KR20200126520A - 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

바이오셀룰로오스-펩티드 복합체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 외부 오염물질에 대한 여과성이 우수한 난각막 구조에 착안하여 만든 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체에 관한 것으로, 세포와 피부에 대하여 접착성이 우수하고, 통기성은 유지하되 수분을 보호하고 외부 유해물질의 차단 능력이 뛰어날 뿐만 아니라, 특히 간단하고 친환경적인 공정에 의하여 제조가 가능하므로 화학, 제약 또는 화장품 산업 등에서 응용할 수 있다.

Description

바이오셀룰로오스-펩티드 복합체 및 이의 제조방법{Biocellulose-peptide composite and preparation method thereof}
본 발명은 외부 오염물질에 대한 여과성이 우수한 난각막 구조에 착안하여 만든 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 박테리아 유래 바이오셀룰로오스의 표면에 존재하는 수산기가 산화되어 카르복실기로 되고, 상기 카르복실기에 펩티드를 공유결합하여 복합체를 제조함으로써 피부 접착제로 응용하는 기술에 관한 것이다.
일반적으로 화장품 산업이나 의료 제약 분야, 공업용 등 다양한 산업에서 셀룰로오스(cellulose)를 이용한 다양한 연구개발이 진행되고 있다. 그 중 박테리아가 생성하는 바이오셀룰로오스(biocellulose, BC)는 식물 셀룰로오스와는 달리 리그닌이나 헤미 셀룰로오스가 없어 추가 처리공정이 필요없고, 습윤성, 흡수성이 좋으며, 고강도 및 고탄력성 특성을 가져 다양한 분야에서 주목받고 있다.
이러한, 바이오셀룰로오스는 3차원 망상구조로 이루어져, 피부에 적용시 가닥가닥이 외부 충격에 의해 쉽게 제거되므로 장기간 적용이 불가능하고, 따라서 피부 보습 효과도 다른 유효성분들에 비해 현저히 떨어지게 되는 문제점이 있다. 따라서, 바이오셀룰로오스에 대한 산업적 수요가 존재하고, 그 규모 또한 작지 않음에도 불구하고 지금까지 다양한 분야에 바이오셀룰로오스가 많이 활용되지 못하고 있다.
다만, 바이오셀룰로오스를 원물을 바로 사용하거나, 산화반응시켜 수분산된 형상으로 조성물에 첨가하여 사용하는 방법들이 알려져 있는데, 이 경우 바이오셀룰로오스가 피부에 안착되어 있는 형태로 존재하기 때문에 외부 충격에 의해 손쉽게 피부로부터 제거되므로 다양한 효과를 볼 수 없다. 따라서 바이오셀룰로오스의 기능도 중요하지만 피부와의 접착성이 뛰어난 소재의 개발이 시급하다. 아울러 셀룰로오스 섬유의 접착력만이 강화된다면 피부의 통기성을 떨어뜨려 피부 속 독소가 배출되는 것을 막기 때문에 오히려 피부의 염증을 유발할 수 있고, 바르는 과정에서 때처럼 밀리게 되어 사용감이 저하되며 더 쉽게 제거될 수 있어 다양한 기능과 더불어 향상된 생체 안정성이 요구되고 있다.
따라서 본 발명자 등은, 바이오셀룰로오스의 응용분야를 확대하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 바이오셀룰로오스의 알코올기를 카르복실기로 치환하고, 여기에 서열번호 1로 표시되는 펩티드를 공유결합시켜 피부와의 접착력이 향상되고, 접착시 피부의 통기성을 막지 않는 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체를 제조할 수 있으면, 미세먼지를 효과적으로 차단 및 수분보호 기능을 갖는 다양한 소재로 응용될 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
특허문헌 1 대한민국공개특허공보 제10-2019-0023153호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 피부에 대한 접착성이 우수한 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체 및 그 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 카르복실화된 바이오셀룰로오스와 하기 세포투과성 펩티드가 공유결합되고, 상기 공유결합은 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 중 하나 이상을 첨가하여 유도되는 것을 특징으로 하는 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체를 제공한다.
