KR20170122179A - 막투과성 펩티드 사슬을 가지는 다당 유도체 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 다당 유도체는, 하기 일반식(1)로 나타내는 부분 구조를 가진다. 하기 일반식(1)의 X2를 구성하는 아미노산의 적어도 하나가 염기성 아미노산인 것이 바람직하다.
Figure pct00015

(식 중, X1은, 중성 아미노산 또는 ω-아미노알칸산으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제거한 잔기를 나타내고, X2는 막투과성 펩티드로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제거한 잔기를 나타내며, X3은 수산기, 아미노기, 탄소 수 1~4의 알콕실기 또는 벤질옥시기를 나타내고, a는 0 또는 1의 수를 나타내며, b는 0~50의 수를 나타낸다.)

Description

막투과성 펩티드 사슬을 가지는 다당 유도체
본 발명은, 저(低)막투과성 화합물을 세포 내 또는 점막 내에 도입하는 경우에 유용한, 다당 유도체에 관한 것이다.
최근, 합성 펩티드나 단백질, 또한 DNA나 당을 세포 내에 도입하여, 세포 내에서의 단백질 상호작용을 조절하고, 세포 내 정보전달이나 전사(轉寫) 등을 컨트롤함으로써, 그들의 기능을 해명하거나 특수한 기능을 유도하는 시도가 이루어지고 있다. 이와 같은 어프로치에 의해, 지금까지 불가사의로 여겨 온 유전 정보의 해명이나 병원(病原)의 해명, 또한 그 치료 방법의 개발을 기대할 수 있다. 또한, ES 세포나 iPS 세포의 개발에 의해, 핵산이나 단백질에 의해 세포기능을 컨트롤하는 기술은 점점 중요성을 더하고 있다.
일반적으로, 폴리펩티드, 핵산, 당 등의 수용성 고분자량 물질은 높은 친수성을 가지기 때문에 세포막을 통과하는 것이 곤란하다. 따라서, 이들을 세포 내에 도입하는 방법으로, 마이크로인젝션법(microinjection method), 일렉트로포레이션법(electroporation method), 인산칼슘법, 리포펙션법(lipofection method), 바이러스 벡터법(viral vector method), 막투과성 펩티드법 등이 알려져 있다.
이 중, 막투과성 펩티드법은, 막투과성 펩티드가 세포의 마크로피노사이토시스(macropinocytosis)를 유발하는 것을 이용하는 방법이다. 막투과성 펩티드법으로는, 세포에 도입하고자 하는 목적 화합물과 막투과성 펩티드를 공유 결합시켜 도입하는 방법(예를 들면, 특허문헌 1 및 2를 참조)이나 막투과성 펩티드를 측쇄에 가지는 고분자 화합물과 세포에 도입하고자 하는 목적 화합물을 공존시켜, 목적 화합물만을 도입하는 방법(예를 들면, 특허문헌 3 및 4를 참조)이 알려져 있다. 목적 화합물과 막투과성 펩티드를 공유 결합시켜 도입하는 방법은 세포에 대한 대미지가 적지만, 번잡한 전처리가 필요하다. 한편, 막투과성 펩티드를 측쇄에 가지는 고분자 화합물을 사용하는 방법은 간편하지만, 종래 알려진 막투과성 펩티드를 측쇄에 가지는 고분자 화합물은 세포 독성이 다소 높아, 사용 농도에 제한이 나오는 경우가 있어, 목적 화합물의 도입 효율을 향상시키는 경우에 문제가 되었다.
또한, 막투과성 펩티드를 측쇄에 가지는 고분자는, 약제의 상피로부터의 흡수성 촉진제에 대한 응용(예를 들면, 특허문헌 5를 참조)도 제안되고 있지만, 점막에 대한 자극성이 있어 실용화하는 경우의 과제가 되어 있다.
한편, 카르복실기를 가지는 다당을 폴리아민으로 가교(架橋)한 화합물(예를 들면, 특허문헌 6을 참조)은, 의료, 의약 및 피부 화장료의 분야에서 증점제, 윤활제, 겔화제 등으로 유용한 것이 알려져 있다. 그러나 카르복실기를 가지는 다당과 막투과성 펩티드를 반응시킨 화합물은 알려져 있지 않다.
US2003/229202A1 일본 공개특허공보 2005-052083호 US2010/113559A1 일본 공개특허공보 2011-229495호 일본 공개특허공보 2010-100781호 US2004/167098A1
본 발명은, 이상의 실정에 비추어 보아 이루어진 것이며, 핵산, 단백질 등의 수용성 고분자량 물질이나, 약제를, 간편한 방법으로, 높은 효율로 세포 내 또는 점막 내에 도입할 수 있고, 세포 독성이나 점막 자극성이 낮은 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 막투과성 펩티드기를 측쇄에 가지는 다당 유도체가 세포 독성이나 점막 자극성이 적고, 그와 같은 화합물을 사용함으로써 핵산, 단백질 등의 수용성 고분자량 물질이나 약제를 세포 내나 점막 내에 용이하게 도입할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기 일반식(1)로 나타내는 부분 구조를 가지는 다당 유도체이다.
