JPH04134096A

JPH04134096A - ペプチド誘導体および血栓症治療剤

Info

Publication number: JPH04134096A
Application number: JP2253849A
Authority: JP
Inventors: Kazuhisa Kashimoto; 和久樫本; Yusuke Hori; 祐輔堀; Yoshihisa Ishizuka; 石塚　善久
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1990-09-21
Filing date: 1990-09-21
Publication date: 1992-05-07
Anticipated expiration: 2016-04-25
Also published as: JP3162069B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

を産業上の利用分野］本発明はペプチド誘導体に関するものであり、詳しくは
、特定の構成を有するペプチドとヒアルロン酸とが結合
されたペプチド誘導体であって、血小板凝集を阻害し、
血小板血栓の生成を調節することができるペプチド誘導
体に関するものである。［従来の技術］血液中には、凝固作用に関与する成分としてフィブリノ
ーゲンと血小板とが存在し、例えば血管が損傷を受ける
と血小板１［ＩＬ栓が生じるが、この血栓は、先ず、血
小板とフィブリノーゲンとが結合することにより血小板
の凝集が開始され、血小板■１栓が生成される。そして
、フィブリノーゲンには結合活性部位としてアルギニン
（Ａｒｇ）−グリシン（Ｇｌｙ）−アスパラギン酸（Ａ
ｓｐ）から構成されるペプチドが存在することが知られ
ており、また、血小板にはこのペプチドに対する膜糖蛋
白質受容体（ｇ、ｐＩ［ｂ／ＩＩＩａ）が存在すること
が知られており、この受容体に前記結合活性部位を介し
てフィブリノーゲンが結合すると言われている。このことから、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−バリン（■ａ
ｌ）配列を有する合成ペプチド単体を血小板の前記受容
体に結合させてフィブリノーゲンの結合を阻害する事例
が報告されている（例えばＨａ　ｖ　ｅ　ｒ　ｓ　ｔ　
ｉ　ｃ　ｋその他　Ｂ　１　ｏ　ｏ　ｄ　、　韮工ｕ９
４６−９５２、（１９８５）等）。［発明が解決しようとする課題］ところが、前記のペプチド単体を用いた血小板の凝集阻
害は阻害率が低いという欠点があった。本発明は、血小板凝集の阻害率が高いペプチド誘導体の
提供を目的とするものである。［課題を解決するための手段］本発明は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸を構
成単位として有するペプチドに、ヒアルロン酸が共有結
合されていることを特徴とするペプチド誘導体を要旨と
するものである。Ａｓｐ−スレオニン（Ｓ　ｅ　ｒ　）、Ａｒｇ　−Ｇｌ
ｙ　−Ａ　ｓ　ｐ−アラニン（Ａｌａ　）　、Ａｒｇ　
−Ｇｌｙ　−ＡＳｐ−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）など
のテトラペプチド、或いはこれらの配列を鎖中または末
端に有するオリゴペプチドおよびポリペプチドなどが挙
げられる。これらのペプチドの製造方法としては従来慣
用されているペプチド合成方法が適用される。また、本発明であるペプチド誘導体としては前記ペプチ
ドの一種または二種以上の混合物にヒアルロン酸のカル
ボキシル基を共有結合させたもの挙げることができ、例
えばジメチルホルムアミド、クロロホルム、ホルムアミ
ド、テトラヒドロフランなどの有機溶媒または水性媒体
中にペプチドを適当な濃度に溶解し、この溶液中にカル
ボキシル基を活性化したヒアルロン酸本発明に用いられ
るヒアルロン酸はヒトを含めて全ての動物の体内で合成
され、体の各部でそれぞれ重要な機能を果たしている生
体物質であり、眼外科や整形外科の分野などで医薬品と
して利用されている安全性の高いムコ多糖類の一種であ
り、従来知られている鶏冠、水晶体、謄帯などからの抽
出物またはストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ）属のヒアルロン酸生産菌の培養によるものなど
を用いることができる。また、本発明に用いられるヒアルロン酸の分子量として
は２０００〜１０００万の範囲を埜げることかできる。本発明に使用するペプチドとしては、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐの配列を構成単位として有するもので、例えばＡ
ｒｇ　−Ｇｌｙ−Ａｓ　ｐ−ＶａＬ　Ａｒｇ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−セリン（Ｓｅｒ　）、Ａｒｇ　−Ｇｌｙ　−を
加え、適当な温度で所要時間反応させる方法などを用い
ることができる。また、ヒアルロン酸のカルボキシル基
を活性化する方法としては例えばＮ、Ｎ−ジシクロへキ
シルカルボジイミド、Ｎ、Ｎ−カルボニルイミダゾール
などの縮合剤を用いてＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、
Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどと反応させてカ
ルボキシル基を活性エステル化させる方法などを挙げる
ことができる。そして、このような本発明であるペプチド誘導体を血栓
治療剤として投与する場合は単独で或いは薬剤的に複合
可能な担体とともに使用される。例えば静脈内注射によ
り投与する場合には、溶液を等張にするために食塩或い
はグルコースなど他の溶質を添加した無菌溶液として使
用すればよい。投与量は投与方法、ベプチド誘導体の種
類、患者の状態などによって決定されるが、例えば静脈
内注射により投与する場合には２．５−５．０ｍ　ｇ　
／　Ｋ　ｇ　／日である。また、前記方法によりオリゴペプチドまたはポリペプチ
ドをヒアルロン酸のカルボキシル基に結合させて、ヒア
ルロン酸にＡｒｇ　−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列のトリペプチ
ドを構成単位として有するペプチド誘導体（後述の実施
例１）について、マウス（雄性、２０ｇ）に対する静脈
内注射による急性毒性（ＬＤ６ｏ）は約４０ｍｇ／ｋｇ
体重であった。［実施例］次に本発明の実施例について説明するが、本発明はこれ
らの実施例に限定されるものではない。尚、各実施例における修飾率（ヒアルロン酸次いで、ジ
メチルホルムアミドを濃縮し、２００ｍ１の水を加えた
後不溶物を除去し、セルロース透析膜（ＶＩＳＫＡＳＥ
　　５ＡＬＥ　Ｃ０ＲＰ、製　１８／３２（以下同様）
）を使用してニンヒドリンが消失するまで透析を行ない
、これを凍結乾燥させてペプチド誘導体　１７１．９　
ｍｇを得た。本実施例におけるペプチド誘導体のカルバゾール法によ
るヒアルロン酸含量は４６．９％、アミノ酸分析値はＡ
ｓｐ（１）、２．０２、Ｑｌｙ（２）、２．０２、Ｖａ
ｌ（１）、　１．００、Ａｒｇ（１）、　０．９１であ
り、修飾率は４４．４％であった。また、ニンヒドリン
テストは陰性であり、坂ロチストは陽性であった。尚、アミノ酸分析値の各成分の括弧内の数値は理論値を
表わす（以下同様）。

