ES2242448T3

ES2242448T3 - Metodos y composiciones para el tratamiento de trastornos proliferativos celulares.

Info

Publication number: ES2242448T3
Application number: ES99968523T
Authority: ES
Inventors: John N. Vournakis; Sergio Finkielsztein; Ernest R. Pariser
Original assignee: Marine Polymer Technologies Inc
Current assignee: Marine Polymer Technologies Inc
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-21
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2019-12-21
Also published as: WO2000036918A1; NO330033B1; HK1043507A1; DE69925156T2; CA2356087A1; CN1335749A; NO20013071L; JP2003522732A; AU780248B2; ATE294504T1; CA2356087C; EP1139752A1; US6063911A; JP4795539B2; IL143700A; WO2000036918A9; EP1139752A4; HK1043507B; EP1139752B1; AU2591900A

Abstract

Una composición antitumoral que comprende al menos un antagonista de endotelina combinado con una poli/-1-4-N-acetilglucosamina, comprendiendo dicha poli-/-1-4-N-acetilglucosamina aproximadamente 4.000 a aproximadamente 150.000 monosacáridos de N-acetilglucosamina unidos covalentemente en una conformación /-1-4 libre de proteína, sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos o inorgánicos, y que tiene un peso molecular de aproximadamente 800.000 daltons a aproximadamente 30 millones de daltons.

Description

Métodos y composiciones para el tratamiento de trastornos proliferativos celulares.

1. Introducción

La presente invención se refiere a métodos y composiciones que comprenden al menos un antagonista de endotelina combinado con una matriz de polisacárido de poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina (p-GlcNAc), para usar en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades proliferativas. Más específicamente, el antagonista de endotelina de la invención puede ser un compuesto peptídico o no peptídico, y la matriz de p-GlcNAc de la invención está compuesta de un polímero de alto peso molecular cuyos azúcares monosacáridos constituyentes están unidos en una conformación \beta-1-4, y la cual está libre de proteínas, y sustancialmente libre de aminoácidos sencillos, ni otros contaminantes orgánicos e inorgánicos. Las composiciones y métodos de la invención son útiles para inhibir el crecimiento de tumores y otras células neoplásicas y/o para inhibir la metástasis de células neoplásicas in vivo.

2. Antecedentes de la invención

Las endotelinas son una familia de péptidos de 21 aminoácidos, por ejemplo, ET-1, ET-2 y ET-3, que en principio se caracterizan por sus potentes propiedades vasoconstrictoras y angiogénicas (véase, por ejemplo, Luscher y col., 1995, Agents Actions Suppl. (Suiza) 45: 237-253; Yanagisawa y col., 1988, Nature 332: 411-415).

Además parece que estos péptidos están relacionados con factores de crecimiento tales como bFGF, y a menudo actúan de forma sinérgica con ellos (véase, p. ej., Halaban, 1996, Seminars in Oncology 23: 673-681; Reid y col., 1996, Development 122: 3911-3919; Markewitz y col., 1995, Am. J. Physiol. 268: L192-L200; y Nelson y col., 1996, Cancer Res. 56: 663-668). Además, estos péptidos presentan propiedades reguladoras de tipo citoquina y pueden influir en ellos hormonas tales como la insulina y la angiotensina II, así como factores de crecimiento tales como TGF-\beta y TNF-\alpha (Nelson y col., véase antes; Suzuki y col., 1989, J. Biochem. 106: 736-741; y Lundblad y col., 1996, Crit. Care Med. 24: 820-826). La actividad de la endotelina es mediada por la unión, con afinidades preferentes, a dos receptores acoplados a proteínas G distintos, ETA y ETB, de una forma autocrina/paracrina (véase, p. ej., Hocher y col., 1997, Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 35(3): 175-189; Shichiri y col., 1991, J. Cardiovascular Pharmacol. 17:S76-S78).

Hay una variedad de agonistas y antagonistas de receptores de endotelina (Webb y col., 1997, Medicinal Research Reviews 17 (1): 17-67), que se han usado para estudiar el mecanismo de acción de las endotelinas. Debido a que se sabe que la endotelina tiene una potente actividad vasoconstrictora, los antagonistas de endotelina en particular (también denominados "antagonistas del receptor de endotelina" en la técnica) se han estudiado en relación con su posible papel en el tratamiento de enfermedades humanas, más concretamente, enfermedades cardiovasculares tales como la hipertensión, insuficiencia cardiaca congestiva, ateroesclerosis, reestenosis e infarto de miocardio (Mateo y col., 1997, Pharmacological Res. 36 (5): 339-351). Por ejemplo, actualmente se están sometiendo a evaluación clínica antagonistas de endotelina no basados en péptidos que pertenecen a la familia de la pirimidinil-sulfonamida, tales como Ro 46-2005 y bosentán, que interaccionan con el receptor de endotelina a través de sus anillos aromáticos, para el tratamiento de la hipertensión, enfermedad vascular, e insuficiencia cardiaca congestiva. Estos antagonistas se pueden unir tanto a ETA como a ETB con diferentes afinidades, y tienen ventajas frente a los antagonistas basados en péptidos, porque tienen una mayor estabilidad metabólica (Webb y col., véase antes; y Parris y col., véase antes). Además, también se han estudiado los antagonistas de endotelina en relación con su posible papel en el tratamiento de enfermedades renales tales como la función renal deteriorada en cirrosis hepática e insuficiencia renal aguda (Gómez-Garre y col., 1996, Kidney Int. 50: 962-972; Hocher y col., véase antes).

Más recientemente, se ha implicado a las endotelinas y receptores de endotelina en una serie de procedimientos de crecimiento celular normal y patológico, por ejemplo, evolución del ciclo celular, crecimiento celular, y desarrollo celular (véase, p. ej., Parris y col., 1997, Vascular Medicine 2: 31-43; Markewitz y col., véase antes; Morbidelli y col., 1995, Am. J. Physiol. 269: H686-H695; y Battistini y col. 1993, Peptides 14: 385-399). Se ha mostrado que ET1 y ET3 son factores mitógenos y quimiocinéticos para los tejidos normales que van de las células endoteliales y epiteliales a macrófagos (véase, p. ej., Webb y col., 1997, Medicinal Research Reviews 17 (1): 17-67; y Gomez-Garre y col., véase antes). Además, se ha mostrado que la unión de las endotelinas a sus receptores produce la síntesis de ADN, proliferación y movilización celular en células normales y neoplásicas (Webb y col., véase antes; Ziche y col., 1995, Cardiovasc. Pharmacol. 26: S284-S286; y Yamashita y col., 1991, Res. Comm. in Chem. Pathol. and Pharmacol. 74 (3): 363-369).

Esta capacidad potencial de las endotelinas para mediar el crecimiento celular y la evolución del ciclo celular ha conducido a algunos estudios iniciales de la expresión de la endotelina y/o la presencia del receptor de endotelina en células cancerígenas. Por ejemplo, se ha mostrado que ET-1 es sobreexpresado en el cáncer de mama y líneas celulares pancreáticas e induce la proliferación en el tejido de cáncer de mama, líneas celulares de ovario y tumores de próstata (véase, p. ej., Moriatis y col., 1997, Eur. J. Canc. 33 (4): 661-668; Nelson y col., 1996, Cáncer Res. 56: 663-668; Patel y col., 1995, Br. J. Cáncer 71: 442-447; Oikawa y col., 1994, Br. J. Cáncer 69:55 1059-1064; Shichiri y col., véase antes; y Yamashita y col., véase antes). Además, se ha demostrado la presencia de receptores de tipo ETA, que tienen una afinidad mayor por ET1 y ET2, en líneas celulares de ovario (Moriatis y col., véase antes) y tejidos de cáncer de mama (Yamashita y col., véase antes). Uno de los pocos tumores que expresan receptores ETB que tienen una afinidad similar por las tres isoformas de la endotelina es el melanoma (Yohn y col., 1994, Biochem. Biophys. Res. Comm. 201 (1): 449-457). Es interesante que los receptores ETB son altamente expresados en melanomas primarios o recurrentes pero menos en melanomas metastáticos (Kikuchi y col., 1996, Biochem. Biophys. Res. Comm. 219: 734-739).

Aunque estos estudios sugieren que los antagonistas de endotelina podrían tener potencialmente aplicaciones terapéuticas en el tratamiento del cáncer, hasta la fecha no ha habido estudios que demuestren ninguna de dichas aplicaciones terapéuticas. De hecho, no está claro el papel que puede jugar la endotelina en promover la enfermedad proliferativa tal como diferentes enfermedades proliferativas vasculares e hipertrofia prostática benigna (HPB) (Webb y col., véase antes y Kenny y col., 1997, J. Med. Chem. 40 (9): 1293-1315). Además, aunque las patentes de Estados Unidos 5.550.110 y 5.641.752 describen el uso de antagonistas de endotelina hexapeptídicos específicos para el tratamiento del cáncer, realmente no hay datos en estas descripciones relativos al tratamiento del cáncer, ni indicaciones de como llevar a cabo dicho tratamiento, o si realmente dicho tratamiento tendría éxito (véase también, solicitudes PCT WO 97/37987, 97/08169, WO 96/11927, y WO 94/03483, solicitud de patente canadiense 2072395, y patente de Estados Unidos 5.658.943).

El documento WO-A-9639122 describe diferentes compuestos antitumorales que se pueden encapsular con fibras de p-GlcNAc para las composiciones de suministro lento del fármaco. Dichos compuestos antitumorales incluyen agentes alquilantes, antimetabolitos, compuestos sintéticos, productos terapéuticos hormonales, fármacos de investigación, productos biológicos y potenciadores de la radiación.

Los compuestos antagonistas de endotelina y los métodos para usar dichos compuestos para tratar los trastornos relacionados con la endotelina se describen con más detalle en los documentos WO-A-9619459 y US-A-5571821.

3. Resumen de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para tratar trastornos proliferativos celulares tales como el cáncer. Más específicamente, la invención se refiere a composiciones que comprenden al menos un antagonista de endotelina combinado con una matriz de polisacárido de poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina (p-GlcNAc), para usar en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades proliferativas. La presente invención se basa en parte, en el descubrimiento de los autores de la invención, de que cuando se administra un antagonista de endotelina in vivo, solo con dosis altas o combinado con una matriz de polisacárido, se inhiben significativamente el crecimiento de las células tumorales y/o el crecimiento de metástasis de células neoplásicas.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, el antagonista de endotelina es un compuesto de pirimidil-sulfonamida no basado en péptido, tal como el representado en la siguiente figura I.