Figure pct00001
(식 중, X1은 중성 아미노산 또는 ω-아미노알칸산으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제거한 잔기를 나타내고, X2는 막투과성 펩티드로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제거한 잔기를 나타내며, X3은 수산기, 아미노기, 탄소 수 1~4의 알콕실기 또는 벤질옥시기를 나타내고, a는 0 또는 1의 수를 나타내며, b는 0~50의 수를 나타낸다.)
본 발명에 의하면, 일반식(1)로 나타내는 부분 구조를 가지는 다당 유도체는 세포 독성이나 점막 자극성이 낮고, 번잡한 전처리를 실시하지 않아도 저막투과성 화합물을 높은 효율로 세포 내나 점막 내에 도입할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시형태의 일례에 대해 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시형태에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에서 저막투과성 화합물이란, 생물학적 이용능(bioavailability)이 낮은 화합물을 의미하고, 구체적으로는 생물학적 이용률(extent of bioavailability)이 50% 이하인 화합물을 의미한다. 생물학적 이용률은 이하의 식에 의해 산출할 수 있다.
생물학적 이용률(%)=100×(경구 투여에 의해 혈액 중에 도달한 양)/(정맥 투여에 의해 혈액 중에 도달한 양)
여기서 말하는 "혈액 중에 도달한 양"은, 혈중 농도와 가로축(시간축)에 의해 둘러싸인 부분의 면적(약물 혈중 농도-시간 곡선 하 면적(area under the drug blood level-time curve): AUC)으로 구해진다.
일반식(1)로 나타내는 부분 구조를 가지는 다당 유도체(이하, 본 발명의 다당 유도체라고 하는 경우가 있음)는, 막투과성 펩티드 잔기를 가지고 있고, 저막투과성 화합물을 효율적으로 세포에 받아들이게 할 수 있다. 막투과성 펩티드가 세포에 받아들여지는 기구는, 일반적으로는 막투과성 펩티드가 세포의 마크로피노사이토시스를 유발하여 받아들여지는 것이고, 주위에 저막투과성 화합물이 존재하는 경우에는 막투과성 펩티드와 함께 이들 저막투과성 화합물이 받아들여지는 것으로 생각되고 있다. 본 발명의 다당 유도체에서는, 막투과성 펩티드 잔기에 의해 세포의 복수의 부분에서 마크로피노사이토시스가 유발되지만, 본 발명의 다당 유도체는, 거대 분자이며, 또한 본 발명의 다당 유도체의 1 분자를 세포가 복수의 부분으로부터 받아들이는 것도 곤란하다. 이 때문에, 본 발명의 다당 유도체의 주위에 저막투과성 화합물이 존재하는 경우에는, 본 발명의 다당 유도체에 의해 마크로피노사이토시스가 유발된 세포에 의해, 저막투과성 화합물이 우발적이면서 계속적으로 받아들여지게 된다. 따라서, 막투과성 펩티드 잔기와 저막투과성 화합물 사이의 상호작용은 반드시 필요로 되지 않고, 본 발명의 다당 유도체와 저막투과성 화합물을 혼합한 것을 세포 또는 점막에 접촉시키는 것만으로, 저막투과성 화합물을 세포 내 또는 점막 내에 도입할 수 있는 것이라고 생각된다. 또한, 본 명세서에서 서술하는 기구는 모두 추측이며, 본 발명을 한정하는 것이 아니다.
[일반식(1)로 나타내는 부분 구조]
일반식(1)로 나타내는 부분 구조에 대해 설명한다. 일반식(1)에 나타낸 당 단위는, L체 또는 D체 중 어느 것이어도 되고, 일반식(1)에 나타낸 당 단위와 다른 당 단위의 결합은, α-글리코시드 결합 또는 β-글리코시드 결합 중 어느 것이어도 된다. 일반식(1)에서 a는 0 또는 1의 수를 나타낸다. a가 1인 경우에는, 본 발명의 다당 유도체의 제조법상, 동일한 당 단위에 복수의 막투과성 펩티드 잔기가 도입되고, 점도 증가에 의한 핸들링성의 저하나 저막투과성 화합물의 도입 효율의 저하가 일어나는 경우가 있기 때문에, a는 0의 수가 바람직하다.
일반식(1)에서, X2는 막투과성 펩티드로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제거한 잔기를 나타낸다. 본 발명의 다당 유도체의 막투과성 펩티드 잔기는, 세포나 점막, 도입하고자 하는 저막투과성 화합물에 따라 적절히 선택되어도 되지만, 막투과성 펩티드 잔기를 구성하는 아미노산의 적어도 하나는 염기성 아미노산인 것이 바람직하다. 또한, 염기성 아미노산은, L체 또는 D체 중 어느 것이어도 되고, 세포나 점막, 도입하고자 하는 저막투과성 화합물에 따라 적절히 선택되어도 된다.