상기 카르복실화된 바이오셀룰로오스는 길이가 10 내지 5000 nm, 두께가 0.001 내지 1000 nm인 섬유형 구조일 수 있다.
상기 세포투과성 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 Bac7 펩티드일 수 있다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, I) 바이오셀룰로오스에 카르복실기를 도입하는 단계; 및 II) 상기 I) 단계의 카르복실화된 바이오셀룰로오스와 세포투과성 펩티드를 반응시키는 단계;를 제공한다.
상기 I) 단계는 (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥실((2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yl)oxyl, TEMPO), 브로민화나트륨(NaBr), 치아염소산나트륨(NaClO)의 존재하에서 수행될 수 있다.
상기 II) 단계는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC) 및 N-하이드록실 석신이미드(NHS)의 존재 하에서 카르복실화된 바이오셀룰로오스와 세포투과성 펩티드를 반응시킬 수 있다.
본 발명에 따른, 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체는 세포와 피부에 대하여 접착성이 우수하고, 통기성은 유지하되 수분보호와 외부 유해물질의 차단 능력이 뛰어날 뿐만 아니라, 특히 간단하고 친환경적인 공정에 의하여 제조가 가능하므로 화학, 제약 또는 화장품 산업 등에서 응용할 수 있다.
도 1은 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체의 제조과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2a는 바이오셀룰로오스(BC), 서열번호 1로 표시되는 Bac7 펩티드 및 실시예 3으로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 1H-NMR로 분석한 결과이다.
도 2b는 바이오셀룰로오스(BC), 서열번호 1로 표시되는 Bac7 펩티드 및 실시예 3으로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 FT-IR 분석결과이다.
도 2b는 바이오셀룰로오스(BC) 및 실시예 1 내지 4로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 형광분광기로 분석한 결과이다.
도 3a는 바이오셀룰로오스(BC) 및 실시예 1 내지 4로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)의 세포 독성 분석 결과이다.
도 3b는 바이오셀룰로오스(BC) 및 실시예 1 내지 4로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)의 세포 표면과의 접착력을 측정하고 이를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 3c는 형광으로 표지된 바이오셀룰로오스(BC)를 세포에 처리한 후, 촬영한 형광이미지이다.
도 3d는 형광으로 표지된 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 세포에 처리한 후, 촬영한 형광이미지이다.
도 4a는 돼지피부에 바이오셀룰로오스(BC) 또는 실시예 1 내지 4로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 적용하여 접착력을 측정하기 위한 레오미터 장치와 측정과정을 도시한 모식도이다.
도 4b는 돼지피부로부터 바이오셀룰로오스(BC) 또는 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)(36 ㎟, 64 ㎟, 100 ㎟, 156.25 ㎟)를 서서히 떼어내는데 소요되는 시간과 이에 따른 힘의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 4c는 다양한 면적의 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7) 필름(36 ㎟, 64 ㎟, 100 ㎟, 156.25 ㎟)의 접착력을 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 5a 내지 d는 순서대로 다양한 농도(0.4 중량%, 0.5 중량%, 0.6 중량%, 0.8 중량%)의 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 주사전자현미경으로 촬영한 것(×50K 배율)이다.
도 5e는 계란의 난각막을 주사전자현미경으로 촬영한 것(×2K 배율)이다.
도 5f는 계란의 난각막을 주사전자현미경으로 촬영한 것(×50K 배율)이다.
도 6a는 카본블랙을 분사하기 전, 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 다양한 농도(0.4 중량%, 0.5 중량%, 0.6 중량%, 0.8 중량%)을 코팅한 메쉬천과 코팅하지 않은 메쉬천의 사진이고, 도 6b는 카본블랙을 분사한 후, 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 다양한 농도(0.4 중량%, 0.5 중량%, 0.6 중량%, 0.8 중량%)을 코팅한 메쉬천과 코팅하지 않은 메쉬천을 걷어낸 후 아래에 남은 종이의 사진이다.
