DE69925156T2

DE69925156T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von zellproliferationsstörungen

Info

Publication number: DE69925156T2
Application number: DE69925156T
Authority: DE
Inventors: N. John VOURNAKIS; Sergio Finkielsztein; R. Ernest PARISER
Original assignee: Marine Polymer Technologies Inc
Current assignee: Marine Polymer Technologies Inc
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-21
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2019-12-22
Also published as: HK1043507B; AU780248B2; DE69925156D1; JP4795539B2; JP2003522732A; NO20013071L; EP1139752B1; IL143700A; CA2356087A1; NO330033B1; EP1139752A1; WO2000036918A9; CN100488512C; HK1043507A1; WO2000036918A1; NZ512586A; EP1139752A4; NO20013071D0; CN1335749A; ES2242448T3

Description

1. EINFÜHRUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen, umfassend mindestens einen Endothelinantagonisten in Kombination mit einer Poly-β-1-4-N-acetylglucosamin(p-GlcNAc)-Polysaccharidmatrix zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs und anderen proliferativen Erkrankungen. Insbesondere kann der Endothelinantagonist der Erfindung eine Peptid- oder Nicht-Peptid-Verbindung sein, und die p-GlcNAc-Matrix der Erfindung besteht aus einem Polymer mit hohem Molekulargewicht, dessen Bestandteil Monosaccharidzucker in einer β-1-4-Konformation gebunden sind und das frei von Proteinen und im Wesentlichen frei von einzelnen Aminosäuren und anderen organischen und anorganischen Schadstoffen ist. Die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung sind zur Hemmung des Wachstums von Tumoren und anderen neoplastischen Zellen und/oder zur Hemmung der Metastasierung von neoplastischen Zellen in vivo geeignet.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Endotheline sind eine Familie von 21 Aminosäurepeptiden, z.B. ET-1, ET-2 und ET-3, und ursprünglich durch ihre potenten vasokonstriktorischen und angiogenen Eigenschaften gekennzeichnet (siehe z.B. Luscher u.a., 1995, Agents Actions Suppl. (Schweiz) 45: 237–253; Yanagisawa u.a., 1988, Nature 332: 411–415). Diese Peptide scheinen außerdem mit Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise bFGF, verwandt zu sein und wirken oft in Synergie mit ihnen (siehe z.B. Halaban, 1996, Seminars in Oncology 23: 673–681; Reid u.a., 1996, Development 122: 3911–3919; Markewitz u.a., 1995, Am. J. Physiol. 268: L192–L200; und Nelson u.a., 1996, Cancer Res. 56: 663–668). Weiterhin zeigen diese Peptide cytokinartige regulatorische Eigenschaften und können durch Hormone, wie beispielsweise Insulin und Angiotensin II, sowie Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise TGF-β und TNF-α (Nelson u.a. oben; Suzuki u.a., 1989, J. Biochem. 106: 736–741; und Lundblad u.a., 1996, Crit. Care Med. 24: 820–826) beeinflusst werden. Die Endothelinaktivität wird über die Bindung mit bevorzugten Affinitäten an zwei ausgeprägte G-gekoppelte Rezeptoren, ETA und ETB, autokrin/parakrin vermittelt (siehe z.B. Hocher u.a., 1997, Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 35(3): 175–189; Shichiri u.a., 1991, J. Cardiovascular Pharmacol. 17: S76–S78).
Es gibt eine Auswahl von Agonisten und Antagonisten von Endothelinrezeptoren (Webb u.a., 1997, Medicinal Research Reviews 17(1): 17–67), die dazu verwendet wurden, den Wirkmechanismus der Endotheline zu untersuchen. Weil Endothelin bekanntermaßen eine starke vasokonstriktive Wirkung hat, sind Endothelinantagonisten insbesondere (auf dem Fachgebiet auch „Endothelinrezeptorantagonisten" genannt) im Hinblick auf ihre mögliche Rolle bei der Behandlung von Erkrankungen beim Menschen, besonders von kardiovaskulären Erkrankungen, wie beispielsweise Bluthochdruck, kongestivem Herzfehler, Atherosklerose, Restenose und Herzinfarkt (Mateo u.a., 1997, Pharmacological Res. 36(5): 339–351), untersucht worden. Zum Beispiel erleben gegenwärtig nicht auf Peptid beruhende Endothelinantagonisten, die zu der Pyrimidinylsulfonamid-Familie gehören, wie beispielsweise Ro 465-2005 und Bosentan, die über ihre aromatischen Ringe mit dem Endothelinrezeptor in Wechselwirkung stehen, eine klinische Einschätzung zur Behandlung von Bluthochdruck, einer vaskulären Erkrankung und einem kongestiven Herzfehler. Diese Antagonisten können sowohl ETA als auch ETB mit unterschiedlichen Affinitäten binden und besitzen Vorteile gegenüber Antagonisten auf Peptid-Basis, weit sie eine verbesserte metabolische Stabilität aufweisen (Webb u.a. oben; und Parris u.a. oben). Darüber hinaus sind Endothelinantagonisten auch im Hinblick auf ihre mögliche Rolle bei der Behandlung einer Nierenerkrankung, wie beispielsweise einer gestörten Nierenfunktion bei Leberzirrhose und akutem Nierenversagen (Gomez-Garre u.a., 1996, Kidney Int. 50: 962–972; Hocher u.a. oben) untersucht worden.
Seit kurzem werden Endotheline und Endothelinrezeptoren bei einer Reihe von normalen und pathologischen Zellwachstumsprozessen einbezogen, z.B. Zellzyk lusablauf, Zellwachstum und Zellentwicklung (siehe z.B. Parris u.a., 1997, Vascular Medicine 2: 31–43; Markewitz u.a. oben; Morbidelli u.a., 1995, Am. J. Physiol. 269: H686–H695 und Battistini u.a. 1993, Peptides 14: 385–399). Es wurde gezeigt, dass ET1 und ET3 mitogene und chemokinetische Faktoren für normale Gewebe sind, die sich von Endothelzellen und Epithelzellen bis Makrophagen erstrecken (siehe z.B. Webb u.a., 1997, Medicinal Research Reviews 17(1): 17–67; und Gomez-Garre u.a. oben). Darüber hinaus ist gezeigt worden, dass die Bindung von Endothelinen an ihre Rezeptoren eine DNA-Synthese, Proliferation und Zellmobilisierung bei normalen und neoplastischen Zellen bewirkt (Webb u.a. oben; Ziche u.a., 1995; Cardiovasc. Pharmacol. 26: S284–S286; und Yamashita u.a., 1991, Res. Comm. in Chem. Pathol. and Pharmacol. 74(3): 363–369).
Diese potentielle Fähigkeit von Endothelinen das Zellwachstum und den Zellzyklusablauf zu vermitteln, hat zu einigen ersten Untersuchungen der Endothelinexpression und/oder Endothelinrezeptorpräsenz in Krebszellen geführt. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass ET-1 in Brustkrebs- und Pankreaszelllinien überexprimiert ist und eine Proliferation in Brustkrebsgewebe, Ovarialzelllinien und Prostatatumoren induziert (siehe z.B. Moriatis u.a., 1997, Eur. J. Canc. 33(4): 661–668; Nelson u.a., 1996, Cancer Res. 56: 663–668; Patel u.a., 1995, Br. J. Cancer 71: 442–447; Oikawa u.a., 1994, Br. J. Cancer 69: 1059–1064; Shichiri u.a. oben; und Yamashita u.a. oben). Darüber hinaus ist das Vorhandensein von Rezeptoren des Typs ETA, die eine höhere Affinität für ET1 und ET2 haben, in Ovarialzelllinien (Moriatis u.a. oben) und Brustkrebsgeweben (Yamashita u.a. oben) gezeigt worden. Einer der wenigen Tumoren, die ETB-Rezeptoren exprimieren, die eine ähnliche Affinität für alle drei Isoformen von Endothelin haben, ist das Melanom (Yohn u.a., 1994, Biochem. Biophys. Res. Comm. 201(1): 449–457). Interessanterweise werden ETB-Rezeptoren in primären oder wiederkehrenden Melanomen stark exprimiert, aber weniger in metastatischen Melanomen (Kikuchi u.a., 1996, Biochem. Biophys. Res. Comm. 219: 734–739).
Obwohl diese Studien nahe legen, dass Endothelinantagonisten möglicherweise therapeutische Anwendungen bei der Behandlung von Krebs haben, gibt es bis jetzt keine Studien, die eine solche therapeutische Anwendung zeigen. Tatsächlich ist die Rolle, die Endothelin bei der Förderung einer proliferativen Erkran kung, wie beispielsweise verschiedenen vaskulären proliferativen Erkrankungen und gutartiger Prostatahypertrophie (BPH) spielen, unklar (Webb u.a. oben und Kenny u.a., 1997, J. Med. Chem. 40(9): 1293–1315). Darüber hinaus gibt es, während die US-Patente 5,550,110 und 5,641,752 die Verwendung von bestimmten Hexapeptid-Endothelinantagonisten zur Behandlung von Krebs offenbaren, in diesen Offenbarungen eigentlich keine Informationen über die Krebsbehandlung und keinen Hinweis darauf, wie eine solche Behandlung durchzuführen ist oder ob eine solche Behandlung erfolgreich sein würde (siehe auch PCT-Anmeldungen WO 97/37987, 97/08169, WO 96/11927 und WO 94/03483, kanadische Patentanmeldung 2072395 und US-Patent 5,658,943).
Die WO-A-9639122 beschreibt verschiedene Antitumorverbindungen, die durch p-GlcNAc-Fasern für Zusammensetzungen mit langsamer Medikamentenabgabe verkapselt werden. Solche Antitumorverbindungen umfassen Alkylierungsmittel, Antimetaboliten, Kunststoffe, hormonale Therapeutika, Medikamente im Versuchsstadium, biologische Präparate und Strahlungsverstärker.
Endothelinantagonistenverbindungen und Verfahren zur Verwendung von solchen Verbindungen zur Behandlung von mit Endothelin in Beziehung stehenden Störungen sind weiter in der WO-A-9619459 und US-A-5571821 offenbart.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung von Zellproliferationsstörungen, wie beispielsweise Krebs. Insbesondere betrifft die Erfindung Zusammensetzungen, die mindestens einen Endothelinantagonisten in Kombination mit einer Poly-β-1-4-N-acetylglucosamin(p-GlcNAc)-Polysaccharidmatrix umfassen, zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs und anderen Proliferationsstörungen. Die vorliegende Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung der Anmelderin, dass das Tumorzellwachstum und/oder das Wachstum oder die Metastasierung von neoplastischen Zellen signifikant gehemmt werden, wenn ein Endothelinantagonist in vivo entweder allein in hohen Dosen oder in Kombination mit einer Polysaccharidmatrix verabreicht wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Endothelinantagonist eine nicht auf einem Peptid beruhende Pyrimidylsulfonamidverbindung wie die in der 1 unten gezeigte.
Die Verbindung der 1 ist 5-Isopropylpyridin-2-sulfonsäure [6-(2-hydroxy-ethoxy)-5-(2-methoxy-phenoxy),-2-[2-(1H-tetrazol-5-yl)-pyridin-4-yl]-pyrimidin-4-yl]-amidnatriumsalz (1:2), hier auch als „Ro61" bezeichnet, und hat ein Molekulargewicht von etwa 650 kD. Es handelt sich dabei um einen nicht spezifischen Nicht-Peptid-Inhibitor der beiden Endothelinrezeptoren ETA und ETB.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Polysaccharidmatrix eine Poly-β-1-4-N-acetylglucosamin(p-GlcNAc)-Polysaccharidmatrix oder ein Derivat davon, wie im US-Patent 5,635,493 beschrieben. Das p-GlcNAc oder seine Derivate können in verschiedenen Umformulierungen verwendet werden, einschließlich Membranen, Fäden, nicht gewebten Textilien, Schwämmen, Gelen und dreidimensionalen Matrizen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das p-GlcNAc in der Form eines Gels verfügbar, ist vorzugsweise deacetyliert und wahlweise zu einem p-GlcNAc-Lactatsalz derivatisiert und mit Ro61 zur Verabreichung in vivo kombiniert.
Die Zusammensetzungen der Erfindung sind für Medikamentenabgabesysteme geeignet, z.B. die Medikamentenabgabe mit langsamer Freisetzung. Die Zusammensetzungen der Erfindung sind gegenüber herkömmlichen Medikamenten formulierungen insofern eine Verbesserung, als die Zusammensetzungen der Erfindung zum Beispiel eine erhöhte Wirksamkeit, eine reduzierte Toxizität und verbesserte Bioverfügbarkeit vorsehen.
Die Verfahren der Erfindung umfassen die Verabreichung von therapeutisch wirksamen Mengen an Zusammensetzungen der Erfindung in vivo zur Behandlung von Zellproliferationserkrankungen, wie beispielsweise Krebs, beim Tier, einschließlich dem Menschen. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird mindestens ein Endothelinantagonist, wie beispielsweise Ro61, in einem deacetylierten p-GlcNAc-Lactatgel gelöst und in einer therapeutisch wirksamen Menge einem Patienten in vivo zur Behandlung von Krebs oder anderen Proliferationserkrankungen oder Störungen verabreicht. Eine besondere Ausführungsform der Erfindung umfasst die Verabreichung eines nicht auf einem Peptid beruhenden Endothelinantagonisten in vivo, wie beispielsweise einem Pyrimidylsulfonamid-Endothelantagonist, zur Behandlung von Krebs oder anderen Proliferationserkrankungen oder -störungen. Die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung sind zur Hemmung von Tumor- und/oder anderem neoplastischen Zellwachstum und/oder zur Hemmung der Metastasierung von neoplastischen Zellen in vivo geeignet.
4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Chemischer Aufbau von 100% p-GlcNAc. „n" betrifft eine ganze Zahl im Bereich von etwa 4.000 bis etwa 150.000, wobei etwa 4.000 bis etwa 15.000 bevorzugt ist.
2. Kohlenhydratanalyse von p-GlcNAc, Gaschromatographie-Massenspektroskopiedaten. Die schwarzen Quadrate stellen p-GlcNAc, gereinigt mittels des im Abschnitt 5.1 beschriebenen Säurebehandlungs/Neutralisations-Verfahrens, dar.
3. REM-Aufnahme, die eine p-GlcNAc-Membran zeigt, welche mittels Säurebehandlungs-/Neutralisations-Variation des chemischen/biologischen Reinigungsverfahrens hergestellt wurde. Vergrößerung 10.000×.
4. Schematische Darstellung, die einen Teil des möglichen p-GlcNAc und der deacetylierten p-GlcNAc-Derivate der Erfindung zeigt (angepasst von S. Hirano, in „Chitin and Chitosan", 1989, Skjak, Braek, Anthonsen und Sanford Hrsg., Elsevier Science Publishing Co., Seite 37–43).
5A und 5B. REM-Aufnahmen einer deacetylierten p-GlcNAc-Matte. Vergrößerung: 5A: 1.000×; 5B: 10.000×.
6A und 6B. REM-Aufnahmen einer p-GlcNAc-Membran, die in Dimethylacetamid/Lithiumchlorid gelöst und in Wasser erneut zu einem faserigen Material präzipitiert wird, wie in dem Beispiel im Abschnitt 8 unten beschrieben.
7. Endothelinrezeptorantagonist-Ro61-Hemmung der B16-Melanomzellproliferation in vitro. Ro61 wurde bei steigenden Konzentrationen einer 96-Loch-Kulturplatte zugesetzt, zu der dann B16-Zellen (schwarze Kreise) und Splenozyten (weiße Kreise) von C57BL/6-(H-2b)-Mäusen gegeben wurden. Die Proliferation der mit Ro61 behandelten Zellen wird als prozentualer Anteil der unbehandelten Kontrollzellen ausgedrückt. Es wurden Mittelwerte der Dreifach-Löcher („triplicate wells") bestimmt.
B. Die Balkendiagramme, die die prozentuale Proliferation einer B16-Melanomzelle bezüglich der unbehandelten Kontrollen nach Aussetzen der Zellen verschiedenen Endothelinantagonisten angeben. Die Ergebnisse zeigen eine Hemmung der Proliferation nach Aussetzen der Zellen den Endothelinantagonisten. FO-Zellen sind Kontroll-B16-Zellen, denen ein ETA-Rezeptor voller Länge fehlt; das Balkendiagramm ET1 stellt eine Kontrolle dar, wobei die Zellen einem bekannten Endothelinantagonisten ausgesetzt waren.
9. Balkendiagramme, die die prozentuale Proliferation einer B16-Melanomzelle bezüglich der unbehandelten Kontrollen nach Aussetzen der Zellen verschiedenen Endothelinantagonisten angeben. Die Ergebnisse zeigen eine Hemmung der Proliferation nach Aussetzen den Endothelinantagonisten. FO-Zellen sind Kontroll-B16-Zellen, denen ein ETA-Rezeptor voller Länge fehlt; die Balkendiagramme ET1 und BQ3020 stellen Kontrollen dar, wobei die Zellen den bekannten Endothelinagonisten ausgesetzt waren.
10. ETA- und ETB-Agonisten-Umkehr der Ro61-Hemmung der B16-Melanomzellenproliferation in vitro. Die B16-Zellen wurden entweder mit dem Agonisten BQ-3020-[Ac-[Ala11,Ala15]-Endothelin(6,21) (schwarzes Dreieck), dem Agonisten [Ala^1,3,11,15]-Endothelin1 (weiße Raute), beiden Agonisten (weißes Kästchen) oder keinem von beiden (schwarzer Kreis) kultiviert, und dann wurde Ro61 jedem Loch zugesetzt. Die Proliferation der mit Ro61 behandelten Zellen ist als prozentualer Anteil der unbehandelten Kontrollzellen ausgedrückt. Es wurden die Durchschnittswerte der Dreifach-Löcher bestimmt.
11A und 11B. Wirkung von Ro61 auf B16-Zellen in der Kultur. Lichtmikroskopaufnahme von B16-Zellen bei 40-facher Vergrößerung. A: B16-Zellen, gezüchtet in 96-Loch-Platten bei 5 × 10⁴ Zellen/Loch 72 Stunden lang bei 37°C in kompletten Medien; B: B16-Zellen, gezüchtet in kompletten, 5 μM Ro61 enthaltenden Medien.
12. Ro61 induziert Apoptose. B16-Zellen wurden auf Apoptose mit einem Fluorescein In Situ Cell Death Detection Kit untersucht, nachdem sie entweder mit gewöhnlichen Medien (Kontrolle) oder R061 (1 μM) (
) 0, 24, 48 und 72 Stunden bei 37°C gezüchtet wurden.