염기성 아미노산으로는 아르기닌, 오르니틴, 리신, 하이드록시리신, 히스티딘 등을 들 수 있고, 그 중에서도 구아니디노기함유 아미노산이 바람직하고, 아르기닌이 더 바람직하다. 막투과성 펩티드 잔기 중의 염기성 아미노산의 비율이 높을수록 저막투과성 화합물의 도입 효율이 오르기 때문에, 막투과성 펩티드를 구성하는 전체 아미노산에 대한 염기성 아미노산의 비율은, 몰 기준으로 50% 이상인 것이 바람직하고, 70% 이상인 것이 더 바람직하다. 막투과성 펩티드 잔기를 구성하는 아미노산 중, 염기성 아미노산 이외의 아미노산은 중성 아미노산인 것이 바람직하다. 또한, 본 명세서 중에서 아미노산이라고 기재하는 경우, 특별히 언급하지 않는 한, α-아미노산을 의미한다.
막투과성 펩티드 잔기를 구성하는 아미노산의 수는, 저막투과성 화합물의 도입 효율이 오르기 때문에, 5~30인 것이 바람직하고, 6~20인 것이 더 바람직하며, 7~15인 것이 가장 바람직하다.
막투과성 펩티드의 바람직한 구체예로는, 7~30개의 아르기닌이 펩티드 결합한 아르기닌 올리고머, GRKKRRQRRRPPQ라는 아미노산 배열을 가지는 펩티드(통칭 HIV-1 Tat: 배열 번호 1), TRQARRNRRRRWRERQR이라는 아미노산 배열을 가지는 펩티드(통칭 HIV-1 Rev: 배열 번호 2), RRRRNRTRRNRRRVR이라는 아미노산 배열을 가지는 펩티드(통칭 FHV Coat: 배열 번호 3), TRRQRTRRARRNR이라는 아미노산 배열을 가지는 펩티드(통칭 HTLV-II Rex: 배열 번호 4), KLTRAQRRAAARKNKRNTR이라는 아미노산 배열을 가지는 펩티드(통칭 CCMV Gag: 배열 번호 5) 등의 친수성의 염기성 펩티드; RQIKIWFQNRRMKWKK라는 아미노산 배열을 가지는 펩티드(통칭 안테나페디아(Antennapedia): 배열 번호 6), KMTRAQRRAAARRNRWTAR이라는 아미노산 배열을 가지는 펩티드(통칭 BMW Gag: 배열 번호 7), RQIKIWFQNRRMKWKK라는 아미노산 배열을 가지는 펩티드(통칭 페너트라틴(Penetratin): 배열 번호 8), NAKTRRHERRRKLAIER이라는 아미노산 배열을 가지는 펩티드(통칭 P22N: 배열 번호 9), DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPDDPVD라는 아미노산 배열을 가지는 펩티드(통칭 VP22: 배열 번호 10) 등의 양친매성의 염기성 펩티드; GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL이라는 아미노산 배열을 가지는 펩티드(통칭 트랜스포탄(Transportan): 배열 번호 11), AGYLLGKINLKALAALAKKIL이라는 아미노산 배열을 가지는 펩티드(통칭 TP-10: 배열 번호 12) 등의 소수성(疎水性)의 염기성 펩티드를 들 수 있다. 이들 중에서, 저막투과성 화합물의 도입 효율이 뛰어나기 때문에 친수성의 염기성 펩티드가 바람직하고, 아르기닌 올리고머가 더 바람직하다. 아르기닌 올리고머 중에서도 아르기닌의 반복의 수는 7~20이 바람직하고, 7~15가 더 바람직하며, 7~10이 가장 바람직하다.
X1은, 중성 아미노산 또는 ω-아미노알칸산으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제거한 잔기를 나타내고, b는 0~50의 수를 나타낸다. 중성 아미노산의 경우는 L체 또는 D체 중 어느 것이어도 된다. 중성 α-아미노산으로는 예를 들면, 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, 하이드록시프롤린 등을 들 수 있고, ω-아미노알칸산으로는, 3-아미노프로판산, 4-아미노부탄산, 5-아미노펜탄산, 6-아미노헥산산, 7-아미노헵탄산, 8-아미노옥탄산, 9-아미노노난산, 10-아미노데칸산, 11-아미노운데칸산 등을 들 수 있다. X1에 적용되는 중성 아미노산으로는, 저막투과성 화합물의 도입 효율이 오르기 때문에, 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌이 바람직하고, 글리신, 알라닌, 세린이 더 바람직하며, 글리신이 가장 바람직하다. 또한, 저막투과성 화합물의 도입 효율의 점이나 합성의 용이함의 점에서, b는 1~30의 수가 바람직하고, 1~20의 수가 더 바람직하며, 1~10의 수가 가장 바람직하다. b가 2~50의 수인 경우에는, X1은 1종의 중성 아미노산잔기이어도 되고, 2종 이상의 조합이어도 된다.
일반식(1)에서, X3은 수산기, 아미노기, 탄소 수 1~4의 알콕실기 또는 벤질옥시기를 나타낸다. 저막투과성 화합물의 도입 효율의 점에서, X3으로는 수산기, 아미노기, t-부톡시기, 벤질옥시기가 바람직하고, 수산기, 아미노기가 더 바람직하며, 아미노기가 가장 바람직하다.
본 발명의 다당 유도체 중, 일반식(1)로 나타내는 부분 구조가 복수 존재하는 경우, 복수 존재하는 (-CH2-O-CH2-)a, (-NH-X1-CO-)b, X2 및 X3은 각각 동일하여도 되고 달라도 된다.