1

El compuesto de la Figura I es una sal de sodio (1:2) de la [6-(2-hidroxi-etoxi)-5-(2-metoxi-fenoxi)-2-[2-(1H-tetrazol-5-il)-piridin-4-il]-pirimidin-4-il]amida del ácido 5-isopropil-piridina-2-sulfónico, también denominada en el presente documento "Ro61" y tiene un peso molecular de aproximadamente 650 kDa, Es un inhibidor no específico y no peptídico de ambos receptores de endotelina, ETA y ETB.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, la matriz de polisacárido es una matriz de polisacárido de poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina (p-GlcNAc), o uno de sus derivados, como se describe en la patente de Estados Unidos 5.635.493. La p-GlcNAc o sus derivados se pueden usar en diferentes reformulaciones, incluyendo membranas, filamentos, telas no tejidas, esponjas, geles y matrices tridimensionales. De acuerdo con una realización preferida, la p-GlcNAc está en forma de un gel, preferiblemente está desacetilada, y opcionalmente derivatizada a una sal de p-GlcNAc-lactato, y se combina con Ro61 para la administración in vivo.

Las composiciones de la invención son útiles para los sistemas de suministro de fármacos, por ejemplo, el suministro de fármaco de liberación lenta. Las composiciones de la invención son una mejora frente a las formulaciones de fármacos tradicionales, en cuanto que las composiciones de la invención proporcionan, por ejemplo, mayor eficacia, menor toxicidad y mejor biodisponibilidad.

Los métodos de la invención comprenden la administración de cantidades terapéuticamente eficaces de las composiciones de la invención in vivo, para tratar enfermedades proliferativas celulares tales como el cáncer, en un animal, incluyendo seres humanos. De acuerdo con una realización de la invención, se disuelve al menos un antagonista de endotelina, tal como Ro61, en un gel de p-GlcNAc-lactato desacetilada, y se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz, a un paciente in vivo, para tratar el cáncer u otras enfermedades o trastornos proliferativos. Una realización particular de la invención comprende la administración in vivo de un antagonista de endotelina no basado en péptidos tal como un antagonista de endotelina de pirimidil-sulfonamida, para tratar el cáncer u otras enfermedades o trastornos proliferativos. Las composiciones y métodos de la invención son útiles para inhibir el crecimiento de tumores y/o de otras células neoplásicas, y/o inhibir la metástasis de células neoplásicas in vivo.

4. Breve descripción de las figuras

Fig. 1. Estructura química de la p-GlcNAc 100%. "n" se refiere a un número entero en el intervalo de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 150.000, siendo preferido de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 15.000.

Fig. 2. Análisis de carbohidratos de p-GlcNAc, datos de cromatografía de gases-espectrometría de masas. Los cuadrados negros representan la p-GlcNAc purificada usando el procedimiento de tratamiento con ácido/neutralización, descrito en la Sección 5.1, véase más adelante.

Fig. 3. Micrografía electrónica de barrido que representa una membrana de p-GlcNAc preparada por la variación de tratamiento con ácido/neutralización del procedimiento de purificación químico/biológico. Aumento: 10.000x.

Fig. 4. Diagrama que representa algunos de los posibles derivados de p-GlcNAc y p-GlcNAc desacetilada de la invención (adaptado de S. Hirano, en "Chitin and Chitosan", 1989, Skjak-Braek, Antonsen, and Sanford, eds., Elsevier Science Publishing Co., pp. 37-43).

Figs. 5A y 5B. Micrografías electrónicas de barrido de una matriz de p-GlcNAc desacetilada. Aumento: Fig. 5A: 1000x; Fig. 5B: 10.000x.

Figs. 6A y 6B. Micrografías electrónicas de barrido de una membrana de p-GlcNAc disuelta en dimetilacetamida/cloruro de litio y vuelta a precipitar en agua en un material fibroso, como se describe en la Sección de Ejemplo 8, véase más adelante.

Fig. 7. Inhibición de la proliferación celular de melanoma B16 por el antagonista del receptor de endotelina Ro61, in vitro. Ro61 se añadió con concentraciones crecientes a una placa de cultivo de 96 pocillos a las que después se añadieron células B16 (círculos negros) y esplenocitos (círculos blancos) de ratones C57BL/6 (H-2b). La proliferación de las células tratadas con Ro61 se expresa como un porcentaje de células control no tratadas. Se determinaron los valores medios de los pocillos por triplicado.

Fig. 8. Gráficos de barras que indican el porcentaje de proliferación de células de melanoma B16 respecto a controles no tratados, tras exposición de las células a diferentes antagonistas de endotelina. Los resultados indican una inhibición de la proliferación tras exposición de las células a los antagonistas de endotelina. Las células FO son células B16 control que carecen de un receptor ETA de longitud completa; el gráfico de barras marcado como ET1 representa un control, en el que las células fueron expuestas a un agonista de endotelina conocido.

Fig. 9. Gráficos de barras que indican el porcentaje de proliferación de células de melanoma B16 respecto a controles no tratados, tras exposición de las células a diferentes antagonistas de endotelina. Los resultados indican una inhibición de la proliferación tras exposición a los antagonistas de endotelina. Las células FO son células B16 control que carecen de un receptor ETA de longitud completa; los gráficos de barras marcados como ET1 y BQ3020 representan controles, en los que las células son expuestas a dos agonistas de endotelina conocidos.

Fig. 10. Inversión de la inhibición por Ro61 de los agonistas de ETA y ETB de la proliferación de células de melanoma B16 in vitro. Se cultivaron células B16 con el agonista BQ-3020-[Ac-[Ala11,Ala15]-endotelina(6,21) (triángulos negros), agonista [Ala^{1,3,11,15}]-endotelina-1 (rombos blancos), ambos agonistas (cuadrados blancos) o ninguno (círculos negros), y después se añadió Ro61 a cada pocillo. La proliferación de las células tratadas con Ro61 se expresa como un porcentaje de las células control no tratadas. Se determinaron los valores medios de los pocillos por triplicado.

Figs. 11A y 11B. Efecto de Ro61 en las células B16 en cultivo. Micrografía óptica de células B16 con aumento 40x. Fig. A: células B16 cultivadas en placas de 96 pocillos con 5x10^{4} células/pocillo durante 72 horas a 37ºC en medio completo; Fig. B: células B16 cultivadas en medio completo que contiene Ro61 5 \muM.

Fig. 12. Ro61 induce apoptosis. Se ensayó la apoptosis de células B16 con un kit de detección de muerte celular in situ con fluoresceína, después de cultivarlas con medio común (control) o R061 (1 \muM) (\ding{110}) durante 0, 24, 48 y 72 horas a 37ºC.

Figs. 13A y 13B. Inhibición por Ro61 de carcinomatosis intraperitoneal. La Fig. 13A representa el efecto de Ro61 IP en la carcinomatosis intraperitoneal de B16. Se inyectó en ratones hembra C57BL/6 por vía IP 5 x 10^{4} células de melanoma B16. Al día siguiente, se inyectó a los animales 100 \mul de: diario x 6 HBSS (control), diario x 6 HBSS que contenía 3 mg/kg de Ro61 (dosis baja), diario x 6 HBSS que contenía 30 mg/kg de Ro61 (dosis alta). La Fig. 13B muestra el efecto del suministro con p-GlcNAc de Ro61. Los animales se estimularon con tumor como en la Fig. 13A, y al día siguiente se trataron con 100 \mul de gel de p-GlcNAc inyectado por vía IP, SC o IP, con 18 mg/kg de Ro61 (IP+Ro61). Después de 7 días, los animales se sacrificaron y se evaluó la presencia de colonias de B16. Los valores representan el número medio de colonias visibles y el error típico para cada grupo (n = 11 para todos los grupos, excepto para el grupo sin tratamiento, n = 13).

Fig. 14. Aparición retrasada del tumor en ratones C57BL/6 tratados con Ro61 después de estimulación subcutánea de tumor de melanoma B16. A los ratones hembra C57BL/6 se les inyectó por vía SC 5 x 10^{4} células de melanoma B16. Al día siguiente, los animales se separaron aleatoriamente en 4 grupos: sin tratamiento (\ding{115}), una inyección IP de gel de p-GlcNac solo (O), inyecciones IP diarias de 3 mg/kg (durante 6 día), Ro61 en HBSS (\boxempty), una inyección IP de gel de p-GlcNAc que contiene 18 mg/kg de Ro61 (\ding{110}). Se controló en los animales la presencia del tumor durante 3 semanas (n = 10 en todos los grupos).

Fig. 15. Efecto de inhibición de diferentes antagonistas de endotelina en la aparición de colonias tumorales B16 usando el modelo de carcinomatosis descrito más adelante. F10 representa las células control B16 no tratadas; mezcla de BQ representa una mezcla del antagonista de ETA, BQ123 y el antagonista de ETB, BQ788; mezcla de BQ/gel representa una mezcla de BQ123 y BQ788 combinado con el gel de p-GlcNAc descrito más adelante; Ro61 es el antagonista de endotelina ETA/ETB no específico descrito más adelante; Ro61/gel es Ro61 combinado con p-GlcNAc; y GRGDS/gel es una combinación del antagonista de endotelina peptídico de ETA/ETB GRGDS combinado con p-GlcNAc.

Fig. 16. Supervivencia a largo plazo de ratones C57BL/6 tratados con Ro61 después de estimulación con melanoma B16 por vía intraperitoneal. Se inyectaron a los ratones C57BL/6 por vía intraperitoneal células B16. Los animales se separaron aleatoriamente en 4 grupos para cada uno de los siguientes tratamientos: (a) sin tratamiento (cuadrados negros); (b) 100 \mul de gel de p-GlcNAc solo (cruces); (c) 100 \mul de HBSS diario que contienen 3 mg/kg de Ro61 (triángulos negros); o (d) 100 \mul de gel de p-GlcNAc que contiene 18 mg/kg de Ro61 (cuadraros blancos). Los animales se controlaron diariamente y se sacrificaron por razones humanitarias cuando se determinó que estaban moribundos.

Figs. 17A y 17B. Fotomicrografías de la morfología celular de las células B16 tratadas con Ro61 (Fig. 17A) y no tratadas (Fig. 17B) con aumento 40X; Ro61 10^{-7} M, 10^{5} células.

5. Descripición detallada de la invención

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden al menos un antagonista de endotelina combinado con una matriz de polisacárido de poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina (p-GlcNAc), y a métodos para usar estas composiciones en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades proliferativas. Los antagonistas de endotelina de acuerdo con esta invención, pueden ser específicos o no específicos para los receptores ETA o ETB, o compuestos basados en péptidos o compuestos no basados en péptidos. De acuerdo con una realización preferida de la invención, el antagonista de endotelina es un antagonista de endotelina no específico y no basado en péptido. De acuerdo con otra realización preferida, el antagonista de endotelina es un compuesto de pirimidil-sulfonamida no basado en péptido, tal como el compuesto Ro61 representado en la siguiente figura I.

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De acuerdo con la presente invención, al menos un tipo de antagonista de endotelina, solo o combinado con uno o más agentes antitumorales distintos, se une covalentemente o no covalentemente, o combina con la p-GlcNAc descrita con detalle en la Sección 5.1, véase más adelante. De acuerdo con una realización preferida de la invención, se disuelve al menos un antagonista de endotelina, tal como Ro61, en un gel de p-GlcNAc desacetilada para formar una composición de antagonista de endotelina ("EA")/p-GlcNAc de la invención. De acuerdo con una realización preferida adicional, la p-GlcNAc desacetilada se derivatiza con ácido láctico para formar una sal de p-GlcNAc-lactato.