13A und 13B. Ro61-Hemmung von intraperitonealer B16-Karzinomatose. 13A: zeigt die Wirkung von IP Ro61 auf intraperitoneale B16-Karzinomatose. Weiblichen C57BL/6-Mäusen wurden 5 × 10⁴ B16-Melanomzellen intraperitoneal injiziert. Am nächsten Tag wurde den Tieren 100 μl entweder: täglich × 6 HBSS (Kontrolle), täglich × 6 HBSS enthaltend 3 mg/kg Ro61 (niedrige Dosis), täglich × 6 HBSS enthaltend 30 mg/kg Ro61 (hohe Dosis) injiziert. 13B zeigt die Wirkung der p-GlcNAc-Abgabe von Ro61. Die Tiere wurden mit Krebs wie in der 13A in Berührung gebracht und am nächsten Tag mit 100 μl p-GlcNAc-Gel behandelt, das entweder IP, SC oder IP mit 18 mg/kg Ro61 (IP + Ro61) injiziert wurde. Die Tiere wurden nach 7 Tagen geopfert und auf Vorhandensein von B16-Kolonien untersucht. Die Werte stellen die durchschnittliche Zahl an sichtbaren Kolonien und Standardfehler für jede Gruppe dar (n = 11 für alle Gruppen, mit Ausnahme der unbehandelten Gruppe, n = 13).
14. Verzögerte Tumorerscheinung in mit Ro61 behandelten C57BL/6-Mäusen nach der subkutanen B16-Melanomtumor-Kontaktierung. Weiblichen C57BL/6-Mäusen wurden SC 5 × 10⁴ B16-Melanomzellen injiziert. Am folgenden Tag wurden die Tiere willkürlich in 4 Gruppen unterteilt: keine Behandlung (
), eine IP-Injektion von p-GlcNAc-Gel allein (O), täglich IP-Injektionen von 3 mg/kg (6 Tage lang) Ro61 in HBSS (☐), eine IP-Injektion von p-GlcNAc-Gel enthaltend 18 mg/kg Ro61 (
). Die Tiere wurden 3 Wochen lang auf Vorhandensein eines Tumors überwacht (n = 10 in allen Gruppen).
15. Hemmwirkung von verschiedenen Endothelinantagonisten bei Erscheinen von B16-Tumorkolonien mittels nachfolgend beschriebenem Karzinomatose-Modell. F10 stellt unbehandelte B16-Kontrollzellen dar; BQmix stellt eine Mischung aus ETA-Antagonist, BQ123 und ETB-Antagonist, BQ788, dar; BQmix/Gel stellt eine Mischung aus BQ123 und BQ788 in Kombination mit dem nachfolgend beschriebenen p-GlcNAc-Gel dar; Ro61 ist der nicht spezifische, nachfolgend beschriebene ETA/ETB-Endothelinantagonist; Ro61/Gel ist Ro61 in Kombination mit pG-lcNAc; und GRGDS/Gel ist eine Kombination des ETA/ETB-Peptid-Endothelinantagonisten GRGDS in Kombination mit p-GlcNAc.
16. Langfristiges Überleben von mit Ro61 behandelten C57BL/6-Mäusen nach intraperitonealer B16-Melanom-Kontaktierung. C57BL/6-Mäusen wurden intraperitoneal B16-Zellen injiziert. Die Tiere wurden für eine der folgenden Behandlungen willkürlich in 4 Gruppen aufgeteilt: (a) keine Behandlung (schwarze Kästchen); (b) 100 μl p-GlcNAc-Gel als solches (Kreuze); (c) 100 μl täglich HBSS enthaltend 3 mg/kg Ro61 (schwarze Dreiecke); oder (d) 100 μl p-GlcNAc-Gel, enthaltend 18 mg/kg Ro61 (weiße Kästchen). Die Tiere wurden täglich überwacht und aus humanen Gründen geopfert, wenn festgestellt wurde, dass sie dem Tode geweiht waren.
17A und 17B. Mikroaufnahmen der Zellmorphologie von mit Ro61 behandelten (17A) und unbehandelten (17B) B16-Zellen bei 40-facher Vergrößerung; 10^–7 M Ro61, 10⁵ Zellen.
5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen umfassend mindestens einen Endothelinantagonisten in Kombination mit einer poly-β-1-4-N-Acetylglucosamin(p-GlcNAc)-Polysaccharidmatrix, und Verfahren zur Verwendung dieser Zusammensetzungen zur Behandlung von Krebs und anderen proliferativen Erkrankungen. Die Endothelinantagonisten gemäß der vorliegenden Erfindung können für ETA- oder ETB-Rezeptoren oder auf Peptid beruhende oder nicht auf Peptid beruhende Verbindungen spezifisch oder nicht spezifisch sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Endothelinantagonist ein nicht spezifischer, nicht auf einem Peptid beruhender Endothelinantagonist. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Endothelinantagonist eine nicht auf einem Peptid beruhende Pyrimidylsulfonamid-Verbindung, wie beispielsweise die in der nachfolgenden 1 gezeigte Ro61-Verbindung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist mindestens eine Art von Endothelinantagonist, entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen Antitumormitteln kovalent oder nicht kovalent an das ausführlich im Abschnitt 5.1 unten beschriebene p-GlcNAc gebunden oder damit kombiniert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist mindestens ein Endothelinantagonist, wie beispielsweise Ro61, in einem deacetylierten p-GlcNAc-Gel gelöst, um eine Endothelinantagonist(„EA")/p-GlcNAc-Zusammensetzung der Erfindung zu bilden. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das deacetylierte p-GlcNAc mit Milchsäure derivatisiert, um ein p-GlcNAc-Lactatsalz zu bilden.
Wie hier definiert umfasst der Begriff „Endothelinantagonist" Endothelinrezeptor-Antagonisten, und „EA/p-GlcNAc-Zusammensetzungen" umfassen Zusammensetzungen, bei denen mindestens eine Art von Endothelin-Antagonist entweder kovalent an das p-GlcNAc gebunden ist oder nicht kovalent an das p-GlcNAc gebunden, damit gemischt oder darin verkapselt ist. Die Zusammensetzungen der Erfindung können zusätzlich andere Antitumormittel umfassen, die in Kombination mit dem Endothelinantagonisten so wirken, dass das Wachstum und/oder die Metastasierung eines Tumors oder anderer neoplastischer Zellen gehemmt werden. Wie hier definiert umfasst „Antitumormittel" jede Verbindung, die das Wachstum oder die Metastasierung von Tumorzellen, Krebszellen oder jeder anderen Art von neoplastischer Zelle hemmt.
Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung der Anmelderin, dass Endothelinantagonisten in Kombination mit dem hier beschriebenen p-GlcNAc die Proliferation von neoplastischen Zellen in vitro hemmen und Metastasen reduzieren und/oder das Überleben von Tieren, die Tumorzellen in sich tragen, in vivo verlängern (siehe das Beispiel in den Abschnitten 12 bis 16 unten). Darüber hinaus hat das p-GlcNAc der vorliegenden Erfindung als solches eine hemmende Wirkung auf Metastasierungen und neoplastisches Zellwachstum in vivo.
Daher werden gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend die EA/p-GlcNAc-Zusammensetzungen der Erfindung, in einer therapeutisch wirksamen Menge einem Patienten in vivo zur Behandlung von Krebs oder anderen proliferativen Erkrankungen verabreicht. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst die Verabreichung ei nes Endothelinantagonisten in vivo, z.B. eines Pyrimidylsulfonamid-Endothelinantagonisten zur Behandlung einer proliferativen Erkrankung.
Einzig zur leichteren Beschreibung wird die ausführliche Beschreibung der Erfindung in die folgenden Abschnitte unterteilt: (1) Das p-GlcNAc der Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung; (2) Endothelinantagonisten der Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung; (3) bevorzugte Formulierungen der Zusammensetzungen der Erfindung; und (4) Verwendungen der Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung.
5.1 Das p-GlcNAc der Zusammensetzungen der Erfindung
Die in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verwendende p-GlcNAc-Polysaccharidmatrix umfasst ein Polymer mit hohem Molekulargewicht im Gewichtsmittelbereich von etwa 800.000 Dalton bis etwa 30 Millionen Dalton, basierend auf Gelpermeationschromatographiemessungen. Ein solcher Molekulargewichtsbereich stellt eine p-GlcNAc-Art mit etwa 4.000 bis etwa 150.000 N-Acetylglucosaminmonosaccharide dar, die in einer β-1-4-Konfiguration angelagert sind, wobei etwa 4.000 bis etwa 15.000 N-Acetylglucosaminmonosaccharide bevorzugt sind (1).
Die Variabilität des p-GlcNAc ist sehr gering und seine Reinheit ist sehr hoch, wobei beides durch chemische und physikalische Kriterien gezeigt wird. Darunter fallen die chemische Zusammensetzung und Nicht-Polysaccharidschadstoffe. Zuerst werden die chemischen Zusammensetzungsdaten für das unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Reinigungsverfahren erzeugte p-GlcNAc in der Tabelle 1 unten gezeigt. Wie ersichtlich ist, ist die chemische Zusammensetzung des mit beiden Verfahren erzeugten p-GlcNAc im Rahmen des experimentellen Fehlers dieselbe wie die Formelzusammensetzungen von p-GlcNAc. Zweitens ist, wie in der Tabelle I auch gezeigt ist, das erzeugte p-GlcNAc frei von detektierbaren Proteinschadstoffen, wie beispielsweise freien Aminosäuren, und ist im Wesentlichen frei von anorganischen Schadstoffen, wie beispielsweise Asche und Metallionen (das p-GlcNAc der Erfindung kann bis zu etwa 2% von den theoretischen Werten von Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff für rei nes p-GlcNAc abweichen). Daher betreffen die Begriffe „im Wesentlichen frei von organischen Schadstoffen" und „im Wesentlichen frei von anorganischen Schadstoffen", wie sie hier verwendet werden, Zusammensetzungen von p-GlcNAc mit den Profilen für Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff, die um nicht mehr als etwa 2% von den theoretischen Werten abweichen, und vorzugsweise enthält das p-GlcNAc der Erfindung ein Profil, wie es in den Versuchsdaten auf p-GlcNAc-Matten in Tabelle 1 beispielhaft gezeigt ist (was eine prozentuale Abweichung ermöglicht).
Weiter zeigt das p-GlcNAc einen sehr geringen Prozentsatz an gebundenem Wasser. TABELLE I CHEMISCHE ANALYSEDATEN (Gew.-%) Theoretische Werte für reines p-GlcNAc:

Kohlenstoff – 47,29

Wasserstoff – 6,40

Stickstoff – 6,89

Sauerstoff – 39,41

Protein – 0,00
Versuchsdaten auf p-GlcNAc-Matten: (Zahl der Versuchschargen für jeden Membrantyp über 30 für jeden Membrantyp)
Das p-GlcNAc der Zusammensetzungen der Erfindung zeigt ein Kohlenhydrat-Analyseprofil, das im Wesentlichen dem in der 2 gezeigten ähnlich ist. Das primäre Monosaccharid des p-GlcNAc ist N-Acetylglucosamin. Weiter enthält das p-GlcNAc nicht das Monosaccharidglucosamin. Andere physikalische Charakteristika von p-GlcNAc sind ausführlich im US-Patent 5,635,493 beschrieben.
Das p-GlcNAc gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt einen hohen Grad an Biokompatibilität, die durch eine Vielzahl von Verfahren bestimmt werden kann, einschließlich – aber nicht ausschließlich – solchen Verfahren wie dem Elutionstest, der intramuskulären Implantation oder intrakutanen oder systemischen Injektion bei Tieren. Siehe zum Beispiel das US-Patent 5,635,493, das hier durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Das p-GlcNAc wird durch Mikroalgen, vorzugsweise Kieselalgen, erzeugt und kann von diesen gereinigt werden. Die Kieselalgen, die als Ausgangsquellen zur Herstellung von p-GlcNAc verwendet werden, umfassen Mitglieder der Coscinodiscus-Gattung, Cyclotella-Gattung und Thalassiosira-Gattung, wobei die Thalatssiosira-Gattung bevorzugt ist, sind aber nicht darauf beschränkt.
Von der Coscinodiscus-Gattung beinhaltet die verwendbare Kieselalgen-Art die Concinnus- und Radiatus-Art, ist aber nicht darauf beschränkt. Die Kieselalgen der verwendbaren Cyclotella-Gattung umfassen die Caspia-, Cryptica- und Meneghiniana-Art, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Thalassiosira-Kieselalgen, die zur Erzeugung des Ausgangsmaterials für das p-GlcNAc der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen die Nitzschoides-, Aestivalis-, Antarctica-, Deciphens-, Eccentrica-, Floridana-, Fluviatilis-, Gravida-, Guillardii-, Hyalina-, Minima-, Nordenskioldii-, Oceanica-, Polychorda-, Pseudonana-; Rotula-, Tubifera-, Tumida- und Weissflogii-Art, wobei die Fluviatilis- und Weissflogii-Art bevorzugt sind, sind aber nicht darauf beschränkt. Kieselalgen, wie beispielsweise die oben beschriebenen, können zum Beispiel von der Kultursammlung des Bigelow Laboratory for Ocean Sciences, Center for Collection of Marine Phytoplankton (McKown Point, West Boothbay Harbor, Maine, 04575) erhalten werden. Jede dieser Kieselalgen kann mit den im US-Patent 5,635,493 beschriebenen Verfahren und Nährmedium gezüchtet werden.
p-GlcNAc-Fasern können von Kieselalgenkulturen, wie beispielsweise den oben beschriebenen, über eine Zahl von unterschiedlichen Verfahren erhalten werden. Gemäß dem Verfahren mittels mechanischer Kraft können p-GlcNAc-Fasern von Kieselalgenzellkörpern getrennt werden, indem der Inhalt der Kultur einer geeigneten mechanischen Kraft unterworfen wird. Eine solche mechanische Kraft kann eine Scherkraft, die zum Beispiel durch eine Kolloidmühle, ein Ultraschallgerät oder ein Blasengenerator erzeugt wird, oder eine Schneidkraft umfassen, die zum Beispiel durch einen Waring-Mischer erzeugt wird, ist aber nicht darauf beschränkt.
Die sich ergebende Suspension von Kieselalgenzellkörpern und p-GlcNAc-Fasern wird dann isoliert. Zum Beispiel kann die Suspension einer Reihe von Zentrifugationsschritten unterworfen werden, die die p-GlcNAc-Fasern von den Zellkörpern trennen, wodurch sich ein klarer Überstand ergibt, der wenig bis kein sichtbares flockiges Material zeigt. Ein Festwinkelrotor und eine Temperatur von etwa 10°C sind für die Zentrifugationsschritte bevorzugt. Die Drehzahl, Dauer und Gesamtzahl der erforderlichen Zentrifugationsschritte kann zum Beispiel je nach dem verwendeten spezifischen Zentrifugationsrotor variieren, aber die Bestimmung der Werte für solche Parameter ist für den Durchschnittsfachmann offensichtlich.
Die p-GlcNAc-Fasern in dem Überstand können dann mittels Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, konzentriert werden. Solche Verfahren können Ansaug- und Filtrationseinrichtungen aufweisen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Schließlich werden die konzentrierten p-GlcNAc-Fasern zum Beispiel mit destilliertem deionisiertem Wasser, HCl und Ethanol oder anderen geeigneten Lösungsmitteln, vorzugsweise Lösungsmitteln, wie beispielsweise Alkoholen, gewaschen, in denen sich sowohl organische als auch anorganische Materialien lösen. Ein Beispiel, das die Verwendung dieses Verfahrens zur Reinigung von p-GlcNAc zeigt, ist in dem Beispiel im Abschnitt 6 unten angegeben.
Gemäß dem chemischen/biologischen Verfahren werden die p-GlcNAc-Fasern von den Kieselalgenzellkörpern getrennt, indem sie chemischen und/oder biologischen Substanzen ausgesetzt werden. Zum Beispiel können Kieselalgenkulturen mit einer Chemikalie behandelt werden, die in der Lage ist, die Kieselalgenzellwände zu schwächen, was zu einer Freisetzung der p-GlcNAc-Fasern führt, ohne dass deren Struktur geändert wird. Eine solche Chemikalie kann Fluorwasserstoffsäure (HF) umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. Alternativ kann eine reife Kieselalgenkultur mit einer biologischen Substanz behandelt werden, die in der Lage ist, einen biologischen Prozess zu ändern, und dazu verwendet werden kann, die p-GlcNAc-Faser-Synthese zu hemmen und so die bereits vorhandenen Fasern freizugeben. Zum Beispiel kann eine solche Substanz Polyoxin-D, einen Inhibitor des Enzyms N-Acetylglucosaminyl-P-transferase, umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt.
Die Zellkörper und p-GlcNAc enthaltenden Fasern von Kieselalgenkulturen, die mit einem Mitglied der oben beschriebenen chemischen oder biologischen Substanzen behandelt wurden, werden dann isoliert. Zum Beispiel können die Inhalte der behandelten Kieselalgenkulturen sich setzen gelassen werden, so dass der Kulturinhalt zwei ausgeprägte Schichten bildet. Die obere Schicht enthält hauptsächlich die p-GlcNAc-Fasern, während die Bodenschicht die Zellkörper enthält. Die obere, p-GlcNAc-Fasern enthaltende Schicht kann abgeschöpft werden und es verbleibt das abgesetzte Zellmaterial der Bodenschicht. Die abgeschöpfte, p-GlcNAc-Fasern enthaltende Schicht kann dann weiter gereinigt werden, um Protein und anderes nicht erwünschtes Material durch Behandlung mit einem Detergens zu entfernen, das die p-GlcNAc-Fasern nicht schädigt. Ein solches Detergens kann Natriumdodecylsulfat (SDS) umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt.
Wenn die Säurebehandlung, wie beispielsweise die HF-Behandlung, angewendet wird, um p-GlcNAc-Fasern von Kieselalgenzellkörpern zu trennen, kann ein Schritt für die Verteilung der Fasern aufgenommen werden. Ein solcher Schritt kann die Anwendung mechanischer Kraft für die Faserverteilung, wie beispielsweise einen Schritt umfassen, bei dem die Fasern den Bewegungen eines Kreisschüttlers unterworfen werden.
Alternativ kann die mit Säure behandelte Suspension in einem wahlweisen Schritt vor einer weiteren Reinigung mittels Detergensbehandlung neutralisiert werden. Eine solche Neutralisation wird im Allgemeinen den pH-Wert der Suspension von etwa 1,8 auf etwa 7,0 ändern und kann zum Beispiel durch Hinzufügen eines geeigneten Volumens an 1 M Tris (pH 8,0) oder durch Hinzufügen eines geeigneten Volumens an Natriumhydroxid (NaOH) erreicht werden. Die Neutralisation ergibt im Allgemeinen reine p-GlcNAc-Fasern von im Wesentlichen größerer Länge als die anderen hier erörterten Reinigungsverfahren.
Die gereinigten p-GlcNAc-Fasern können dann mit Verfahren konzentriert werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie beispielsweise durch Verwendung einer Absaug- und Filtrationsvorrichtung. Schließlich werden die p-GlcNAc-Fasern in einer Reihe von Schritten mit destilliertem entionisiertem Wasser, HCl und Ethanol oder anderen geeigneten Lösungsmitteln, vorzugsweise Lösungsmitteln, wie beispielsweise Alkoholen, in denen sowohl organische als auch anorganische Materialien gelöst werden, gewaschen. Ein Beispiel, das die erfolgreiche Verwendung eines solchen Reinigungsverfahrens zeigt, ist in dem Beispiel im Abschnitt 7 unten angegeben.