【実施例２１ヒアルロン酸ナトリウム（分子量１０００　ＫＤ　）中
のカルボキシル基にペプチドが結合している割合）は、
アミノ酸分析により求めたペプチド含量とカルバゾール
法により求めたヒアルロン酸含量との比から求めた。ま
た、ニンヒドリンテストおよび坂ロチストは生成された
ペプチド誘導体の０．１％溶液を濾紙上に５μｍスポッ
トして行なった。【実施例１】ヒアルロン酸ナトリウム（分子量１０００　Ｉ’Ｏ）　
）２００ｍｇをジメチルホルムアミド　２００ｍ１に溶
解し、これにＮ−ヒドロキシコハク酸イミド　５０ｍｇ
およびＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド１００
ｍｇを加えて１６時間撹拌し、その後　Ｈ−Ｇｌｙ　−
Ａｒｇ　−Ｇｌｙ　−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＮＨ２（以下ｒ
ＧＲＧＤＶＪという）　　２００ｍｇを加えて１６時間
撹拌した。２００ｍｇをジメチルホルムアミド　２００ｍ１に溶解
し、これにＮ−ヒドロキシコハク酸イミド　２５ｍｇお
よびＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド５０　ｍ
　ｇを加えて１６時間撹拌し、その後ｒＧＲＧ　Ｄ　Ｖ
　Ｊ　１００ｍｇを加えて１６時間撹拌した。次いで、ジメチルホルムアミドを濃縮し、２００ｍ１の
水を加えた後不溶物を除去し、セルロース透析膜を使用
してニンヒドリンが消失するまで透析を行ない、これを
凍結乾燥させてペプチド誘導体１７４．５　ｍｇを得た
。本実施例におけるペプチド誘導体のカルバゾール法によ
るヒアルロン酸含量は５７．９％、アミノ酸分析値はＡ
ｓｐ（１）、１．０６、Ｇｕｙ（２）、１．９７、Ｖａ
ｌ（１）、１．０２、Ａｒｇ（１）、０．９５であり、
修飾率は２５．９％であった。また、ニンヒドリンテス
トは陰性であり、坂ロチストは陽性であっ