Como se define en el presente documento, la expresión "antagonista de endotelina" incluye antagonistas del receptor de endotelina, y "composiciones de EA/p-GlcNAc" incluye composiciones en las que al menos un tipo de antagonista de endotelina se une covalentemente a la p-GlcNAc o no se une covalentemente, se mezcla con o encapsula dentro de la p-GlcNAc. Las composiciones de la invención pueden comprender adicionalmente otros agentes antitumorales, que combinados con el antagonista de endotelina actúan para inhibir el crecimiento y/o metástasis del tumor u otras células neoplásicas. Como se define en el presente documento, "agente antitumoral" incluye cualquier compuesto que inhibe el crecimiento o metástasis de células tumorales, células cancerosas, o cualquier otro tipo de célula neoplásica.

Esta invención se basa en parte, en el descubrimiento de los autores de la invención, de que los antagonistas de endotelina combinados con la p-GlcNAc descrito en el presente documento, inhiben la proliferación de células neoplásicas in vitro y disminuyen la metástasis y/o aumentan la supervivencia de animales que portan células tumorales in vivo (véase las secciones de Ejemplos 12 a 16, véase más adelante). Además, la p-GlcNAc sola de esta invención tiene un efecto inhibidor en la metástasis y crecimiento celular neoplásico in vivo.

Por lo tanto, de acuerdo con los métodos de esta invención, las composiciones farmacéuticas que comprenden EA/p-GlcNAc de la invención, se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz a un paciente in vivo, para tratar el cáncer u otras enfermedades proliferativas. Una realización preferida de la invención comprende la administración in vivo de un antagonista de endotelina, por ejemplo, un antagonista de endotelina de pirimidil-sulfonamida para el tratamiento de la enfermedad proliferativa.

Sólo para facilitar la descripción, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones: (1) La p-GlcNAc de las composiciones y métodos de la invención; (2) Antagonistas de endotelina de las composiciones y métodos de la invención; (3) Formulaciones preferidas de las composiciones de la invención; y (4) Usos de las composiciones y métodos de la invención.

5.1. La p-GlcNAc de las composiciones de la invención

La matriz de polisacárido de p-GlcNAc que se va a usar en las composiciones y métodos de esta invención, comprende un polímero de alto peso molecular en el intervalo de un peso medio de aproximadamente 800.000 daltons a aproximadamente 30 millones de daltons, basándose en las mediciones de cromatografía de gel permeable. Dicho intervalo de peso molecular representa una especie de p-GlcNAc que tiene de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 150.000 monosacáridos de N-acetilglucosamina unidos en una configuración \beta-1-4, siendo preferido de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 15.000 monosacáridos de N-acetilglucosamina (Figura 1).

La variabilidad de la p-GlcNAc es muy baja, y su pureza es muy alta, los cuales se ponen ambos de manifiesto por criterios químicos y físicos. Entre estos están la composición química y los contaminantes no polisacáridos. Primero, los datos de la composición química para la p-GlcNAc producida usando dos procedimientos de purificación diferentes se muestran a continuación en la Tabla I. Como puede verse, la composición química de la p-GlcNAc producida por ambos procedimientos está dentro de los límites del error experimental, al igual que las composiciones formuladas de la p-GlcNAc. Segundo, como puede verse también en la Tabla I, la p-GlcNAc producida está libre de contaminantes proteicos detectables, está sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos tales como aminoácidos libres, y está sustancialmente libre de contaminantes inorgánicos, tales como cenizas e iones metálicos (la p-GlcNAc de la invención se puede desviar hasta aproximadamente el 2% de los valores teóricos de carbono, hidrógeno, nitrógeno y oxígeno de la p-GlcNAc pura). Por lo tanto, tal como se usa en el presente documento, las expresiones "sustancialmente libre de contaminantes orgánicos" y "sustancialmente libre de contaminantes inorgánicos" se refiere a composiciones de p-GlcNAc que tienen los perfiles de carbono, hidrógeno, nitrógeno y oxígeno que no se desvían más de aproximadamente 2% de los valores teóricos, y preferiblemente, la p-GlcNAc de la invención contiene un perfil, como se ejemplifica en los datos experimentales de las matrices de p-GlcNAc en la Tabla I (dentro del porcentaje de desviación). Además, la p-GlcNAc presenta un porcentaje muy bajo de agua unida.

TABLA I

Datos de análisis químicos (% en peso) Valores teóricos para la p-GlcNAc pura:
Carbono -	47,29
Hidrógeno -	6,40
Nitrógeno -	6,89
Oxígeno -	39,41
Proteína -	0,00

Datos experimentales de matrices de p-GlcNAc

	Procedimiento de fuerza mecánica	Método químico/biológico
	Normalizado	% Desv.	Normalizado^{1}	% Desv.
Carbono	47,21 \pm 0,08	-0,17	47,31 \pm 0,11	+0,04
Hidrógeno	6,45 \pm 0,08	+0,78	6,34 \pm 0,08	-0,94
Nitrógeno	6,97 \pm 0,18	+0,87	6,94 \pm 0,16	+0,73
Oxígeno	39,55 \pm 0,36	+0,36	39,41 \pm 0,10	0,00
	Valores medios	Valores medios
Proteína	0,00	0,00
Cenizas	1,30	0,98
Humedad	2,0	1,2
^{1} \begin{minipage}[t]{140mm} Los datos analíticos brutos se han normalizado para tener en cuenta el contenido de cenizas y humedad de las muestras. \end{minipage}

La p-GlcNAc de las composiciones de la invención presenta un perfil de análisis de carbohidratos sustancialmente similar al mostrado en la Figura 2. El monosacárido principal de la p-GlcNAc es la N-acetilglucosamina. Además, la p-GlcNAc no contiene el monosacárido glucosamina. Se describen con detalle otras características físicas de p-GlcNAc en la patente de Estados Unidos 5.635.493.

La p-GlcNAc de acuerdo con esta invención, presenta un grado alto de biocompatibilidad, el cual se puede determinar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitar, procedimientos tales como el ensayo de elución, implantación intramuscular, o inyección intracutánea o sistémica en sujetos animales. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.635.493 incorporada en el presente documento por referencia.

La p-GlcNAc se produce y se puede purificar de microalgas, preferiblemente diatomeas. Las diatomeas que se pueden usar como fuentes de partida para producir la p-GlcNAc incluyen, pero no se limitan, miembros del género Coscinodiscus, el género Cyclotella, y el género Thalassiosira, prefiriéndose el género Thalassiosira.

Del género Coscinodiscus, las especies de diatomeas que se pueden usar incluyen, pero no se limita, especies concinnus y radiatus. Entre las diatomeas del género Cyclotella que se pueden usar se incluyen, pero no se limitan, las especies caspia, cryptica y meneghiniana. Las diatomeas Thalassiosira que se pueden usar para producir el material de partida para la p-GlcNAc de esta invención incluyen, pero no se limita, las especies nitzschoides, aestivalis, antarctica, deciphens, eccentrica, floridana, fluviatilis, gravida, guillardii, hyalina, minima, nordenskioldii, oceanica, polychorda, pseudonana; rotula, tubifera, tumida y weissflogii, siendo las especies preferidas fluviatilis y weissflogii. Las diatomeas tales como las descritas antes se pueden obtener, por ejemplo, de la colección de cultivos del Bigelow Laboratory for Ocean Sciences, Center for Collection of Marine Phytoplankton (McKown Point, West Boothbay Harbor, Maine, 04575). Cualquiera de estas diatomeas se puede hacer crecer usando los métodos y el medio nutriente descrito en la patente de Estados Unidos 5.635.493.

Las fibras de p-GlcNAc se pueden obtener de cultivos de diatomeas tales como los descritos antes, mediante una serie de métodos diferentes. De acuerdo con el método de la fuerza mecánica, las fibras de p-GlcNAc se pueden separar de los cuerpos celulares de las diatomeas sometiendo el contenido del cultivo a una fuerza mecánica adecuada. Dicha fuerza mecánica puede incluir, pero no se limita, una fuerza de cizalladura generada, por ejemplo, con un molino coloidal, un dispositivo de ultrasonidos, o un generador de burbujas, o una fuerza cortante generada, por ejemplo, por una mezcladora Waring.

Después se separa la suspensión resultante de cuerpos celulares y fibras de p-GlcNAc de las diatomeas. Por ejemplo, la suspensión se puede someter a una serie de etapas de centrifugación que separan las fibras de p-GlcNAc de los cuerpos celulares, dando un líquido sobrenadante transparente que presenta poco, o nada, de material floculante visible. Para las etapas de centrifugación se prefiere un rotor de ángulo fijo y una temperatura de aproximadamente 10ºC. La velocidad, duración y número total de etapas de centrifugación necesarias pueden variar dependiendo, por ejemplo, del rotor de centrifugación específico que se usa, pero la determinación de los valores de dichos parámetros será evidente para un experto en la técnica.

Después, las fibras de p-GlcNAc en el líquido sobrenadante se pueden concentrar usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Dichas técnicas pueden incluir, pero no se limitan, dispositivos de succión y filtración. Finalmente, las fibras de p-GlcNAc concentradas se lavan, por ejemplo, con agua destilada-desionizada, HCl y etanol, u otros disolventes adecuados, preferiblemente disolventes tales como alcoholes, en los que se disuelvan los materiales tanto orgánicos como inorgánicos. Se expone un ejemplo que demuestra el uso de este procedimiento para purificar la p-GlcNAc en la Sección de ejemplo 6, véase más adelante.

De acuerdo con el método químico/biológico, las fibras de p-GlcNAc se separan de los cuerpos celulares de diatomeas sometiéndolas a agentes químicos y/o biológicos. Por ejemplo, los cultivos de diatomeas se pueden tratar con un producto químico capaz de debilitar las paredes celulares de las diatomeas, lo cual conduce a la liberación de las fibras de p-GlcNAc sin alterar su estructura. Dicho producto químico puede incluir, pero no se limita, ácido fluorhídrico (HF). Alternativamente, un cultivo de diatomeas maduro se puede tratar con un agente biológico capaz de alterar un proceso biológico, y se puede usar para inhibir la síntesis de fibras de p-GlcNAc, liberando así las fibras que ya están presentes. Por ejemplo, dicho agente puede incluir, pero no se limita, polioxina D, un inhibidor de la enzima N-acetilglucosaminil-P-transferasa.

Después se separan los cuerpos celulares y las fibras que contienen p-GlcNAc de los cultivos de diatomeas tratados con un miembro de los agentes químicos o biológicos antes descritos. Por ejemplo, el contenido de los cultivos de diatomeas tratados se puede dejar sedimentar de modo que se deja que el contenido de los cultivos forme dos capas distintas. La capa superior contendrá principalmente las fibras de p-GlcNAc, mientras que la capa inferior contendrá los cuerpos celulares. La capa superior que contiene las fibras de p-GlcNAc se puede sifonar, dejando detrás el material celular sedimentado de la capa inferior. Después, la capa sifonada que contiene las fibras de p-GlcNAc se puede purificar más para separar las proteínas y otros materiales no deseados por tratamiento con un detergente que no dañe las fibras de p-GlcNAc. Dicho detergente puede incluir, pero no se limita, dodecilsulfato sódico
(SDS).