Während jedes dieser Verfahren zur Reinigung von p-GlcNAc aus Mikroalgen, vorzugsweise Kieselalgen, als Ausgangsquelle sehr reines, unverfälschtes, kristallines p-GlcNAc erzeugt, ergibt jedes der Verfahren ein p-GlcNAc mit bestimmten Charakteristika und vorteilhaften Merkmalen. Zum Beispiel erzeugt das über das Verfahren mittels mechanischer Kraft gereinigte p-GlcNAc eine p-GlcNAc-Membran, die ein überlegenes Substrat zur Bindung von Zellen an das p-GlcNAc zur Verfügung stellt. Das chemische/biologische Verfahren erzeugt eine viel hö here durchschnittliche Ausbeute als die mittlere p-GlcNAc-Ausbeute, die mit dem Verfahren mittels mechanischer Kraft erzeugt wird. Darüber hinaus erzeugt die Säurebehandlungs/Neutralisations-Variation des chemischen/biologischen Verfahrens extrem lange p-GlcNAc-Fasern, wobei einige Fasern länger als 100 μm sind und Moleküle des p-GlcNAc-Polymers von sehr hohem Molekulargewicht von 20–30 Million Dalton enthalten.
Der elektronenmikroskopische Aufbau des in den Zusammensetzungen und den Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verwendenden p-GlcNAc, das mittels der Säurebehandlungs/Neutralisations-Variation des chemischen/biologischen Reinigungsverfahrens erzeugt wurde, ist in der 3 gezeigt. Die Reinigung der p-GlcNAc-Fasern führt oft zur Bildung von Fasermembranen, wie in der 3 gezeigt.
5.1.1 Derivatisierung von p-GlcNAc
Das vollständig acetylierte p-GlcNAc der Erfindung kann mittels einer Vielzahl von kontrollierten Zuständen und Verfahren zu einer großen Auswahl von unterschiedlichen Verbindungen derivatisiert werden. Siehe 4 hinsichtlich einer Darstellung, die einige dieser Verbindungen zeigt. Solche derivatisierten Verbindungen können teilweises oder vollständig deacetyliertes p-GlcNAc aufweisen, das über chemische und/oder enzymatische Mittel, wie weiter unten näher beschrieben, modifiziert wurde, ist aber nicht darauf beschränkt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist p-GlcNAc ein zu 100% deacetyliertes p-GlcNAc.
Darüber hinaus kann p-GlcNAc oder sein deacetyliertes Derivat derivatisiert werden, indem es sulfatiert, phosphoryliert und/oder nitriert wird. Weiter können wie nachfolgend ausführlicher beschrieben O-Sulfonyl, N-Acyl, O-Alkyl, N-Alkyl, Deoxyhalogen und N-Alkyliden und N-Aryliden und andere Derivate aus dem p-GlcNAc oder deacetylierten p-GlcNAc der Erfindung hergestellt werden. Das deacetylierte p-GlcNAc der Erfindung kann auch dazu verwendet werden, um eine Vielzahl von organischen Salzen und/oder Metallchelaten herzustellen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können ein oder mehrere Monosaccharideinheiten von p-GlcNAc deacetyliert werden, um eine deacetylierte Poly-β-1-4-N-glucosamin-Art zu bilden. Eine Poly-β-1-4-N-glucosamin-Art, bei der jede der Monosaccharideinheiten der Poly-β-1-4-N-acetylglucosamin-Art deacetyliert wurde, d.h. ein zu 100% deacetyliertes Derivat, hat ein Molekulargewicht von etwa 640.000 Dalton bis etwa 24 Millionen Dalton, wobei etwa 640.000 Dalton bis etwa 2,4 Millionen Dalton bevorzugt sind. Eine Art mit einem solchen Molekulargewichtsbereich stellt eine Art dar, die etwa 4.000 bis etwa 150.000 Glucosaminmonosaccharide kovalent in einer β-1-4-Konfiguration gebunden hat.
Das p-GlcNAc kann durch Behandeln mit einer Basis deacetyliert werden, um Glucosamine mit freien Aminogruppen zu ergeben. Dieses Hydrolyseverfahren kann mit Lösungen von konzentriertem Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid bei erhöhten Temperaturen durchgeführt werden. Siehe z.B. das Beispiel im Abschnitt 8 unten. Alternativ kann ein enzymatisches Verfahren, das ein Chitin-Deacetylase-Enzym benutzt, für die Deacylierung von p-GlcNAc verwendet werden. Ein solches enzymatisches Deacetylaseverfahren ist dem Fachmann bekannt und kann wie im US-Patent 5,219,749 durchgeführt werden.
Weiter können ein oder mehrere Monosaccharideinheiten des p-GlcNAc der Erfindung derivatisiert werden, um mindestens eine Sulfatgruppe zu enthalten, oder können alternativ phosphoryliert oder nitriert werden, wie unten gezeigt:
worin R und/oder R₁ anstelle von Wasserstoff und/oder R₂ anstelle von -COCH₃ eine Sulfat- (-SHO₃), eine Phosphat- (-P(OH)₂) oder eine Nitrat- (-(-NO₂) Gruppe sein kann.
Nachfolgend werden Verfahren beschrieben, durch die solche p-GlcNAc-Derivate hergestellt werden können. Bevor diese Verfahren durchgeführt werden, kann es vorteilhaft sein, zuerst das p-GlcNAc-Ausgangsmaterial zu lyophilisieren, in flüssigem Stickstoff einzufrieren und zu pulverisieren.
Sulfatierte p-GlcNAc-Derivate können zum Beispiel mit einem zweistufigen Verfahren hergestellt werden. In der ersten Stufe kann O-Carboxymethyl-p-GlcNAc aus p-GlcNAc und/oder p-GlcNAc-Derivaten der Erfindung hergestellt werden, indem zum Beispiel Techniken, wie die von Tokura u.a. (Tokura, S. u.a., 1983, Polym. J. 15: 485) beschriebenen verwendet werden. Zweitens kann der Sulfatierungsschritt zum Beispiel mit N,N-Dimethylformamid-schwefeltrioxid gemäß dem Fachmann bekannter Verfahren, wie sie beispielsweise von Schweigen (Schweigen, R. G., 1972, Carbohydrate Res. 21: 219) beschrieben sind, durchgeführt werden. Das sich ergebende Produkt kann als Natriumsalz isoliert werden.
Phosphorylierte p-GlcNAc-Derivate können zum Beispiel durch Anwendung von Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie beispielsweise die von Nishi u.a. (Nishi, N. u.a., 1986 in „Chitin in Nature and Technology, Muzzarelli u.a., Hrsg. Plenum Press, New York, Seite 297–299) beschriebenen. Kurz kann eine p-GlcNAc/Methansulfonsäure-Mischung mit Phosphorpentoxid (in etwa 0,5 bis 4,0 molar Äquivalent) unter Rühren bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 5°C behandelt werden. Die Behandlung kann etwa 2 Stunden dauern. Das sich ergebende Produkt kann dann präzipitiert und mittels Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, gewaschen werden. Zum Beispiel kann die Probe mit einem Lösungsmittel, wie beispielsweise Ether, präzipitiert, zentrifugiert, mit einem Lösungsmittel, wie beispielsweise Ether, Aceton oder Methanol, gewaschen und getrocknet werden.
Nitrierte p-GlcNAc-Derivate können durch Anwendung von Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie beispielsweise die von Schorigin und Halt (Schorigin, R. und Halt, E., 1934, Chem. Ber. 67: 1712) beschriebenen. Kurz können p-GlcNAc und/oder ein p-GlcNAc-Derivat mit konzentrierter Salpetersäure behandelt werden, um ein stabiles nitriertes Produkt zu bilden.
Ein oder mehrere Monosaccharideinheiten des p-GlcNAc der Erfindung können eine Sulfonylgruppe enthalten, wie nachfolgend gezeigt:
worin R₃ ein Alkyl-, ein Aryl-, ein Alkenyl- oder ein Alkinylrest sein kann. Ein solches Derivat kann durch bekannte Verfahren, wie beispielsweise das in Kurita u.a. (Kurita, K. u.a., 1990, Polym. Prep. [Am. Chem. Soc., Div. Polym. Chem.] 31: 624–625) beschriebene Verfahren, erzeugt werden. Kurz kann eine wässrige Alkali-p-GlcNAc-Lösung mit einer Chloroformlösung von Tosylchlorid reagiert werden, und die Reaktion kann dann sanft bei niederen Temperaturen fortschreiten gelassen werden.
Ein oder mehrere Monosaccharide des p-GlcNAc der Erfindung oder sein deacetyliertes Derivat können ein oder mehrere O-Acrylgruppen enthalten, wie nachfolgen gezeigt:
worin R₄ und R₅ anstelle von Wasserstoff ein Alkyl-, ein Alkenyl- oder ein Alkinylrest sein können und R₆ ein Alkyl-, ein Alkenyl- oder ein Alkinylrest sein kann. Ein Beispiel für ein solches Derivat kann durch bekannte Verfahren, wie beispielsweise die von Komai (Komai, T. u.a., 1986 in „Chitin in Nature and Technology", Muzzarelli u.a., Hrsg., Plenum Press, New York, Seite 497–506) beschriebenen, erzeugt werden. Kurz kann p-GlcNAc mit jedem aus einer Anzahl geeigneter Acylchloride in Methansulfonsäure reagiert werden, um p-GlcNAc-Derivate zu ergeben, die Caproyl-, Capryl-, Lanoyl- oder Benzoylderivate umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind.
Ein oder mehrere Monosaccharide des deacetylierten p-GlcNAc der Erfindung können eine N-Acylgrupe enthalten, wie nachfolgend gezeigt:
worin R₇ ein Alkyl-, ein Alkenyl- oder ein Alkinylrest sein kann. Eine solche Derivatisierung kann durch Anwendung von Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie beispielsweise das in Hirano u.a. (Hirano, S. u.a., 1976, Carbohydrate Research 47: 315–320) beschriebene Verfahren. Deacetyliertes p-GlcNAc ist in einer Reihe von wässrigen Lösungen von organischen Säuren löslich. Die Zugabe von ausgewählten Carbonsäureanhydriden zu solchen p-GlcNAc enthaltenden Lösungen in wässriger methanolischer Essigsäure führt zur Bildung von N-Acyl-p-GlcNAc-Derivaten. N-Acyl-p-GlcNAc ist ein bevorzugtes Derivat zur Herstellung von Medikamentenabgabesystemen mit kontrollierter Freisetzung.
Ein oder mehrere Monosaccharide des p-GlcNAc der Erfindung oder seines deacetylierten Derivats können eine O-Alkylgruppe enthalten, wie nachfolgend gezeigt:
worin R₈ ein Alkyl- und Alkenyl- oder ein Alkinylrest sein kann. Eine solche Derivatisierung kann durch Anwendung von Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind; zum Beispiel das von Maresh u.a. (Maresh, G. u.a. in „Chitin and Chitosan", Skjak-Braek, G. u.a., Hrsg., 1989, Elsevier Publishing Co., Seite 389–395) beschriebene Verfahren. Kurz kann deacetyliertes p-GlcNAc in Dimethoxyethan (DME) dispergiert werden und mit einem Überschuss an Propylenoxid reagiert werden. Die Reaktionsdauer kann 24 Stunden betragen, und die Reaktion findet in einem Autoklaven bei 40 bis 90°C statt. Das Gemisch kann dann mit Wasser verdünnt und filtriert werden. Das DME kann durch Destillation entfernt werden. Schließlich kann das Endprodukt über Lyophilisierung isoliert werden. Das O-Alkyl-p-GlcNAc und sein deacetyliertes Derivat ist auch ein bevorzugtes Derivat zur Herstellung von Medikamentenabgabesystemen mit kontrollierter Freisetzung.
Ein oder mehrere Monosaccharideinheiten des p-GlcNAc der Erfindung können ein Alkaliderivat sein, wie nachfolgend gezeigt:
Ein solches Derivat kann unter Anwendung von Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel kann ein Verfahren wie das von Noguchi u.a. (Noguchi, J. u.a., 1969, Kogyo Kagaku Zasshi 72: 796–799) beschriebene verwendet werden. Kurz kann p-GlcNAc im Vakuum in NaOH (vorzugsweise 43%) für einen Zeitraum von ungefähr zwei Stunden bei etwa 0°C eingetaucht werden. Überschüssiges NaOH kann dann zum Beispiel durch Zentrifugation in einer Korbzentrifuge und durch mechanisches Pressen entfernt werden.
Ein oder mehrere Monosaccharideinheiten des deacetylierten Derivats des p-GlcNAc der Erfindung können eine N-Alkylgruppe enthalten, wie nachfolgend gezeigt:
worin R₉ ein Alkyl-, ein Alkenyl- oder ein Alkinylrest sein kann. Eine solche Derivatisierung kann zum Beispiel durch Anwendung eines Verfahrens erhalten werden, wie beispielsweise des von Maresh u.a. (Maresh, G. u.a., in „Chitin and Chitosan", Skjak-Brack, G. u.a., Hrsg. 1989, Elsevier Publishing Co., Seite 389-395) beschriebenen, wie oben ausgeführt, zur Herstellung von N-Alkyl-p-GlcNAc-Derivaten.
Ein oder mehrere Monosaccharideinheiten des deacetylierten Derivats des p-GlcNAc der Erfindung können mindestens ein Desoxyhalogenderivat enthalten, wie nachfolgend gezeigt:
worin R₁₀ F, Cl, Br oder I sein kann, wobei I bevorzugt ist. Ein solches Derivat kann unter Anwendung von Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel kann ein Verfahren verwendet werden, wie das von Kurita u.a. (Kurita, K. u.a., 1990, Polym. Prep. [Am. Chem. Soc. Div. Polym. Chem.] 31: 624–625) beschriebene. Kurz wird ein tosyliertes p-GlcNAc mit einem Natriumhalogenid in Dimethylsulfoxid reagieren gelassen, was zu einem Desoxyhalogenderivat führt. Die p-GlcNAc-Tosylierung kann durchgeführt werden, indem eine wässrige Alkali-p-GlcNAc-Lösung mit einer Chloroformlösung von Tosylchlorid reagiert wird. Eine solche Reaktion kann sanft bei niedrigen Temperaturen voranschreiten.
Ein oder mehrere Monosaccharideinheiten des deacetylierten Derivats des p-GlcNAc der Erfindung können ein Salz bilden, wie nachfolgend gezeigt:
worin R₁₁ ein Alkyl-, ein Alkenyl- oder ein Alkinylrest sein kann. Eine solche Derivatisierung kann unter Anwendung von Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel kann ein Verfahren verwendet werden, wie das von Austin und Sennett (Austin, P. R. und Sennett, S. in „Chitin in Nature and Technology", 1986, Muzzarelli, R. A. A. u.a., Hrsg. Plenum Press, Seite 279–286) beschriebene. Kurz kann deacetyliertes p-GlcNAc in einem organischen Medium, wie beispielsweise Ethylacetat oder Isopropanol, suspendiert werden, dem eine geeignete organische Säure, wie beispielsweise Ameisen-, Essig-, Glycol- oder Milchsäure, zugesetzt werden kann. Das Gemisch kann eine Zeitlang (zum Beispiel 1 bis 3 Stunden) stehen gelassen werden. Die Temperatur der Reaktion und Trocknung kann von etwa 12°C bis etwa 35°C variieren, wobei 20° bis 25°C bevorzugt sind. Die Salze können dann durch Filtration getrennt, mit frischem Medium gewaschen und das restliche Medium verdampft werden.
Ein oder mehrere Monosaccharideinheiten des deacetylierten Derivats des p-GlcNAc der Erfindung können ein Metallchelat bilden, wie nachfolgend gezeigt:
worin R₁₂ ein Metallion sein kann, insbesondere eines der Übergangsmetalle, und X die dative Bindung ist, die durch die Stickstoffelektronen eingerichtet wurde, die in den Amino- und substituierten Aminogruppen, die in dem deacetylierten p-GlcNAc vorhanden sind, vorkommen.
Ein oder mehrere Monosaccharideinheiten des deacetylierten Derivats des p-GlcNAc der Erfindung können ein N-Alkyliden oder eine N-Arylidengruppe enthalten, wie nachfolgend gezeigt:
worin R₁₃ ein Alkyl-, ein Alkenyl-, ein Alkinyl- oder ein Arylrest sein kann. Eine solche Derivatisierung kann unter Anwendung von Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel kann ein Verfahren verwendet werden, wie das von Hirano u.a. (Hirano, S. u.a., 1981, J. Biomed. Mat. Res. 15: 903–911) beschriebene. Kurz kann eine N-Substitutionsreaktion von deacetyliertem p-GlcNAc mit Carbonsäureanhydriden und/oder Arylaldehyden durchgeführt werden, um Acyl- und/oder Arylidenderivate zu ergeben.
Weiter kann das p-GlcNAc oder sein deacetyliertes Derivat kontrollierten Hydrolysebedingungen ausgesetzt werden, die Molekülgruppen mit einem einheitlichen, diskreten Molekulargewicht und anderen physikalischen Charakteristika ergeben. Solche Hydrolysebedingungen können zum Beispiel die Behandlung mit dem Enzym Lysozym umfassen. p-GlcNAc kann dem Lysozym für unterschiedliche Zeitdauern ausgesetzt werden, um das Ausmaß der Hydrolyse zu kontrollieren. Darüber hinaus kann die Hydrolyserate abhängig von dem Umfang kontrolliert werden, in dem das p-GlcNAc, das mit Lysozym behandelt wird, deacetyliert wurde. Die Deacetylierungsbedingungen können wie oben beschrieben sein. Je vollständiger ein p-GlcNAc-Molekül deacetyliert wurde, zwischen etwa 20 und etwa 90 Prozent deacetyliert, desto vollständiger wird das Molekül in einer bestimmten Zeit hydrolysiert. Änderungen der physikalischen Charakteristika zusätzlich zur Reduzierung des Molekulargewichts können durch Hydrolyse und/oder Deacetylierungsbehandlungen ausgelöst werden. Eine ausgedehnte Hydrolyse bewirkt eine Verflüssigung des p-GlcNAc.
Weiter kann eine Wärmedenaturierung so wirken, dass der kristalline Aufbau des p-GlcNAc modifiziert wird. Eine solche Modifikation des kristallinen Aufbaus des p-GlcNAc-Produkts kann zum Beispiel die Reaktivität des p-GlcNAc vorteilhaft beeinflussen.
Darüber hinaus können Hybride, die p-GlcNAc und/oder p-GlcNAc-Derivate umfassen, gebildet werden. Solche Hybride können alle aus einer Anzahl von natürlichen und/oder synthetischen Materialien zusätzlich zu dem p-GcNAc und/oder den p-GlcNAc-Derivaten enthalten. Zum Beispiel können Hybride aus p-GlcNAc und/oder p-GlcNAc-Derivaten plus einer oder mehreren extrazellulären Matrix (ECM)-Komponenten gebildet werden. Solche ECM-Komponenten können Kollagen, Fibronektin, Glycosaminoglykane und/oder Peptidoglycane umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Hybride können auch aus p-GlcNAc und/oder p-GlcNAc-Derivaten plus einem oder mehreren synthetischen Materialien, wie beispielsweise Polyethylen, gebildet werden. Ein solches p-GlcNAc/Polyethylen- oder p-GlcNAc-Derivat/Polyethylen-Hybrid kann durch thermisches Verbinden der Hybridkomponenten zum Beispiel mittels Autoklavieren hergestellt werden.