도 7은 카본블랙을 처리하기 전 종이(a), 카본블랙을 처리하고 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 코팅하지 않은 메쉬천 아래에 위치한 종이(b), 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 다양한 농도(0.4 중량%, 0.5 중량%, 0.6 중량%, 0.8 중량%)(c~f)을 코팅한 메쉬천 아래의 종이 표면을 광학현미경으로 촬영한 것이다.
이하에서는 본 발명에 따른 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체 및 그 제조방법에 관하여 첨부된 도면과 함께 상세히 설명하기로 한다.
본 발명에서는 카르복실화된 바이오셀룰로오스와 하기 세포투과성 펩티드가 공유결합되고, 상기 공유결합은 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 중 하나 이상을 첨가하여 유도되는 것을 특징으로 하는 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체를 제공한다.
상기 카르복실화된 바이오셀룰로오스는 바이오셀룰로오스가 카르복실기를 갖는 것으로, 바이오셀룰로오스를 산화 처리하여, 카르복실기를 도입한 것일 수 있고, 예를 들어 바이오셀룰로오스에 TEMPO 산화처리 등으로 산화 처리를 실시하거나 카르복실산 유래의 기를 갖는 화합물, 그 유도체를 처리하여 카르복실기가 도입된 것일 수 있다.
상기 카르복실화된 바이오셀룰로오스는 섬유 다발이 마이크로피브릴 단위로 풀어져 미세섬유 형태로 존재할 수 있다.
상기 카르복실기로 치환되는 바이오셀룰로오스로는 길이가 10 내지 5000 nm, 두께가 0.001 내지 1000 nm의 섬유형 구조를 갖는 것이 사용될 수 있다. 이때, 상기 바이오셀룰로오스의 표면에 존재하는 수산기가 산화반응을 통해 카르복실기로 산화된다.
또한 본 발명에 따른 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체는 궁극적으로 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC) 및 N-하이드록실 석신이미드(NHS)의 존재 하에서 상술한 카르복실화된 바이오셀룰로오스에, 세포투과성 펩티드가 결합된 구조일 수 있다.
이때 상기 세포투과성 펩티드는 Bac7 펩티드인 것이 바람직하다. 상기 Bac7 펩티드는 bovine cathelicidin antimicrobial peptide Bac7의 아미노산 서열 중 우수한 세포투과성을 가지는 15번~23번 활성 단편을 이용하였다. 하기 서열번호 1로 표시될 수 있다.
[서열번호 1]
PRPLPFPRPG
또한, 본 발명의 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체 구조가 도 1에 도시되어 있으며, 이에 따르면 바이오셀룰로오스를 산화반응하여 바이오셀룰로오스의 표면에 존재하는 수산기가 카르복실기로 되고, 그 카르복실기에 세포투과성 펩티드가 공유결합된 것을 알 수 있다.
본 발명의 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체는 바이오셀룰로오스에 세포투과성 펩티드가 결합됨으로써, 세포 또는 피부에 대하여 접착성이 더욱 향상된 것일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체는 피부에 대하여 접착력이 0.2~0.4 N으로, 바이오셀룰로오스에 비해 2~4 배이상 높은 접착력을 가짐을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 구현예로서 상술한 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체는 세포 또는 피부에 도포시, 세포나 피부 표면에 난각막과 유사한 구조를 형성하여 세포나 피부를 보호할 수 있다. 특히 세포나 피부의 표면에서 통기성은 유지하되 수분을 보호하며, 외부 오염물질만을 효과적으로 차단하기 때문에, 독성이나 부작용이 없고, 물리적 충격에 의해 쉽게 제거되지 않으므로 장기간 사용이 가능하다. 따라서 본 발명의 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체는 다양한 분야에 활용이 가능하며, 구체적으로 피부 접착제 뿐만 아니라 화장료 조성물로도 활용할 수 있다.