Cuando se usa el tratamiento con ácido, tal como el tratamiento con HF, para separar las fibras de p-GlcNAc de los cuerpos celulares de las diatomeas, se pude incluir una etapa para dispersar las fibras. Dicha etapa puede incluir, pero no se limita, el uso de fuerza mecánica para dispersar la fibra, tal como una etapa en la que las fibras se someten a los movimientos de un agitador orbital.

Alternativamente, la suspensión tratada con ácido, en una etapa opcional, se puede neutralizar antes de la purificación adicional por tratamiento con detergente. Dicha neutralización, en general, cambiará el pH de la suspensión de aproximadamente 1,8 a aproximadamente 7,0, y se puede llevar a cabo, por ejemplo, por adición de un volumen adecuado de Tris 1 M (pH 8,0) o la adición de un volumen adecuado de hidróxido sódico (NaOH). En general, la neutralización da fibras de p-GlcNAc puras de una longitud sustancialmente mayor que los otros procedimientos de purificación discutidos en el presente documento.

Después, las fibras de p-GlcNAc purificadas se pueden concentrar usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tal como usando un dispositivo de succión y filtración. Finalmente, las fibras de p-GlcNAc se lavan, en una serie de etapas con agua destilada-desionizada, HCl y etanol, u otros disolvente adecuados, preferiblemente disolvente tales como alcoholes, en los que se disuelvan tanto los materiales orgánicos como los inorgánicos. Se expone un ejemplo que demuestra el uso satisfactorio de dicho método de purificación en la Sección de ejemplo 7, véase más adelante.

Aunque cada uno de estos métodos para purificar la p-GlcNAc de las fuentes de partida, las microalgas preferiblemente diatomeas como fuentes de partida, producen p-GlcNAc cristalina, muy pura y sin adulterar, cada uno de los procedimientos produce p-GlcNAc que tiene características específicas y características ventajosas. Por ejemplo, la p-GlcNAc purificada por el método de la fuerza mecánica produce una membrana de p-GlcNAc que proporciona un sustrato superior para la unión de las células a la p-GlcNAc. El procedimiento químico/biológico produce un rendimiento medio mucho mayor que el rendimiento medio de p-GlcNAc producida por el método de la fuerza mecánica. Adicionalmente, la variación del tratamiento con ácido/neutralización del procedimiento químico/biológico produce fibras de p-GlcNAc extremadamente largas, siendo algunas de las fibras de más de 100 \mum, y conteniendo moléculas de polímero p-GlcNAc de peso molecular muy alto, tan alto como 20-30 millones de daltons.

La estructura por micrografía electrónica de la p-GlcNAc que se va a usar en las composiciones y métodos de esta invención, producido usando la variación del tratamiento con ácido/neutralización del método de purificación químico/biológico se representa en la Figura 3. A menudo, la purificación de las fibras de p-GlcNAc da como resultado la formación de membranas fibrosas como se representa en la Figura 3.

5.1.1 Derivatización de la p-GlcNAc

La p-GlcNAc totalmente acetilada de la invención se puede derivatizar, usando una variedad de condiciones y procedimientos controlados, en una amplia variedad de compuestos diferentes. Véase en la Figura 4 un diagrama que representa algunos de estos compuestos. Dichos compuestos derivatizados pueden incluir, pero no se limitan, p-GlcNAc parcialmente o completamente desacetiladas, que se ha modificado por medios químicos y/o enzimáticos como se describe con más detalle a continuación. De acuerdo con una realización preferida de la invención, la p-GlcNAc es una p-GlcNAc 100% desacetilada.

Adicionalmente, la p-GlcNAc, o su derivado desacetilado, se puede derivatizar mediante sulfatación, fosforilación y/o nitración. Además, como se detalla a continuación, los derivados de O-sulfonilo, N-acilo, O-alquilo, N-alquilo, desoxihalogenado, y N-alquilideno y N-arilideno, y otros derivados, se pueden preparar a partir de la p-GlcNAc o p-GlcNAc desacetilada de la invención. La p-GlcNAc desacetilada de la invención también se puede usar para preparar una variedad de sales orgánicos y/o quelatos de metales.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, se pueden desacetilar una o más unidades de monosacárido de la p-GlcNAc, para formar una especie de poli-\beta-1-4-N-glucosamina desacetilada. Una especie de poli-\beta-1-4-N-glucosamina desacetilada en la que cada una de las unidades de monosacárido de la especie de poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina se ha desacetilado, es decir, un derivado 100% desacetilado, tendrá un peso molecular de aproximadamente 640.000 daltons a aproximadamente 24 millones de daltons, siendo preferido de aproximadamente 640.000 daltons a aproximadamente 2,4 millones de daltons. Una especie con dicho intervalo de peso molecular representa una especie que tiene de aproximadamente 4000 a aproximadamente 150.000 monosacáridos de glucosamina unidos covalentemente en una configuración \beta-1-4.

La p-GlcNAc se puede desacetilar por tratamiento con una base para dar las glucosaminas con grupos amino libres. Este procedimiento de hidrólisis se puede llevar a cabo con soluciones concentradas de hidróxido sódico o hidróxido potásico a temperaturas elevadas. Véase, por ejemplo, la Sección de ejemplo 8, véase más adelante. Alternativamente, se puede usar un procedimiento enzimático que usa una enzima de quitina desacetilasa, para desacetilar la p-GlcNAc. Dicho procedimiento enzimático con la desacetilasa es conocido por los expertos en la técnica, y se puede llevar a cabo como en la patente de Estados Unidos nº 5.219.749.

Además, se puede derivatizar una o más de las unidades de monosacárido de la p-GlcNAc de la invención para que contenga al menos un grupo sulfato, o alternativamente, se puede fosforilar o nitrar, como se representa a continuación:

3

donde, R y/o R_{1} en lugar de un hidrógeno, y/o R_{2} en lugar de -COCH_{3}, pueden ser un grupo sulfato (-SHO_{3}), un fosfato (-P(OH)_{2}), o un nitrato (-NO_{2}).

A continuación se describen métodos mediante los cuales se pueden preparar dichos derivados de p-GlcNAc. Antes de llevar a cabo estos métodos, puede ser ventajoso primero liofilizar, congelar en nitrógeno líquido y pulverizar el material de partida de la p-GlcNAc.

Los derivados de p-GlcNAc sulfatados se pueden generar, por ejemplo, por un procedimiento en dos etapas. En la primera etapa, se puede preparar la p-GlcNAc O-carboximetilada, a partir de la p-GlcNAc y/o derivados de p-GlcNAc de la invención, por ejemplo, usando técnicas tales como las descritas por Tokura y col. (Tokura, S. y col., 1983, Polym. J. 15:485). Segundo, la etapa de sulfatación se puede llevar a cabo, por ejemplo, con N,N-dimetilformamida-trióxido de azufre, de acuerdo con técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como las descritas por Schweiger (Schweiger, R.G., 1972, Carbohydrate Res. 21:219). El producto resultante se puede aislar en forma de la sal de sodio.

Los derivados de p-GlcNAc fosforilados se pueden preparar, por ejemplo, usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como las descritas por Nishi y col. (Nishi, N. y col., 1986, en "Chitin in Nature and Technology", Muzzarelli y col., eds. Plenum Press, New York, pp. 297-299). Brevemente, se puede tratar una mezcla de p-GlcNAc/ácido metanosulfónico con pentóxido de fósforo (aproximadamente con 0,5 a 4,0 equivalentes molares) con agitación, a una temperatura de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 5ºC. El tratamiento puede ser durante aproximadamente 2 horas. Después, el producto resultante se puede precipitar y lavar usando técnicas patrón conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede precipitar la muestra con un disolvente tal como éter, centrifugar, lavar con un disolvente tal como éter, acetona o metanol, y secar.

Los derivados de p-GlcNAc nitrados se pueden preparar usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como las descritas por Schorigin y Halt (Schorigin, R. and Halt, E., 1934, Chem. Ber. 67:1712). Brevemente, la p-GlcNAc y/o un derivado de p-GlcNAc se puede tratar con ácido nítrico concentrado para formar un producto nitrado estable.

Uno o más de las unidades de monosacárido de la p-GlcNAc de la invención, pueden contener un grupo sulfonilo, como se representa a continuación:

4

donde R_{3} puede ser un resto alquilo, un arilo, un alquenilo o un alquinilo. Dicho derivado se puede generar por métodos conocidos tales como el método descrito por Kurita y col. (Kurita, K. y col., 1990, Polym. Prep [Am. Chem. Soc, Div. Polym. Chem.] 31:624-625). Brevemente, se puede hacer reaccionar una solución acuosa alcalina de p-GlcNAc con una solución de cloruro de tosilo en cloroformo, y después la reacción se puede dejar evolucionar suavemente a bajas temperaturas.

Uno o más de los monosacáridos de la p-GlcNAc de la invención o su derivado acetilado, puede contener uno o más grupos O-acilo, como se representa a continuación:

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5

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donde, R_{4} y/o R_{5} en lugar de hidrógeno, puede ser un resto alquilo, un alquenilo o un alquinilo, y R_{6} puede ser un resto alquilo, un alquenilo o un alquinilo. Se puede generar un ejemplo de dicho derivado por métodos conocidos tales como los descritos por Komai (Komai, T. y col., 1986, in "Chitin in Nature and Technology", Muzzarelli y col., eds., Plenum Press, New York, pp. 497-506). Brevemente, se puede hacer reaccionar la p-GlcNAc con cualquiera de una serie de cloruros de acilo adecuados en ácido metanosulfónico para dar los derivados de p-GlcNAc que incluyen, pero no se limitan, derivados de caproilo, caprilo, lanoilo, o benzoilo.

Uno o más de los monosacáridos de la p-GlcNAc desacetilada de la invención pueden contener un grupo N-acilo, como se representa a continuación:

6

donde, R puede ser un resto alquilo, un alquenilo o un alquinilo. Dicha derivatización se puede obtener usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como la técnica descrita por Hirano y col. (Hirano, S. y col., 1976, Carbohydrate Research 47:315-320). La p-GlcNAc desacetilada es soluble en una serie de soluciones acuosas de ácidos orgánicos. La adición de anhídridos carboxílicos seleccionados a dichas soluciones que contienen p-GlcNAc, en ácido acético en metanol acuoso, da como resultado la formación de derivados de N-acilo de la p-GlcNAc. La p-GlcNAc N-acilada es un derivado preferido para producir sistemas de suministro de fármaco de liberación controlada.

