

作为本发明的一种优选技术方案：所述褪黑素呈现计量依赖性的方式抑制猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PEDV和猪Delta冠状病毒PDCoV的复制。

作为本发明的一种优选技术方案：所述褪黑素抑制猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PEDV和猪Delta冠状病毒PDCoV的复制发生在病毒复制的早期阶段。

作为本发明的一种优选技术方案：所述褪黑素抑制猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PEDV和猪Delta冠状病毒PDCoV的入侵过程。

作为本发明的一种优选技术方案：所述褪黑素直接靶向猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PEDV和猪Delta冠状病毒PDCoV从而影响病毒的复制。

有益效果：本申请所述褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：

1、本发明所述的褪黑素，在PK-1和PK-15细胞具有很高的安全浓度，十分安全；

2、褪黑素可以在体外通过抑制猪冠状病毒的入侵来抑制其复制，并呈现剂量依赖性方式；

3、褪黑素广泛存在于动植物中，来源广泛，且生产加工合成工艺成熟，在生物医药领域有广泛的应用，较为安全，有很好的开发药物基础。

附图说明：

图1 为本申请褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用褪黑素在不同种细胞上的安全性验证图。

图2为本申请褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用不同浓度的药物在PK-15、Vero和PK-1细胞上抑制TGEV、PEDV和PDCoV病毒N蛋白在mRNA水平、蛋白水平、病毒滴度、IFA以及抑制效率检测结果图。

图3为本申请褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用药物在不同阶段对TGEV、PEDV和PDCoV病毒病毒N蛋白在mRNA水平，蛋白水平以及病毒滴度检测结果图。

图4为本申请褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用药物直接作用于病毒后对病毒直接杀伤效果图。

图5为本申请褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用不同病毒在吸附和入侵阶段药物对病毒mRNA和蛋白水平影响差异图。

图6为本申请褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用药物直接靶向病毒后对病毒复制影响差异图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步的具体说明，但是本发明并不限于这些实施例。

溶液配制：将褪黑素粉末溶于DMSO溶液中使其终浓度为250 mg/mL，然后经0.22 µm无菌过滤器过滤除菌，配制成褪黑素原液，-80℃储存备用。

实施例1

一种褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用，

褪黑素在PK-15、Vero和PK-1细胞上的安全性验证：。

将在细胞培养液上生长良好的PK-15、Vero或PK-1细胞传至96孔细胞培养板中，于37℃，5%CO₂培养，待细胞长满单层后，弃掉细胞培养液，用PBS溶液洗涤2次，加入100 µL含不同浓度褪黑素（用维持液将褪黑素分别稀释成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL）的细胞维持液(5 µg/mL胰酶，0.3% TPB，DMEM培养基)，将不同浓度的药物设立六个重复，同时设立DMSO阴性对照和正常细胞对照。处理12 h和24 h时，更换含10% CCK8的细胞维持液，37℃，5%CO₂条件孵育2 h，测定450 nm的吸光度。

采用公式（A_（加药）- A_{（培养基）}）/（A_{（对照组）}- A_{（培养基）}）*100%计算不同浓度药物处理后的细胞活性，利用Graphpad Prism 7软件对数据进行拟合分析。由图1可知， PK-15、Vero或PK-1细胞可以用到1.2 mg/mL以上。

实施例2

褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用，褪黑素呈现计量依赖性的方式抑制TGEV、PEDV和PDCoV的复制。

将PK-15、Vero或PK-1细胞传至24孔板，待细胞长满单层后，弃去培养液，用PBS洗2遍，每孔加入500 μL的病毒液（MOI=0.01），置于37℃温箱培养1 h。保证病毒完成吸附和入侵过程，弃去病毒液，用PBS洗2遍，然后向每孔中加入500 µL含不同浓度褪黑素（用维持液将褪黑素分别稀释成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）的细胞维持液，同时设立DMSO阴性对照，放入37℃温箱继续培养12 h。病毒的感染情况分别通过病毒滴度、检测蛋白表达水平和检测mRNA表达水平进行测定。

参考实施例1，12 h后，采用CCK8法，用酶标仪测定450 nm的吸光度，计算药物半数有效浓度(EC₅₀)。同时固定液固定细胞，间接免疫荧光实验（IFA）检测病毒荧光强度。

由图2A-J可知，褪黑素呈现计量依赖性的方式抑制TGEV、PEDV和PDCoV的复制。褪黑素对TGEV、PEDV和PDCoV的剂量效应曲线如图2K-M所示，褪黑素表现出较高抗病毒活性，其EC₅₀值分别为0.67 mg/mL、0.57 mg/mL和0.60 mg/mL。

实施例3

褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用，褪黑素在病毒复制的早期发挥抗病毒作用。

为分析褪黑素对TGEV、PEDV和PDCoV在侵染细胞哪个阶段有抑制作用，将PK-15、Vero和PK-1细胞传至24孔板中，待细胞长满单层后，弃去培养液，PBS洗2遍，以最大安全浓度药物（1.2 mg/mL）处理1 h，之后每孔加入500 μL的病毒液（MOI=0.01），此时记为0h，置于37℃温箱培养1 h，保证病毒完成吸附和入侵过程，弃去病毒液，PBS洗2遍，加入细胞维持液，在0、1、3、5、7、9 h（TGEV和PEDV）或者0、1、4、7、10、13 h（PDCoV）分别向不同孔中加入褪黑素，使药物的终浓度达到1.2 mg/mL，同时设立DMSO阴性对照，37℃温箱培养至12 h（TGEV和PEDV）或者18 h（PDCoV）后，收集不同组上清液，进行病毒滴度测定，检测病毒蛋白表达水平和mRNA表达水平情况。

