KR950002869B1 - 세균으로부터 생체활성다당체를 분리 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
제1도는 본 발명의 실시예 1에서 얻어진 다당의 IR데이타이다.
본 발명은 세균의 배양액으로부터 다당을 분리, 정제하므로써 생체활성다당체를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 연쇄상 구균인 스트렙토코카스 페칼리스(Streptococcus faecalis) ATCC 19433의 배양액으로부터 생체유효 활성을 검색하기 위해 다당체를 분리, 정제하여 생체활성다당체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
자연계로부터 정제되는 다당체에는 생체유효 활성을 나타내는 것들이 존재하는데, 예를들면 효모에서 추출된 지이모산(Zymosan)은 항암효과를 나타내며[Cancer Res., 18, 34791958)], 렌티누스(Lentinusedodes)로부터 추출된 렌티난(Lentinan)은 항암 및 면역촉진작용을 나타내는 것으로 알려져 있다[Nature, 229, 634(1971)].
한편, 스트렙토코카스 페칼리스 배양액으로부터 분리된 다당체가 혈액내 트리글리세라이드 농도를 낮추므로서, 아데롬성 동맥경화치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며[Microecology and Therapy, 15, 271(1985)], 이들의 분리방법이 일부 문헌[Microecology and Therapy, Vol.14, 109-126(1984)]에 공지되어 있다.
이 방법에 따르면 세균 배양액을 끓이거나 초음파로 파쇄한후 클로로포름으로 지질등의 비극성 물질을 제거한후, 단백질과 핵산을 제거하기 위해 효소를 처리하여 정제하는데, 이러한 방법들은 공업적으로 비경제적일 뿐 아니라 대량생산의 조건이 되지 못하고 그 순도 및 수율도 떨어지기때문에 개선의 여지가 많았다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 종래의 방법에서 나타난 분리정제상의 문제점을 해소하기 위해, 스트렙토코카스 페칼리스 배양액으로부터 생체유효활성다당을 고순도, 고수율로 분리, 정제함에 있어서, 공업적 경제성을 높이기 위해 메칠 또는 에칠 알콜등과 같은 저렴한 가격의 용매를 이용하게되면 세파덱스 수지 등의 칼럼을 이용하지 않고서도 다당체를 고순도, 고수율로 정제할 수 있는 효과적인 방법을 개발하게되어 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 스트렙토코카스 페칼리스 배양액으로부터 생체활성 다당을 분리, 정제함에 있어서, 간단하고 경제적인 방법으로 고순도, 고수율의 다당을 분리, 정제하는 생체활성 다당체의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 스트렙토코카스 페칼리스 ATCC 19433균의 배양액으로부터 다당체를 분리하여 생체활성 다당체를 제조함에 있어서, 상기 세균 배양액을 끓이거나 초음파를 이용하여 균체를 파쇄한후 클로로포름으로 처리하여 비극성 물질을 제거하고, 남은 여액에 저급알콜을 3 내지 4배의 부피비로 적가한후 생성된 침전물을 원심분리하여 다당 조침전물을 얻은다음, 여기에다 황산바륨을 가하여 흡착시키고 구연산 암모늄 용액으로 용출시킨후, 이를 순수상에서 투석하여 염이나 저분자 물질을 제거하여서 생체활성 다당을 정제하는 것을 포함한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서는 공지균주인 연쇄상 구균의 스트렙토코카스 페칼리스 ATCC 19433균의 배양액으로부터 생체활성 다당체를 분리제조하기 위해, 세균배양액을 생리식염수로 세척한후 다당 추출 효율을 높이기 위해 끓이거나 초음파를 이용하여 균체를 파쇄한 다음 클로로포름으로 3회 처리하여 지질등과 같은 비극성 물질을 제거하고, 그 남은 여액에다 저급알콜을 적가한다음 생성된 침전물을 원심분리하고 저급알콜로 세척하여 다당의 조침전물을 얻는다.
이때, 상기 저급알콜의 첨가량이 상기 남은 여액에 대해 3배의 부피비 미만일 경우에는 원하는 다당분획의 침전형성이 완전히 이루어지지 않기 때문에 수율이 저하될 우려가 있고, 4배의 부피비를 초과하면 전체량이 늘어나 정제과정이 불편해지고 순도가 떨어지는 문제가 있다.
본 발명에 따르면 이때 저급알콜로서는 예컨대 에탄올, 메탄올 또는 이들의 혼합물중에서 선택된 것이 사용될 수 있다.
이와같은 과정을 거쳐 제조한 상기의 다당 조침전물을 더욱 정제하기 위해서는 순수에서 용해시킨 다음, 황산바륨을 5∼15%(w/v)되게 첨가한후 교반기를 이용하여 서서히 저어준다. 이때, 황산바륨에는 다당체만 흡착되는데 단백질과 일부 다당체는 흡착되지 못한다. 이렇게 교반이 완료된 다음 원심분리하여 다당체가 흡착된 황산바륨 침전물을 얻고, 여기에 구연산암모늄 용액을 넣어주면서 혼탁시키고 황산바륨 침전을 세척한다.