일반식(1)로 나타내는 부분 구조는, 저막투과성 화합물의 도입 효율의 점에서, 하기 일반식(2)로 나타내는 부분 구조인 것이 바람직하다.
Figure pct00002
(식 중, X1~X3 및 b는 일반식(1)과 동일한 의미이다.)
[본 발명의 다당 유도체]
본 발명의 다당 유도체에 대해 설명한다. 본 발명의 다당 유도체는, 일반식(1)로 나타내는 부분 구조를 가지는 것에 특징이 있지만, 일반식(1)로 나타내는 부분 구조의 비율이 아주 적은 경우에는 저막투과성 화합물의 도입 효율이 낮고, 또한 아주 많은 경우에는 본 발명의 다당 유도체의 제조가 곤란해짐과 함께, 본 발명의 다당 유도체가 고점도가 되어 저막투과성 화합물의 도입 효율이 저하되기 때문에, 본 발명의 다당 유도체 중의, 일반식(1)로 나타내는 부분 구조의 비율은, 본 발명의 다당 유도체의 전체 당 단위에 대하여 0.001~0.8이 바람직하고, 0.005~0.6이 더 바람직하며, 0.01~0.5가 가장 바람직하다. 여기서 말하는 비율이란, 당 단위의 수에 대한 부분 구조의 수의 비율이다. 또한, 여기서 말하는 당 단위란, 단당 단위를 가리킨다.
또한, 본 발명의 다당 유도체의 분자량이 아주 작은 경우에는 본 발명의 다당 유도체 자체가 세포에 받아들여지는 경우가 있고, 또한 아주 큰 경우에는 고점도가 되어 저막투과성 화합물의 도입 효율이 저하되기 때문에, 본 발명의 다당 유도체의 분자량은, 중량 평균 분자량으로 5000~5000만이 바람직하고, 1만~4000만이 더 바람직하며, 5만~3000만이 가장 바람직하다. 또한, 본 발명에서 본 발명의 다당 유도체의 중량 평균 분자량이란, 수계(水系) 용매를 사용하여 GPC 분석을 실시한 경우의, 풀루란 환산의 중량 평균 분자량을 말한다(후술하는 일반식(1a)로 나타내는 부분 구조를 가지는 다당 유도체도 마찬가지이다).
본 발명의 다당 유도체 중에서도, 저막투과성 화합물의 도입 효율이 높기 때문에, 일반식(3)~(5) 중 어느 하나로 나타내는 다당 유도체가 바람직하고, 일반식(3)으로 나타내는 다당 유도체가 더 바람직하다.
Figure pct00003
(식 중, c 및 d는, c+d가 일반식(3)으로 나타내는 다당 유도체의 중량 평균 분자량이 5000~5000만이고, d/(c+d)가 0.002~1이 되는 수를 나타내며, X1~X3 및 b는 일반식(1)과 동일한 의미이다. 단, c의 유닛과 d의 유닛은 랜덤 형상으로 연결되어 있다.)
Figure pct00004
(식 중, e, f 및 g는, e+f+g가 일반식(4)로 나타내는 다당 유도체의 중량 평균 분자량이 5000~5000만이 되는 수이고, g/(e+f+g)가 0.001~1이 되는 수를 나타내며, X1~X3 및 b는 일반식(1)과 동일한 의미이다. 단, e의 유닛, f의 유닛 및 g의 유닛은 랜덤 형상으로 연결되어 있다.)
Figure pct00005
(식 중, h, j, k 및 m은, h+j+k+m이 일반식(5)로 나타내는 다당 유도체의 중량 평균 분자량이 5000~5000만이 되는 수이고, (k+m)/(h+j+k+m)이 0.001~1이 되는 수를 나타내며, X1~X3 및 b는 일반식(1)과 동일한 의미이다. 단, h의 유닛, j의 유닛, k의 유닛 및 m의 유닛은 랜덤 형상으로 연결되어 있다.)
[본 발명의 다당 유도체의 제조법]
본 발명의 다당 유도체는, 예를 들면, 하기 일반식(1a)로 나타내는 부분 구조를 가지는 다당 유도체의 카르복실기와, 하기 일반식(1a)로 나타내는 펩티드 화합물의 아미노기를 펩티드 반응시킴으로써 얻을 수 있다. 카르복실기와 아미노기의 반응은 공지의 방법을 이용하면 되고, 예를 들면, 카르복실기를 N-하이드록시숙신산이미드에 의해 숙신이미드에스테르화한 후, 아미노기를 반응시키는 방법 등을 들 수 있다.
Figure pct00006
(식 중, a는 일반식(1)과 동일한 의미이다.)
Figure pct00007
(식 중, X1~X3 및 b는 일반식(1)과 동일한 의미이다.)