또한, 본 발명은 I) 바이오셀룰로오스에 카르복실기를 도입하는 단계; 및
II) 상기 I) 단계의 카르복실화된 바이오셀룰로오스와 세포투과성 펩티드를 반응시키는 단계;를 포함하는 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 바이오셀룰로오스를 증류수에 첨가한 후, (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥실((2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yl)oxyl, TEMPO), 브로민화나트륨(NaBr), 치아염소산나트륨(NaClO)을 첨가하여, 바이오셀룰로오스의 수산기를 산화하여 카르복실기가 도입될 수 있다. 구체적으로 바이오셀룰로오스 표면에 있는 -OH 기가 TEMPO 존재하에서 카르복실기로 산화될 수 있다. 도 1에서와 같이 수산기의 산화반응은, 바이오셀룰로오스의 수산기가 우선적으로 알데하이드기(COH)로 전환되고, 더욱 산화되면 카르복시산기(COOH)로 전환되는 것이다.
상기 I) 단계는 수산화나트륨(NaOH)을 더 포함할 수 있다.
이어서 상기 II) 단계에서는 I) 단계에서 제조된 카르복실화된 바이오셀룰로오스와 세포투과성 펩티드를 반응시켜 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체를 얻을 수 있다. 이때 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride; EDC] 및 N-하이드록실 석신이미드(N-hydrosuccinimide; NHS)를 적정량 첨가하여, 카르복실화된 바이오셀룰로오스의 카르복실기를 활성화시켜 세포투과성 펩티드의 아미노기와 공유결합을 유도함으로써, 상기 바이오셀룰로오스에 세포투과성 펩티드가 결합된다.
이하에서는 본 발명에 따른 실시예를 첨부된 도면과 함께 구체적으로 설명한다.
[실시예 1 내지 4] 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체의 합성
1 중량% 바이오셀룰로오스를 상온에서 호모디스퍼를 통해 물에 고르게 분산시켜 분산액을 제조하였다. 상기 바이오셀룰로오스 분산액 총 질량 대비 10 중량%의 NaBr을 TEMPO 촉매와 함께 첨가하여 상온 조건 하에서 10분간 교반하였다. 여기에 5 mmol의 NaClO를 첨가하여 반응용액을 제조하였다. 상기 반응용액은 0.5 M NaOH를 이용하여 pH를 10.5로 적정하면서, 상온에서 하루 동안 교반시켰다. 상술한 산화반응을 통해 바이오셀룰로오스의 표면에 존재하는 수산기를 산화시켜 카르복실기를 도입하면, 바이오셀룰로오스 섬유 다발이 마이크로피브릴 단위로 풀어지게 되어 바이오셀룰로오스 미세섬유로 형태로 카르복실화된 바이오셀룰로오스가 얻어진다. 반복적인 원심분리를 통하여 카르복실화된 바이오셀룰로오스를 세정하고 회수하였다.
상기 카르복실화된 바이오셀룰로오스를 상온에서 물에 희석하고, 교반하였다. 이때 상기 카르복실화된 바이오셀룰로오스의 농도는 0.2 중량%로 고정하였다. 첨가된 상기 카르복실화된 바이오셀룰로오스의 총 질량 대비 20 중량%의 EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)과 50 중량%의 sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)를 첨가한 후, 상온에서 15분간 교반하였다. 다음, 서열번호 1로 표시되는 Bac7 펩티드를 펩트론(peptron)에 의뢰하여 합성한 후, 이를 다양한 농도(25, 50, 100, 200 μM)로 각각 첨가한 후, 상온 조건 하에서 4시간동안 교반하여, 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체를 제조하였다. 최종적으로 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체를 투석 과정을 통해 세정하고 회수하였다.
[시험예 1] 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BC Bac7 ) 분석
상술한 과정을 통해 제조된 실시예 3으로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)의 형성유무를 확인하기 위해 1H-NMR(도 2a)과 FT-IR(도 2b)로 정성분석하였다. 이때 비교예로 바이오셀룰로오스(BC)와 서열번호 1로 표시되는 Bac7 펩티드(Bac7)를 사용하였다. 도 2a와 도 2b에 나타난 바와 같이 실시예 3을 통해 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)는 바이오셀룰로오스와 Bac7 펩티드가 결합을 통해 형성되었음을 확인하였다.