Bevorzugte p-GlcNAc-Derivate zur Verwendung in der beanspruchten Erfindung sind deacetylierte p-GlcNAc-Salzderivate, wie beispielsweise ein p-GlcNAc-Lactat-Derivat, insbesondere ein p-GlcNAc-Lactatgelderivat. Wie hier verwendet bedeutet der Begriff „p-GlcNAc-Lactat", dass der Milchsäurerest funktionell an einem teilweise oder vollständig deacetylierten p-GlcNAc angelagert ist. Solche p-GlcNAc-Lactat-Derivate können wie oben beschrieben erhalten werden (z.B. durch Derivatisierung mit Milchsäure) und als Gel mittels Propylenglycol und Wasser formuliert werden, wie in dem Beispiel im Abschnitt 10 unten beschrieben. p-GlcNAc-Lactat-Derivate können mit hohen und niedrigen Viskositäten erzeugt werden, wodurch es ermöglicht wird, dass das p-GlcNAc an die spezifische interessante Indikation angepasst wird. Zum Beispiel kann es nützlich sein, ein p-GlcNAc mit einer niedrigeren Viskosität zur Abgabe durch eine Spritze oder über ein Spray zu verwenden.
Wie ausführlicher im Abschnitt 5.3 unten beschrieben, können das p-GlcNAc und/oder seine Derivate, wie oben beschrieben, weiter durch die kovalente oder nicht kovalente Anlagerung an oder Kombination mit Molekülen oder Medikamenten von Interesse, wie beispielsweise Endothelin-Antagonisten, derivatisiert werden.
5.1.2. Umformulierungen von p-GlcNAc
Das p-GlcNAc, seine deacetylierten Derivate und/oder deren Derivatisierungen, wie beispielsweise die oben beschriebenen, die in den Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden sollen, können gelöst und anschließend zu einer Auswahl von Formen und Konfigurationen umformuliert werden.
Ein Lösen des p-GlcNAc kann durch Behandeln mit Dimethylacetamid (DMA)/Lithiumchlorid erreicht werden. Das p-GlcNAc kann ohne weiteres durch Rühren in einer DMA-Lösung, enthaltend 5% LiCl (bezogen auf des Gewicht des DMA) gelöst werden. Wasserlösliche p-GlcNAc-Derivate, wie beispielsweise p-GlcNAc-Salze, z.B. Lactat oder Carboxymethylderivate können in Wasser gelöst werden. p-GlcNAc, das zu mindestens etwa 75% deacetyliert wurde, kann zum Beispiel in einer milden sauren Lösung, wie beispielsweise 1%ige Essigsäure, gelöst werden. p-GlcNAc-Derivate, die in Wasser unlöslich sind, können in organischen Lösungsmitteln gelöst werden.
Die Derivatisierung von p-GlcNAc in DMA:LiCl mit Phenylisocyanaten kann dazu verwendet werden, Carbanilate zu erzeugen. Weiter kann die Derivatisierung von p-GlcNAc in DMA-LiCl mit Toluol-p-sulphonylchlorid dazu verwendet werden, Toluol-p-sulfonat zu erzeugen.
Das p-GlcNAc, seine deacetylierten Derivate und/oder deren gelöste Derivatisierungen können dann präzipitiert und zu Formen umformuliert werden, die Matten, Stränge, Mikrokügelchen, Mikroperlen, Membranen, Fasern, Pulver, Schwämme und Gels umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Weiter können ultradünne (d.h. weniger als 1 μm dicke) einheitliche Membranen formuliert werden. Außerdem können pharmazeutische Formulierungen, wie beispielsweise Pillen, Tabletten und Kapseln, hergestellt werden.
Solche Umformulierungen können zum Beispiel unter Ausnutzung der Tatsache erreicht werden, dass reines p-GlcNAc in Lösungen, wie beispielsweise Wasser und Alkohol, vorzugsweise Ethanol, unlöslich ist. Eine Einführung durch herkömmliche Mittel, wie beispielsweise durch Injektion des p-GlcNAc enthaltenden DMA/LiCl-Gemischs in eine solche Wasser- oder Alkohol-, vorzugsweise Ethanol-, Lösung bringt eine erneute Präzipitation zustande, und daher eine Umformulierung des gelösten p-GlcNAc. Die Umformulierung einer p-GlcNAc-Membran zu einem Fasermaterial wird in dem Beispiel im Abschnitt 9 unten gezeigt. Im Fall von wasserlöslichen p-GlcNAc-Derivaten können Umformulierungen durch erneute Präzipitation in solchen organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Ethylacetat oder Isopropanol, erreicht werden. Umformulierungen von p-GlcNAc, das zu mindestens etwa 75% deacetyliert wurde, können durch erneute Präzipitation in einer alkalischen Lösung erreicht werden. In Wasser unlösliche p-GlcNAc-Derivate können durch erneute Präzipitation in wässrigen Lösungen, wie beispielsweise Wasser, umformuliert werden.
p-GlcNAc-Membranen und dreidimensionale p-GlcNAc-Matrizen können mittels Verfahren hergestellt werden, die die Bildung von kontrollierten mittleren Porengrößen entweder in den Membranen oder den Matrizen vorsehen. Die Porengröße kann in den Membranen und Matrizen durch Variieren der Menge an verwendetem p-GlcNAc-Material und durch Zusetzen von bestimmten Lösungsmitteln, wie beispielsweise Methanol oder Ethanol, wobei Ethanol bevorzugt ist, in bestimmten Mengen, die im Bereich von etwa 5% bis etwa 40% liegen, vor der Bildung von Membranen und/oder Matrizen kontrolliert werden. Im Allgemeinen ist, je größer der prozentuale Anteil des Lösungsmittels ist, die durchschnittliche gebildete Porengröße desto kleiner.
Gemäß einer bevorzugten Umformulierung der Erfindung, wird ein p-GlcNAc-Lactat-Derivat zu einem Gel derivatisiert, wie ausführlich in dem Beispiel im Abschnitt 10 unten beschrieben.
5.2 Die Endothelinantagonisten der Zusammensetzungen der Erfindung
Die in den Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung zu verwendenden Endothelinantagonisten umfassen auf Peptid beruhende Endothelinantagonisten, nicht auf Peptid beruhende Endothelinantagonisten, ETA-spezifische, ETB-spezifische oder nicht spezifische Endothelinantagonisten, sind aber nicht darauf beschränkt. Beispiele für auf Peptid beruhende Endothelin-Rezeptor-Antagonisten, die in den Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung nützlich sind, umfassen BQ-123 (Cyclo(-D-Trp-D-Asp-L-Pro-D-Val-L-Leu-), BQ-153, BQ238, BQ-485, BQ-610, BQ-788, BQ-928, TAK-044, FR139317 (Perhydroazepin-1-ylcarbonyl-L-leucyl-(1-methyl)-D-tryptophyl-[3-(2-pyridyl)]-D-alanin), RES- 701-1 (Novabiochem), PD 142893 (Acetyl-(3,3-diphenyl-D-alanin)-L-Leu-L-Asp-L-Ile-L-Ile-L-Trp), PD 145065, CP 170687, Ac-DBhg16-Leu-Asp-Ile, IRL-1038 ([Cys11–Cys15]-Endothelin-1 (11–21)), das GRGDS-Pentapeptid und ET-1[Dprl-Asp15]. Viele dieser Peptide sind im Handel erhältlich, z.B. von American Peptide Company, Sunnyvale CA oder Calbiochem-Novabiochem Company, San Diego CA.
Beispiele für nicht auf Peptid beruhende Endothelin-Rezeptor-Antagonisten zur Verwendung in den Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung umfassen Ro 61-0612, Ro 61-1790, Ro 42-2005, Ro 46-2005, Ro 46-8443, Ro 47-0203 (auf dem Fachgebiet auch als Bosentan bekannt), PD 155080, PD 156707, SB 209670, SB 217242, L-744,453, L-749,329, L-754,142, CGS 27830, BMS 182874, LU 135252, S-1039, mA386, A-127722, TBC11251, Nz-arg-3-(isoxazdylsulfameyl)-2-thiophencarboxamid und EQ 123. Siehe z.B. Webb u.a. oben und Ohlstein u.a., oben bezüglich der Strukturen von vielen dieser bekannten Endothelinantagonisten.
Nicht auf Peptid beruhende Endothelinantagonisten können gemäß dieser Erfindung bevorzugt sein, weil sie günstigere pharmakokinetische Eigenschaften als auf Peptid beruhende Antagonisten, z.B. eine verbesserte metabolische Stabilität und eine bessere Bioverfügbarkeit und orale Wirksamkeit, haben. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der verwendete Endothelinantagonist Ro61, wie oben in der 1 gezeigt.
5.3 Bevorzugte Formulierungen der Zusammensetzungen der Erfindung
Gemäß der Erfindung wird ein wie oben beschriebener Endothelinantagonist („EA") kovalent oder nicht kovalent funktionell an oder kombiniert mit dem p-GlcNAc oder einem oder mehreren Derivaten oder Umformulierungen davon gebunden, wie oben beschrieben. Gemäß einer Ausführungsform ist mindestens eine Art von Endothelinantagonist kovalent, nicht kovalent oder anderweitig mit einem deacetylierten p-GlcNAc kombiniert oder gemischt. Andere Antitumormittel, die zusammen mit den EA/p-GlcNAc-Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden können, sind unten beschrieben.
Der Endothelinantagonist oder ein anderes Antitumormittel kann kovalent an die offenen primären Amine des deacetylierten p-GlcNAc zum Beispiel durch chemische Anlagerung unter Verwendung von bifunktionellen Vernetzungsreagenzien gebunden werden, die als chemische Abstandshalter bestimmter Länge fungieren. Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt und können zum Beispiel den Verfahren von Davis und Preston (Davis, M. und Preston, J. F. 1981, Anal. Biochem. 116: 404–407) und Staros u.a. (Staros, J. V. u.a., 1986, Anal. Biochem. 156: 220–222) ähnlich sein. Zum Beispiel können im Fall der auf Peptid beruhenden Verbindungen Carbonsäurereste auf dem an das deacetylierte oder teilweise deacetylierte p-GlcNAc anzulagernde Peptid aktiviert und dann mit dem p-GlcNAc vernetzt werden. Die Aktivierung kann zum Beispiel durch Zugabe einer Lösung, wie beispielsweise Carbodiimid EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid) zu einer Peptidlösung in einem Phosphatpuffer erreicht werden. Vorzugsweise enthält diese Lösung zusätzlich ein Reagens, wie beispielsweise Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid), um die Kopplung zu verstärken. Das aktivierte Peptid kann mit dem deacetylierten p-GlcNAc durch Mischen in einem Puffer mit hohem pH-Wert, wie beispielsweise einem Carbonatpuffer (pH 9,0–9,2), vernetzt werden.
Die biologische Wirksamkeit des gebundenen Moleküls kann durch Variieren der Länge des Linker-Moleküls (z.B. bifunktionelle Venetzungsverbindung), das dazu verwendet wird, das Molekül an das p-GlcNAc zu binden, erhalten werden. Eine geeignete Linkerlänge für ein bestimmtes anzulagerndes Molekül, das die biologische Aktivität des angelagerten Moleküls nicht ändert, kann routinemäßig ermittelt werden. Zum Beispiel kann die biologische Aktivität (z.B. ein therapeutisch wirksames Niveau an biologischer Aktivität) eines Moleküls, das über einen Linker mit bestimmter Länge angelagert wurde, mittels bekannter Assays, die für das bestimmte, anzulagernde Molekül spezifisch sind, getestet werden. Außerdem kann es, um die biologische Aktivität des anzulagernden Moleküls aufrechtzuerhalten, notwendig sein, einen Linker zu verwenden, der mittels eines geeigneten natürlich auftretenden Enzyms abgespalten werden kann, um das angelagerte Molekül freizusetzen.
Assays, die vom Fachmann üblicherweise angewendet werden, können dazu verwendet werden, die Retention der biologischen Aktivität des bestimmten, anlagernden Moleküls zu testen, um sicherzustellen, dass ein annehmbares Aktivitätsniveau (z.B. eine therapeutisch wirksame vernünftige Aktivität) beibehalten wird.
Alternativ können die auf Peptid beruhenden oder nicht auf Peptid beruhenden Endothelinantagonisten, allein oder in Kombination mit anderen Antitumormitteln, mit dem p-GlcNAc und/oder seinen Derivaten gemischt oder nicht kovalent daran angelagert werden, um die Zusammensetzungen der Erfindung zu bilden, und zwar mittels Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel können ein Molekül oder Moleküle nach Wahl, z.B. ein Endothelinantagonist, mit Suspensionen von p-GlcNAc, mit einer deacetylierten oder teilweise deacetylierten p-GlcNAc-Lösung, mit einer deacetylierten oder teilweise deacetylierten p-GlcNAc-Salzlösung, z.B. mit einer p-GlcNAc-Lactatlösung (teilweise oder vollständig deacetyliert), oder mit einer p-GlcNAc-Derivatlösung gemischt werden. Die Gemische können wahlweise lyophilisiert werden. Moleküle werden nach einer Lyophilisierung in nicht kovalenter Weise an die p-GlcNAc-Matrizen vermutlich über hydrophobe, elektrostatische und andere, nicht kovalente Wechselwirkungen gebunden. Solche p-GlcNAc-Formulierungen sind sehr leicht herzustellen. Weiter können solche Formulierungen wirksam mit einer großen Auswahl von Molekülen erreicht werden, die ein breites Spektrum an physikalischen Charakteristika und Wasserlöslichkeitseigenschaften haben, die vom hydrophobsten bis zum hydrophilsten reichen. Nach der Anlagerung des Moleküls oder der Moleküle können Assays, die üblicherweise vom Fachmann angewendet werden, um die Aktivität des/der bestimmten, nicht kovalent gebundenen Moleküls/Moleküle zu testen, dazu verwendet werden, um sicherzustellen, dass ein annehmbares Aktivitätsniveau (z.B. eine therapeutisch wirksame Aktivität) mit dem angelagerten Molekül erreicht wird.
Darüber hinaus können Endothelinantagonisten allein oder in Kombination mit anderen Antitumormitteln in dem p-GlcNAc mittels auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren eingekapselt werden. Zum Beispiel kann ein Verfahren zum Erzielen der Verkapselung das von Hwang u.a. behandelte Verfahren umfassen (Hwang, C. u.a. in Muzzarelli, R. u.a., Hrsg., 1985, „Chitin in Nature and Technology", Plenum Press, Seite 389–396). Eine Verkapselung kann zum Beispiel auch dadurch erreicht werden, dass einer Modifikation der Säurebehandlungs/Neutralisations-Variation des chemischen/biologischen, oben dargestellten Reinigungsverfahrens gefolgt wird. Anstatt den pH-Wert der p-GlcNAc-Lösung auf einen ungefähr neutralen pH-Bereich zu erhöhen (d.h. ungefähr 7,4), kann man eine basische pH-Umgebung erzeugen, indem der pH-Wert auf ungefähr 9,0 nach der Vervollständigung der Reinigung des p-GlcNAc angehoben wird. Bei einem basischeren pH-Wert nimmt der Aufbau des p-GlcNAc oder eines Derivats davon eine dreidimensionalere oder „offenere" Konfiguration an. Wenn der pH-Wert gesenkt wird, kehrt die Konfiguration des Moleküls zu einer kompakteren, „geschlosseneren" Konfiguration zurück. Daher kann eine Verbindung oder ein Medikament von Interesse, wie beispielsweise ein Endothelinantagonist, zu einer p-GlcNAc-Lösung mit hohem pH-Wert zugegeben werden, dann der pH-Wert der p-GlcNAc-/Medikamentensuspension erniedrigt werden, wodurch das Medikament von Interesse in der p-GlcNAc-Matrix „gefangen" oder eingekapselt wird. Nach der Verkapselung des Moleküls können Assays, die üblicherweise vom Fachmann verwendet werden, dazu dienen, die Aktivität des/der bestimmten eingekapselten Moleküls/Moleküle zu testen, wodurch sichergestellt wird, dass ein annehmbares Niveau an biologischer Aktivität (z.B. eine therapeutisch wirksame Aktivität) durch das verkapselte Molekül beibehalten wird.
Ein Beispiel für die Herstellung einer EA/p-GlcNAc-Zusammensetzung der Erfindung wird in dem Beispiel im Abschnitt 10 unten angegeben, wobei ein Endothelinantagonist mit einem p-GlcNAc-Lactatgel gemischt wird. Alternativ kann eine EA-Zusammensetzung (ohne begleitendes p-GlcNAc) z.B. durch Lösen des Endothelinantagonisten in PBS, HBSS oder wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben und Anpassen der Lösung an die gewünschte Konzentration hergestellt werden.
Die Zusammensetzungen der Erfindung, einschließlich EA/p-GlcNAc-Zusammensetzungen, können zur Verabreichung als pharmazeutische Zusammensetzungen z.B. durch Inhalation oder Insufflation (entweder durch den Mund oder die Nase) oder orale, bukkale, parenterale oder rektale Verabreichung for muliert werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die EA/p-GlcNAc-Zusammensetzung der Erfindung durch Injektion in Form eines Gels wie in dem Beispiel im Abschnitt 10 unten beschrieben verabreicht. In der Ausführungsform der Erfindung, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung die Verabreichung eines Endothelinantagonisten, z.B. eines Nicht-Peptidyl-Endothelinantagonisten, wie beispielsweise ein Pyrimidylsulfonamid, für die Behandlung einer proliferativen Erkrankung, z.B. Krebs, umfasst, kann die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge an Endothelinantagonist in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen.
Für die orale Verabreichung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen zum Beispiel die Form von Tabletten oder Kapseln haben, die durch herkömmliche Mittel mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen oder Trägern, wie beispielsweise Bindemitteln (z.B. vorgelatinierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllstoffen (z.B. Lactose, mikrokristalline Cellulose oder Calciumhydrogenphosphat); Schmiermitteln (z.B. Magnesiumstearat, Talkum oder Siliziumdioxid); Abbaumitteln (z.B. Kartoffelstärke oder Natriumstärkeglycolat); oder Netzmitteln (z.B. Natriumlaurylsulfat) hergestellt werden. Das p-GlcNAc kann anstelle von oder zusätzlich zu den Hilfsstoffen, Trägern und Füllstoffen verwendet werden. Tabletten können mit p-GlcNAc unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, beschichtet werden.
Flüssige Präparate zur oralen Verabreichung können zum Beispiel die Form von Lösungen, Sirupen oder Suspensionen haben, oder sie können als Trockenprodukt zum Aufbau mit Wasser oder anderen geeigneten Vehikeln vor der Verwendung dargeboten werden. Solche flüssigen Präparate können mit herkömmlichen Mitteln mit pharmazeutisch annehmbaren Zusätzen, wie beispielsweise Suspendiermitteln (z.B. Sorbitsirup, Cellulosederivate oder hydrierte essbare Fette); Emulgatoren (z.B. Lecithin oder Akazie), nicht wässrigen Vehikeln (z.B. Mandelöl, öligen Estern, Ethylalkohol oder fraktionierten pflanzlichen Ölen); und Konservierungsstoffen (z.B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure) hergestellt werden. Die Präparate können auch, soweit erforderlich, Puffersalze, Geschmacks-, Farb- und Süßmittel enthalten.