일반식(1a)로 나타내는 부분 구조를 가지는 다당 유도체 중, a가 0인 화합물로는 펙틴 또는 펙트산, 히알루론산, 알긴산 등을 들 수 있고; a가 1인 화합물로는 카르복시메틸화 전분, 카르복시메틸화 셀룰로오스, 카르복시메틸화 β글루코오스 등의 카르복시메틸화 다당 유도체를 들 수 있다. 또한, 히알루론산으로부터는 일반식(3)으로 나타내는 다당 유도체, 펙틴 또는 펙트산으로부터는 일반식(4)로 나타내는 다당 유도체, 알긴산으로부터는 일반식(5)로 나타내는 다당 유도체가 각각 얻어진다.
[저막투과성 화합물]
본 발명의 다당 유도체는, 저막투과성 화합물을 세포 내나 점막 내에 도입하기 위한 도입제로 사용함으로써, 다양한 저막투과성 화합물이 도입 가능해진다. 이와 같은 저막투과성 화합물로는 예를 들면, 인슐린 및 인슐린 분비 촉진제(예를 들면, 엑센딘-4, GLP-1) 등의 펩티드·단백성 의약품, 스테로이드호르몬, 비스테로이드계 진통항염증제, 정신 안정제, 항고혈압약, 허혈성 심질환 치료약, 항히스타민약, 항천식약, 항파킨슨약, 뇌순환 개선약, 제토제, 항우울약, 항부정맥약, 항응고약, 항통풍약, 항진균약, 항치매약, 쇼그렌증후군 치료약, 마약성 진통약, 베타차단약, β1 작동약, β2 작동약, 부교감신경 작동약, 항종양약, 이뇨약, 항혈전약, 히스타민 H1 리셉터 길항약, 히스타민 H2 리셉터 길항약, 항알레르기약, 금연보조약, 비타민 등의 의약품;
데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 유사체 또는 유도체(예를 들면, 펩티드핵산(PNA), 포스포로티오에이트 DNA 등) 등의 핵산 화합물; 효소, 항체, 당단백질, 전사 인자 등의 펩티드 화합물;
풀루란, 아밀로펙틴, 아밀로오스, 글리코겐, 시클로덱스트린, 덱스트란, 하이드록시에틸덱스토란, 만난, 셀룰로오스, 전분, 알긴산, 키틴, 키토산, 히알루론산 등의 다당 유도체 및 그들의 유도체 등을 들 수 있다.
본 발명의 다당 유도체가 적용되는 세포는 동물, 식물, 세균 등의 어느 세포이어도 되지만, 저막투과성 화합물의 도입 효율의 점에서 인간 등의 포유류의 세포가 바람직하다. 본 발명의 다당 유도체가 적용되는 점막도 저막투과성 화합물의 도입 효율의 점에서 인간 등의 포유류의 세포가 바람직하다.
[세포]
본 발명의 다당 유도체를 사용함으로써, 다양한 세포 내에 저막투과성 화합물을 도입하는 것이 가능하고, 배양액(액체 배지라고도 함) 등에 분산된 세포, 고체 배지 등에 접착한 세포, 생체 조직의 세포 등의 어느 세포에도 저막투과성 화합물을 도입하는 것이 가능하다. 세포는, 조직 세포나 신경 세포 등을 형성하는 접착계 세포와, 혈구 세포 등의 부유계 세포로 대별할 수 있다. 부유계 세포에 대해서는, 마이크로인젝션법이나 일렉트로포레이션법은 적용할 수 없고, 인산칼슘법, 리포펙션법, 바이러스 벡터법 등을 적용할 수 있었지만, 도입 효율은 만족할 수 있는 것이 아니었다. 본 발명의 도입 방법은, 접착계 세포뿐만 아니라, 부유계 세포에 대해서도 저막투과성 화합물을 높은 도입 효율로 도입하는 것이 가능하다.
[세포 내로의 도입 방법]
본 발명의 다당 유도체를 사용하여 세포 내에 저막투과성 화합물을 도입하는 경우에는, 본 발명의 다당 유도체와 저막투과성 화합물을 함유하는 수성 용액 또는 수성 분산액을 세포와 접촉시키면 되고, 바이러스 벡터법이나 막투과성 펩티드를 사용한 종래의 도입 방법과 같은 번잡한 전처리를 필요로 하지 않으며, 또한 세포에 대한 악영향을 그다지 주지 않고, 세포 내에 저막투과성 화합물을 도입할 수 있다.
본 발명의 다당 유도체와 저막투과성 화합물을 용해 또는 분산시키고, 이들을 함유하는 수성 용액 또는 수성 분산액이 되는 수성 매체로는 증류수, 세포 배양에 일반적으로 사용되는 배양액 이외에, 생리식염수, 5질량% 포도당 수용액 등의 등장수(等張水)를 들 수 있지만, 세포에 대한 영향이 적기 때문에 배양액, 생리식염수 및 5질량% 포도당 수용액이 바람직하다.
세포를 수성 용액 또는 수성 분산액에 현탁하는 경우에는, 저막투과성 화합물과 본 발명의 다당 유도체를 함유하는 수성 용액 또는 수성 분산액에, 세포를 현탁시키면 되고, 필요에 따라, 이들 3자를 함유하는 현탁액을 교반이나 진탕하여도 된다. 또한, 세포가 고체 배지 등에 접착되어 있거나, 세포 조직이 크거나 하는 등의 이유에 의해, 세포를 수성 용액 또는 수성 분산액에 현탁할 수 없는 경우에는, 저막투과성 화합물과 본 발명의 다당 유도체를 함유하는 수성 용액 또는 수성 분산액에 세포를 침지시키면 된다.