또한 혼합비율에 따른 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체의 합성효율을 검증하기 위하여, 실시예 1 내지 4로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7) 형광분광기 분석(도 2c)을 이용해 정량분석하였다. 이때 비교예로 바이오셀룰로오스(BC)(서열번호 1로 표시되는 Bac7 펩티드 0 μM)을 사용하였다. 도 2c에 따르면 서열번호 1로 표시되는 Bac7 펩티드 농도가 증가함에 따라 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7) 합성효율이 증가함을 확인할 수 있다.
[시험예 2] 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BC Bac7 )의 세포 독성 분석
바이오셀룰로오스(BC) 및 실시예 1 내지 4로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)가 세포에 대하여 독성을 나타내는지 확인하기 위하여, 인간 신장 세포 293 T 세포(HEK 293 T cell, invitrogen)를 대상으로 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 에쎄이를 사용하여 실험을 수행하였다. 이는 탈수소 효소 작용에 의해 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색의 비수용성 MTT formazan으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용한 시험법이다.
먼저, 96 well plate에 HEK 293 T cell를 5×104 cell/mL의 밀도로 분주하고 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 24시간 후 바이오셀룰로오스(BC) 및 실시예 1 내지 4로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 각각 첨가하고 24시간을 더 배양하였다. 그리고, 2 mg/mL MTT 용액을 처리하고 4시간동안 반응시킨 뒤 배지를 제거하고 DMSO로 용해한 다음 ELISA reader기를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 하기 수학식 1로 계산하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이때 대조군로 아무것도 처리하지 않은 인간 신장 세포 293 T 세포(HEK 293 T cell, invitrogen)를 사용하였다.
[수학식 1]
세포 생존율(%) = (시료처리군의 흡광도 / 대조군의 흡광도) × 100
도 3a에 나타낸 바와 같이, HEK 293 T cell에 바이오셀룰로오스(BC) 및 실시예 1 내지 4로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 각각 처리한 후 세포생존능력을 측정한 결과, 실시예 1 내지 4로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)에 대해서는 전혀 독성이 없는 것으로 확인되었다. 오히려 바이오셀룰로오스(BC)를 단독으로 사용하는 경우 10~20% 세포 생존율이 감소하였다.
[시험예 3] 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BC Bac7 )의 세포 접착력 분석
바이오셀룰로오스(BC) 및 실시예 1 내지 4로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)가 세포에 대하여 접착력을 가지는지 확인하기 위하여, 인간 신장 세포 293 T 세포(HEK 293 T cell, invitrogen)를 대상으로 실험을 수행하였다.
먼저, 96 well plate에 HEK 293 T cell를 5×104 cell/mL의 밀도로 분주하고 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 24시간 후 direct red 23으로 염색시킨 바이오셀룰로오스(BC) 및 실시예 1 내지 4로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 각각 첨가하고 1시간을 더 배양하였다. 그리고, PBS 버퍼로 세척한 다음 접착되어 남아있는 바이오셀룰로오스 양을 Microplate 리더기를 이용하여 535/595nm에서 형광 세기를 측정하였다.
도 3b에는 형광 표지된 바이오셀룰로오스(BC) 또는 형광 표지된 실시예 1 내지 4로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 세포에 처리하고, 배양한 다음 정제하였을 때, 세포 표면에 부착/접착되어 있는지를 관찰하기 위해 형광 현미경으로 촬영하고 마이크로플레이트 리더기로 정량화하여 나타내었다. 이중 형광으로 표지된 바이오셀룰로오스(BC) 및 형광으로 표지된 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 각각 세포에 처리한 후, 촬영한 각각의 형광이미지를 도 3c, d에 나타내었다.
