CN107207627A - 具有膜透过性肽链的多糖衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明的多糖衍生物具有下述通式(1)表示的部分结构。构成下述通式(1)中的X2的氨基酸中的至少1个优选为碱性氨基酸。(式中，X1表示从中性氨基酸或ω‑氨基烷酸中除去末端氨基及末端羧基而得到的残基，X2表示从膜透过性肽中除去末端氨基及末端羧基而得到的残基，X3表示羟基、氨基、碳数为1～4的烷氧基或苄氧基，a表示0或1的数，b表示0～50的数。)

Description

具有膜透过性肽链的多糖衍生物
技术领域
本发明涉及在将低膜透过性化合物导入细胞内或粘膜内时有用的多糖衍生物。
背景技术
近年来，通过将合成肽、蛋白、甚至DNA、糖导入细胞内、调节细胞内的蛋白相互作用、控制细胞内信息传递、转录等，进行着阐明它们的功能、诱导特殊的功能的尝试。通过这样的方法，可期待进行至今成谜的遗传信息的阐明、病原的阐明、或其治疗方法的开发。另外，通过ES细胞、iPS细胞的开发，利用核酸或蛋白控制细胞功能的技术的重要性不断增加。
通常，多肽、核酸、糖等水溶性高分子量物质由于具有高的亲水性而难以通过细胞膜。因此，作为将它们导入细胞内的方法，已知微注射法、电穿孔法、磷酸钙法、脂转染法、病毒载体法、膜透过性肽法等。
其中，膜透过性肽法是利用膜透过性肽诱发细胞的巨胞饮的方法。作为膜透过性肽法，已知使膜透过性肽与欲导入细胞的目标化合物共价键合、进行导入的方法(例如参照专利文献1及2)，或使侧链具有膜透过性肽的高分子化合物与欲导入细胞的目标化合物共存、仅导入目标化合物的方法(例如参照专利文献3及4)。使目标化合物与膜透过性肽共价键合进行导入的方法虽然对细胞的损害小，但需要繁杂的前处理。另一方面，使用侧链具有膜透过性肽的高分子化合物的方法简便，但以往已知的侧链具有膜透过性肽的高分子化合物的细胞毒性稍高，有时在使用浓度上存在限制，在提高目标化合物的导入效率方面成为问题。
另外，提出了将侧链具有膜透过性肽的高分子应用于药剂从上皮吸收的吸收促进剂(例如参照专利文献5)，但对粘膜具有刺激性、在实用化方面成为课题。
另一方面，已知将具有羧基的多糖用聚胺交联而成的化合物(例如参照专利文献6)在医疗、医药及皮肤化妆品领域中作为增稠剂、润滑剂、凝胶化剂等是有用的。但是，尚未已知使具有羧基的多糖与膜透过性肽反应而成的化合物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：US2003/229202A1
专利文献2：日本特开2005-052083号公报
专利文献3：US2010/113559A1
专利文献4：日本特开2011-229495号公报
专利文献5：日本特开2010-100781号公报
专利文献6：US2004/167098A1
发明内容
发明所要解决的课题
本发明是鉴于上述实际情况而完成的，本发明的目的在于提供能够将核酸、蛋白等水溶性高分子量物质或药剂以简便的方法、高的效率导入细胞内或粘膜内、且细胞毒性和粘膜刺激性低的化合物。
用于解决课题的方法
本发明者们发现在侧链具有膜透过性肽基团的多糖衍生物的细胞毒性和粘膜刺激性小，通过使用这样的化合物，能够将核酸、蛋白等水溶性高分子量物质或药剂容易地导入细胞内或粘膜内，从而完成了本发明。
即，本发明涉及具有下述通式(1)表示的部分结构的多糖衍生物。
[化学式1]
(式中，X1表示从中性氨基酸或ω-氨基烷酸中除去末端氨基及末端羧基而得到的残基，X2表示从膜透过性肽中除去末端氨基及末端羧基而得到的残基，X3表示羟基、氨基、碳数为1～4的烷氧基或苄氧基，a表示0或1的数，b表示0～50的数)。
发明效果
根据本发明，具有通式(1)表示的部分结构的多糖衍生物的细胞毒性和粘膜刺激性低，即使不进行繁杂的前处理，也能够以高的效率将低膜透过性化合物导入细胞内或粘膜内。
具体实施方式
以下，对本发明实施方式的一个例子进行说明，但本发明并不限于以下实施方式。其中，本发明中，低膜透过性化合物是指生物利用度(bioavailability)低的化合物，具体而言是指生物学上的利用率(extent of bioavailability)为50％以下的化合物。生物学上的利用率可通过下式计算。
生物学上的利用率(％)＝100×(通过经口给予到达血液中的量)/(通过静脉给予到达血液中的量)
这里所说的“到达血液中的量”以被血中浓度和横轴(时间轴)包围的部分的面积(血药浓度－时间曲线下面积：AUC)求出。