저막투과성 화합물을 세포 내에 도입하는 경우, 본 발명의 다당 유도체의 사용 농도는 특별히 한정되지 않지만, 수성 용액 또는 수성 분산액에서 0.1㎍/㎖~10㎎/㎖로 하는 것이 알맞다. 또한, 도입하는 저막투과성 화합물의 농도도 특별히 한정되지 않지만, 수성 용액 또는 수성 분산액에서 0.5㎍/㎖~10㎎/㎖로 하는 것이 알맞다. 또한, 세포를, 배양액 혹은 생리식염수 등을 매체로 하는 수성 용액 또는 수성 분산액에 현탁시키는 경우의 세포의 농도도 한정되지 않지만, 수성 용액 또는 수성 분산액에서 1만~200만cells/㎖로 하는 것이 알맞다.
본 발명의 다당 유도체, 도입하고자 하는 저막투과성 화합물, 및 세포 3자를 공존시키는 시간은 특별히 한정되지 않지만, 30분~24시간으로 하는 것이 알맞다.
[점막]
본 발명의 다당 유도체를 점막 내에 사용함으로써, 다양한 점막 내에 저막투과성 화합물을 도입하는 것이 가능하다. 점막으로는 비점막, 구강점막, 질점막, 직장점막, 안점막, 위점막, 장관점막 등을 들 수 있다. 종래의 막투과성 펩티드를 측쇄에 가지는 고분자 화합물은 점막에 대한 자극성이 컸기 때문에, 예를 들면, 비점막에 사용하면 가려움이 발생하는 경우가 있었지만, 본 발명의 다당 유도체에서는 이와 같은 가려움이 경감된다.
[점막 내로의 도입 방법]
본 발명의 다당 유도체를 사용하여 점막 내에 저막투과성 화합물을 도입하는 경우에는, 본 발명의 다당 유도체와 저막투과성 화합물의 혼합물을 점막에 밀착시키면 되고, 이 혼합물이 점막으로부터 박리되기 어려운 제형이라면, 제형은 한정되지 않는다. 바람직한 제형은 점막에 따라 다르지만, 예를 들면, 환제, 정제, 트로치제, 첨부제, 좌약, 파프제 등을 들 수 있다. 본 발명의 다당 유도체와 저막투과성 화합물의 혼합물은, 제형에 따라 액상, 유상(乳狀), 현탁상, 겔상, 분말상, 고형상 등의 형상을 선택하면 된다. 저막투과성 화합물은 목적에 따라 1종만을 도입하여도 되고, 2종 이상을 조합시켜도 된다. 또한, 필요에 따라 부형제, 유화제, 분산제, 겔화제, 보습제 등을 병용하여도 된다.
[소(小)돌기 어레이(array)의 이용]
본 발명의 다당 유도체는 저막투과성 화합물을, 피부를 경유하여 세포 내에 도입할 수는 없지만, 소돌기 어레이(시트 상에 미세한 돌기를 배치한 약제 송달 부재. 예를 들면, US2005025778A1, 일본 공개특허 2008-006178 등을 참조)를 이용함으로써, 피부 밑의 세포 내에 저막투과성 화합물을 도입하는 것이 가능해진다. 예를 들면, 본 발명의 다당 유도체와 저막투과성 화합물의 혼합물을 표면에 도포한 소돌기 어레이, 또는 본 발명의 다당 유도체와 저막투과성 화합물의 혼합물을 함유하는 소돌기를 가지는 소돌기 어레이를, 피부 표면에 붙이고, 미세한 돌기에 의해 피부를 관통시켜 피부 밑으로 본 발명의 다당 유도체와 저막투과성 화합물을 침투시킴으로써, 피부 밑의 세포 내에 저막투과성 화합물을 도입하는 것이 가능해진다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다. 또한, 특별히 한정이 없는 한, 실시예 중의 "부"나 "%"는 질량기준에 의한 것이다.
<제조예 1: 다당 유도체 1>
1㎖의 디메틸술폭시드(DMSO)에 50㎎의 히알루론산(중량 평균 분자량: 5000~150000)을 용해하였다. 이 용액에 0.5㎖의 DMSO에 용해한 47㎎의 N-하이드록시숙신산이미드를 첨가하고, 또한 0.5㎖의 DMSO에 용해한 82㎎의 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)를 첨가하여 실온(25℃)에서 24시간 교반하여 반응을 실시하였다. 석출되는 고체를 여과에 의해 여과 분별하고, 0.5㎖의 DMSO를 첨가하여, 숙신이미드에스테르화된 히알루론산의 DMSO 용액 2.5㎖을 얻었다.