도 3b, c, d에 따르면 바이오셀룰로오스(BC)만을 단독으로 처리한 세포에서는 세포 표면에 바이오셀룰로오스가 접착되지 못하고 제거되었음을 확인할 수 있다. 이에 반해 실시예 1 내지 4로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)는 세포 표면에 많은 양이 접착되어 있었으며, Bac7 펩티드 혼합비율이 증가할수록 세포 표면과의 접착력이 향상됨을 알 수 있다.
[시험예 4] 돼지피부에서의 접착 거동 분석
본 발명의 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)와 피부와의 접착 거동을 확인하기 위하여 돼지 피부를 사용하였다. 먼저, 실시예 1 내지 4로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 기판 상에 도포하고, 건조시켜 20㎛ 두께의 필름을 제조하였다. 이를 홀 펀치로 일정한 크기(36 ㎟, 64 ㎟, 100 ㎟, 156.25 ㎟)를 잘라내 레오미터의 지오메트리에 고정시키고, 도 4a과 같이 돼지 피부에 접착시킨 후 서서히 떼어내면서 그 힘을 측정하였다. 필름형태에서 완전히 건조된 상태이면 인장력 측정이 어려우므로, 증류수를 분사하여 젖은 상태로 만든 후 피부와 접착시켰다. 비교군으로 바이오셀룰로오스만으로 제조된 필름(BC film)(36 ㎟)을 사용하였다. 돼지피부와 필름 간의 접착력은 레오미터의 인장력 측정을 통하여 측정하였다.
도 4b는 돼지피부로부터 바이오셀룰로오스(BC) 또는 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)(36 ㎟, 64 ㎟, 100 ㎟, 156.25 ㎟)를 서서히 떼어내는데 소요되는 시간과 이에 따른 힘의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 4c는 다양한 면적의 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7) 필름(36 ㎟, 64 ㎟, 100 ㎟, 156.25 ㎟)의 접착력을 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 4b, c에 따르면 돼지피부로부터 바이오셀룰로오스(BC) 필름을 떼어내는데 드는 힘보다 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 떼어내는데 드는 힘이 더 큰 것을 확인하였다. 아울러 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)의 면적이 넓을수록 떼어내는데 드는 힘이 증가하였다.
[시험예 5] 표면특성 분석
실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 다양한 농도(0.4 중량%, 0.5 중량%, 0.6 중량%, 0.8 중량%)로 증류수에 분산시켜 제조된 용액을 제조하고, 슬라이드 글라스에 시료를 균일하게 도포하였다. 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)가 코팅된 슬라이드 글라스를 Pt로 코팅한 뒤 주사전자현미경(HITACHI SU-8010)을 사용하여 관찰하였다. 비교군으로 계란의 난각막을 사용하였다.
도 5a~d는 순서대로 다양한 농도(0.4 중량%, 0.5 중량%, 0.6 중량%, 0.8 중량%)의 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 주사전자현미경으로 촬영한 것(× 50K 배율)이고, 도 5e는 계란의 난각막을 주사전자현미경으로 촬영한 것(×2K 배율)이며, 도 5f는 계란의 난각막을 주사전자현미경으로 촬영한 것(× 50K 배율)이다.
이에 따르면, 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)의 섬유 평균 직경이 각각 70.86 ㎚, 77.45 ㎚, 74.96 ㎚, 81.7 ㎚임을 확인하였다. 이에 반해 계란의 난각막을 형성하는 섬유의 평균 직경은 1.95 ㎛이므로, 본 발명의 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)가 훨씬 더 조밀한 구조를 가지고 있음을 알 수 있다.
[시험예 6] 미세먼지 차단능력 평가
실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)의 미세먼지 차단 능력을 평가하고자 하였다. 우선 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 다양한 농도(0.4 중량%, 0.5 중량%, 0.6 중량%, 0.8 중량%)로 증류수에 분산시켜 제조된 용액을 제조하고, 이를 카본블랙(시그마알드리치, 484164-50G, 2~12㎛)이 통과할 수 있는 공극을 가진 메쉬천에 도포하여 코팅시켰다. 다음 미세먼지와 크기가 유사하고 흡착성이 좋은 카본 블랙을 파우더 분사용 용기를 이용하여 코팅된 종이 위에 분사하였다. 각각의 메쉬천를 회수한 뒤, 카본블랙이 분사된 종이의 윗면을 광학 현미경을 통해 확인하여, 카본블랙이 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)가 코팅된 메쉬천를 투과하였지를 확인하였다. 대조군으로 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)가 코팅하지 않은 것을 사용하였다. 광학 현미경은 OLYMPUS BX51을 사용하였고, 10×/0.30BD 배율로 촬영하였다.