Uno o más de los monosacáridos de la p-GlcNAc de la invención o de su derivado desacetilado, puede contener un grupo O-alquilo, como se representa a continuación:

7

donde, R_{8} puede ser un resto alquilo, un alquenilo o un alquinilo. Dicha derivatización se puede obtener usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo el procedimiento descrito por Maresh y col. (Maresh, G. y col., en "Chitin and Chitosan," Skjak-Braek, G. y col., eds., 1989, Elsevier Publishing Co., pp. 389-395). Brevemente, la p-GlcNAc desacetilada se puede dispersar en dimetoxietano (DME) y hacer reaccionar con un exceso de óxido de propileno. El periodo de reacción puede ser 24 horas, y la reacción se lleva a cabo en un autoclave de 40 a 90ºC. Después, la mezcla se puede diluir con agua y filtrar. El DME se puede separar por destilación. Finalmente, el producto final se puede aislar por liofilización. La p-GlcNAc O-alquilada y su derivado desacetilado también es un derivado preferido para producir sistemas de suministro de fármacos de liberación controlada.

Una o más de las unidades de monosacárido de la p-GlcNAc de la invención puede ser un derivado alcalino, como se representa a continuación:

8

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Dicho derivado se puede obtener usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un método tal como el descrito por Noguchi y col. (Noguchi, J. y col., 1969, Kogyo Kagaku Zasshi 72:796-799). Brevemente, la p-GlcNAc se remojó a vacío en NaOH (43%, preferiblemente) durante un periodo de aproximadamente dos horas a aproximadamente 0ºC. Después se puede separar el exceso de NaOH, por ejemplo, por centrifugación en una centrífuga de cesta y por prensado mecánico.

Una o más de las unidades de monosacárido del derivado desacetilado de la p-GlcNAc de la invención puede contener un grupo N-alquilo, como se representa a continuación:

9

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donde R_{9} puede ser un resto alquilo, un alquenilo o un alquinilo. Dicha derivatización se puede obtener usando, por ejemplo, un procedimiento tal como el de Maresh y col. (Maresh, G. y col., in "Chitin and Chitosan," Skjak-Brack, G. y col., eds. 1989, Elsevier Publishing Co., pp. 389-395), como se ha descrito antes, para la producción de los derivados de p-GlcNAc N-alquilados.

Una o más de las unidades de monosacárido del derivado desacetilado de la p-GlcNAc de la invención pueden contener al menos un derivado desoxihalogenado, como se representa a continuación:

10

donde R_{10} puede ser F, Cl, Br o I, siendo preferido el I. Dicho derivado se puede obtener usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un procedimiento tal como el descrito por Kurita y col. (Kurita, K. y col., 1990, Polym. Prep. [Am. Chem. Soc. Div. Polym. Chem.] 31:624-625). Brevemente, se hace reaccionar una p-GlcNAc tosilada con un haluro sódico en dimetilsulfóxido, dando un derivado desoxihalogenado. La tosilación de la p-GlcNAc se puede llevar a cabo haciendo reaccionar una solución acuosa de p-GlcNAc alcalino con una solución de cloruro de tosilo en cloroformo. Dicha reacción puede avanzar suavemente a temperaturas bajas.

Una o más de las unidades de monosacárido del derivado desacetilado de la p-GlcNAc de la invención pueden formar una sal, como se representa a continuación:

11

donde, R_{11} puede ser un resto alquilo, un alquenilo o un alquinilo. Dicha derivatización se puede obtener usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un procedimiento tal como el descrito por Austin y Sennett (Austin, P.R. and Sennett, S., in "Chitin in Nature and Technology," 1986, Muzzarelli, R.A.A. y col., eds. Plenum Press, pp. 279-286). Brevemente, se puede suspender la p-GlcNAc desacetilada en un medio orgánico, tal como por ejemplo, acetato de etilo o isopropanol, al que se puede añadir un ácido orgánico adecuado, tal como por ejemplo, ácido fórmico, acético, glicólico o láctico. La mezcla se puede dejar reposar durante un periodo de tiempo (de 1 a 3 horas, por ejemplo). La temperatura de la reacción y secado pueden variar de aproximadamente 12ºC a aproximadamente 35ºC, siendo preferida de 20ºC a 25ºC. Después las sales se pueden separar por filtración, lavar con medio reciente, y evaporar el medio residual.

Una o más de las unidades de monosacárido del derivado desacetilado de la p-GlcNAc de la invención pueden formar un quelato con metal, como se representa a continuación:

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12

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donde R_{12} puede ser un ion metálico, particularmente uno de los metales de transición, y X es un enlace dativo establecido por los electrones del nitrógeno presentes en los grupos amino y amino sustituido presentes en la p-GlcNAc desacetilada.

Una o más de las unidades de monosacárido del derivado desacetilado de la p-GlcNAc de la invención pueden contener un grupo N-alquilideno o N-arilideno, como se representa a continuación:

13

donde R_{13} puede ser un resto alquilo, un alquenilo o un alquinilo. Dicha derivatización se puede obtener usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un procedimiento tal como el procedimiento descrito por Hirano y col. (Hirano, S. y col., 1981, J. Biomed. Mat. Res. 15:903-911). Brevemente, se puede llevar a cabo una reacción de N-sustitución de la p-GlcNAc desacetilada con anhídridos carboxílicos y/o arilaldehídos para dar derivados de acil- y/o arilideno.

Además, la p-GlcNAc, o su derivado desacetilado, se puede someter a condiciones de hidrólisis controladas, que dan grupos de moléculas que tienen peso molecular discreto y uniforme y otras características físicas. Dichas condiciones de hidrólisis pueden incluir, por ejemplo, el tratamiento con la enzima, lisozima. La p-GlcNAc se puede exponer a la lisozima durante periodos diferentes de tiempo, con el fin de controlar el grado de hidrólisis. Además, la tasa de hidrólisis se puede controlar como una función del grado que se ha desacetilado la p-GlcNAc que está siendo tratado con lisozima. Las condiciones de desacetilación pueden ser como las que se han descrito antes. Cuanto más se haya desacetilado una molécula de p-GlcNAc, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 90 por ciento de desacetilación, más completamente se hidrolizará la molécula en un tiempo dado. Mediante los tratamientos de hidrólisis y/o desacetilación se pueden provocar cambios en las características físicas, además de disminuir el peso molecular. La hidrólisis extensiva produce licuefacción de la p-GlcNAc.

Además, la desnaturalización térmica puede modificar la estructura cristalina de la p-GlcNAc. Dicha modificación de la estructura cristalina del producto p-GlcNAc puede afectar ventajosamente, por ejemplo, a la reactividad de la p-GlcNAc.

Además, se pueden formar híbridos que comprenden p-GlcNAc y/o derivados de p-GlcNAc. Dichos híbridos pueden contener cualquiera de una serie de materiales naturales y/o sintéticos, además de la p-GlcNAc y/o derivados de la p-GlcNAc.

Por ejemplo, se pueden formar híbridos de p-GlcNAc y/o derivados de p-GlcNAc más uno o más componentes de matriz extracelulares (ECM). Dichos componentes ECM pueden incluir, pero no se limita, colágeno, fibronectina, glicosaminoglicanos, y/o peptidoglicanos. Los híbridos también se pueden formar de p-GlcNAc y/o derivados de p-GlcNAc más uno o más materiales sintéticos tales como, por ejemplo, polietileno. Dicho híbrido de p-GlcNAc/polietileno o derivado de p-GlcNAc/polietileno se puede hacer uniendo térmicamente los componentes híbridos, por ejemplo, mediante autoclave.

Los derivados de p-GlcNAc preferidos para usar en la invención reivindicada son derivados de sales de p-GlcNAc desacetilada tales como un derivado de p-GlcNAc-lactato, especialmente un derivado de gel de p-GlcNAc-lactato. Como se usa en el presente documento, la expresión "p-GlcNAc-lactato" significa que el resto de ácido láctico está unido funcionalmente a una p-GlcNAc parcial o totalmente desacetilada. Dichos derivados de p-GlcNAc-lactato se pueden obtener como se ha descrito antes (por ejemplo, por derivatización con ácido láctico) y formular en forma de un gel usando propilenglicol y agua, como se describe en la Sección de ejemplo 10, véase más adelante. Los derivados de p-GlcNAc-lactato se pueden producir con viscosidades altas y bajas, lo cual permite poder adaptar la p-GlcNAc a la indicación específica que interese. Por ejemplo, puede ser útil usar una p-GlcNAc que tenga una viscosidad inferior para suministrar mediante una jeringuilla o mediante un pulverizador.

Como se describe con mayor detalle en la Sección 5.3, véase más adelante, la p-GlcNAc y/o sus derivados descritos antes, se pueden derivatizar más mediante la unión covalente o no covalente, o combinación con, moléculas o fármacos de interés tales como antagonistas de endotelina.

5.1.2 Reformulaciones de p-GlcNAc

La p-GlcNAc, sus derivados desacetilados y/o sus derivatizaciones tales como las descritas antes, que se van a usar en las composiciones de la invención, se puede disolver y posteriormente reformular en una variedad de formas y configuraciones.

La solución de la p-GlcNAc se puede lograr mediante tratamiento con dimetilacetamida (DMA)/cloruro de litio. La p-GlcNAc se puede disolver fácilmente agitando en una solución de DMA que contiene LiCl al 5% (en peso del DMA). Los derivados de p-GlcNAc solubles en agua, tales como las sales de p-GlcNAc, por ejemplo, los derivados de lactato o carboximetilo, se pueden disolver en agua. La p-GlcNAc que se ha desacetilado al menos aproximadamente el 75%, se puede poner en solución, por ejemplo, en una solución ácida suave, tal como ácido acético al 1%. Los derivados de p-GlcNAc que son insolubles en agua se pueden poner en solución en disolventes orgánicos.

La derivatización de la p-GlcNAc en DMA:LiCl con isocianatos de fenilo, se puede usar para producir carbanilatos. Además, la derivatización de la p-GlcNAc en DMA:LiCl con cloruro de p-toluenosulfonilo se puede usar para producir p-toluenosulfonato.

Después, la p-GlcNAc, sus derivados desacetilados, y/o sus derivatizaciones, en solución se pueden precipitar y reformular en formar que incluyen, pero no se limitan, matrices, cuerdas, microesferas, microperlas, membranas, fibras, polvos, esponjas y geles. Además, se pueden formular membranas ultrafinas uniformes (es decir, menos de aproximadamente 1 micrómetro de grosor). Adicionalmente, se pueden preparar formulaciones farmacéuticas tales como píldoras, comprimidos y cápsulas.

Dichas reformulaciones se pueden lograr, por ejemplo, aprovechando el hecho de que la p-GlcNAc pura es insoluble en soluciones tales como agua y alcohol, preferiblemente etanol. La introducción, por medios convencionales, tales como por inyección, por ejemplo de la mezcla de DMA/LiCl que contiene p-GlcNAc en dicha solución de agua o alcohol, preferiblemente etanol, producirá la reprecipitación, y por lo tanto la reformulación, de la p-GlcNAc disuelta. La reformulación de una membrana de p-GlcNAc en un material fibroso se demuestra en la Sección de ejemplo 9, véase más adelante. En el caso de los derivados de p-GlcNAc solubles en agua, las reformulaciones se pueden lograr por reprecipitación en disolventes orgánicos tales como, por ejemplo, acetato de etilo o isopropanol. Las reformulaciones de la p-GlcNAc que se ha desacetilado al menos aproximadamente el 75%, se pueden lograr volviéndolos a precipitar en una solución alcalina. Los derivados de p-GlcNAc insolubles en agua se pueden reformular volviendo a precipitar en soluciones acuosas, tales como, por ejemplo, agua.