具有通式(1)表示的部分结构的多糖衍生物(以下有时称为本发明的多糖衍生物)具有膜透过性肽残基，能够使低膜透过性化合物高效率地摄入到细胞内。通常认为膜透过性肽被摄入到细胞内的机理为，膜透过性肽通过诱发细胞的巨胞饮而被摄入，因此当周围存在低膜透过性化合物时，这些低膜透过性化合物与膜透过性肽一起被摄入。为本发明的多糖衍生物时，在膜透过性肽残基作用下，巨胞饮在细胞的多个部位被诱发，但本发明的多糖衍生物为巨大分子，细胞难以将本发明的多糖衍生物的1个分子从多个部位摄入。因此，当本发明的多糖衍生物的周围存在低膜透过性化合物时，在本发明的多糖衍生物作用下，低膜透过性化合物被诱发了巨胞饮的细胞偶发且持续地摄入。因此认为，并不一定需要膜透过性肽残基与低膜透过性化合物之间的相互作用，仅通过使混合有本发明的多糖衍生物和低膜透过性化合物而成的物质与细胞或粘膜接触，即能够将低膜透过性化合物导入细胞内或粘膜内。需要说明的是，本说明书中所述的机理均为推测，并不是对本发明进行限定。
[通式(1)表示的部分结构]
对通式(1)表示的部分结构进行说明。通式(1)所示的糖单元可以为L体或D体中的任一种，通式(1)所示的糖单元与其他糖单元的键可以为α-糖苷键或β-糖苷键中的任一种。通式(1)中，a表示0或1的数。a为1时，在本发明的多糖衍生物的制造方法上，由于有时在同一糖单元上导入多个膜透过性肽残基、粘度增加导致操作性降低或低膜透过性化合物的导入效率降低，因此a优选为0的数。
通式(1)中，X2表示从膜透过性肽中除去末端氨基及末端羧基而得到的残基。本发明的多糖衍生物的膜透过性肽残基可以根据细胞或粘膜、欲导入的低膜透过性化合物来适当选择，但优选构成膜透过性肽残基的氨基酸中的至少1个为碱性氨基酸。另外，碱性氨基酸可以为L体或D体中的任一种，可以根据细胞或粘膜、欲导入的低膜透过性化合物来适当选择。
作为碱性氨基酸，可列举出精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、羟基赖氨酸、组氨酸等，其中优选含胍基的氨基酸、更优选精氨酸。由于膜透过性肽残基中的碱性氨基酸的比例越高、低膜透过性化合物的导入效率越高，因此碱性氨基酸与构成膜透过性肽的总氨基酸的比例以摩尔基准计优选为50％以上、更优选为70％以上。构成膜透过性肽残基的氨基酸中，除碱性氨基酸以外的氨基酸优选为中性氨基酸。需要说明的是，本说明书中提及氨基酸时，只要没有特别说明，则指α-氨基酸。
构成膜透过性肽残基的氨基酸的数从低膜透过性化合物的导入效率提高的角度出发，优选为5～30、更优选为6～20、最优选为7～15。
作为膜透过性肽的优选的具体例子，可列举出7～30个精氨酸肽键合而成的精氨酸寡聚物、具有GRKKRRQRRRPPQ构成的氨基酸序列的肽(通称HIV-1Tat：序列号1)、具有TRQARRNRRRRWRERQR构成的氨基酸序列的肽(通称HIV-1Rev：序列号2)、具有RRRRNRTRRNRRRVR构成的氨基酸序列的肽(通称FHV Coat：序列号3)、具有TRRQRTRRARRNR构成的氨基酸序列的肽(通称HTLV-II Rex：序列号4)、具有KLTRAQRRAAARKNKRNTR构成的氨基酸序列的肽(通称CCMV Gag：序列号5)等亲水性的碱性肽；具有RQIKIWFQNRRMKWKK构成的氨基酸序列的肽(通称Antennapedia：序列号6)、具有KMTRAQRRAAARRNRWTAR构成的氨基酸序列的肽(通称BMW Gag：序列号7)、具有RQIKIWFQNRRMKWKK构成的氨基酸序列的肽(通称Penetratin：序列号8)、具有NAKTRRHERRRKLAIER构成的氨基酸序列的肽(通称P22N：序列号9)、具有DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPDDPVD构成的氨基酸序列的肽(通称VP22：序列号10)等两亲性的碱性肽；具有GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL构成的氨基酸序列的肽(通称Transportan：序列号11)、具有AGYLLGKINLKALAALAKKIL构成的氨基酸序列的肽(通称TP-10：序列号12)等疏水性的碱性肽。其中，从低膜透过性化合物的导入效率优异的角度出发，优选亲水性的碱性肽、更优选精氨酸寡聚物。精氨酸寡聚物中，精氨酸的重复数优选为7～20、更优选为7～15、最优选为7～10。