도 6a는 카본블랙을 분사하기 전, 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 다양한 농도(0.4 중량%, 0.5 중량%, 0.6 중량%, 0.8 중량%)을 코팅한 메쉬천과 코팅하지 않은 메쉬천의 사진이고, 도 6b는 카본블랙을 분사한 후, 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 다양한 농도(0.4 중량%, 0.5 중량%, 0.6 중량%, 0.8 중량%)을 코팅한 메쉬천과 코팅하지 않는 메쉬천을 걷어낸 후 아래 종이의 사진이다.
도 7은 카본블랙을 처리하기 전 종이(a), 카본블랙을 처리하고 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 코팅하지 않은 종이(b), 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 다양한 농도(0.4 중량%, 0.5 중량%, 0.6 중량%, 0.8 중량%)(c~f)을 코팅한 메쉬천 아래의 종이 표면을 광학현미경으로 촬영한 것이다.
이에 따르면, 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 코팅하지 않은 종이는 카본블랙이 투과되었음을 확인하였다. 이에 반해 실시예 2로부터 제조된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)가 코팅된 메쉬천 아래의 종이는 카본블랙이 전혀 투과되지 않음을 알 수 있다. 즉 본 발명의 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체(BCBac7)를 피부에 도포시 외부 오염물질(미세먼지)을 차단하는 우수한 효과를 가짐을 확인하였다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따라 제조된, 바이오셀룰로오스에서 수산기가 카르복실기로 산화된 후, 상기 카르복실기에 세포투과성 펩티드가 결합되어 형성된 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체는 세포와 피부에 대하여 접착성이 우수하고, 기존의 바이오셀룰로오스보다 세포 또는 피부 보호 효과가 더 뛰어날 뿐만 아니라, 세포 또는 피부에 적용시 난각막과 유사한 구조의 막을 형성함으로써, 통기성은 유지하되 수분을 보호하고 외부 유해물질의 차단 능력이 뛰어나므로 화학, 제약 또는 화장품 산업 등에서 응용할 수 있다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> Biocellulose-peptide composite and preparation method thereof <130> HPC8691 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bovine cathelicidin antimicrobial peptide Bac7 <400> 1 Pro Arg Pro Leu Pro Phe Pro Arg Pro Gly 1 5 10

Claims (6)

  1. 카르복실화된 바이오셀룰로오스와 하기 세포투과성 펩티드가 공유결합되고,
    상기 공유결합은 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 중 하나 이상을 첨가하여 유도되는 것을 특징으로 하는 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 카르복실화된 바이오셀룰로오스는 길이가 10 내지 5000 nm, 두께가 0.001 내지 1000 nm인 섬유형 구조인 것을 특징으로 하는 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포투과성 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 Bac7 펩티드인 것을 특징으로 하는 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체.
  4. I) 바이오셀룰로오스에 카르복실기를 도입하는 단계; 및
    II) 상기 I) 단계에서 제조된 카르복실화된 바이오셀룰로오스와 세포투과성 펩티드를 반응시키는 단계;를 포함하는 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 I) 단계는 (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥실((2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yl)oxyl, TEMPO), 브로민화나트륨(NaBr), 치아염소산나트륨(NaClO)의 존재하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 II) 단계는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC) 및 N-하이드록실 석신이미드(NHS)의 존재 하에서 카르복실화된 바이오셀룰로오스와 세포투과성 펩티드를 반응시키는 것을 특징으로 하는 바이오셀룰로오스-펩티드 복합체의 제조방법.
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