Las membranas de p-GlcNAc y matrices de p-GlcNAc tridimensionales se pueden producir por procedimientos que proporcionan la formación de tamaños de poros medios controlados en las membranas o las matrices. El tamaño de los poros se puede controlar en las membranas y matrices variando la cantidad de material de p-GlcNAc usado, y por adición de determinados disolventes tales como metanol o etanol, siendo preferido el etanol, en cantidades específicas, que están en el intervalo de aproximadamente 5% a aproximadamente 40%, antes de la formación de las membranas y/o matrices. En general, cuanto mayor es el porcentaje de disolvente, menor será el tamaño medio de los poros formados.

De acuerdo con una reformulación preferida de la invención, un derivado de p-GlcNAc-lactato se formula en un gel como se describe con detalle en la Sección de ejemplo 10, véase más adelante.

5.2. Los antagonistas de endotelina de las composiciones de la invención

Los antagonistas de endotelina que se van a usar en las composiciones y métodos de la invención incluyen, pero no se limitan, antagonistas de endotelina basados en péptidos, antagonistas de endotelina no basados en péptidos, antagonistas de endotelina específicos para ETA, específicos para ETB o no específicos. Los ejemplos de antagonistas del receptor de endotelina basados en péptidos útiles en las composiciones y métodos de la invención incluyen BQ-123 (Ciclo(-D-Trp-D-Asp-L-Pro-D-Val-L-Leu-), BQ-153, BQ-238, BQ-485, BQ-610, BQ-788, BQ-928, TAK-044, FR139317 (Perhidroazepin-1-ilcarbonil-L-leucil-(1-metil)-D-triptofil-[3-(2-piridil)]-D-alanina), RES-701-1 (Novabiochem), PD 142893 (Acetil-(3,3-difenil-D-alanina)-L-Leu-L-Asp-L-Ile-L-Ile-L-Trp), PD 145065, CP 170687, Ac-DBhgI6-Leu-Asp-lle, IRL-1038 ((Cys11-Cys15)-Endotelina-1 (11 -21)), el pentapéptido GRGDS, y ET-1 [Dprl-Asp 15]. Muchos de estos péptidos están disponibles en el comercio, por ejemplo, en the American Peptide Company, Sunnyvale CA o Calbiochem-Novabiochem Company, San Diego CA.

Los ejemplos de antagonistas del receptor de endotelina no basado en péptidos para usar en las composiciones y métodos de la invención incluyen Ro 61-0612, Ro 61-1790, Ro 42-2005, Ro 46-2005, Ro 46-8443, Ro 47-0203 (también conocido en la técnica como bosentán), PD 155080, PD 156707, SB 209670, SB 217242, L-744.453, L-749.329, L-754.142, CGS 27830, BMS 182874, LU 135252, S-1039, mA386, A-127722, TBC11251, Nz-arg-3-(isoxazidilsulfamil)-2-tiofenocarboxamida, y EQ 123. Véase, p. ej., en Webb y col., véase antes, y Ohlstein y col., véase antes, las estructuras de muchos de estos antagonistas de endotelina conocidos.

De acuerdo con esta invención, pueden ser preferidos los antagonistas de endotelina no basados en péptidos porque presentan propiedades farmacocinéticas más favorables que los antagonistas basados en péptidos, por ejemplo, mayor estabilidad metabólica y mejor biodisponibilidad y actividad oral. De acuerdo con una realización preferida de la invención, el antagonista de endotelina usado es Ro61 representado en la Figura I, véase antes.

5.3. Formulaciones preferidas de las composiciones de la invención

De acuerdo con la invención, un antagonista de endotelina como se ha descrito antes ("EA") se une funcionalmente covalente o no covalentemente, o se combina con la p-GlcNAc, o uno o más de sus derivados o reformulaciones, como se ha descrito antes. De acuerdo con una realización, al menos un tipo de antagonista de endotelina se combina covalente, no covalentemente o de otra forma o se mezcla con una p-GlcNAc desacetilada. A continuación se discuten otros agentes antitumorales que se pueden usar junto con las composiciones de EA/p-GlcNAc de la invención.

El antagonista de endotelina u otro agente antitumoral se puede unir covalentemente a las aminas primarias expuestas de la p-GlcNAc desacetilada, por ejemplo, por unión química usando reactivos de reticulación bifuncionales que actúan como espaciadores químicos de longitud específica. Dichas técnicas son conocidas por los expertos en la técnica, y se pueden parecer, por ejemplo, a los métodos de Davis y Preston (Davis, M. and Prestan, J.F. 1981, Anal. Biochem. 116:404-407) y Staros y col. (Staros, J. V. y col., 1986, Anal. Biochem. 156:220-222). Por ejemplo, en el caso de los compuestos basados en péptidos, los restos carboxílicos en el péptido que se van a unir a la p-GlcNAc desacetilada o parcialmente desacetilada, se pueden activar y después reticular con la p-GlcNAc. La activación se puede llevar a cabo, por ejemplo, por adición de una solución tal como de carbodiimida EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) a una solución de péptido en un tampón de fosfato. Preferiblemente, esta solución contiene adicionalmente un reactivo tal como sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida) para potenciar el acoplamiento. El péptido activado se puede reticular a la p-GlcNAc desacetilada mezclándolo en un tampón de pH alto, tal como tampón de carbonato (pH 9,0-9,2).

La actividad biológica de la molécula unida se puede mantener variando la longitud de la molécula conectora (por ejemplo, el compuesto reticulador bifuncional) utilizado para unir la molécula a la p-GlcNAc. Se puede determinar de forma rutinaria una longitud adecuada del conector para una molécula dada que se va a unir, que no altere la actividad biológica de la molécula. Por ejemplo, la actividad biológica (por ejemplo, un nivel terapéuticamente eficaz de actividad biológica) de una molécula que se ha unido mediante un conector de una longitud dada, se puede ensayar usando ensayos conocidos específicos para la molécula dada que se va a unir. Adicionalmente, con el fin de mantener la actividad biológica de la molécula que se va a unir, puede ser necesario usar un conector que se pueda escindir mediante una enzima natural adecuada para liberar la molécula unida. Se pueden usar ensayos usados normalmente por los expertos en la técnica, para ensayar la retención de la actividad biológica de la molécula particular que se va a unir para asegurar que se retiene un nivel aceptable de actividad (por ejemplo, un nivel de actividad terapéuticamente eficaz).

Alternativamente, los antagonistas de endotelina basados en péptidos o no basados en péptidos, solos o combinados con otros agentes antitumorales, se pueden mezclar o unir no covalentemente a la p-GlcNAc y/o sus derivados para formar las composiciones de la invención, usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede mezclar una moléculas o moléculas que se elijan, por ejemplo, un antagonista de endotelina, con suspensiones de p-GlcNAc, con una solución de p-GlcNAc desacetilada o parcialmente desacetilada, con una solución de la sal de p-GlcNAc desacetilada o parcialmente desacetilada, por ejemplo, con una solución de p-GlcNAc-lactato (parcial o totalmente desacetilada), o con una solución de cualquier derivado de p-GlcNAc. Opcionalmente, las mezclas se pueden liofilizar. Después de la liofilización, las moléculas quedan unidas de forma no covalente a las matrices de p-GlcNAc, supuestamente mediante interacciones hidrófobas, electrostáticas y otras interacciones no covalentes. Dichas formulaciones de p-GlcNAc son muy fáciles de producir. Además, dichas formulaciones se pueden lograr eficazmente con una amplia variedad de moléculas que tienen un amplio espectro de características físicas y propiedades de solubilidad en agua, que van desde las más hidrófobas a las más hidrófilas. Tras la unión de la molécula o moléculas, se pueden usar los ensayos usados normalmente por los expertos en la técnica para ensayar la actividad de la molécula o moléculas particulares unidas de forma no covalente, para asegurar que se logra un nivel de actividad aceptable (por ejemplo, una actividad terapéuticamente eficaz) con la molécula
unida.

Además, los antagonistas de endotelina, solos o combinados con otros agentes antitumorales, se pueden encapsular en la p-GlcNAc usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento para lograr la encapsulación puede implicar el procedimiento indicado por Hwang y col. (Hwang, C. y col. in Muzzarelli, R. y col., eds., 1985, "Chitin in Nature and Technology", Plenum Press, pp. 389-396).

La encapsulación también se puede lograr, por ejemplo, siguiendo una modificación de la variación del tratamiento con ácido/neutralización del método de purificación químico/biológico presentado antes. En lugar de aumentar el pH de la solución de p-GlcNAc a un intervalo de pH aproximadamente neutro (es decir, aproximadamente 7,4), se puede crear un entorno de pH básico, aumentando el pH a aproximadamente 9,0 después de completar la purificación de la p-GlcNAc. A un pH más básico, la estructura de la p-GlcNAc o uno de sus derivados, adopta una configuración más tridimensional o "abierta". Cuando se baja el pH, la configuración de la molécula revierte a una configuración "cerrada" más compacta. Por lo tanto, se puede añadir un compuesto o fármaco de interés, tal como un antagonista de endotelina a una solución de p-GlcNAc a un pH alto, y después se puede bajar el pH de la suspensión de p-GlcNAc/fármaco, "atrapando" o encapsulando así el fármaco de interés dentro de una matriz de p-GlcNAc. Tras la encapsulación de la molécula, se pueden usar los ensayos usados normalmente por los expertos en la técnica para ensayar la actividad de la molécula o moléculas particulares encapsuladas, asegurando así que la molécula encapsulada retiente un nivel de actividad biológica aceptable (por ejemplo, una actividad terapéuticamente eficaz).

Se muestra un ejemplo de la preparación de una composición de EA/p-GlcNAc de la invención en la Sección de ejemplo 10, véase a continuación, en la que se mezcla un antagonista de endotelina con un gel de p-GlcNAc-lactato. Alternativamente, se puede preparar una composición de EA (sin p-GlcNAc acompañando), por ejemplo, disolviendo el antagonista de endotelina en PBS, HBSS o como se describe en las instrucciones del fabricante, y ajustando la solución a la concentración deseada.