5.4. Verwendungen der Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
Biomedizinische Verwendungen der Zusammensetzungen der Erfindung umfassen ihre Verwendung von Medikamentenabgabesysteme für Endothelinantagonisten sowie andere therapeutische Mittel, wie beispielsweise andere Antitumormittel. Die p-GlcNAc enthaltenden Formulierungen der Erfindung sehen zusätzliche Vorteile im Vergleich zu bekannten Medikamentenformulierungen vor, einschließlich beispielsweise eine erhöhte Wirksamkeit, reduzierte Toxizität und verbesserte Bioverfügbarkeit. In der Tat gibt es zahlreiche Vorteile bei der Verwendung der auf p-GlcNAc basierenden Medikamentenabgabesysteme der Erfindung. Zum Beispiel wird die traditionelle Medikamentenverabreichung durch Injektion gewöhnlich mit Proteinen und vielen anderen Medikamenten verwendet. Allerdings führen wiederholte Dosen zu oszillierenden Blutmedikamentkonzentrationen und beeinflussen die Bequemlichkeit und die Compliance des Patienten. Die orale Verabreichung kann vorteilhaft sein, da sie eine vielfältigere Charge des freizusetzenden Medikaments ermöglicht und weniger unangenehm für den Patienten ist. Allerdings werden Proteine und andere Verbindungen denaturiert und im Magen abgebaut.
Eine verbesserte orale Verabreichung wird allerdings durch die p-GlcNAc enthaltenden Zusammensetzungen der Erfindung erreicht, indem eine schützende Umgebung für die einmal verabreichte Arznei zur Verfügung gestellt wird. Zum Beispiel schützt das p-GlcNAc einen auf einem Peptid beruhenden Endothelinantagonisten vor der sauren und enzymatischen Umgebung im Magen. Das p-GlcNAc-System setzt die Verbindung über Diffusion und/oder Verkapselungsabbau frei, sobald es den Darmbereich erreicht, wo sie wirksam in den Blutstrom aufgenommen wird. Diese p-GlcNAc-Systeme der Erfindung können zum Beispiel verwendet werden, um Proteine sowie viele andere Verbindungen abzugeben. Liposome, die mit p-GlcNAc-Derivaten oder p-GlcNAc-Derivat-Alginat-Verkapselungen überzogen sind, sind für solche oralen Abgabeverfahren bevorzugt.
Darüber hinaus wird bei Einführung der Zusammensetzungen der Erfindung in einen Patienten das p-GlcNAc im Lauf der Zeit biologisch abgebaut, so dass die angelagerten oder eingeschlossenen Verbindungen allmählich in den Blutstrom des Patienten freigesetzt werden und so ein Verfahren zur kontrollierten Medikamentenabgabe mit langsamer Freisetzung zur Verfügung gestellt wird.
Die deacetylierte oder teilweise deacetylierte p-GlcNAc-Art kann mit einer vorhersagbaren Rate an Bioabbaubarkeit hergestellt werden. Zum Beispiel beeinflusst der prozentuale Anteil an Deacetylierung die Rate, bei der die p-GlcNAc-Art abgebaut wird. Im Allgemeinen ist, je höher der prozentuale Anteil an Deacetylierung ist, die Rate an Bioabbaubarkeit und Resorption desto schneller. Daher können der Grad an p-GlcNAc-Bioabbaubarkeit und die In-vivo-Resorptionsrate während der p-GlcNAc Herstellung kontrolliert werden.
Die p-GlcNAc-Materialien mit solchen kontrollierbaren Bioabbaubarkeitsraten können zu Membranen, Gels, Schwämmen, Mikrokügelchen, Fasern und dergleichen formuliert werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann ein 100%ig deacetyliertes oder teilweise deacetyliertes p-GlcNAc mit einer vorhersagbaren Rate an Bioabbaubarkeit verwendet werden.
Die p-GlcNAc/Medikamentenzusammensetzungen der Erfindung können einem Patienten über eine Auswahl von Wegen unter Verwendung von Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, abgegeben werden. Zum Beispiel kann eine solche Abgabe eine ortsspezifische, orale, nasale, intravenöse, subkutane, intradermale, transdermale, intramuskuläre oder intraperitoneale Verabreichung sein. Im Hinblick auf die ortsspezifische Abgabe können Verabreichungsverfahren die Injektion, Implantation, Arthroskopie, Laparoskopie oder ähnliche Mittel umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. p-GlcNAc-Membranen und/oder -Gels sowie Mikrokügelchen und Schwämme werden für solche ortsspezifischen Abgabeverfahren bevorzugt.
Wie oben angeführt kann das p-GlcNAc der Zusammensetzungen der Erfindung zu Membranen, Gels, Schwämmen, Mikrokügelchen, Fasern und dergleichen formuliert werden. Diese p-GlcNAc-Produkte haften und formen sich an Geweben, sowohl weichen als auch harten Geweben, im menschlichen Körper an, ohne dass die Notwendigkeit des Nähens besteht. Die p-GlcNAc-Materialien kön nen zum Beispiel während einer allgemeinen oder minimalinvasiven Operation, wie beispielsweise einer Laparoskopie, angewendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt das p-GlcNAc in Form eines Gels vor, in dem das Endothelinantagonist und/oder ein andere Antitumormittel gelöst oder anderswie eingelagert wird. Die Gels und Membranen auf p-GlcNAc-Grundlage haben eine Auswahl von Anwendungen als therapeutische Medikamentenabgabesysteme, zum Beispiel um eine ortsspezifische Abgabe mit langsamer Freisetzung direkt an einen Tumor oder einen Bereich vorzusehen, der nach einer Operation von einem Tumor befreit wurde. Eine solche immobilisierte Zusammensetzung mit langsamer Freisetzung kann als wichtiges defensives Anfangsverfahren nach der Operation wirken. Darüber hinaus kann ein solches Antitumor-Medikamenten-Abgabesystem besonders nützlich bei der Behandlung von Tumoren sein, die völlig oder teilweise unzugänglich für eine Operation sind, wie beispielsweise bestimmte Hirntumoren.
Die EA/p-GlcNAc-Zusammensetzungen der Erfindung sind daher als therapeutische Medikamentenabgabesysteme für die Behandlung von Krebs und anderen proliferativen Erkrankungen nützlich. Diese Zusammensetzungen können zusätzlich andere Antitumormittel aufweisen, die an das p-GlcNAc der Erfindung angelagert oder darin eingekapselt werden können, um eine synergistische Wirkung zu ermöglichen. Solche Antitumormittel sind dem Fachmann bekannt und umfassen die folgenden Kategorien und speziellen Verbindungen, sind aber nicht darauf beschränkt: Alkylierungsmittel, Antimetaboliten, Antitumor-Antibiotika, Vinka-Alkaloid- und Epidophyllotoxine, Nitrosoharnstoffe, Enzyme, Kunststoffe, hormonelle therapeutische biologische Präparate und Medikamente im Versuchsstadium.
Solche Alkylierungsmittel können Stickstofflost, Chlorambucil, Cyclophosphamid, Ifosfamid, Melphalan, Thiptepa und Busulfan umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Antimetabolite können Methotrexat, 5-Fluorouracil, Cytosinarabinosid (ara-C), 5-Azacytidin, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin und Fludarabinphosphat umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Antitumor-Antibiotika können Doxorubicin, Daunorubicin, Dactinomyin, Bleomycin, Mitomycin C, Plicamycin, Idarubicin und Mitoxantron umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Vikaalkaloide und Epipodophyllotoxine können Vincristin, Vinblastin, Vindesin, Etoposid und Teniposid umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Nitrosoharnstoffe umfassen Carmustin, Lomustin, Semustin und Streptozocin. Enzyme können L-Asparagin umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Kunststoffe können Dacrabazin, Hexamethylmelamin, Hydroxyharnstoff, Mitotanprocabazin, Cisplatin und Carboplatin umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Hormonale Therapeutika können Corticosteroide (Cortisonacetat, Hydrocortison, Prednison, Prednisolon, Methylprednisolon und Dexamethason), Östrogene (Diethylstibesterol, Estradiol, veresterte Östrogene, konjugiertes Östrogen, Chlortiasnen), Progestine (Medroxyprogesteronacetat, Hydroxyprogesteroncaproat, Megestrolacetat), Antiöstrogene (Tamoxifen), Aromastasehemmer (Aminoglutethimid), Androgene (Testosteronpropionat, Methyltestosteron, Fluoxymesteron, Testolacton), Antiandrogene (Flutamid), LHRH-Analoge (Leuprolidacetat) und Endokrine für Prostatakrebs (Ketoconazol) umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Biologische Präparate können Interferone, Interleukine, Tumornekrosefaktor und biologische Reaktionsmodifikatoren umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Medikamente im Versuchsstadium können Alkylierungsmittel, wie beispielsweise Nimustin AZQ, BZQ, Cyclodison, DADAG, CB10-227, CY233, DABIS-Maleat, EDMN, Fotemustin, Hepsulfam, Hexamethylmelamin, Mafosamid, MDMS, PCNU, Spiromustin, TA-077, TCNU und Temozolomid; Antimetabolite, wie beispielsweise Acivicin, Azacytidin, 5-aza-Desoxycytidin, A-TDA, Benzylidenglucose, Carbetimer, CB3717, Deazaguaninmesylat, DODOX, Doxifluridin, DUP-785, 10-EDAM, Fazarabin, Fludarabin, MZPES, MMPR, PALA, PLAC, TCAR, TMQ, TNC-P und Piritrexim; Antitumorantikörper, wie beispielsweise AMPAS, BWA770U, BWA773U, BWA502U, Amonafid, m-AMSA, CI-921, Datelliptium, Mitonafid, Piro xantron, Aclarubicin, Cytorhodin, Epirubicin, Esorubicin, Idarubicin, Iododoxorubicin, Marcellomycin, Menaril, Morpholinoanthracycline, Pirarubicin und SM-5887; Mikrotubulus-Spindel-Hemmer, wie beispielsweise Amphethinil, Navelbin, und Taxol; die Alkyllysophospholipide, wie beispielsweise BM41-440, ET-18-OCH₃ und Hexacyclophosphocholin; Metallverbindungen, wie beispielsweise Galliumnitrat, CL286558, CL287110, Cycloplatam, DWA2114R, NK121, Iproplatin, Oxali latin, Spiroplatin, Spirogermanium und Titanverbindungen; und neue Verbindungen, wie beispielsweise Aphidoicolinglycinat, Ambazon, BSO, Caracemid, DSG, Didemnin, B, DMFO, Elsamicin, Espertatrucin, Flavonessigsäure, HMBA, HHT, ICRF-187, Ioddesoxyuridin, Ipomeanol, Liblomycin, Lonidamin, LY186641, MAP, MTQ, Merabaron SK&F104864, Suramin, Tallysomycin, Teniposid, THU und WR2721; und Toremifen, Trilosan und Zindoxifen, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Antitumormittel, die Strahlungsverstärker sind, werden in den Fällen bevorzugt, in denen eine Strahlungstherapiebehandlung verordnet werden soll, und zwar entweder anstelle von oder anschließend an eine Operation. Beispiele für solche Medikamente umfassen zum Beispiel die Chemotherapeutika 5'-Fluoruracil, Mitomycin, Cisplatin und die Derivate davon, Taxol, Doxorubicin, Actinomycin, Bleomycine, Daunomycine und Methamycine.
Zusätzliche synergistische Wirkungen können mittels der EA/GlcNAc-Zusammensetzungen der Erfindung in Kombination mit zwei oder mehreren anderen Antitumormitteln, wie beispielsweise Thioguanin kombiniert mit Cytosinarabinosid (ara-C) für die verbesserte Behandlung von akuter nicht lymphocytischer Leukämie, Tamoxifen mit Cisplatin bei Brustkrebs und Prostaglandine mit Cisplatin bei Brust- und Prostatakrebs erhalten werden. Viele andere synergistische Kombinationen von Antikrebsmitteln, die dem Fachmann bekannt sind, können mit dem EA/p-GlcNAc- und EA/p-GlcNAc-Derivatformulierungen der Erfindung verwendet werden.
Darüber hinaus ist die Verwendung der p-GlcNAc enthaltenden Zusammensetzungen der Erfindung wünschenswert, vorausgesetzt, dass das p-GlcNAc-Polymer chemische Eigenschaften und Charakteristika hat, die die Formulierung und Abgabe von einigen Medikamenten möglich macht, die bisher schwierig zu formulieren und abzugeben waren. Zum Beispiel ist Taxol, ein Mikrotubulus-Spindel-Hemmer, zur Behandlung von Brustkrebs hydrophob und erfordert die Zugabe von polyoxyethyliertem Rizinusöl, um es als Flüssiginfusion für die intravenöse Abgabe zu lösen. Die hydrophobe Natur von Taxol macht es zu einer idealen Verbindung zur Formulierung mit p-GlcNAc-Polymermaterialien für die topische kontrollierte Freisetzungsabgabe. Das US-Patent 5,635,493, Abschnitt 23, stellt eine solche p-GlcNAc/Taxol-Formulierung dar. Zusätzliche Ziele für p-GlcNAc-Antitumorsysteme umfassen Haut-, Gastrointestinaltrakt-, Pankreas-, Lungen-, Brust-, Harntrakt- und Uterustumoren und mit HIV verwandte Kaposi-Sarkomen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Weil die p-GlcNAc-Materialien der Erfindung selbst immunneutral sind, insofern als sie keine Immunreaktion beim Menschen auslösen, können solche p-GlcNAc-Einheiten, die wie oben beschrieben p-GlcNAc-Membranen, poröse 3D-Matrizen und/oder Gele umfassen, die immobilisierte Medikamente aufnehmen, solche Medikamente auf eine Weise abgeben, dass es keine Immunreaktion gibt. Bestimmte zusätzliche Materialien, wie beispielsweise natürliche Alginate und synthetische Polymere, können in einigen Fällen dazu verwendet werden, solche Einheiten in Kombination mit dem p-GlcNAc-Material zu konstruieren. Zum Beispiel kann ein polymeres Abgabesystem mit verzögerter Medikamentenfreisetzung auf eine Weise hergestellt werden, die ähnlich der von A. Polk (Polk, A. u.a., 1994, J. of Pharmaceutical Sciences, 83(2): 178–185) vorgeschlagenen ist. Bei einem solchen Verfahren wird deacetyliertes p-GlcNAc mit Natriumalginat in Gegenwart von Calciumchlorid reagiert, um Mikrokapseln zu bilden, die das abzugebende Medikament enthält, und unter geeigneten Bedingungen und einen bestimmten Zeitraum freigesetzt.
Die therapeutisch wirksamen Dosen von jedem der oben beschriebenen Medikamente oder Wirkstoffe können zusammen mit den hier beschriebenen, auf p-GlcNAc basierenden Systemen routinemäßig mittels Verfahren bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Eine „therapeutisch wirksame" Dosis betrifft die Menge an Verbindung, die ausreicht, um zu einer Besserung der Symptome der hier beschriebenen Verfahren und/oder Krankheiten zu kommen.
Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit der Arzneien kann durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, z.B. durch Bestimmen der LD₅₀ (der Dosis, die für 50% der Population letal ist) und der ED₅₀ (der Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist). Das Dosisverhältnis zwischen toxischer und therapeutischer Wirkung ist der therapeutische Index, der als das Verhältnis LD₅₀/ED₅₀ ausgedrückt werden kann. Verbindungen, die einen großen therapeutischen Index haben, sind bevorzugt. Während Verbindungen, die toxische Nebenwirkungen zeigen, verwendet werden können, ist darauf zu achten, dass ein Abgabesystem entworfen wird, das diese Verbindungen auf die Stelle des betroffenen Gewebes richtet, um einen potentiellen Schaden der nicht infizierten Zellen zu minimieren und dadurch die Nebenwirkungen zu reduzieren.
Die von den Zellkulturassays und Tierstudien erhaltenen Daten können zur Formulierung eines Dosisbereichs zur Verwendung beim Menschen verwendet werden. Die Dosierung von solchen Verbindungen liegt vorzugsweise im Bereich von zirkulierenden Konzentrationen, die eine ED₅₀ mit wenig oder keiner Toxizität aufweisen. Die Dosierung kann in diesem Bereich variieren, je nach der angewendeten Dosisform und dem benutzten Verabreichungsweg. Für jede im Verfahren der Erfindung verwendete Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich von den Zellkulturassays berechnet werden. Eine Dosis kann in Tiermodellen formuliert werden, um einen zirkulierenden Plasmakonzentrationsbereich zu erreichen, der die IC₅₀ (d.h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Hemmung der Symptome erreicht) aufweist, wie in der Zellkultur bestimmt. Solche Informationen können dazu verwendet werden, um die nützlichen Dosen beim Menschen genauer zu bestimmen. Plasmaniveaus können zum Beispiel durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gemessen werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Dosisbereich der in den Zusammensetzungen der Erfindung verwendeten Endothelinantagonisten etwa 1 mg/kg bis etwa 100 mg/kg.
Weiter sind die Dosen von vielen der oben angeführten Antitumormittel dem Fachmann bekannt und können leicht in solchen Kompendien, wie PHYSICIANS DESK REFERENCE, Medical Economics Data Publishers; REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Marck Publishing Co., GOODMAN & GILMAN, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, McGraw Hill Publishers, THE CHEMOTHERAPY SOURCE BOOK, Williams und Wilkens Publishers, Online-Diensten, wie beispielsweise Cancer Lit^®, Datenbank des U.S. National Cancer Institute, sowie Berichten über pharmakologische Studien, wie beispielsweise „A MultiCenter Randomized Trial of Trial of Two Doses of Taxol" Nabholtz, J. M. Gelmon, K., Bontenbal, M. u.a., Medical Education Services Monograph – 1994 Bristol-Myers Squibb Company Publication; „Randomized Trial of Two Doses of Taxol in Metastatic Breast Cancer: An Interim Analysis" Nabholtz, J. M., Gelmon, K., Bontenbal, M., u.a. 1993, Proc. Am. Clin. Oncol., 12: 60. Abstract 42 gefunden werden.
Die Dosisbereiche für Antikrebsmittel in den Zusammensetzungen der Erfindung können niedriger als, gleich wie oder höher als die typischen täglichen Dosen sein, die für die systemische Behandlung von Patienten vorgesehen sind. Zum Beispiel führten Dosen von 5'-FU, die 50% der Standarddosen entsprachen, die verwendet wurden, um Kolorektalkrebs mit 5'-FU beim Menschen (300–450 mg/m² i.v. täglich über 5 Tage) zu behandeln, zu einer 80–90%igen Volumensreduzierung von ektopischen HT29-Colonkrebstumorimplantaten bei scid-Mäusen. Die Verwendung der p-GlcNAc-Membran als Medikamentenabgabematrix zur Verabreichung von 5'-FU reduzierte die Dosis, die erforderlich war, um das Tumorvolumen drastisch zu reduzieren, um 50% im Vergleich zu intravenösen Kontrolltieren. Details im Hinblick auf diese Daten können in dem Beispiel im Abschnitt 21 des US-Patents 5,635,493 gefunden werden. In den Fällen, in denen höhere Dosen erforderlich sind, können diese höheren Dosen insofern toleriert werden, als die Medikamente lokal an den Tumorort abgegeben werden und daher andere Gewebe, einschließlich Blutzellen, nicht so schnell den Medikamenten ausgesetzt werden.