숙신이미드에스테르화된 히알루론산의 DMSO 용액 1㎖에, 옥타아르기닌의 말단 카르복실기가 아미드화된 화합물(GL Biochem사 제품, 상품명: RRRRRRRR-NH2, [R=D-Arg]TFA Salt)의 DMSO 용액(500㎎/㎖) 0.4㎖를 혼합하고, 60℃에서 24시간 교반하여, 반응을 실시하였다. 반응 후, 반응 용액을 셀룰로오스 투석 튜브(심리스(seamless) 셀룰로오스 튜브, 와코 쥰야꾸사 제품)에 넣고, 튜브의 양구를 묶은 후, 이온 교환수를 사용하여 2일간 투석을 실시하였다. 그 후, 튜브의 내용물을 동결 건조하여, 102㎎의 본 발명의 다당 유도체 1을 얻었다. 다당 유도체 1은, 일반식(3)의 b가 0, X2가 옥타아르기닌으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제거한 잔기, X3이 아미노기이고, d/(c+d)가 0.58인 화합물이다. 또한, d/(c+d)의 값은 NMR의 적분값으로부터 구하였다. 이 d/(c+d)의 값으로부터, 다당 유도체 1에 따른 전체 당 단위에 대한 일반식(1)로 나타내는 부분 구조의 비율은 0.29로 산출되었다. 다당 유도체 1의 중량 평균 분자량은 22만이었다.
<제조예 2: 다당 유도체 2>
제조예 1에서, 옥타아르기닌의 말단 카르복실기가 아미드화된 화합물의 DMSO 용액(500㎎/㎖) 0.4㎖ 대신에, 일반식(1b)에서 b가 4, X1이 글리신으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제거한 잔기, X2가 옥타아르기닌 잔기, X3이 아미노기인 화합물(RS Synthesis사 제품, 상품명: H-(Gly)4-(D-Arg)8-NH2(Purity: 90%), TFA Salt)의 DMSO 용액(320㎎/㎖) 0.5㎖를 사용한 것 이외는, 제조예 1과 동일한 조작을 실시하여 60㎎의 본 발명의 다당 유도체 2를 얻었다. 다당 유도체 2는, 일반식(3)의 b가 4, X1이 글리신으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제거한 잔기, X2가 옥타아르기닌으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제거한 잔기, X3이 아미노기이고, d/(c+d)가 1.0인 화합물이다. 또한, d/(c+d)의 값은 NMR의 적분값으로부터 구하였다. 이 d/(c+d)의 값으로부터, 다당 유도체 2에 따른 전체 당 단위에 대한 일반식(1)로 나타내는 부분 구조의 비율은 0.5로 산출되었다. 또한, 다당 유도체 2의 중량 평균 분자량은 37만이었다.
<비교 화합물 1>
일본 공개특허공보 2011-229495호의 제조예 1에 준거하여 제조하여, 비교 화합물 1을 얻었다. 비교 화합물 1은 하기의 구조를 가지는 화합물이다. (식 중, R은 아르기닌 잔기를 나타낸다.)
Figure pct00008
<비교 화합물 2>
US2010113559A1의 제조예에 준거하여, 중량 평균 분자량 약 10만의 키토산을 사용하여, 비교 화합물 2를 제조하였다. 비교 화합물 2는 하기의 구조를 가지는 화합물이다. (식 중, R은 아르기닌 잔기를 나타내고, x:y=80:20)
Figure pct00009
<세포>
CHO 세포: 차이니즈 햄스터 난소유래 세포
<배지>
Ham's F12 배지(상품명, 와코사 제품)
Opti-MEM 배지(상품명, Life Technologies사 제품)
<시약>
트립신/EDTA 용액: 0.25%의 트립신, 1m㏖/ℓ의 EDTA 수용액
<세포 독성 시험 키트>
Cell Counting Kit-8(상품명, 도우진 가가꾸사 제품)
<저막투과성 화합물>
FITC-BSA: 플루오레세인 표식-소혈청 알부민(Sigma-Aldrich사 제품)
<세포 내로의 도입 효율>
24웰플레이트(24-well plate)의 각 웰에 CHO 세포의 Ham's F12 배지 현탁액(2×105cells/㎖) 500㎕를 파종하고, 탄산가스 인큐베이터에서 24시간, 전배양하였다. 상청(上淸)의 배지를 제거한 후, FITC-BSA의 Opti-MEM 배지 용액(10㎍/㎖) 250㎕를 첨가하고, 또한 다당 유도체 1~2, 또는 비교 화합물 1~2의 Opti-MEM 배지 용액(100㎍/㎖) 250㎕ 첨가하여, 탄산가스 인큐베이터에서 1시간 배양하였다. 상청의 배지 용액을 제거하고, 인산 완충 생리식염수 500㎕로 2회 세정한 후, 트립신/EDTA 용액 100㎕를 첨가하여, 배양한 CHO 세포를 플레이트로부터 박리, 분산시켰다. 다음으로, 0.08% 트리판블루 용액 100㎕를 첨가하여 세포를 현탁시키고, 마이크로 튜브에 회수하였다. 회수한 세포 현탁액을, 셀 스트레이너를 통과시켜, 플로우사이토메트리(flow cytometry)에 의해 MFI(평균 형광 강도)를 측정하였다. 또한, 다당 유도체를 사용하지 않은 것을 블랭크로 하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00010
세포 외의 FITC-BSA는 트리판블루에 의해 실활(失活)되어 형광을 발하지 않고, 세포 내에 도입된 FITC-BSA만이 형광을 발한다. MFI는 세포 1개당 형광 강도의 평균값을 나타내기 때문에, MFI의 값이 클수록 수용성 고분자 화합물이며 저막투과성 화합물인 FITC-BSA가 세포 내에 받아들여진 것을 나타내고 있다. 표 1의 결과로부터, 다당 유도체 1 및 2는 수용성 고분자량 물질의 세포 내로의 도입 효율이 높은 것을 알 수 있다.