通过检测上清液病毒滴度，检测蛋白表达水平和mRNA表达水平来分析病毒侵染细胞不同时期的抑制情况，结果如图3所示，接毒前给药与阴性对照相比抑制效果不显著，接毒时给药抑制效果显著，在接毒后1 h给药抑制效果极显著，说明褪黑素可能在病毒吸附入侵和复制的早期起作用，而预防阶段作用不大。

实施例4

褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用，褪黑素对病毒没有直接杀毒效果。

将PK-15、Vero和PK-1细胞传至96孔板，待细胞长满单层后，弃去培养液，用PBS洗2遍，每孔加入100 µL预先与1.2 mg/mL褪黑素37℃共同孵育1 h的病毒液（MOI=0.05），进行病毒滴度测定, 并设置DMSO阴性对照组和正常细胞对照组, 48 h后记录细胞病变数并用Reed and Munch法计算结果。

由图4可知，不同处理组的病毒滴度无差异，说明褪黑素对TGEV、PEDV和PDCoV没有直接杀毒效果。

实施例5

褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用，褪黑素抑制PEDV复制阶段的检测。

病毒吸附阶段：为检验褪黑素是否对病毒吸附细胞有影响，将PK-15、Vero和PK-1细胞传至12孔板中，待细胞长满单层后，细胞4℃预冷10分钟，弃去培养液，用预冷PBS缓冲液(PH=7)洗2遍，加入500 μL褪黑素终浓度为1.2 mg/mL的病毒液（MOI=0.01），设立DMSO阴性对照，将细胞板放入4℃冰箱作用1 h，只允许病毒附着于细胞表面，冷PBS洗去未结合病毒，检测病毒蛋白表达水平和mRNA表达水平情况。

由图5可知，褪黑素处理组与对照组的蛋白水平和mRNA水平无明显差异，说明褪黑素对病毒吸附细胞没有影响。

病毒入侵阶段：为检验褪黑素是否对病毒入侵细胞有影响，将PK-15、Vero和PK-1细胞传至12孔板中，待细胞长满单层后，细胞4℃预冷10分钟，在冰上进行如下操作：弃去培养液，预冷PBS缓冲液(PH=7)洗2遍，每孔加入500 μL的病毒液（MOI=0.01）。将细胞板放入4℃冰箱1 h，允许病毒吸附细胞表面，用冷PBS洗去未结合的病毒，然后向每孔中加入500 μL终浓度为1.2 mg/mL的褪黑素，同时设立DMSO阴性对照，将细胞板放入37℃温箱培养1 h，弃去药物，用PBS缓冲液(pH=2.0)洗去未内化的病毒，继续37℃培养至12 h，检测病毒蛋白表达情况和mRNA表达水平情况。

由图5可知，褪黑素处理后，病毒蛋白和mRNA表达显著减少，说明褪黑素可以抑制TGEV、PEDV和PDCoV的入侵。

实施例6

褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用，为检验褪黑素是否直接靶向病毒，将PK-15、Vero和PK-1细胞传至12孔板中，TGEV、PEDV和PDCoV与1.2mg/ml褪黑素或DMSO在室温下孵育1小时，预冷PBS缓冲液(PH=7)洗2遍，将孵育药物后的毒液(MOI=0.01)分别感染PK-15、Vero和PK-1细胞1小时，然后用PBS缓冲液洗涤细胞后加入细胞维持液培养24 h，进行Westernblot、qRT-PCR和病毒滴定试验。同时进行IFA实验进行验证。

由图6可知，用1.2 mg/mL的褪黑素与病毒直接作用后可显著抑制TGEV、PEDV和PDCoV的病毒增殖。在IFA实验中， DMSO处理的细胞中观察到强烈的信号，而在1.2 mg/mL褪黑素处理后，荧光信号降低。这些结果表明，褪黑素的预处理导致病毒滴度、病毒mRNA或N蛋白水平显著降低，表明褪黑素通过直接靶向病毒而发挥抗病毒作用。

以上实例仅为本发明的优选方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明原理所做的改变、修饰都应视为本发明的保护范围。

Claims

1.褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用。

2.根据权利要求1所述的褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用，其特征在于：所述猪冠状病毒为引起猪腹泻类型的病毒，所述引起猪腹泻类型的病毒为猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪Delta冠状病毒（PDCoV）。

3.根据权利要求1所述的褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用，其特征在于：所述褪黑素在胞内水平上的安全浓度大于1200ug/mL。

4.根据权利要求1所述的褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用，其特征在于：所述褪黑素在PK-1和PK-15细胞上的安全浓度达1.8 mg/mL。

5.根据权利要求1所述的褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用，其特征在于：所述褪黑素呈现计量依赖性的方式抑制猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪Delta冠状病毒（PDCoV）的复制。

6.根据权利要求1所述的褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用，其特征在于：所述褪黑素抑制猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪Delta冠状病毒（PDCoV）的复制发生在病毒复制的早期阶段。

7.根据权利要求5所述的褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用，其特征在于：所述褪黑素抑制猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪Delta冠状病毒（PDCoV）的入侵过程。

8.根据权利要求1所述的褪黑素在抗猪冠状病毒方面的应用，其特征在于：所述褪黑素直接靶向猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪Delta冠状病毒（PDCoV）从而影响病毒的复制。