X1表示从中性氨基酸或ω-氨基烷酸中除去末端氨基及末端羧基而得到的残基，b表示0～50的数。为中性氨基酸时，可以是L体或D体中的任一种。作为中性α-氨基酸，可列举出例如丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、羟基脯氨酸等；作为ω-氨基烷酸，可列举出3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸、10-氨基癸酸、11-氨基十一烷酸等。作为适用于X1的中性氨基酸，从低膜透过性化合物的导入效率提高的角度出发，优选甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸，更优选甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸，最优选甘氨酸。另外，从低膜透过性化合物的导入效率的角度或合成容易性的角度出发，b优选为1～30的数、更优选为1～20的数、最优选为1～10的数。b为2～50的数时，X1可以为1种中性氨基酸残基、也可以为2种以上的组合。
通式(1)中，X3表示羟基、氨基、碳数为1～4的烷氧基或苄氧基。从低膜透过性化合物的导入效率的角度出发，作为X3，优选羟基、氨基、叔丁氧基、苄氧基，更优选羟基、氨基，最优选氨基。
本发明的多糖衍生物中，通式(1)表示的部分结构多个存在时，多个存在的(-CH2-O-CH2-)a、(-NH-X1-CO-)b、X2及X3可以分别相同也可以不同。
通式(1)表示的部分结构从低膜透过性化合物的导入效率的角度出发，优选为下述通式(2)表示的部分结构。
[化学式2]
(式中，X1～X3及b与通式(1)中的含义相同。)
[本发明的多糖衍生物]
对本发明的多糖衍生物进行说明。本发明的多糖衍生物的特征在于具有通式(1)表示的部分结构，当通式(1)表示的部分结构的比例太少时，低膜透过性化合物的导入效率低，而太多时，本发明的多糖衍生物的制造变得困难，同时本发明的多糖衍生物变得高粘度、低膜透过性化合物的导入效率降低，因此本发明的多糖衍生物中的通式(1)表示的部分结构的比例相对于本发明的多糖衍生物的总糖单元优选为0.001～0.8、更优选为0.005～0.6、最优选为0.01～0.5。这里所说的比例是指部分结构的数与糖单元的数的比例。另外，这里所说的糖单元是指单糖单元。
另外，当本发明的多糖衍生物的分子量太小时，本发明的多糖衍生物本身有时会被细胞摄入，而太大时，变得高粘度、低膜透过性化合物的导入效率降低，因此本发明的多糖衍生物的分子量以重均分子量计优选为5000～5000万、更优选为1万～4000万、最优选为5万～3000万。其中，本发明中，本发明的多糖衍生物的重均分子量是指，使用水系溶剂进行GPC分析时用普鲁兰多糖换算的重均分子量(后述的具有通式(1a)表示的部分结构的多糖衍生物也同样)。
本发明的多糖衍生物中，从低膜透过性化合物的导入效率高的角度出发，优选通式(3)～(5)中的任一个表示的多糖衍生物、更优选通式(3)表示的多糖衍生物。
[化学式3]
(式中，c及d表示c+d达到通式(3)表示的多糖衍生物的重均分子量为5000～5000万、d/(c+d)为0.002～1的数，X1～X3及b与通式(1)中的含义相同。其中，c的单元与d的单元无规状地连接。)
[化学式4]
(式中，e、f及g表示e+f+g达到通式(4)表示的多糖衍生物的重均分子量为5000～5000万的数、g/(e+f+g)达到0.001～1的数，X1～X3及b与通式(1)中的含义相同。其中，e的单元、f的单元及g的单元无规状地连接。)
[化学式5]
(式中，h、j、k及m为h+j+k+m达到通式(5)表示的多糖衍生物的重均分子量为5000～5000万的数、(k+m/(h+j+k+m)达到0.001～1的数，X1～X3及b与通式(1)中的含义相同。其中，h的单元、j的单元、k的单元及m的单元无规状地连接。)
[本发明的多糖衍生物的制造方法]
本发明的多糖衍生物例如可以通过使具有下述通式(1a)表示的部分结构的多糖衍生物的羧基与下述通式(1a)表示的肽化合物的氨基发生肽反应而得到。羧基与氨基的反应可以使用公知的方法，可列举出例如用N-羟基琥珀酰亚胺将羧基进行琥珀酰亚胺酯化后、使氨基反应的方法等。
[化学式6]
(式中，a与通式(1)中的含义相同。)
[化学式7]
(式中，X1～X3及b与通式(1)中的含义相同。)