<세포 독성시험>
96웰플레이트의 각 웰에 CHO 세포의 Ham's F12 배지 현탁액(2×105cells/㎖) 100㎕를 파종하고, 탄산가스 인큐베이터에서 24시간, 전배양하였다. 다당 유도체 1~2, 또는 비교 화합물 1~2의 Opti-MEM 배지 용액(2g/㎖)을 10㎕ 첨가하고, 탄산가스 인큐베이터에서 1시간 배양하며, 또한 Cell Counting Kit-8을 10㎕ 첨가하여 탄산가스 인큐베이터에서 1시간 정치(靜置)하였다. 이 후, 450㎚에서의 흡광도를 측정하고, 다당 유도체 1~2, 또는 비교 화합물 1~2를, 넣지 않은 경우의 흡광도에 대한, 넣은 경우의 흡광도의 비율(%)을 세포 생존율로 하였다. 결과를 표 2에 나타낸다. 또한, 세포 생존율이 낮을수록 세포독성이 높은 것을 나타낸다.
Figure pct00011
표 2의 결과로부터, 다당 유도체 1 및 2는, 비교 화합물 1 및 2에 비해 세포 생존율이 높고, 세포 독성이 낮은 것을 알 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Josho Gakuen Educational Foundation ADEKA Corporation <120> Polysaccharide derivative having membrane-permeable peptide chain <130> A1506 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydrophilic basic peptide <400> 1 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydrophilic basic peptide <400> 2 Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln 1 5 10 15 Arg <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydrophilic basic peptide <400> 3 Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg 1 5 10 15 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydrophilic basic peptide <400> 4 Thr Arg Arg Gln Arg Thr Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydrophilic basic peptide <400> 5 Lys Leu Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Lys Asn Lys Arg 1 5 10 15 Asn Thr Arg <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiphilic basic peptide <400> 6 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiphilic basic peptide <400> 7 Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp 1 5 10 15 Thr Ala Arg <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiphilic basic peptide <400> 8 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiphilic basic peptide <400> 9 Asn Ala Lys Thr Arg Arg His Glu Arg Arg Arg Lys Leu Ala Ile Glu 1 5 10 15 Arg <210> 10 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiphilic basic peptide <400> 10 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Asp Asp Pro 20 25 30 Val Asp <210> 11 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydrophobic basic peptide <400> 11 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydrophobic basic peptide <400> 12 Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ala Lys Lys Ile Leu 20

Claims (9)

  1. 하기 일반식(1)로 나타내는 부분 구조를 가지는 다당 유도체.
    Figure pct00012

    (식 중, X1은, 중성 아미노산 또는 ω-아미노알칸산으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제거한 잔기를 나타내고, X2는 막투과성 펩티드로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제거한 잔기를 나타내며, X3은 수산기, 아미노기, 탄소 수 1~4의 알콕실기 또는 벤질옥시기를 나타내고, a는 0 또는 1의 수를 나타내며, b는 0~50의 수를 나타낸다.)
  2. 제1항에 있어서,
    상기 일반식(1)의 X2를 구성하는 아미노산의 적어도 하나가 염기성 아미노산인 다당 유도체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 일반식(1)의 a가 0의 수인 다당 유도체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    다당 유도체의 전체 당 단위에 대하여, 상기 일반식(1)로 나타내는 부분 구조의 비율이 0.001~0.8인 다당 유도체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 일반식(1)로 나타내는 부분 구조가, 하기 일반식(2)로 나타내는 부분 구조인, 다당 유도체.
    Figure pct00013

    (식 중, X1~X3 및 b는 일반식(1)과 동일한 의미이다.)
  6. 제5항에 있어서,
    상기 일반식(2)로 나타내는 부분 구조를 가지는 다당 유도체가, 하기 일반식(3)으로 나타내는 다당 유도체인, 다당 유도체.
    Figure pct00014

    (식 중, c 및 d는, c+d가 일반식(3)으로 나타내는 다당 유도체의 중량 평균 분자량이 5000~5000만이고, d/(c+d)가 0.002~1이 되는 수를 나타내며, X1~X3 및 b는 일반식(1)과 동일한 의미이다. 단, c의 유닛과 d의 유닛은 랜덤 형상으로 연결되어 있다.)
  7. 저(低)막투과성 화합물을, 세포 내 또는 점막 내에 도입하기 위한 도입제로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 다당 유도체로 이루어지는 도입제.
  8. 제7항에 기재된 도입제를 사용하는, 저막투과성 화합물을, 세포 내에 도입하기 위한 방법.
  9. 제7항에 기재된 도입제를 사용하는, 저막투과성 화합물을, 점막 내에 도입하기 위한 방법.
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