Bestimmte Antitumormittel sind blaseninduzierende Substanzen, einschließlich Dactinomycin, Daunomycin, Doxorubicin, Estramustin, Mechlorethamin, Mitomycin C, Vinblastin, Vincristin und Vindesin; während bestimmte Antitumormittel reizende Substanzen sind, einschließlich Carmustin, Decarbazin, Etoposid, Mithrmycin, Streptozocin und Teniposid. Blaseninduzierende und reizende Substanzen bewirken ungünstige Nebenwirkungen, einschließlich eine Extravasation und Irritation von Geweben mit Schmerz, Rötung, Schwellung und anderen Symptomen. Weiter kann eine Gewebenekrose von einigen der Nebenwirkungen herrühren. Die p-GlcNAc-Membran und Gelmaterialien der Zusammensetzungen der Erfindung, die für die topische, kontrollierte Freisetzung von Antitumormitteln verwendet werden, haben Wundheilungseigenschaften. Normale Gewebe, die sich mit blaseninduzierenden oder reizenden Antitumormitteln in Kontakt befinden, die durch die p-GlcNAc-Membran und Gelformulierungen der Erfindung abgegeben werden, werden daher nicht sofort zerstört und heilen aufgrund der aktiven Heilwirkungen der p-GlcNAc-Komponente der das p-GlcNAc enthaltenden Zusammensetzungen der Erfindung schneller.
6. BEISPIEL: REINIGUNG VON p-GlcNAc UNTER VERWENDUNG DES REINIGUNGSVERFAHRENS MITTELS MECHANISCHER KRAFT
In diesem Abschnitt wurde p-GlcNAc mit dem Verfahren mittels mechanischer Kraft, das im Abschnitt 5.1 oben beschrieben ist, gereinigt.
6.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN/ERGEBNISSE
Kieselalgenkulturbedingungen: Die Kieselalgenart Thalassiosira fluviatilis wurde in einer Kultur gemäß den im US-Patent 5,635,493 beschriebenen Verfahren, das hier durch Bezugnahme aufgenommen wird, gezüchtet.
REM-Verfahren: Die hier verwendeten REM-Verfahren waren wie folgt: Es wurde ein Zeiss 962 Instrument mit einer Beschleunigungsspannung von 10 kv verwendet und einem Arbeitsabstand von 15 mm verwendet. Polaroidart 55 p/n (u4) wurde bei verschiedenen Vergrößerungen, wie angegeben, benutzt. Probenüberzug: Kohlenstoffüberzug (100 å) & 100 å aupd.
(a) Probenherstellung: Für eine primäre Fixierung wurde das Kulturzuchtmedium durch 2% Glutaraldehyd in Eagle-DMEM ohne Serum ersetzt. Es wurden mehrere Änderungen durchgeführt, um einen vollständigen Wechsel von den Zuchtmedien zur Fixierung sicherzustellen. Die Fixierung schritt 0,5 h bei Raumtemperatur voran. Deckgläser wurden auf frische Fläschchen, enthaltend 2 Glutaraldehyd in 0,1 M Na Cacodylat bei einem pH-Wert von 7,2 mit 0,1 M Saccharose, übertragen und weitere 1,5 Stunden bei Raumtemperatur fixiert.
p-GlcNAc-Reinigungsverfahren: p-GlcNAc wurde aus der Kieselalgenkultur unter Verwendung des Verfahrens mittels mechanischer Kraft gereinigt, das im Abschnitt 5.1 oben beschrieben ist. Insbesondere wurden die p-GlcNAc-Fasern von den Kieselalgenzellkörpern getrennt, indem die Kulturinhalte drei kurzen Schüben einer Mischbewegung mit Höchstgeschwindigkeit in einem Waring-Mischer ausgesetzt wurden. Die Gesamtdauer der drei Schübe betrug etwa 1 Sekunde. Die sich ergebende Suspension wurde bei 3500 U/min in einem Sorvall GS-4 Festwinkelrotor 20 Minuten lang bei etwa 10°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und erneut zentrifugiert, diesmal bei 4.000 U/min in einem Sorvall GS-4 Festwinkelrotor 20 Minuten lang bei 10°C. Der Überstand wurde noch einmal dekantiert und bei 4.000 U/min bei 10°C zentrifugiert. Der letzte Überstand der dritten Zentrifugation war klar und hatte wenig bis keine sichtbaren, in der Flüssigkeit treibenden Flocken. Der klare Überstand wurde in einer Buchner-Filtrationseinheit, die mit einer Supor-800 Polyethersulfonfiltermembran mit einer Porengröße von 0,8 μm (Gelman, Inc.) ausgestattet war, dekantiert, dann wurde abgesaugt und die Flüssigkeit aus der Fasersuspension filtriert, wodurch es möglich wurde, die Fasern auf der Membran zu sammeln. Die gesammelten Fasern wurden mit 1 Liter destilliertem, deionisiertem H₂O bei 70°C gewaschen. Als fast alles Wasser abgeleitet war, wurden die Fasern unter Absaugen mit 1 Liter 1 N HCl bei 70°C gewaschen. Wenn der Hauptteil der Säurelösung abgeleitet war, wurden die Fasern mit 1 Liter destilliertem deionisiertem H₂O bei 70°C unter Absaugen gewaschen. Sobald fast alles Wasser abgeleitet war, wurden die Fasern mit 1 Liter 95%igem Ethanol bei Raumtemperatur gewaschen und es wurde ein Vakuum angelegt. Die Filtermembran, auf der die weiße Fasermembran gesammelt worden war, wurde dann aus der Filtrationseinheit entfernt und die Membran und der Membranträger wurden in einem Trockenschrank bei 58°C 20 Minuten lang getrocknet, wonach die Membran und der Träger 16 Stunden lang in einen Exsikkator gegeben wurden.
Nach diesem Reinigungsverfahren betrug die p-GlcNAc-Ausbeute aus einer 1000 ml Kultur 6,85 Milligramm pro Liter Kieselgelkultur.
7. BEISPIEL: REINIGUNG VON p-GlcNAc MITTELS DES BIOLOGISCHEN/CHEMISCHEN REINIGUNGSVERFAHRENS
In diesem Abschnitt wurde p-GlcNAc mittels zwei der chemische/biologischen Verfahren, die im Abschnitt 5.1 oben beschrieben sind, gereinigt. Kurz wurde p-GlcNAc in einem Fall mittels HF-Behandlung und im zweiten Fall durch eine Säurebehandlung/Neutralisation gereinigt.
7.1. MATERIALIEN UND VERFAHREN/ERGEBNISSE
Kieselalgenzuchtbedingungen: Die Kieselalgenart Thalassiosira fluviatilis wurde in einer Kultur gemäß den im US-Patent 5,635,493 beschriebenen Verfahren gezüchtet, wobei das Patent hier durch Bezugnahme aufgenommen wird.
REM-Verfahren: Die Verfahren, die in dieser Untersuchung verwendet wurden, waren wie oben beschrieben.
Reinigungsverfahren: Zuerst wurde p-GlcNAc mittels HF-Behandlung gereinigt. Insbesondere wurden unter einem Abzug 2,42 ml einer 49%igen (29 N) HF-Lösung den Kieselalgeninhalten der Kultur bei Raumtemperatur pro 1000 ml Volumen der ursprünglichen Zellkultur zugesetzt, was zu einer 0,07 M HF-Lösung führte. Das Gemisch wurde dann etwa 30 Sekunden lang kräftig geschüttelt, wodurch ein anhaltender Schaum auf der Flüssigkeit erschien. Der Behälter wurde 5–6 Stunden lang ungestört stehen gelassen, damit sich schwere Schwebstoffe absetzen konnten. Am Ende dieser Zeit hatte sich eine Schaumschicht gebildet, während die Flüssigkeit selbst in zwei Schichten unterteilt war: zuerst eine dünne, sehr dunkelgrüne Schicht, die auf dem Boden des Behälters unter einer zweiten, viel helleren, graugrünen und düsteren Phase ruhte, die vielleicht 85–90% des Gesamtvolumens der Flüssigkeit darstellte. Die Schaumschicht wurde sorgfältig mittels Kapillarglasröhrchen und Vakuumabsaugung abgeschöpft. Der gräuliche trübe Überstand wurde dann abgeschöpft, wobei darauf geachtet wurde, dass die dunkle Bodenschicht nicht gestört wurde, die hauptsächlich aus den abgesetzten Zellkörpern bestand, und auf einen separaten Kunststoffbehälter übertragen. Der gräuliche trübe Überstand wurde ungestört für weitere 16 Stunden stehen gelassen. Die Flüssigkeit war anfänglich fast farblos, hellgrau, aber nicht transparent. Nach 16 Stunden Absetzzeit blieb eine geringe Menge Schaum oben auf dem Hauptteil der Flüssigkeit zurück und eine geringe Menge grüner Substanz hatte sich am Boden des Behälters abgesetzt. Die Flüssigkeit war farblich heller aber noch nicht transparent. Der Schaum oben auf der Flüssigkeit wurde wie zuvor abgeschöpft. Der Hauptteil der Flüssigkeit wurde dann sorgfältig abgeschöpft und es blieb die geringe Menge an abgesetztem grünem Material am Behälterboden zurück. Die Flüssigkeit, die auf diese Weise isoliert worden war, enthielt den Hauptteil der p-GlcNAc-Fasern und einige Verunreinigungen.
Um Proteine und andere unerwünschte Substanzen zu entfernen, die während der vorhergehenden Verfahrensschritte aus der Fasern enthaltenden Flüssigkeit durch die Kieselalgen freigesetzt wurden, wurde die Suspension aus Fasern und Zellüberresten mit Natriumdodecylsulfat (SDS) gewaschen. Insbesondere wurde das notwendige Volumen einer 20% SDS-Lösung zugesetzt, um die Endkonzentration der Flüssigkeit 0,5% SDS, basierend auf dem Volumen, werden zu lassen. Der Behälter mit der Flüssigkeit wurde verschlossen, in einer horizontalen Stellung auf einem Schüttler gesichert und 24 Stunden lang bei etwa 100 Schüttlern pro Minute gerührt. Kurz nach dem Beginn des Schüttelns tauchten große Flocken weißer p-GlcNAc-Fasern in der Suspension auf und eine beträchtliche Menge an Schaum sammelte sich im Kopfraum der Behälter. Am Ende der SDS-Waschung wurde der Inhalt der Behälter auf eine Buchner-Filtrationsvorrichtung gegeben, die mit einer Supor-800 Polyethersulfonfiltermembran mit einer Porengröße von 0,8 μm (Gelman, Inc.) ausgestattet war, übertragen. Die Flüssigkeit wurde unter Absaugen filtriert, und die p-GlcNAc-Fasern in der Flüssigkeit wurden auf der Filtermembran gesammelt.
Die auf der Filtermembran gesammelten p-GlcNAc-Fasern wurden dann weiter gewaschen. Zuerst wurden die Fasern mit heißem (70°C), destilliertem deionisiertem H₂O unter Verwendung von 3-mal dem Volumen der ursprünglichen Suspension gewaschen. Mit einem Wasserstrahl unter Verwendung von destilliertem deionisiertem H₂O wurden die weißen Faserklumpen, die auf der Filtermembran des Buchner-Filters gesammelt wurden, auf einen Waring-Mischer übertragen, und die Faserklumpen wurden mit etwa 10 kurzen Mischschüben zersetzt. Die Suspension der zersetzten Fasern wurde auf einen Buchner-Filtertrichter übertragen, der mit einer Polyethersulfonfiltermembran, wie oben beschrieben, ausgestattet war, und die Flüssigkeit wurde unter Absaugen entfernt. Die gesammelten Fasern wurden mit 1000 ml heißer (70°C) 1 N HCl-Lösung gewaschen, und anschließend weiter mit 1000 ml heißen (70°C) destilliertem deionisiertem H₂O gewaschen. Schließlich wurden die Fasern mit 1000 ml 95% Ethanol bei Raumtemperatur gewaschen und zur Trockene filtriert. Die Fasermembran und die die Fasermembran tragende Fasermembran wurden dann in einem Trockenschrank bei 58°C 20 Minuten lang getrocknet. Die Membran und der Membranträger wurden dann 16 Stunden lang in einem Exsikkator gelassen. Die Membran wurde danach sorgfältig von der Filtermembran abgetrennt.
Zweitens wurde p-GlcNAc mittels der Säurebehandlungs/Neutralisationsverfahren, das im Abschnitt 5.1 oben beschrieben ist, gereinigt. Insbesondere wurde das p-GlcNAc wie zuvor in diesem Abschnitt beschrieben bis vor den SDS-Waschschritt verarbeitet, zu welchem Zeitpunkt die Lösung auf einen pH-Wert von etwa 7,0 durch Zugabe einer 2,9 M Tris-Lösung neutralisiert wurde. Die p-GlcNAc-Ausbeute aus diesem besonderen Reinigungsverfahren betrug 20,02 Milligramm pro Liter Kieselalgenkultur, obwohl im Durchschnitt etwa 60 Milligramm pro Liter Kieselalgenkultur erhalten werden. Eine REM-Aufnahme einer als Ergebnis des Säurebehandlungs/Neutralisationsreinigungsverfahrens gebildeten Membran ist in der 3 gezeigt.
8. BEISPIEL: p-GlcNAc-Deacetylierung
Eine p-GlcNAc-Membran wurde in einer wässrigen 50 %igen NaOH-Lösung suspendiert. Die Suspension wurde 2 Stunden lang bei 80°C erwärmt. Die sich ergebende deacetylierte Membran wurde getrocknet und mittels Rasterelektronenmikroskopie, wie in der 5 gezeigt, untersucht.
9. BEISPIEL: p-GlcNAc-Umformulierung
Eine p-GlcNAc-Membran (16,2 mg) wurde in 1 ml einer Dimethylacetamidlösung, enthaltend 5% LiCl, gelöst. Die p-GlcNAc enthaltende Lösung wurde in eine Spritze gefüllt und in 50 ml reines Wasser extrudiert, um die Fasern auszufällen. Das sich ergebende Fasermaterial wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie, wie in der 6 gezeigt, untersucht.
10. BEISPIEL: HERSTELLUNG EINER EA/p-GlcNAc-ZUSAMMENSETZUNG DER ERFINDUNG
Ro61-0612/001 (hier auch als „Ro61" bezeichnet) ist ein nicht spezifischer, nicht auf Peptid beruhender Endothelinantagonist mit dem in der Formel 1 oben gezeigten Aufbau. Sein chemischer Name – in der Salzform – ist 5-Isopropyl-pyridin-2-sulfonsäure [6-(2-hydroxy-ethoxy)-5-(2-methoxy-phenoxy),-2-[2-(1H-tetrazol-5-yl)-pyridin-4-yl]-pyrimidin-4-yl]amidnatriumsalz (1:2) und sein Molekulargewicht ist 649,59. Seine Löslichkeit in Wasser beträgt über 3%. Die bindungshemmende Wirksamkeit (IC₅₀) von Ro61 im Hinblick auf den ETA-Rezeptor beträgt 1–20 nM und ist im Hinblick auf den ETB-Rezeptor 20–30 nM. Seine funktionelle hemmende Wirksamkeit (pA2) im Hinblick auf den ETA-Rezeptor ist 9,5 und ist im Hinblick auf den ETB-Rezeptor 7,7. Die empfohlene Dosis in vivo ist 1–30 mg/kg i.v. oder i.p. Die empfohlene Dosis in vitro ist 10^–9 bis 10^–5 M.
Ro61 wurde zur Verwendung in einer Zusammensetzung der Erfindung zuerst als lyophilisiertes Pulver von Acetelion Ltd., Allschwil, Schweiz zur Verfügung gestellt, das in sterilem Wasser suspendiert wurde, und der pH-Wert wurde mit steriler Salzsäure auf 4,0 eingestellt. Alternativ kann Ro61 mittels auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren synthetisiert werden.
Eine p-GlcNAc-Faser-Aufschlämmung wurde wie folgt hergestellt: p-GlcNAc, das mit dem in dem Beispiel im Abschnitt 7 oben beschriebenen biologischen/chemischen Verfahren hergestellt wurde, wurde in destilliertem deionisiertem Wasser erneut suspendiert und gerührt, um eine faserige Suspension oder eine Aufschlämmung von 1 mg/ml zu bilden. Die Faseraufschlämmung wurde dann im Ofen bei 60°C 2 h lang getrocknet, um p-GlcNAc-Polymermembranen zu bilden. Die Membranen wurden in 40% NaOH-Lösung bei 80°C 2 h lang deacetyliert. Wenn die Membranen 100% Deacetylierung erreichten, wurden sie mit destilliertem deionisiertem Wasser gewaschen, bis ein pH-Wert von 7,0 erreicht war.
Die gewaschenen deacetylierten Membranen wurden dann in Gegenwart von Milchsäure zu dem p-GlcNAc-Lactatsalz umgewandelt, und zwar im Wesentlichen wie im US-Patent 5,623,064, das hier durch Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben. Kurz wurde das deacetylierte p-GlcNAc in einem organischen Medium, wie beispielsweise 2-Propanol (enthaltend 10% Wasser), suspendiert, um so das ganze deacetylierte p-GlcNAc-Material zu benetzen. Unter Rühren wurde eine geeignete Menge an 50%iger wässriger Milchsäurelösung zugesetzt. Die Milchsäure sollte Reagensklasse besitzen und ist zu analysieren, um die genaue Konzentration an verfügbarer (d.h. nicht veresterter) vorhandener Milchsäure zu bestimmen. Dies wurde allgemein durch Titration mit 0,1 N NaOH zum Phenolphthalein-Endpunkt (pH 7,0) erreicht. Das Gemisch wurde für mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur rühren gelassen. Es kann etwas Wärme zugeführt werden, um die Reaktionsrate zu erhöhen. Die Reaktionszeit kann verlängert oder die Menge an 50%iger wässriger Milchsäure erhöht werden, um sicherzustellen, dass die Reaktion vervollständigt wird. Die Suspension wurde dann durch einen Buchner-Trichter mit quantitativem aschelosen Filterpapier fein filtriert und das Material in Form einer Membran wurde mit wasserfreiem 2-Propanol gewaschen. Die Membran wurde dann an der Luft in einem Abzug 2 Stunden lang trocknen gelassen und dann bei 40°C über Nacht in einen Ofen gestellt.
Als nächstes wurde ein EA/p-GlcNAc-Gel zur Injektion durch Lösen der p-GlcNAc-Lactatmembranen in destilliertem deionisiertem Wasser in der gewünschten Konzentration, z.B. 2% p-GlcNAc-Lactat, basierend auf dem Gewicht, und Zusetzen von Ro61 zur Lösung hergestellt. Die Endkonzentration von Ro61 in dem Gel wurde so eingestellt, dass jedes Tier 3 mg/kg in einer 200 μl Gelprobe erhielt. Wahlweise kann ein Reagensklasse-Propylenglycol (2-Propandiol) der p-GlcNAc-Lösung zugesetzt werden, um eine endgültige Propylenglycolkonzentra tion von zwischen 1–10% zu ergeben. In einigen Fällen kann ein Konservierungsstoff zugegeben werden, um eine bakterielle und/oder Pilzkontamination zu verhindern. Gemäß anderen Ausführungsformen können Konzentrationen von p-GlcNAc-Lactat im Bereich von 0,1% bis 4,0% wie oben beschrieben hergestellt werden. Die Viskosität dieser Präparate steigt mit steigendem prozentualem Anteil an p-GlcNAc-Lactat, so dass Formulierungen mit 0,5% oder mehr an p-GlcNAc-Lactat sich als Gel verhalten.