具有通式(1a)表示的部分结构的多糖衍生物中，作为a为0的化合物，可列举出果胶或果胶酸、透明质酸、海藻酸等；作为a为1的化合物，可列举出羧甲基化淀粉、羧甲基化纤维素、羧甲基化β葡萄糖等羧甲基化多糖衍生物。其中，从透明质酸得到通式(3)表示的多糖衍生物，从果胶或果胶酸得到通式(4)表示的多糖衍生物，从海藻酸得到通式(5)表示的多糖衍生物。
[低膜透过性化合物]
本发明的多糖衍生物通过作为用于将低膜透过性化合物导入细胞内或粘膜内的导入剂使用，能够导入各种低膜透过性化合物。作为这样的低膜透过性化合物，可列举出例如胰岛素及胰岛素分泌促进剂(例如Exendin-4、GLP-1)等肽-蛋白性药物、甾体激素、非甾体系镇痛抗炎症剂、镇定剂、抗高血压药、缺血性心脏疾病治疗药、抗组胺药、抗哮喘药、抗帕金森药、脑循环改善药、制吐剂、抗抑郁药、抗心律失常药、抗凝血药、抗痛风药、抗真菌药、抗痴呆药、干燥综合征(syndrome)治疗药、麻药性镇痛药、β阻断药、β1激动剂、β2激动剂、副交感神经激动剂、抗肿瘤药、利尿药、抗血栓药、组胺H1受体拮抗药、组胺H2受体拮抗药、抗过敏药、戒烟辅助药、维生素等药物；脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及它们的类似物或衍生物(例如肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯DNA等)等核酸化合物；酶、抗体、糖蛋白、转录因子等肽化合物；普鲁兰多糖、支链淀粉、糖淀粉、糖原、环糊精、葡聚糖、羟乙基葡聚糖、甘露聚糖、纤维素、淀粉、海藻酸、甲壳素、壳聚糖、透明质酸等多糖衍生物及它们的衍生物等。
本发明的多糖衍生物适用的细胞可以为动物、植物、细菌等的任意细胞，从低膜透过性化合物的导入效率的角度出发，优选人等哺乳类的细胞。本发明的多糖衍生物适用的粘膜从低膜透过性化合物的导入效率的角度出发，也优选人等哺乳类的细胞。
[细胞]
通过使用本发明的多糖衍生物，可将低膜透过性化合物导入各种细胞内，还可将低膜透过性化合物导入分散在培养液(也称为液体培养基)等中的细胞、粘附在固定培养基等上的细胞、生物体组织的细胞等任意细胞。细胞大致分为形成组织细胞、神经细胞等的粘附系的细胞、和血细胞等游离系的细胞。对于游离系的细胞，无法应用微注射法或电穿孔法而可以应用磷酸钙法、脂转染法、病毒载体法等，但其并不是可满足导入效率的细胞。本发明的导入方法不仅能够将低膜透过性化合物以高的导入效率导入粘附系的细胞、而且能够导入游离系的细胞。
[导入细胞内的方法]
使用本发明的多糖衍生物将低膜透过性化合物导入细胞内时，可以使含有本发明的多糖衍生物和低膜透过性化合物的水性溶液或水性分散液与细胞接触，不需要如使用了病毒载体法或膜透过性肽的以往的导入方法那样繁杂的前处理，而能够对细胞不太产生不良影响地将低膜透过性化合物导入细胞内。
作为使本发明的多糖衍生物和低膜透过性化合物溶解或分散、制成含有它们的水性溶液或水性分散液的水性介质，除了蒸馏水、细胞培养通常使用的培养液以外，可列举出生理盐水、5质量％葡萄糖水溶液等等渗水，从对细胞的影响小的角度出发，优选培养液、生理盐水及5质量％葡萄糖水溶液。
将细胞悬浮在水性溶液或水性分散液中时，可以使细胞悬浮在含有低膜透过性化合物和本发明的多糖衍生物的水性溶液或水性分散液，也可以根据需要，将含有这3者的悬浮液搅拌、振荡。另外，由于细胞粘附在固体培养基等上或者细胞组织大等理由，无法使细胞悬浮在水性溶液或水性分散液中时，可以将细胞浸渍到含有低膜透过性化合物和本发明的多糖衍生物的水性溶液或水性分散液中。
将低膜透过性化合物导入细胞内时，本发明的多糖衍生物的使用浓度没有特殊限定，优选在水性溶液或水性分散液中为0.1μg/mL～10mg/mL。另外，所导入的低膜透过性化合物的浓度也没有特殊限定，优选在水性溶液或水性分散液中为0.5μg/mL～10mg/mL。此外，将细胞悬浮在以培养液或生理盐水等为介质的水性溶液或水性分散液中时的细胞浓度也没有限定，优选在水性溶液或水性分散液中为1万～200万个细胞/mL。
使本发明的多糖衍生物、欲导入的低膜透过性化合物及细胞这3者共存的时间没有特殊限定，优选为30分钟～24小时。
[粘膜]
通过将本发明的多糖衍生物用于粘膜内，能够将低膜透过性化合物导入各种粘膜内。作为粘膜，可列举出鼻粘膜、口腔粘膜、阴道粘膜、直肠粘膜、眼粘膜、胃粘膜、肠道粘膜等。由于以往的侧链具有膜透过性肽的高分子化合物对粘膜的刺激性大，因此例如用于鼻粘膜时，有时会发痒，但使用本发明的多糖衍生物时该发痒症状减轻。
[导入粘膜内的方法]