【実施例３】ヒアルロン酸ナトリウム（分子量１０００　ＫＤ　）２
００ｍｇをジメチルホルムアミド　２００　ｍｌに溶解
し、これにＮ−ヒドロキシコハク酸イミド１５ｍｇおよ
びＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド６０ｍｇを
加えて１６時間撹拌し、その後ｒＧＲＧＤＶＪ６０ｍｇ
を加えて１６時間撹拌した。次いで、ジメチルホルムアミドを濃縮し、２００ｍ１の
水を加えた後不溶物を除去し、セルロース透析膜（１８
／　３２　）を使用してニンヒドリンが消失するまで透
析を行ない、これを凍結乾燥させてペプチド誘導体８６
．６ｍｇを得た。本実施例におけるペプチド誘導体のカルバゾール法によ
るヒアルロン酸含量は４１．８％、アた。

【実施例５１ヒアルロン酸ナトリウム（分子量１０００　ＫＤ　）の
代わりにヒアルロン酸ナトリウム（分子量１５０　ＫＤ
　）を用いて前記実施例２と同様の操作を行った。本実施例におけるペプチド誘導体のカルバゾール法によ
るヒアルロン酸含量は４１．８％、アミノ酸分析値はＡ
ｓｐ（１）、１．０３、Ｇｌｙ（２）、１．９８、ｖａ
ｌ（１）、１．０１、Ａｒｇ　（１）、０．９５であり
、修飾率は１７．１％であった。また、ニンヒドリンテ
ストは陰性であり、坂ロチストは陽性であった。【実施例６】ヒアルロン酸ナトリウム（分子量１０００　ＫＤ　）の
代わりにヒアルロン酸ナトリウム（分子量ミノ酸分析値
はＡｓｐ（１）、１．０３、Ｇｌｙ（２）、１．９８、
Ｖａｌ（１）、１．０１、Ａｒｇ（１）　、０．９５で
あり、修飾率は１６．２％であった。また、ニンヒドリ
ンテストは陰性であり、坂ロチストは陽性であった。

【実施例４）ヒアルロン酸ナトリウム（分子ｍ　１０００　ＫＤ　）
の代わりにヒアルロン酸ナトリウム（分子量１５０　Ｋ
Ｄ　）を用いて前記実施例１と同様の操作を行った。本実施例におけるペプチド誘導体のカルバゾール法によ
るヒアルロン酸含量は４２．１％、アミノ酸分析値はＡ
ｓｐ（１）、１．０１、Ｇｌｙ　（２）、１．９９、Ｖ
ａｌ（１）、１．０３、Ａｒｇ　（１）、０．９６であ
り、修飾率は４２．２％であった。また、ニンヒドリン
テストは陰性であり、坂ロチストは陽性であっ１５０　
ＫＤ　）を用いて前記実施例３と同様の操作を行った。本実施例におけるペプチド誘導体のカルバゾール法によ
るヒアルロン酸含量は５４．６％、アミノ酸分析値はＡ
ｓｐ（１）、１．０３５、Ｇｌｙ　（２）、２．００、
Ｖａｌ（１）、１．０３、Ａｒｇ　（１）、０．９４で
あり、修飾率は１４．９％であった。また、ニンヒドリ
ンテストは陰性であり、坂ロチストは陽性であった。【実施例７】ヒアルロン酸ナトリウム（分子量１０００　ＫＤ　）の
代わりにヒアルロン酸ナトリウム（分子量１０　ＫＤ　
）を用いて前記実施例１と同様の操作を行った。本実施例におけるペプチド誘導体のカルバゾール法によ
るヒアルロン酸含量は３７．３％、アミノ酸分析値はＡ
ｓｐ（１）、１．０５、Ｇｌｙ　（２）、２．０６．　
Ｖａｌ（１）、　１．００、Ａｒｇ　（１）、０．８９
であり、修飾率は８９．３％であった。また、ニンヒド
リンテストは陰性であり、坂ロチストは陽性であった。