11A: BEISPIEL: B16 ALS AUF ENDOTHELIN ANSPRECHENDES TUMORMODELL
B16-Zellen wurden zur Verwendung als auf Endothelin ansprechendes Tumormodellsystem bewertet. Die B16-Zellen, d.h. von der B16-Mausmelanomzelllinie (mit Fibroblast-Ursprung) wurden von der American Type Culture Collection (Rockville MD) als gefrorener Bestand erhalten. Die Zellen wurden in einem vollständigen Medium (CM): RPMI 1640 (Irvine Scientific, Santa Ana CA), das mit 10% wärmeinaktiviertem fötalen Rinderserum (Summit Biotechnologies, Ft. Collins CO), Penicillin (50 Einheiten/ml), Streptomycin (50 μg/ml), 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM MEM nicht essentielle Aminosäuren (Gibco BRL, Gaithesburg MD), 1 mM Natriumpyruvat und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol (Sigma Immunochemicals, St. Louis MO) ergänzt war, kultiviert. Die Zellen wurden bei 37°C in einem befeuchteten 5% CO₂ Inkubator gezüchtet und jeden zweiten Tag auf 1 × 10⁵ Zellen/ml angepasst.
Die B16-Zellen wurden auf Endothelinniveaus und eine Endothelinrezeptor(ETR)-Expression wie folgt analysiert: ET1 in den B16-Kulturüberständen wurde durch einen kompetitiven Radioimmunoassay (RPA 545, Amersham, Milford Ma) mit radioaktivem Ligand und einem ET1-spezifischen Antikörper gemessen. Gebundes und freies ET wurde mit einem zweiten Antikörperphasensystem reagiert und anschließend magnetisch getrennt. Eine Standardkurve wurde bestimmt, indem der prozentuale Anteil an gebundenem Ligand/Nullstandard (B/Bo) berechnet wurde, und die Konzentration von ET konnte von dieser Standardkurve abgelesen werden. Die Ausbeute aus dem Extraktionsverfahren betrug 75 ± 5%, basierend auf den mit Plasma beimpften Standards (4–20 fmol/ml). Die Interassayvari ation betrug 10% und die Intraassayvariation war 9% für das ET-Radioimmunoassayverfahren.
Unter Verwendung dieses Assays wurde in einem Experiment festgestellt, dass die Grundlinien-ET1-Niveaus in den B16-Kulturüberständen in 24 h 1,269 fmol/ml betrugen. Eine Zugabe entweder von 10 μM eines ETA- oder ETB-Agonisten oder von beidem induzierte eine gesteigerte Proliferation der B16-Zellen um 137%, 117% bzw. 164% von unbehandelten Kontrollen mit entsprechenden ET1-Niveaus von 34,01, 1,158 bzw. 34,01 fmol/ml. In einem nachfolgenden Experiment waren die Grundlinienniveaus von ET1 in 24 h B16-Kultur 597 ± 58 fmol/l, und die Zugabe von 10 μM eines nicht selektiven Agonisten (ET1), eines selektiven ETB-Rezeptoragonisten (BQ3020) oder beidem steigerte die Proliferation der B16-Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen um 154%, 116% bzw. 141% (siehe Tabelle 1 unten). Diese Daten zeigen, dass Maus-B16-Melanomzellen ETR exprimieren, die auf etablierte Endothelinagonisten ansprechen.
Tabelle 1
Wie außerdem festgestellt wurde, exprimieren die B16-Zellen Endothelinrezeptoren über Immunfluoreszenzfärben mittels des intrazellulären Durchflusszytometriekits von Pharmingen mit antizytoplasmatischen Endothelinrezeptorantikörpern, d.h. sind gerichtet gegen den zytoplasmatischen Bereich des Rezeptors (Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ) und Schaf anti-Maus-IgG, isotypischen Antikörperkontrollen (Sigma Immunchemicals, St. Louis MO). Gemäß diesem Verfahren wurden die B16-Zellen in Cytofix/Cytoperm-Puffer (aus dem Pharmingen-Kit) gewaschen und 20 min lang mit einer Permeabilisierungslösung (0,1% Triton X100 in 0,1% Natriumcitrat) inkubiert. Die Zellen wurden dann bei 4°C in der Dunkelheit 30 min lang mit einem primären Anti-Endothelinrezeptor oder Isotyp-Kontrollantikörpern inkubiert, und dann gewaschen und weitere 30 min mit dem sekundären FITC-markierten Antikörper (Maus anti-Schaf-IgG; Sigma) inkubiert. Die Zellen wurden sichtbar gemacht und mit einem Axioplan-Forschungsmikroskop (Carl Zeiss Inc. Jena, Deutschland), das mit einer 100 Watt Quecksilberlampenquelle und einem 40 × „plan-neufluar" na1,3-Objektiv ausgestattet war, fotografiert.
Diese Immunfluoreszenzfärbeexperimente zeigten, dass B16-Melanomzellen feststellbare Niveaus an ETA- und ETB-Rezeptoren exprimierten.
Bindungsassays mit ET-1¹²⁵ legten auch nahe, dass B16-Zellen ET-Rezeptoren exprimieren. Diese Assays wurden wie folgt durchgeführt: Glatte Muskelzellen der Aortagefäße, genannt A10-Zellen, B16- und CHO-Zellen wurden in einer Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml in Bindungspuffer (50 mM Tris/HCl – pH = 7,4, 5 mM EDTA und 0,5% BSA) in einzelnen Röhrchen suspendiert. Die A10 wurden als positive ETA-Kontrolle verwendet, während CHO-Zellen als negative Kontrolle verwendet wurden, was keine Bindung des markierten ET1 in Einklang mit dem Fehlen von ETR auf dieser Zelllinie zeigte.
Ein Aliquot von 21 μl (3-[¹²⁵I]-Iodotyrosyl)endothelin-1 (ET1-I¹²⁵, von Amersham Life Science Inc, Arlington Heights, IL) wurde jedem Röhrchen in einer Endkonzentration von 10^–12 M zugegeben. Markierte Zellen wurden dann in Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert und 18 μl unmarkiertes ET1 (in einer Endkonzentration von 10^–8 M) oder HBSS wurde zugesetzt. Die Röhrchen wurden gemischt und jede Probe wurde in 300 pl Aliquots geteilt, in silikonisierte Röhrchen gegeben und 2,5 Stunden bei 37°C geschüttelt. Anschließend an eine Inkubation wurden die Röhrchen bei 10.000 U/min 6 Minuten lang zentrifugiert, die Zellpellets wurden durch Vortexen in 300 μl Bindungspuffer erneut suspendiert und zweimal wieder in Bindungspuffer gewaschen. Nach dem abschließenden Waschen wurden die Zellen in 500 μl 1 N NaOH erneut suspendiert, 10 Minuten lang bei 37°C geschüttelt und zur Zählung auf Packard Cobra Autogamma 5000 Reihe (Modell 5002) Gammazählsystem (Packard Instrument Co., Meridea, CT) in Szintillationsröhrchen gegeben.
Die Ergebnisse dieser ET1-Bindungsassays, die zeigen, dass B16-Zellen ETR exprimieren, sind in der Tabelle 2 unten gezeigt.
Tabelle 2 Bindung von ET1 an B16-Tumorzellen.
Die Ergebnisse sind als mittlere cpm pro 10⁶ Zellen (± REM) ausgedrückt.
11B. BEISPIEL: Ro61-INHIBIERUNG DER MELANOMZELLENPROLIFERATION IN VITRO
Normale Splenozyten zeigen keine sichtbaren Niveaus an ETR, wie mittels Immunfluoreszenz festgestellt, wie oben beschrieben. Aufgrund der leichten Splenozytenisolation und -kultur, wurden sie daher als Kontrollzellen verwendet, um die Wirkungen von Ro61 auf die Zellproliferation zu einzuschätzen. Splenozyten wurden von weiblichen 6–8 Wochen alten C57BL/6(H-2b)-Mäusen (Jackson Laboratories, Bar Harbor MA) wie folgt geerntet: Die Milz wurde entfernt, in Kulturmedium gelegt und die Zellen mit einem 3 cm³ Spritzenkolben dispergiert. Die Zellsuspension wurde dann durch ein 70 μm Zellsieb filtriert, und Erythrozyten wurden mit Ammoniumchloridlyselösung lysiert (hergestellt durch Mischen von 9 Teilen 8,3 g/l Ammoniumchlorid; 1 Teile 20,59 g/l Tris, pH 7,65, direkt vor dem Gebrauch). Die Splenozyten wurden dann gewaschen und erneut in Kulturmedium suspendiert.
Ro61 wurde als lyophilisiertes Pulver von Acetelion Ltd, Allschwil, Schweiz wie oben beschrieben erhalten und Proliferationsassays wurden durchgeführt, um die Wirkung von Ro61 auf die B16-Zellproliferation in vitro zu bewerten. Insbesondere wurde Ro61 in HBSS in steigenden Konzentrationen einer 96-Loch-Kulturplatte zugegeben. B16-Zellen oder Kontrollsplenozyten wie oben beschrieben wurden dann den Löchern in einer Konzentration von 10⁵ Zellen pro Loch zugesetzt und 72 h lang gezüchtet. Die Zellproliferation wurde mit dem CellTiter 96 Kit für nicht radioaktive Zellproliferationsmessung (Promega, Madison, WI) wie folgt untersucht: Es wurden Zellen mit 15 ml MTT-Farbstoff (vom Promega Kit) 4 h inkubiert, wonach eine Formazankristallbildung sichtbar wurde. Kristalle wurden in 50 ml Solubilisierungs/Stopplösung (vom Promega Kit) 30 min lang bei Raumtemperatur gelöst und Farbänderungen wurden als OD 570 nm gemessen. Hintergrund-OD bei 630 wurde automatisch subtrahiert. Durchschnittswerte von Dreifach-Löchern wurden bestimmt. Die Zellproliferation oder der Tod wurde auch mittels Lichtmikroskopfotographie bei 40facher inverser Brennweite aufgezeichnet.
Die Hemmwirkung von Ro61 auf die B16-Melanomzellen ist in der 7 veranschaulicht. Die Proliferation von mit Ro61 behandelten Zellen ist als prozentualer Anteil der unbehandelten Kontrollzellen ausgedrückt.
Die Durchschnittswerte von Dreifachlöchern wurden bestimmt. Wie in der 7 zu sehen ist, hemmte Ro61 die Proliferation der B16-Zellen (schwarze Kreise), aber hemmte nicht die normalen Splenozyten (weiße Kreise). Darüber hinaus wurde, wenn Ro61 in steigenden Konzentrationen den Zellen in der Kultur zugesetzt wurde, eine dosisabhängige Hemmung beobachtet. Diese Wirkung wurde in Konzentrationen von 0,1 μM (22% Hemmung im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen) festgestellt und war maximal bei 10 μM (83% Hemmung). Mikroskopisch hatten in der höchsten Konzentration von Ro61 die B16-Zellen keine normale fibroblastartige Spindelform mehr, sondern waren rund und zerstreut mit geringer Lebensfähigkeit (siehe die 17A–17B). Im Gegensatz dazu waren die Splenozyten durch die Zugabe sogar der höchsten Konzentration von Ro61 (10 μm) nur minimal beeinflusst.
Es wurde auch gefunden, dass Endothelinniveaus in den B16-Kulturüberständen dosisabhängig (p < 0,001) anstiegen (von 513 ± 27 fmol/l bei 50 nM Ro61 auf 954 ± 31 fmol/l bei 5 μM Ro61). Diese Beobachtung stimmt mit der Ro61-Blockade von ETR überein, was zu einer Unterbrechung einer durch Rezeptor vermittelten Feedback-Schleife führt.
Da Ro61, ein Hemmer des ET-Rezeptors, die Hemmung der B16-Zellproliferation bewirkte, war es von Interesse zu bestimmen, ob die Zugabe von Peptidagonisten, die für ETA oder ETB spezifisch sind, diesen Effekt umkehren könnte, d.h. durch Konkurrenz mit Ro61 für die Rezeptorbindungsstellen. Der Agonist BQ3020-[Ac-[Ala11,15]-endothelin(6,21), d.h. BQ3020 (Novabiochem, Katalog-Nr. A1 4534) und der Agonist [Ala^1,3,11,15]-Endothelin1 (Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO, Katalog-Nr.. E6877) wurden zur Verwendung in HBSS suspendiert. 5 × 10⁴ B16-Zellen wurden entweder mit Agonist allein, mit beiden Agonisten zusammen oder mit keinem von beiden in einer Konzentration von 10 nM in jedem Loch kultiviert, und Ro61 wurde dann in verschiedenen Konzentrationen den Löchern zugesetzt.
Wie in der 10 gezeigt, wurde die Ro61-Hemmung der B16-Proliferation durch Zugabe von ET-Rezeptoragonisten gehemmt. Die Proliferation von mit Ro61 behandelten Zellen ist als prozentualer Anteil der unbehandelten Kontrollzellen ausgedrückt. Die Durchschnittswerte von Dreifach-Löchern wurden bestimmt. Zuerst induzierte, wie durch die Y-Achse der 10 (0 Konzentration von Ro61) angegeben, die Zugabe des BQ3020-Agonisten (schwarzes Dreieck) oder des ET-1-Agonisten (weiße Raute) allein, oder der beiden Agonisten in Kombination (weißes Kästchen) die Proliferation der B16-Zellen. Für den BQ3020-Agonisten betrug die Proliferation 137% der unbehandelten Kontrollen, für den ET1-Agonisten betrug die Proliferation 117% der unbehandelten Kontrollen und für die Kombination der Agonisten betrug die Proliferation 164% der unbehandelten Kontrollen.
Wie weiter in der 10 angegeben, wirkte die Zugabe dieser Agonisten auch der Hemmung entgegen, die durch steigende Dosen an Ro61 induziert wurde.
Zum Beispiel kehrte die Zugabe von ET1 in einer Konzentration von 10 nM die Wirkungen von Ro61 in einer Konzentration von 1 nM vollständig um und reduzierte die Hemmung von Ro61 bei 5 μM um 50%. Der BQ3020-Agonist war in der Lage, die Wirkungen von 5 μM Ro61 (nur 12% Proliferationshemmung bei 5 μM) maßgeblich umzukehren. Der signifikanteste Effekt wurde mit der Kombination der beiden die Proliferation induzierenden Agonisten (123% der unbehandelten Kontrollen) sogar bei Zugabe von 0,1 μM Ro61 beobachtet. Diese dosisabhängigen Erkenntnisse definierten eine durch Endothelinrezeptor vermittelte Proliferationsreaktion für die Maus-B16-Zellen, die durch einen ETR-Antagonisten gehemmt werden kann.
In anderen Experimenten wurde Ro61, ein Antagonist, sowohl von ETA als auch ETB, mit einer etwa 10-fach höheren Affinität für ETA, zusammen mit BQ123, einem ETA-Antagonist, und BQ788, einem ETB-Antagonist, getestet (beide erhalten von der American Peptide Co., Sunnyvale, CA), um die Wirkung dieser Antagonisten auf die B16-Zellproliferation mittels des oben beschriebenen Zellproliferationsassays zu bestimmen. Das Vorhandensein von BQ123, BQ788, BQ123 + BQ788 oder Ro 61-0612/001 (jeweils in einer Gesamtkonzentration von 10 μM) in der Kultur führte zu einer signifikanten Hemmung der Proliferation (16, 18, 19 bzw. 50% im Vergleich zu nicht behandelten Kontrollen; p = 0,001, siehe Tabelle 3 unten).
Tabelle 3
In noch anderen Proliferationsassays, wie oben beschrieben, wurden verschiedene Endothelinantagonisten getestet, um ihre Wirkung auf die B16- Zellproliferation zu bestimmen. Die B16-Zellen, die zehnmal in Tieren passagiert worden waren und ein Wildtyp-ETR voller Länge exprimieren, wurden mit Kontroll-B16-Zellen verglichen, die als F9 bezeichnet waren und eine abgeschnittene ETA-mRNA exprimieren und daher einen unvollständigen ETA-Rezeptor zu erzeugen scheinen.
Wie in den 8 und 9 gezeigt, hemmten die Endothelinantagonisten IRL, BQ123, BQ610, BQ485, BQ788, RES bei einer Konzentration von 10^–6 M alle die B16-Zellproliferation im Vergleich zu den FO-Kontrollen und den Endothelinagonistkontrollen, ET1 und BQ3020.
12. BEISPIEL: Ro61-INDUKTION VON B16-MELANOMTUMOR-APOPTOSE-ZELLTOD
Studien in vitro zeigten, dass die Ro61-Behandlung nicht nur zu einer Hemmung der Zellproliferation beitrug, sondern dass es eine signifikante Komponente von Zelltod oder vorhandener Nekrose gab. In der Tat zeigten mit Ro61 behandelte B16-Zellen einen signifikanten Grad an morphologischen Änderungen in Übereinstimmung mit dem programmierten Zelltod (siehe 11).
Daher wurde die Wirkung von Ro61 auf apoptotische B16-Zelltod untersucht. B16-Zellen wurden in Kulturmedium in 25 ml Kulturkolben mit oder ohne 1 μM Ro61 bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator für bis zu 72 h gezüchtet. Die Zellen wurden auf Apoptose oder Zelltod mittels des Fluorescein In Situ Cell Death Detection Kit (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) wie folgt untersucht: Kurz wurden die Zellen trypsiniert und mit PBS, enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA), gewaschen. Nach 30-minütiger Fixierung mit einer 4%igen Paraformaldehydlösung in PBS (pH 7,4) wurden die Zellen mit einer Lösung aus 0,1% Triton × 100 in 0,1% Natriumcitrat für 2 min auf Eis permeabilisiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit TUNEL Reaktionsgemisch (Boehringer Kit) 1 h lang bei 37°C markiert und gewaschen. Die Fluoreszenz wurde auf einem Coulter EPICS XL Durchflusszytometer (Coulter, Miami FL) analysiert. Die Messungen wurde mit einer positiven Kontrolle mittels 100 μg/ml DNase I (Boehringer Mann heim, Mannheim, Deutschland) 10 min bei Raumtemperatur verglichen, um doppelsträngige DNA-Brüche zu induzieren.
Wie in der 12 gezeigt, induzierte der Endothelinantagonist Ro61 eine Apoptose in B16-Melanomzellen in der Kultur. Zum Beispiel erhöhte die Zugabe von 1 μM Ro61 zu den B16-Zellen den prozentualen Anteil an Zellen, die einer Apoptose unterworfen waren, signifikant im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen (p = 0,0007). Der prozentuale Anstieg der Zellen, die durch den oben beschriebenen TUNEL-Assay positiv waren, war bereits 24 h später sichtbar und noch nach 72 h feststellbar. Die Wirkung von Dauer nach der Kultur mit Ro61 war nicht signifikant; allerdings war die erhöhte Apoptose von mit Ro61 behandelten Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen stark signifikant (12,7%, 95 Konfidenzintervall: 11,7%–13,8%). Diese Ergebnisse begründeten das Vorhandensein einer apoptotischen, durch ETR vermittelten Zell-Signalgebung, die durch einen ETR-Antagonisten induziert werden kann. Daher trägt die Apoptose zumindest teilweise zur Hemmung einer zellulären Proliferation und dem beobachteten Zelltod bei.