使用本发明的多糖衍生物将低膜透过性化合物导入粘膜内时，可以使本发明的多糖衍生物与低膜透过性化合物的混合物粘附在粘膜上，只要是该混合物不易从粘膜剥离的剂型，则剂型没有限定。优选的剂型因粘膜的不同而不同，可列举出例如丸剂、片剂、锭片(troche)、贴剂、栓剂、糊剂等。本发明的多糖衍生物与低膜透过性化合物的混合物根据剂型，可选择液状、乳状、悬浮状、凝胶状、粉末状、固态状等形状。低膜透过性化合物根据目的，可以仅导入1种，也可以将2种以上组合。另外，根据需要，还可以并用赋形剂、乳化剂、分散剂、凝胶化剂、保湿剂等。
[小突起阵列的利用]
本发明的多糖衍生物无法将低膜透过性化合物经由皮肤导入细胞内，但可通过利用小突起阵列(在片材上配置有微细的突起的药剂递送部件。例如US2005025778A1、日本特开2008-006178等)，能够将低膜透过性化合物导入皮肤下的细胞内。例如通过将表面涂布有本发明的多糖衍生物与低膜透过性化合物的混合物的小突起阵列、或具有含有本发明的多糖衍生物与低膜透过性化合物的混合物的小突起的小突起阵列贴到皮肤表面，使微细的突起穿透皮肤，使本发明的多糖衍生物和低膜透过性化合物浸透到皮肤下，由此能够将低膜透过性化合物导入皮肤下的细胞内。
实施例
以下，通过实施例对本发明进一步进行说明，但本发明并不限于这些实施例。其中，只要没有特殊限定，实施例中的“份”、“％”是指以质量基准计的单位。
<制造例1：多糖衍生物1>
在1mL二甲基亚砜(DMSO)中溶解50mg透明质酸(重均分子量：5000～150000)。向该溶液中添加溶解在0.5mL的DMSO中的47mg N-羟基琥珀酰亚胺，进而添加溶解在0.5mL的DMSO中的82mg的二环己基碳二亚胺(DCC)，在室温(25℃)下搅拌24小时进行反应。将析出的固体通过过滤滤除，添加0.5mL的DMSO，获得经琥珀酰亚胺酯化的透明质酸的DMSO溶液2.5mL。
向经琥珀酰亚胺酯化的透明质酸的DMSO溶液1mL中混合八精氨酸的末端羧基经酰胺化的化合物(GL Biochem公司制、商品名：RRRRRRRR-NH2，[R＝D-Arg]TFA Salt)的DMSO溶液(500mg/mL)0.4mL，在60℃下搅拌24小时，进行反应。反应后，将反应溶液加入纤维素透析管(无缝纤维素管，和光纯药公司制)中，将管的两口绑住后，用离子交换水进行2日透析。之后，将管的内容物冷冻干燥，得到102mg本发明的多糖衍生物1。多糖衍生物1为通式(3)中的b为0、X2为从八精氨酸除去末端氨基及末端羧基而得到的残基、X3为氨基、d/(c+d)为0.58的化合物。其中，d/(c+d)的值通过NMR的积分值求出。由该d/(c+d)的值算出通式(1)表示的部分结构与多糖衍生物1的总糖单元的比例为0.29。多糖衍生物1的重均分子量为22万。
<制造例2：多糖衍生物2>
代替制造例1中的八精氨酸的末端羧基经酰胺化的化合物的DMSO溶液(500mg/mL)0.4mL，使用通式(1b)中的b为4、X1为从甘氨酸除去末端氨基及末端羧基而得到的残基、X2为八精氨酸残基、X3为氨基的化合物(RS Synthesis公司制、商品名：H-(Gly)4-(D-Arg)8-NH2(纯度：90％)，TFA Salt)的DMSO溶液(320mg/mL)0.5mL，除此以外，进行与制造例1同样的操作，得到60mg本发明的多糖衍生物2。多糖衍生物2为通式(3)中的b为4、X1为从甘氨酸除去末端氨基及末端羧基而得到的残基、X2为从八精氨酸除去末端氨基及末端羧基而得到的残基、X3为氨基、d/(c+d)为1.0的化合物。其中，d/(c+d)的值通过NMR的积分值求出。由该d/(c+d)的值算出通式(1)表示的部分结构与多糖衍生物2的总糖单元的比例为0.5。另外，多糖衍生物2的重均分子量为37万。
<比较化合物1>
按照日本特开2011-229495号公报的制造例1进行制造，得到比较化合物1。比较化合物1为具有下述结构的化合物(式中，R表示精氨酸残基)。
[化学式8]
<比较化合物2>
按照US2010113559A1的制造例、使用重均分子量为约10万的壳聚糖，制造比较化合物2。比较化合物2为具有下述结构的化合物(式中，R表示精氨酸残基、x：y＝80：20)。
[化学式9]
<细胞>
CHO细胞：中国仓鼠卵巣来源的细胞
<培养基>
Ham's F12培养基(商品名、和光公司制)
Opti-MEM培养基(商品名、Life Technologies公司制)
<试剂>
胰蛋白酶/EDTA溶液：0.25％的胰蛋白酶、1mmol/L的EDTA水溶液