【実施例８）ヒアルロン酸ナトリウム（分子量１０００　ＫＤ　）の
代わりにヒアルロン酸ナトリウム（分子量１０ＫＤ）を
用いて前記実施例２と同様の操作を行った。本実施例におけるペプチド誘導体のカルバゾール法によ
るヒアルロン酸含量は３９．８％、アミノ酸分析値はＡ
ｓｐ（１）、１．０１、Ｇｕｙ　（２）、２．０１、Ｖ
ａｌ（１）、１．０２、Ａｒｇ（１）、０．９４であり
、修飾率は３９．９％であった。また、ニンヒドリンテ
ストは陰性であり、坂ロチストは陽性であっいて前記実
施例７と同様の操作を行った。本実施例におけるペプチド誘導体のカルバゾール法によ
るヒアルロン酸含量は３７．３％、アミノ酸分析値はＡ
ＳＩ）（１）、１．０１、Ｇｕｙ　（２）、１．９９．
８ｅｒ　（１）、１．０２、Ａｒｇ　（１）、０．９６
であり、修飾率は８８．６％であった。また、ニンヒド
リンテストは陰性であり、坂ロチストは陽性であった。【実施例１１１ｒＧＲＧＤＶＪの代わりにＨ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ｒＧＲＧＤＦＪ　）を用い
て前記実施例７と同様の操作を行った。本実施例におけるペプチド誘導体のカルバゾール法によ
るヒアルロン酸含量は３８．４％、アミノ酸分析値はＡ
ＳＩ）（１）、１．０１、Ｇｕｙ　（２）、１．９９、
　Ｐｈｅ（１）、１．００．　Ａｒｇ（１）、０．９６
であり、修【実施例９】ヒアルロン酸ナトリウム（分子量１０００　ＫＤ　）の
代わりにヒアルロン酸すｌ・リウム（分子量１０　ＫＤ
　）を用いて前記実施例３と同様の操作を行った。本実施例におけるペプチド誘導体のカルバゾール法によ
るヒアルロン酸含量は４１．０％、アミノ酸分析値はＡ
ｓｐ（１）、１．０２、Ｇｌｙ　（２）、１．９９、Ｖ
ａｌ（１）、１．０５、Ａｒｇ　（１）、０．９５であ
り、修飾率は３９．９％であった。また、ニンヒドリン
テストは陰性であり、坂ロチストは陽性であった。

【実施例１０】ｒＧＲＧＤＶＪの代わりにＨ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ−８ｅｒ−ＮＨ２（ｒＧＲＧＤＳＪ　）を用飾
率は８４．５％であった。また、ニンヒドリンテストは
陰性であり、坂ロチストは陽性であった。