13. BEISPIEL: HEMMUNG VON B16-MELANOMINTRAPERITONEALCARCINOMATOSE IN VIVO DURCH EINEN ENDOTHELINANTAGONISTEN ODER EINE EA/p-GlcNAc-ZUSAMMENSETZUNG DER ERFINDUNG
Die markanten Wirkungen von Ro61 auf B16-Zellen in vitro führten zu weiteren Untersuchungen, um die Auswirkung des ETR-Antagonismus auf das Tumorwachstum in vivo unter Verwendung eines aggressiven intraperitonealen (IP) B16-Melanommetastasen/Carcinomatose-Modells einzuschätzen. Gemäß diesem Modell wurde weiblichen C57BL/6-Mäusen intraperitoneal 5 × 10⁴ B16-Zellen in 100 ml BHSS injiziert. Einen Tag später wurde den Mäusen 100 μl entweder HBSS allein (keine Behandlung), HBSS enthaltend 3 mg/kg Ro61 (täglich verabreicht), HBSS enthaltend 30 mg/kg Ro61 (täglich verabreicht), p-GlcNAc-Gel (2%) allein oder p-GlcNAc-Gel (2%) enthaltend 18 mg/kg Ro61 injiziert.
Die Tiere in den Gruppen, die mit HBSS entweder enthaltend 3 mg/kg oder 30 mg/kg Ro61 allein behandelt wurden, erhielten täglich i.p.-Injektionen, während alle der anderen Gruppen nur einmal behandelt wurden. Das p-GlcNAc-Gel allein, das in diesem Experiment verwendet wurde, wurde wie in dem Beispiel im Abschnitt 10 oben angegeben hergestellt, abzüglich der Zugabe von Ro61. Das in diesem Experiment verwendete Ro61/p-GlcNAc wurde auch wie oben im Abschnitt 10 näher beschrieben hergestellt. Die Mäuse wurden nach 7 Tagen geopfert, und das Vorhandensein einer intraperitonealen Krankheit bewertet. Genauer wurden einzelne Tumorkolonien unter einem Seziermikroskop für jedes Tier auf der peritonealen Oberfläche, dem Gekröse, der Leber, der Milz und dem Pankreas gezählt. Es wurden Untersuchungen unter Doppelblindkonditionen durchgeführt. Es wurden Fotographien des Peritoneums und der Verdauungsorgane sowie Schnitte durch das Gekröse, die Leber, die Milz und das Pankreasfett und Peritoneum für die histologische Analyse durch H und E sowie als Melaninfärbung angefertigt.
Die 13A zeigt, dass die Mäuse, die täglich IP-Injektionen von Ro61 in einer niedrigen Dosis, z.B. 3 mg/kg, 6 Tage lang (insgesamt 18 mg/kg) erhielten, keine signifikant niedrigeren Zahlen an Metastasen oder Tumorkolonien pro Tier zeigten. (Wie hier verwendet betrifft der Begriff Metastase Tumorkolonien, die im Peritoneum und den Verdauungsorganen von Mäusen festgestellt wurden, denen B16-Melanomzellen gemäß dem oben beschriebenen Karzinomatosemodell injiziert wurden).
Im Gegensatz dazu reduzierten die täglichen Injektionen von höheren Dosen an Ro61 allein bei 30 mg/kg über 6 Tage (Gesamtdosis 180 mg/kg) die durchschnittliche Zahl an Tumorkolonien an Tag 7 nach der Tumorinjektion signifikant.
Darüber hinaus reduzierte, wie in der 13B gezeigt, das p-GlcNAc-Gel allein die durchschnittliche Zahl der Tumorkolonien im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen, wenn es IP injiziert wurde, aber hatte keine signifikante Wirkung auf das Wachstum der Kolonien bei subkutaner (SC) Injektion. Die 13B zeigt auch, dass die höchste Reduktion der Tumorkolonien mit der Verabreichung einer einzelnen Dosis (18 mg/kg) von Ro61 auftrat, das in dem p-GlcNAc-Gel for muliert war (durchschnittliche Zahl an Kolonien = 2,7 ± 1,4). Die Gel/Ro61-Zusammensetzung führte zu deutlich weniger Kolonien im Vergleich zu sowohl Ro61 in hoher Dosis (p = 0,001) und p-GlcNAc-Gel allein IP (p = 0,02). Die Behandlung mit Ro61 in niedriger Dosis und p-GlcNAc allein SC unterschied sich nicht signifikant von den unbehandelten Kontrollen.
Um zu bestimmen, ob Ro61 aufgrund des p-GlcNAc nicht nur eine lokale Wirkung sondern auch eine systemische Wirkung hat, untersuchten wir die Wirkungen einer IP-Ro61-Behandlung in einem subkutanen, SC, Modell eines B16-Melanoms. Weiblichen CS7BL/6-Mäusen wurde SC in die Flanke 5 × 10⁴ B16-Melanomzellen in 100 μl HBSS injiziert. Nach 24 Stunden erhielten die Tiere eine der folgenden Behandlungen (100 μl, IP): HBSS (täglich 6-mal), 30 mg/kg Ro61 in HBSS (täglich 6-mal), pGlcNAc-Gel (eine Verabreichung) oder 18 mg/kg Ro61 in p-GlcNAc (eine Verabreichung). Die Tiere wurden über einen Zeitraum von 3 Wochen nach der Tumorinjektion (n = 10 in allen Gruppen) auf Tumorauftreten und -wachstum überwacht.
Wie in der 14 veranschaulicht, zeigte das SC-Modell von B16-Melanom, dass alle Tiere, die IP Ro61 in HBSS erhielten, bis zum Tag 17 Tumoren entwickelten; allerdings gab es eine signifikante Verzögerung beim Auftreten des Tumors (50% der Tumor tragenden Mäuse am Tag 15 im Vergleich zu 100% der Tumor tragenden Mäuse am Tag 15 in den unbehandelten Kontrollen). Die Kombination von Ro61 plus pGlcNAc führte zu einem verzögerten Tumorauftreten (50% der Tumor tragenden Mäuse am Tag 13) sowie zu 10% tumorfreien Tieren am Tag 21 nach der Tumorinjektion, was nahe legt, dass die verzögerte Freisetzung von Ro61 in einem getrennten Raum vom Tumor das B16-Melanomwachstum signifikant beeinflussen kann. Es gab keine Unterschiede bei Tumorerscheinung und -wachstum zwischen der unbehandelten Kontrollgruppe und der IP-p-GlcnNAc-Gruppe.
Mittels des oben beschriebenen Karzinomatose-Modells wurde die Wirkung von verschiedenen anderen Endothelinantagonisten auf die B16-Tumorkoloniebildung eingeschätzt. In diesen Experimenten wurden den Tieren 100 μl Proben enthaltend 14,3 mg/ml von jedem Medikament oder Medikamentengemisch in einer einzigen Dosis injiziert. Wie in der 15 veranschaulicht, reduzierte ein Gemisch aus BQ123 (einem ETA-Antagonist) und BQ788 (einem ETB-Antagonist) in einer Endkonzentration gleich der von Ro61 (einem ETA- und ETB-Antagonist) signifikant die Zahl der Tumorkolonien um ein Ausmaß, ähnlich dem durch Ro61 gezeigten, im Vergleich zu den unbehandelten B16-Kontrollzellen. Außerdem wurde, wenn das BQ-Gemisch mit p-GlcNAc, wie oben beschrieben, kombiniert wurde, die Zahl der Tumorkolonien weiter gesenkt, und zwar auf ein Ausmaß, das in etwa dem bei Ro61 plus p-GlcNAc beobachteten entspricht. Schließlich zeigte der gemischte ETA/ETB-Antagonist GRGDS, ein im Handel erhältliches Pentapeptid (American Peptide Co.), in Kombination mit p-GlcNAc ein noch größeres Sinken der Tumorkoloniezahl als Ro61/p-GlcNAc (siehe die 15, letzte Spalte).
14. BEISPIEL: LANGZEITÜBERLEBENSRATE VON C57BL/6-MÄUSEN NACH INTRAPERITONEALER B16-MELANOMPROVOKATION MIT EINEM ENDOTHELINANTAGONIST ALLEIN ODER EINER EA/p-GlcNAc- ZUSAMMENSETZUNG DER ERFINDUNG
Wir bewerteten auch die Endothelinantagonismustherapie bei Langzeitüberlebensexperimenten in vivo. Die Ergebnisse sind in der 16 gezeigt. Weiblichen C57BL/6-Mäusen wurden intraperitoneal 5 × 10⁴ B16-Zellen in 100 ml HBSS injiziert. Die Tiere wurden für eine der folgenden Behandlungen willkürlich in 4 Gruppen eingeteilt: (a) keine Behandlung (schwarze Kästchen); (b) 100 μl p-GlcNAc-Gel allein (Kreuze); (c) 100 μl täglich HBSS enthaltend 3 mg/kg Ro61 (schwarze Dreiecke); oder (d) 100 μl p-GlcNAc-Gel enthaltend 3 mg/kg Ro61 (weiße Kästchen). Die Tiere wurden täglich überwacht und wenn sie dem Tode geweiht waren, aus humanen Gründen geopfert.
Es ist interessant festzuhalten, dass das B16-Melanom ein äußerst virulenter Tumor ist, der durchweg innerhalb von 19–20 Tagen nach Tumorinjektion zu einer Überlebensrate von 0% führt. Wie in der 10 gezeigt, verzögerte die Injektion von p-GlcNAc allein den Tod um 5 Tage, erhöhte aber nicht die Überlebensrate der Tiere. Allerdings verzögerte auch die Kombination von p-GlcNAc und Ro61 in niedriger Dosis (3 mg/kg) den Tod und 33% der Tiere zeigten am Tag 33 nach der Tumorinjektion kein Anzeichen für einen Tumor. Die täglichen Injektionen derselben niedrigen Dosis von Ro61 allein beeinflussten nicht das Überleben der Mäuse.
15. DISKUSSION DER ERGEBNISSE
Die hier geführten Studien beweisen direkt, das eine Hemmung der Bindung von Endothelinen an ihre Rezeptoren die normale Proliferation einer Maus-Melanomzelllinie sowohl in vitro als auch in vivo beeinflussen kann. Zum Beispiel ist der Endothelinantagonist Ro61 ein Hemmen sowohl für ETA- als auch ETB-Rezeptoren mit einer etwa 10-fach höheren Affinität für ETA. Dies korreliert gut mit der dosisabhängigen Hemmung der Melanomzellproliferation durch Ro61 in unseren Experimenten sowie dem stärkeren entgegenwirkenden Effekt auf diese Hemmung, die durch Zugabe eines ETA-Agonisten im Gegensatz zu einem ETB-Agonisten erzielt wird. Darüber hinaus sind auch zahlreiche andere Endothelinantagonisten als die Melanomzellproliferation hemmend gezeigt worden, einschließlich sowohl der ETA- als auch ETB-spezifische Agonist, z.B. BQ123, BQ485, BQ610, BQ788, RES und IRL.
Es ist interessant festzuhalten, dass, wie gezeigt wurde, Melanomzellen hohe Niveaus an ET-Rezeptoren exprimieren und gegenüber einer Endothelinantagonisthemmung empfänglicher sind als normale Splenozyten, die bekanntermaßen viel niedrigere Membran-ET-Rezeptoren aufweisen. Daher deuten die hier vorgelegten Beweise darauf hin, dass Endothelinantagonisten, wie beispielsweise Ro61, BQ123, BQ485, BQ610, BQ788, RES und IRL eine anti-proliferative Wirkung auf Tumorzellen in der Kultur haben, wobei die Hemmung des Tumorzellwachstums durch die Bindung an Endothelinrezeptoren vermittelt wird, die auf die für ETA und/oder ETB spezifischen Peptidagonisten reagieren.
Darüber hinaus zeigen unsere Untersuchungen, dass Endothelinantagonisten allein oder in Kombination mit dem hier beschriebenen p-GlcNAc eine Karzinomatose in vivo signifikant verringern. Außerdem erhöhen die EA/p-GlcNAc-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung z.B. Ro61/p-GlcNAc, drastisch die Überlebensrate von Tumorzellen tragenden Tieren in vivo. Die Wirkung von Ro61 scheint einen apoptotischen Wirkmechanismus zu umfassen, der einigen der bekannten Wirkmechanismen von Endothelinen und ihren Signalweitergabemechanismen nicht widerspricht.
Pharmakokinetische Studien mit Ro61 zeigen, dass es relativ schnell in vivo metabolisiert wird, z.B. innerhalb von 2 bis 4 Stunden; allerdings wird, wenn Ro61 mit dem p-GlcNAc-Polymer der vorliegenden Erfindung kombiniert wird, das Ro61 in dem Gel zurückgehalten und langsamer freigesetzt und kann z.B. mindestens 48 Stunden lang festgestellt werden. Weiterhin kann, wenn die Konzentration des Endothelinantagonisten in dem Gel erhöht wird, der Antagonist in dem Gel mindestens 72 Stunden lang (Daten nicht gezeigt) zurückgehalten werden. Daher kann durch Modifizieren der Konzentration des Endothelinantagonisten in dem p-GlcNAc der Erfindung die gewünschte langsame Freisetzung des Antagonisten und so eine erhöhte Wirkung desselben bei der Behandlung einer proliferativen Erkrankung erhalten werden.
Schließlich reagieren, wie in der Tabelle 4 unten gezeigt, auch andere Zelltypen, die den ETA-Rezeptor exprimieren, auf den Endothelinantagonisten Ro61, wie hier beschrieben, d.h. sie zeigen eine Hemmung der Zellproliferation nach Aussetzen dem Endothelinantagonisten. Diese Daten setzen in unterschiedlichen Zelltypen das Vorhandensein von z.B. dem ETA-Rezeptor mit der Wirkung der Endothelinantagonisten bei Zellproliferation in Beziehung. Zum Beispiel zeigen diese Ergebnisse, dass, wenn ein Tumor, wie beispielsweise ein Pankreas-, Brust- oder Prostatatumor den ETA-Rezeptor exprimiert, er mit einem ETA-empfindlichen Endothelinantagonisten, wie hier offenbart, behandelt werden kann.
Tabelle 4
Die vorliegende Erfindung soll nicht in ihrem Umfang durch die speziellen, hier beschriebenen Ausführungsformen beschränkt sein, die als einzelne Veranschaulichungen von individuellen Aspekten der Erfindung dienen sollen, und funktionell äquivalente Verfahren und Komponenten liegen im Umfang der Erfindung. In der Tat werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier gezeigten und beschriebenen dem Fachmann aus der vorangehenden Beschreibung und den begleitenden Zeichnungen deutlich. Solche Modifikationen sollen unter den Umfang der beigefügten Ansprüche fallen.

Claims

Antitumorzusammensetzung umfassend mindestens einen Endothelinantagonisten in Kombination mit einem Poly-β-1-4-N-acetylglucosamin, wobei das Poly-β-1-4-N-acetylglucosamin etwa 4.000 bis etwa 150.000 N-Acetylglucosaminmonosaccharide umfasst, die kovalent in einer β-1-4-Konformation gebunden sind, frei von Protein und im Wesentlichen frei von anderen organischen oder anorganischen Verunreinigungen ist und ein Molekulargewicht von etwa 800.000 Dalton bis etwa 30 Millionen Dalton aufweist.
Antitumorzusammensetzung, umfassend mindestens einen Endothelinantagonisten in Kombination mit einem Poly-β-1-4-Glucosamin, wobei das Poly-β-1-4-Glucosamin etwa 4.000 bis etwa 150.000 Glucosaminmonosaccharide umfasst, die kovalent in einer β-1-4-Konformation gebunden sind, frei von Protein und im Wesentlichen frei von anderen organischen oder anorganischen Verunreinigungen ist und ein Molekulargewicht von etwa 640.000 Dalton bis etwa 24 Millionen Dalton aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Endothelinantagonist ein nicht spezifischer Endothelinantagonist ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Endothelinantagonist ein ETA-spezifischer Endothelinantagonist ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Endothelinantagonist ein ETB-spezifischer Endothelinantagonist ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Endothelinantagonist ein auf einem Peptid basierender Endothelinantagonist ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Endothelinantagonist ein nicht auf einem Peptid basierender Endothelinantagonist ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei der nicht auf einem Peptid basierende Endothelinantagonist eine Pyrimidylsulfonamidverbindung ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die Pyrimidylsulfonamidverbindung Ro61 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Poly-β-1-4-N-acetylglucoasmin ein Poly-β-1-4-N-Acetylglucosaminderivat umfasst, wobei mindestens ein N-Acetylglucosaminmonosaccharid deacetyliert wurde.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das deacetylierte Monosaccharid zu einem Laktatsalz derivatisiert wurde.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei mindestens etwa 25% bis etwa 75% der N-Acetylglucosaminmonosaccharide deacetyliert wurde.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, 10 oder 11, wobei das Poly-β-1-4-N-acetylglucosamin als Gel formuliert wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 10, wobei das Poly-β-1-4-N-acetylglucosamin eine Matte, Schnur, ein Strang, eine Membran, Faser oder ein Schwamm ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei der Endothelinantagonist in dem Poly-β-1-4-N-acetylglucosamingel gelöst ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Poly-β-1-4-Glucosamin zu einem Laktatsalz derivatisiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder 16, wobei das Poly-β-1-4-glucosamin als Gel formuliert wurde.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Poly-β-1-4-glucosamin eine Matte, Schnur, ein Strang, eine Membran, Faser oder ein Schwamm ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei der Endothelinantagonist in dem Poly-β-1-4-glucosamingel gelöst ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei der Endothelinantagonist Ro61 ist und das Poly-β-1-4-glucosamingel ein 2%iges Gel ist.
Verwendung von mindestens einem Endothelinantagonisten in Kombination mit einem Poly-β-1-4-N-acetylglucosamin, wobei das Poly-β-1-4-N-acetylglucosamin etwa 4.000 bis etwa 150.000 N-Acetylglucosaminmonosaccharide umfasst, die kovalent in einer β-1-4-Konformation gebunden sind, frei von Protein und im Wesentlichen frei von anderen organischen oder anorganischen Verunreinigungen ist und ein Molekulargewicht von etwa 800.000 Dalton bis etwa 30 Millionen Dalton aufweist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei einem Verfahren zum Behandeln einer proliferativen Erkrankung, die das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge davon an einen Patienten umfasst.
Verwendung von mindestens einem Endothelinantagonisten in Kombination mit einem Poly-β-1-4-glucosamin, wobei das Poly-β-1-4-glucosamin etwa 4.000 bis etwa 150.000 Glucosaminmonosaccharide umfasst, die kovalent in einer β-1-4-Konformation gebunden sind, frei von Protein und im Wesentlichen frei von anderen organischen oder anorganischen Verunreinigungen ist und ein Molekulargewicht von etwa 640.000 Dalton bis etwa 24 Millionen Dalton aufweist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei einem Verfahren zum Behandeln einer proliferativen Erkrankung, die das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge davon an einen Patienten umfasst.
Verwendung nach Anspruch 21 oder 22, wobei die proliferative Erkrankung Krebs ist.