<细胞毒性试验试剂盒>
Cell Counting Kit-8(商品名、同仁化学公司制)
<低膜透过性化合物>
FITC-BSA：荧光素标记-牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司制)
<导入细胞内的效率>
向24孔平板的各孔中播种CHO细胞的Ham's F12培养基悬浮液(2×105个细胞/mL)500μL，用二氧化碳孵育箱前培养24小时。除去上清的培养基后，添加FITC-BSA的Opti-MEM培养基溶液(10μg/mL)250μL，进而添加多糖衍生物1～2或比较化合物1～2的Opti-MEM培养基溶液(100μg/mL)250μL，用二氧化碳孵育箱培养1小时。除去上清的培养基溶液，用磷酸缓冲生理盐水500μL洗涤2次，然后添加胰蛋白酶/EDTA溶液100μL，将经培养的CHO细胞从平板剥离、使其分散。接着，添加0.08％台盼蓝溶液100μL、使细胞悬浮，回收到微量管中。使回收的细胞悬浮液从细胞滤网(Cell Strainer)通过，用流式细胞仪测定MFI(平均荧光强度)。另外，将未使用多糖衍生物者作为空白。将结果示于表1。
表1
MFI
多糖衍生物1 122
多糖衍生物2 135
比较化合物1 127
比较化合物2 42.4
空白 5.64
细胞外的FITC-BSA在台盼蓝作用下失活而不发出荧光，仅被导入细胞内的FITC-BSA发出荧光。MFI表示单位细胞的每1个的荧光强度的平均值，因此MFI的值越大，则表示为水溶性高分子化合物且为低膜透过性化合物的FITC-BSA越被摄入到细胞内。根据表1的结果可知，多糖衍生物1及2的水溶性高分子量物质在细胞内的导入效率高。
<细胞毒性试验>
向96孔平板的各孔中播种CHO细胞的Ham's F12培养基悬浮液(2×105个细胞/mL)100μL，用二氧化碳孵育箱前培养24小时。添加多糖衍生物1～2或比较化合物1～2的Opti-MEM培养基溶液(2g/mL)10μL，用二氧化碳孵育箱培养1小时，进而添加Cell Counting Kit-8 10μL，在二氧化碳孵育箱中静置1小时。然后，测定450nm下的吸光度，将加入了多糖衍生物1～2或比较化合物1～2时的吸光度与未加入时的吸光度的比例(％)作为细胞存活率。将结果示于表2。其中，细胞存活率越低，表示细胞毒性越高。
表2
细胞存活率(％)
多糖衍生物1 75
多糖衍生物2 78
比较化合物1 41
比较化合物2 62
从表2的结果可知，多糖衍生物1及2与比较化合物1及2相比，细胞存活率高、细胞毒性低。
序 列 表
<110> 学校法人常翔学园；株式会社艾迪科
<120> 具有膜透过性肽链的多糖衍生物
<130> A1506
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hydrophilic basic peptide
<400> 1
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hydrophilic basic peptide
<400> 2
Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln
1 5 10 15
Arg
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hydrophilic basic peptide
<400> 3
Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg
1 5 10 15
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hydrophilic basic peptide
<400> 4
Thr Arg Arg Gln Arg Thr Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hydrophilic basic peptide
<400> 5
Lys Leu Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Lys Asn Lys Arg
1 5 10 15
Asn Thr Arg
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiphilic basic peptide