【実施例１２］ｒＧＲＧＤＶＪの代わりにＨ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ−Ａｌａ−ＮＨ２（ｒＧＲＧＤＡｊ　）を用い
て前記実施例７と同様の操作を行った。本実施例におけるペプチド誘導体のカルバゾール法によ
るヒアルロン酸含量は３８．３％、アミノ酸分析値はＡ
８ｐ（１）、１．０１、Ｇｌｙ　（２）、１．９９、　
Ａｌａ（１）、０．９９、Ａｒｇ　（１）、０．９７で
あり、修飾率は８６．７％であった。また、ニンヒドリ
ンテストは陰性であり、坂ロチストは陽性であった。【実施例１３】ｒＧＲＧＤＶＪの代わりにＨ−Ｇｌｙ　−ＡｒｇＧｌｙ
−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（ｒＧＲＧＤＹＪ　）を用い
て前記実施例７と同様の操作を行った。本実施例におけるペプチド誘導体のカルバゾール法によ
るヒアルロン酸含量は３７．７％、アミノ酸分析値はＡ
ｓｐ（１）、１．０１、Ｇｕｙ　（２）、１．９９、Ｔ
ｙｒ　（１）、０．９９、Ａｒｇ　（１）、１．００で
あり、修飾率は８４．４％であった。また、ニンヒドリ
ンテストは陰性であり、坂ロチストは陽性であった。次に、前記各実施例に示したペプチド誘導体の修飾率、
旋光度（濃度：　１０ｍｇ　／　ｍｌ、　Ｈ２０）およ
びコラーゲンによる血小板凝集に対する阻害率を比較例
とともに次表に示す。尚、阻害率測定用の血液は５週齢のマウスをエーテル麻
酔下で開腹し、工大静脈から抗凝固剤（３，２％クエン
酸ナトリウム溶液）　０．１　ｍｌを添加して採血した
０、９　ｍｌを３７°Ｃに保温し３．５時間以内のもの
使用した。また、測定は前記血液をコラーゲン５μｇ　
（ＣＨＲＯＮＯ−ＬＯＧ）および所定濃度（ペプチドの
濃度として２．５Ｘ１０−　’　Ｍ　）の各実施例また
は比較例の試料とともにインキュベートし、６分後の血
小板凝集能を全血凝集能測定機（ＣＨＲＯＮＯ−ＬＯＧ
　５４０；Ｂａｘｔｅｒ）により行ない、次式により阻
害率（％）を求めた阻害率（％）　＝Ｃａ−８ａ　／　ＣａＸ１００［但し
Ｃａは試料無添加の血液における６分後のコラーゲン凝
集能、Ｓａは試料添加の血液における６分後のコラーゲ
ン凝集能を示す］（以下余白）第１表［作用］上記第１表によれば、本発明のペプチド誘導体が従来か
ら血小板凝集の阻害剤として知られている比較例である
ペプチド単独のものに比べて数倍の阻害率を有している
ことが判る。これは、ペプチド単独では血小板に存在す
る受容体に対応する量が必要であるのに対して、ヒアル
ロン酸が結合した本発明のペプチド誘導体の場合にはヒ
アルロン酸が受容体を物理的に阻害して少ないペプチド
量で大きな阻害率を発揮するためであると考えられる。このことは第１図に示した一定のペプチド含量（２，５
Ｘ１０−６Ｍ）においてヒアルロン酸の分子量を変化さ
せた場合の本発明であるペプチド誘導体の血小板凝集の
阻害率と修飾率との関係において、ヒアルロン酸の分子
量が大きい場合がより効果的であることからも推察され
る。また、第２図乃至第１１図にヒアルロン酸く分子量１０
００ＫＤ、１５０ＫＤ、ｌ０ＫＤ　）、ｒＧＲＧＤ■」
ならびに実施例１乃至８に示したペチド誘導体の赤外吸
収曲線を示す（赤外分光光度計：日本電子株式会社製、
ＪＩＲＲＦＸ３００２（ＢＵ）０．５％ＫＢｒ）。［発明の効果　］以上の構成を有する本発明によれば、低用量のペプチド
含量で血小板凝集をきわめて有効に阻害し、血小板血栓
生成を容易に調節することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明であるペプチド誘導体の血小板凝集の阻
害率と修飾率との関係を示すグラフ、第２図乃至第１１
図は赤外分光光度計によるＯＭ）０　　　　　　　　酬口旨（％）由　示　和１吸収曲線を示すものであり、第２図はヒアルロン酸（分
子量１０００ＫＤ）の吸収曲線、第３図はヒアルロン酸
（分子量１５０ＫＤ）の吸収曲線、第４図はヒアルロン
酸（分子量１０ＫＤ）の吸収曲線、第５図はｒＧＲＧＤ
ＶＪの吸収曲線、第６図は実施例１に示したペプチド誘
導体の吸収曲線、第７図は実施例２に示したペプチド誘
導体の吸収曲線、第８図は実施例５に示したペプチド誘
導体の吸収曲線、第９図は実施例６に示したペプチド誘
導体の吸収曲線、第１０図は実施例７に示したペプチド
誘導体の吸収曲線、第１１図は実施例８に示したペプチ
ド誘導体の吸収曲線である。

Claims

【特許請求の範囲】

　アルギニン−グリシン−アスパラギン酸を構成単位と
して有するペプチドに、ヒアルロン酸が共有結合されて
いることを特徴とするペプチド誘導体。