그후, 원심분리하여 황산바륨 침전을 회수하고 구연산암모늄용액으로 세척을 2회 반복한다. 세척된 황산바륨침전물을 원심분리로 모은후 다시 구연산암모늄용액을 가하여 적당한 시간동안 황산바륨침전물이 현탁된 상태에서 저어준다. 이렇게 하면 황산바륨에 흡착되어 있던 다당체가 용액중으로 용출되며, 이 현탁액을 원심분리하여 다당체가 용출된 상등액을 얻고 침전된 황산바륨은 제거한다.
회수된 상등액은 순수상에서 투석하여 염이나 저분자 물질을 제거한후 동결건조하면 생체활성 다당체를 고농도, 고수율로 얻을 수 있게 된다.
여기서 사용되는 상기의 황산바륨은 단백질의 선택적 제거를 목적으로 첨가되는 바, 그 사용량이 상기의 범위를 벗어나면 일부 단백질이 흡착되거나 불순물이 혼입될 가능성이 있으므로 주의해야 한다.
상술한 바와같이 본 발명에 의하면 스트렙토코카스 페칼리스 배양액으로부터 생체활성 다당을 추출, 정제함에 있어서 간단하고도 경제적인 방법으로 고순도, 고수율로 다당체를 얻을 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거 더욱 상세히 설명하면 다음과 같은바, 본 발명이 다음의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
스트렙토코카스 페칼리스(Streptococcus faecalis) ATCC 19433를 MRS액체배지 6에 균체농도가 ml당 1×106세포수가 되도록 접종한후 37℃에서 15시간호기 정치배양하여 얻은 균체를 원심분리(12,000rpm, 15분)하여 집적한다.
집적된 균체는 생리식염수(0.85% NaCl)로 세척하고 순수 300ml에 녹인후 100℃, 30분간 열처리하여 세포를 파쇄한후 동일량의 클로로포름으로 3회 처리하여 지질등 비극성 물질을 제거한다.
지질등이 제거된 배양액을 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 클로로포름층을 버리고 상등액을 취한후 1,200ml 에칠알콜을 적가시켜 4℃에서 5시간 방치한후 생성된 침전물을 원심분리(3,000rpm, 30분)하여 20mg의 다당 조침전물을 얻었다.
이 침전물을 다시 15ml이 순수에 녹인후 1.5g의 황산바륨을 첨가한후 교반기를 이용하여 서서히 저어준다. 교반이 완료된 다음 원심분리하여 황산바륨 침전물을 얻고 여기에 1mM의 구연산암모늄 용액으로 황산바륨 침전물을 3회 세척한다. 세척된 황산바륨을 원심분리로 모은후 100mM 구연산암모늄 용액으로 황산바륨 침전물을 3∼5시간 현탁하고, 이 현탁액을 원심분리하여 다당체가 용출된 상등액을 얻고 침전된 황산바륨을 제거한다.
용출된 상등액은 순수상에서 투석한후 동결전조하여 6.9mg의 생체활성 다당체를 얻었다.
상기 실시예에서 얻어진 생체활성 다당의 분자량을 확인하기 위해 겔여과 크로마토그래피를 실시한 결과 분자량이 320,000±50,000되는 다량체로 이루어졌으며, 이 다당의 IR데이타는 제1도에 나타내었다.
상기 실시예에서 얻은 생체활성 다당의 화학적 분석 데이타는 다음 표 1에 나타내었다.
[표 1]
(분석방법)
1. 다당 ; 페놀-황산법
2. 단백질 : Bradford법[Anal.Biochem., 72, 248(1976)]
3. 핵산 : UV법[Biochem, Z., 310, 384(1942)]
Claims (3)
- 스트렙토코카스 페칼리스 ATCC 19433배양액으로부터 생체활성 다당체를 제조함에 있어서, 상기 세균배양액을 끓이거나 초음파를 이용하여 균체를 파쇄한후 클로로포름으로 비극성 물질을 제거하고, 남은 여액에 저급알콜을 3 내지 4배의 부피비로 적가한후 생성된 침전물을 원심분리하여 다당 조침전물을 얻은다음, 여기에다 황산바륨을 첨가하여 흡착시키고, 이를 구연산암모늄용액으로 용출시키고 정제하여서 제조함을 특징으로 하는 세균으로부터 생체활성 다당체를 분리 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 저급알콜은 에칠알콜, 메칠알콜 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 생체활성 다당체의 분리 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 황산바륨은 다당 조침전물에 대해 5∼15%(w/v)로 첨가함을 특징으로 하는 생체활성 다당체의 분리 제조방법.
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| KR930008153A (ko) | 1993-05-21 |
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