<400> 6
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiphilic basic peptide
<400> 7
Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp
1 5 10 15
Thr Ala Arg
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiphilic basic peptide
<400> 8
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiphilic basic peptide
<400> 9
Asn Ala Lys Thr Arg Arg His Glu Arg Arg Arg Lys Leu Ala Ile Glu
1 5 10 15
Arg
<210> 10
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiphilic basic peptide
<400> 10
Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr
1 5 10 15
Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Asp Asp Pro
20 25 30
Val Asp
<210> 11
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hydrophobic basic peptide
<400> 11
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
1 5 10 15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
20 25
<210> 12
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hydrophobic basic peptide
<400> 12
Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ala Lys Lys Ile Leu
20

Claims (9)

1.一种具有下述通式(1)表示的部分结构的多糖衍生物，
通式(1)中，X1表示从中性氨基酸或ω-氨基烷酸中除去末端氨基及末端羧基而得到的残基，X2表示从膜透过性肽中除去末端氨基及末端羧基而得到的残基，X3表示羟基、氨基、碳数为1～4的烷氧基或苄氧基，a表示0或1的数，b表示0～50的数。
2.根据权利要求1所述的多糖衍生物，其中，构成所述通式(1)中的X2的氨基酸中的至少1个为碱性氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的多糖衍生物，其中，所述通式(1)中的a为0的数。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的多糖衍生物，其中，所述通式(1)表示的部分结构与多糖衍生物的总糖单元的比例为0.001～0.8。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的多糖衍生物，其中，所述通式(1)表示的部分结构为下述通式(2)表示的部分结构；
通式(2)中，X1～X3及b与通式(1)中的含义相同。
6.根据权利要求5所述的多糖衍生物，其中，具有所述通式(2)表示的部分结构的多糖衍生物为下述通式(3)表示的多糖衍生物；
通式(3)中，c及d表示c+d为通式(3)表示的多糖衍生物的重均分子量为5000～5000万、且d/(c+d)达到0.002～1的数，X1～X3及b与通式(1)中的含义相同，其中，c的单元与d的单元无规状地连接。
7.一种用于将低膜透过性化合物导入细胞内或粘膜内的导入剂，其由权利要求1～6中任一项所述的多糖衍生物构成。
8.一种用于将低膜透过性化合物导入细胞内的方法，其使用权利要求7所述的导入剂。
9.一种用于将低膜透过性化合物导入粘膜内的方法，其使用权利要求7所述的导入剂。
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