Las composiciones de la invención, incluyendo las composiciones de EA/p-GlcNAc, se pueden formular para administrar en forma de composiciones farmacéuticas, por ejemplo, por inhalación o insuflación (a través de la boca o la nariz), o administración oral, bucal, parenteral o rectal. De acuerdo con una realización preferida, la composición de EA/p-GlcNAc de la invención se administra por inyección en forma de un gel como se describe en la Sección de ejemplo 10, véase más adelante. En esta realización de la invención, en la que la composición farmacéutica comprende la administración de un antagonista de endotelina, por ejemplo, un antagonista de endotelina no peptídico tal como una pirimidil-sulfonamida, para tratar la enfermedad proliferativa, por ejemplo, el cáncer, la composición puede comprender una cantidad terapéuticamente eficaz del antagonista de endotelina combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Para administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tener forma, por ejemplo, de comprimidos o cápsulas preparados por medios convencionales con excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivnilpirrolidona o hidroxipropil-metilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato magnésico, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o almidón-glicolato sódico); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato sódico). La p-GlcNAc se puede usar en lugar de, o además de, los excipientes, vehículos y cargas. Los comprimidos se pueden revestir usando p-GlcNAc, usando procedimientos conocidos en la técnica.

Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tener forma, por ejemplo, de soluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar en forma de un producto seco para reconstituir con agua u otros vehículos adecuados antes de usar. Dichas preparaciones líquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas hidrogenadas comestibles); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres aceitosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales de tampón, agentes de sabor, colorantes y edulcorantes según sea adecuado.

5.4 Usos de las composiciones y métodos de la invención

Los usos biomédicos de las composiciones de la invención incluyen su uso como sistemas de suministro de fármacos para antagonistas de la endotelina, así como otros agentes terapéuticos tales como otros agentes antitumorales. Las formulaciones que contienen p-GlcNAc de la invención proporcionan beneficios adicionales comparados con las formulaciones de fármaco conocidas, incluyendo, por ejemplo, mayor eficacia, menor toxicidad y menor biodisponibilidad. De hecho, hay numerosas ventajas en el uso de los sistemas de suministro de fármaco basados en la p-GlcNAc de la invención. Por ejemplo, normalmente se usa la administración de fármacos tradicionales por inyección con proteínas y otros muchos fármacos. Sin embargo, las dosis repetidas conducen a concentraciones de fármaco en la sangre que oscilan y afectan a la comodidad y observancia del paciente. La administración oral puede ser ventajosa puesto que permite una carga más variada de fármaco para ser liberada y es menos incómodo para el paciente. Sin embargo, las proteínas y otros compuestos son desnaturalizados y degradados en el estómago.

Sin embargo, se logra una mejor administración oral mediante las composiciones que contienen la p-GlcNAc de la invención, proporcionando un entorno protector para el fármaco una vez que se ha administrado. Por ejemplo, la p-GlcNAc protege un antagonista de la endotelina basado en péptidos del entorno ácido y enzimático del estómago. El sistema de p-GlcNAc libera el compuesto por difusión y/o degradación de la encapsulación una vez que llega a la región intestinal, donde es absorbido eficazmente en el torrente sanguíneo. Estos sistemas de p-GlcNAc de la invención se pueden usar, por ejemplo, para suministrar proteínas así como muchos otros compuestos. Se prefieren los liposomas revestidos con derivados de p-GlcNAc o las encapsulaciones de derivados de p-GlcNAc-alginato, para dichos procedimientos de suministro oral.

Además, tras la introducción de las composiciones de la invención en un paciente, la p-GlcNAc se biodegrada con el tiempo, de forma que los compuestos unidos o encerrados son liberados gradualmente en el torrente sanguíneo del paciente, proporcionando así un procedimiento para el suministro de fármaco con liberación lenta y controlada.

Se pueden producir especies de p-GlcNac desacetiladas o parcialmente desacetiladas que tengan una velocidad de biodegradabilidad predecible. Por ejemplo, el porcentaje de desacetilación afecta a la velocidad a la cual se degrada la especie de p-GlcNAc. En general, cuanto mayor es el porcentaje de desacetilación, más rápido será la velocidad de biodegradabilidad y resorción. Por lo tanto, el grado de biodegradabilidad de la p-GlcNAc y la velocidad de resorción in vivo se pueden controlar durante la producción de las p-GlcNAc.

Los materiales de p-GlcNAc que tienen dichas velocidades de biodegradabilidd controlables se pueden formular en membranas, geles, esponjas, microesferas, fibras y similares. De acuerdo con una realización preferida de la invención, se puede usar una p-GlcNAc 100% desacetilada o parcialmente desacilada que tenga una velocidad de biodegradabilidad predecible.

Las composiciones de p-GlcNAc/fármaco de la invención se pueden suministrar a un paciente mediante una variedad de vías usando procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, dicho suministro puede ser administración en un sitio específico, oral, nasal, intravenosa, subcutánea, intradérmica, transdérmica, intramuscular o intraperitoneal. Con respecto al suministro en un sitio específico, los métodos de administración pueden incluir, pero no se limitan, inyección, implantación, medios artroscópicos, laparoscópicos o similares. Se prefieren las membranas y/o geles de p-GlcNAc así como las microesferas y esponjas para dichos métodos de suministro en un sitio específico.

Como se ha indicado antes, las composiciones de p-GlcNAc de la invención se pueden formular en membranas, geles, esponjas, microesferas, fibras y similares. Estos productos de p-GlcNAc se adhieren y moldean al tejido, tanto a tejidos blandos como duros, en el cuerpo humano sin necesidad de sutura. Por ejemplo, los materiales de p-GlcNAc se pueden aplicar durante la cirugía general o mínima invasiva, tal como la cirugía laparoscópica.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, la p-GlcNAc está en forma de un gel en el que se disuelve o incorpora de otra forma el antagonista de endotelina y/u otro agente antitumoral. Los geles y membranas basados en p-GlcNAc tienen una variedad de aplicaciones como sistemas de suministro de fármacos terapéuticos, por ejemplo, para proporcionar el suministro de liberación lenta específico en un sitio directamente a un tumor o a la región dejada vacía por un tumor después de cirugía. Dicha composición de liberación lenta inmovilizada puede actuar como un procedimiento defensivo inicial importante después de cirugía. Además, dichos sistemas de suministro de fármacos antitumorales pueden ser particularmente útiles para tratar tumores que son total o parcialmente inaccesibles a la cirugía tales como, por ejemplo, ciertos tumores cerebrales.

Por lo tanto, las composiciones de EA/p-GlcNAc de la invención son útiles como sistemas de suministro de fármacos terapéuticos para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades proliferativas. Estas composiciones pueden incluir adicionalmente otros agentes antitumorales, que se pueden unir o encapsular dentro de la p-GlcNAc de la invención para proporcionar un efecto sinérgico. Dichos agentes antitumorales son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan, las siguientes categorías y compuestos específicos: agentes alquilantes, agentes antimetabolitos, antibióticos antitumorales, alcaloides de la vinca y agentes epidofilotoxinas, nitrosoureas, enzimas, productos sintéticos, productos biológicos terapéuticos hormonales y fármacos de investigación.

Dichos agentes alquilantes pueden incluir, pero no se limitan, mostazas nitrogenadas, clorambucil, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán, tiptea y busulfán.

Los antimetabolitos pueden incluir, pero no se limitan, metotrexato, 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina (ara-C), 5-azacitidina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, y fosfato de fludarabina. Los antibióticos antitumorales pueden incluir, pero no se limita, doxorrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, bleomicina, mitomicina C, plicamicina, idarrubicina, y mitoxantreno. Los alcaloides de la vinca y las epipodofilotoxinas pueden incluir, pero no se limitan, vincristina, vinblastina, vindesina, etopósido, y tenipósido.

Las nitrosoureas incluyen carmustina, lomustina, semustina y estreptozocina. Las enzimas pueden incluir, pero no se limitan, L-asparagina. Los productos sintéticos pueden incluir, pero no se limitan, Dacrabazina, hexametilmelamina, hidroxiurea, mitotano procabazina, cisplatino y carboplatino.

Los productos terapéuticos hormonales pueden incluir, pero no se limitan, corticoesteroides (acetato de cortisona, hidrocortisona, prednisona, prednisolona, metil-prednisolona y dexametasona), estrógenos, (dietilestibesterol, estradiol, estrógenos esterificados, estrógenos conjugados, clorotiasneno), progestinas (acetato de medroxiprogesterona, caproato de hidroxi-progesterona, acetato de megestrol), antiestrógenos (tamoxifeno), inhibidores de aromatasa (aminoglutetimida), andrógenos (propionato de testosterona, metiltestosterona, fluoximesterona, testolactona), antiandrógenos (flutamida), análogos de LHRH (acetato de leuprolida), y productos endocrinos para el cáncer de próstata (ketoconazol).

Los productos biológicos pueden incluir, pero no se limitan, interferones, interleuquinas, factor de necrosis tumoral, y modificadores de la respuesta biológica.

Los fármacos de investigación pueden incluir, pero no se limitan, agentes alquilantes tales como nimustina AZQ, BZQ, Cyclodisone, DADAG, CB10-227, CY233, maleato de DABIS, EDMN, fotemustina, hepsulfamo, hexametilmelamina, mafosamida, MDMS, PCNU, espiromustina, TA-077, TCNU y temozolomida; antimetabolitos, tales como acivicina, azacitidina, 5-aza-desoxicitidina, A-TDA, benciliden-glucosa, carbetimer, CB3717, mesilato de desazaguanina, DODOX, doxifluridina, DUP-785, 10-EDAM, fazarabina, fludarabina, MZPES, MMPR, PALA, PLAC, TCAR, TMQ, TNC-P y piritrexim; anticuerpos antitumorales, tales como AMPAS, BWA770U, BWA773U, BWA502U, amonafida, m-AMSA, CI-921, datelliptium, mitonafida, piroxantrona, aclarrubicina, cytorhodin, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, yodo-doxorrubicina, marcelomicina, menaril, morfolino-antraciclinas, pirarrubicina, y SM-5887; inhibidores del huso de los microtúbulos, tales como amfetinila, navelbina y taxol; los alquil-lisofosfolípidos tales como BM41-440, ET-18-OCH_{3}, y hexaciclofosfocolina; compuestos metálicos tales como nitrato de galio, CL286558, CL287110, cicloplatam, DWA2114R, NK121, iproplatino, oxaliplatino, espiroplatino, espirogermanio, y compuestos de titanio; y compuestos nuevos tales como, por ejemplo glicinato de afidoicolina, ambazona, BSO, caracemida, DSG, didemnina, B, DMFO, elsamicina, espertatrucina, ácido flavona-acético, HMBA, HHT, ICRF-187, yodo-desoxiuridina, ipomeanol, liblomicina, lonidamina, LY186641, MAP, MTQ, Merabarona SK&F104864, suramina, talisomicina, tenipósido, THU y WR2721; y toremifeno, trilosano, y zindoxifeno.

Se prefieren los fármacos antitumorales que son potenciadores de la radiación para los casos en los que se prescribe el tratamiento con terapia de radiación, en lugar de o después de cirugía. Los ejemplos de dichos fármacos incluyen, por ejemplo, los agentes quimioterapéuticos 5'-fluorouracilo, mitomicina, cisplatino y sus derivados, taxol, doxorrubicina, actinomicina, bieomicinas, daunomicinas, y metamicinas.

Se pueden obtener efectos sinérgicos adicionales usando las composiciones de EA/p-GlcNAc de la invención combinadas con uno o más agentes antitumorales distintos tales como la tioguanina combinada con arabinósido de citosina (ara-C) para el tratamiento mejorado de la leucemia no linfocítica aguda, tamoxifeno con cisplatino para el cáncer de mama, y prostaglandinas con cisplatino para el cáncer de mama y próstata. Se pueden usar muchas otras combinaciones sinérgicas de fármacos anticancerígenos conocidas por los expertos en la técnica, con las formulaciones de EA/p-GlcNAc y EA/derivado de p-GlcNAc de la invención.

Adicionalmente, es conveniente el uso de las composiciones que contienen la p-GlcNAc de la invención, dado que el polímero de p-GlcNAc tiene propiedades químicas y características que permiten que se pueda formular y suministrar algunos fármacos que hasta ahora han sido difíciles de formular y suministrar. Por ejemplo, el taxol, un fármaco inhibidor del huso de los microtúbulos para tratar el cáncer de mama, es hidrófobo y requiere la adición de aceite de ricino polioxietilado con el fin de solubilizarlo como una infusión líquida para el suministro intravenoso. La naturaleza hidrófoba del taxol hace que sea un compuesto ideal para formularlo con materiales polímeros de p-GlcNAc para el suministro tópico de liberación controlada. La patente de Estados Unidos 5.635.493 en la Sección 23, presenta una de dichas formulaciones de p-GlcNAc/taxol. Otros objetivos adicionales para los sistemas antitumorales de p-GlcNAc incluyen, pero no se limitan, tumores de piel, tubo digestivo, pancreáticos, de pulmón, mama, tracto urinario y tumores uterinos, y sarcomas de Kaposi relacionados con el VIH.

Debido a que los materiales de p-GlcNAc de la invención son inmunoneutros por si mismos, en cuanto que no provocan una respuesta inmunitaria en seres humanos, dichos dispositivos de p-GlcNAc, como se ha descrito antes, que comprenden membranas de p-GlcNAc, matrices porosas 3D y/o geles que albergan fármacos inmovilizados, pueden suministrar dichos fármacos de forma que no haya respuesta inmunitaria. Se pueden usar determinados materiales adicionales, tales como alginatos naturales y polímeros sintéticos en algunos casos, para construir dichos dispositivos, combinados con el material de p-GlcNAc. Por ejemplo, se puede fabricar un sistema de suministro de fármaco de liberación retardada polímero de una forma similar a al sugerida por A. Polk (Polk, A. y col., 1994, J. of Pharmaceutical Sciences, 83(2):178-185). En dicho procedimiento, se hace reaccionar la p-GlcNAc desacetilada con alginato sódico en presencia de cloruro de calcio para formar microcápsulas que contienen el fármaco que se va a suministrar y liberar en las condiciones adecuadas y en un determinado periodo de tiempo.

Las dosis terapéuticamente eficaces de cualquiera de los fármacos o agentes descritos antes, junto con los sistemas basados en p-GlcNAc descritos en el presente documento, se pueden determinar de forma rutinaria usando técnicas conocidas por el experto en la técnica. Una dosis "terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del compuesto suficiente para dar como resultado la mejora de los síntomas de los procesos y/o enfermedades descritas en el presente documento.

La toxicidad y eficacia terapéutica de los fármacos se puede determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, determinando la DL_{50} (la dosis letal del 50% de la población) y la DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación DL_{50}/DE_{50}. Se prefieren los compuestos que presentan índices terapéuticos grandes. Aunque se pueden usar compuestos que presentan efectos secundarios tóxicos, hay que tener cuidado para diseñar un sistema de suministro que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado, con el fin de minimizar el potencial daño a las células no afectadas, y por lo tanto, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y estudios en animales se pueden usar para formular un intervalo de dosificación para usar en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos está preferiblemente en un intervalo de concentraciones en la circulación que incluyen la DE_{50} con poca toxicidad o sin toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación usada y la vía de administración usada. Para cualquier compuesto usado en el procedimiento de la invención, se puede calcular inicialmente la dosis terapéuticamente eficaz a partir de los ensayos de cultivos celulares. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración que circula en el plasma que incluye la CI_{50} (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logra una inhibición de los síntomas que es la mitad del máximo) determinado en el cultivo celular. Dicha información se puede usar para determinar con más precisión las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en el plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta eficacia. De acuerdo con una realización preferida, el intervalo de dosis de los antagonistas de endotelina usados en las composiciones de la invención, es de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg.

Además, las dosis de muchos de los fármacos antitumorales listados antes son conocidos por los expertos en la técnica, y se pueden encontrar fácilmente en compendios tales como PHYSICIANS DESK REFERENCE, Medical Economics Data Publishers; REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co.; GOODMAN & GILMAN, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, McGraw Hill Publishers, THE CHEMOTHERAPY SOURCE BOOK, Williams y Wilkens Publishers, servicios en línea tales como Cancer Lit®, base de datos de U.S. National Cancer Institute, así como informes de estudios farmacológicos tales como "A MultiCenter Randomized Trial of Trial of Two Doses of Taxol" Nabholtz, J.M., Gelmon, K., Bontenbal, M. y col. Medical Education Services Monograph -1994 Bristol-Myers Squibb Company Publication; "Randomized Trial of Two Doses of Taxol in Metastatic Breast Cáncer: An Interim Analysis" Nabholtz, J. M., Gelmon, K., Bontenbal, M., y col. 1993, Proc. Am. Clin. Oncol., 12:60. Abstract 42.

Los intervalos de dosis para los fármacos antitumorales en las composiciones de la invención pueden ser menores, iguales o mayores que las dosis diarias típicas prescritas para el tratamiento sistémico de los pacientes. Por ejemplo, las dosificaciones de 5'-FU equivalentes al 50% de las dosificaciones estándar usadas para tratar el cáncer colorrectal con el 5'-FU en seres humanos (300-450 mg/m^{2} i.v., diario durante 5 días) dio como resultado una reducción de 80-90% del volumen de implantes de tumor cancerígeno de colon HT29 ectópico en ratones scid. El uso de la membrana de p-GlcNAc como una matriz de suministro del fármaco para la administración del 5'-FU redujo la dosificación requerida para reducir espectacularmente el volumen del tumor en el 50% comparado con los animales control de administración intravenosa. Se pueden encontrar detalles relacionados con estos datos en la Sección de ejemplo 21 de la patente de Estados Unidos 5.635.493. En los casos en los que son necesarias dosis mayores, estas dosis mayores pueden ser toleradas si los fármacos son suministrados localmente en el sitio del tumor, y por lo tanto, otros tejidos incluyendo las células sanguíneas, no son expuestos fácilmente a los fármacos.

Determinados agentes antitumorales son vesicantes, incluyendo dactinomicina, daunomicina, doxorrubicina, estramustina, mecloretamina, mitomicina C, vinblastina, vincristina y vindesina; mientras que determinados agentes antitumorales son irritantes incluyendo la carmustina, decarbazina, etopósido, mitramicina, estreptozocina y tenipósido. Los vesicantes e irritantes producen efectos secundarios adversos, incluyendo la extravasación e irritación de tejidos con dolor, enrojecimiento, hinchazón, y otros síntomas. Además, de algunos de los efectos secundarios puede resultar la necrosis tisular. La membrana de p-GlcNAc y los materiales de gel de las composiciones de la invención usados para la liberación tópica y controlada de los fármacos antitumorales tiene propiedades de curación de heridas. Por lo tanto, los tejidos normales que están en contacto con los fármacos antitumorales vesicantes o irritantes suministrados por la membrana de p-GlcNAc y formulaciones de gel de la invención, no son dañados tan fácilmente y se curarán más rápido debido a los efectos activos de curación del componente de p-GlcNAc de las composiciones que contienen p-GlcNAc de la invención.

6. Ejemplo Purificación de la p-GlcNAc usando el método de purificación con fuerza mecánica

En esta sección, la p-GlcNAc se purificó usando la técnica de la fuerza mecánica descrita en la Sección 5.1, véase antes.

6.1. Materiales y métodos/resultados

Condiciones del cultivo de diatomeas: La especie diatomea Thalassiosira fluviatilis se hizo crecer en cultivo de acuerdo con los procedimientos descritos en la patente de Estados Unidos 5.635.493, incorporada en el presente documento por referencia.

Procedimientos de SEM: Las técnicas de SEM usadas aquí fueron las siguientes: Se usó un instrumento Zeiss 962 con un voltaje acelerador de 10 kV, y una distancia de trabajo de 15 mm. Se usó un aparato Polaroid tipo 55 p/n (u4) con diferentes aumentos, como se indica. Revestimiento de la muestra: revestimiento de carbón (100 \ring{A}) y 100 \ring{A} aupd.

(a) Preparación de la muestra: Para la fijación principal, el medio de crecimiento del cultivo se sustituyó por glutaraldehído al 2% en DMEM de Eagle sin suero. Se llevaron a cabo varios cambios para asegurar una transición completa del medio de crecimiento al fijador. La fijación se produjo en 0,5 horas a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se transfirieron a viales recientes que contenían glutaraldehído al 2% en cacodilato de Na 0,1 M a pH 7,2 con sacarosa 0,1 M y fijado durante 1,5 horas adicionales a temperatura ambiente.

Procedimiento de purificación de la p-GlcNAc: la p-GlcNAc se purificó del cultivo de diatomeas usando la técnica de la fuerza mecánica descrita en la sección 5.1, véase antes. Específicamente, se separaron las fibras de p-GlcNAc de los cuerpos celulares de las diatomeas sometiendo el contenido del cultivo a tres golpes cortos de movimiento de mezcla a la velocidad superior en un mezclador Waring. El tiempo total de los tres golpes fue aproximadamente un segundo. La suspensión resultante se centrifugó a 3500 rpm en un rotor de ángulo fijo Sorvall GS-4, durante 20 minutos a aproximadamente 10ºC. El líquido sobrenadante se decantó, y se volvió a centrifugar, esta vez a 4000 rpm, en un rotor de ángulo fijo Sorvall GS-4 durante 20 minutos a aproximadamente 10ºC. Otra vez se decantó el líquido sobrenadante y se centrifugó a 4000 rpm a 10ºC. El líquido sobrenadante final de la tercera centrifugación era transparente, con pocos o ningún flóculo flotante visible en el líquido. El líquido sobrenadante transparente se decantó en una unidad de filtración Buchner equipada con una membrana de filtro de poliéter-sulfona Supor-800 con un tamaño de poros de 0,8 \mum (Gelman, Inc.), después se aplicó succión y el líquido se filtró de la suspensión de fibra, permitiendo recoger las fibras sobre la membrana. Las fibras recogidas se lavaron con 1 litro de H_{2}O destilada y desionizada a 70ºC. Cuando se hubo drenado prácticamente toda el agua, las fibras se lavaron, con succión, con 1 litro de HCl 1 N a 70ºC. Cuando se hubo drenado la mayor parte de la solución ácida, las fibras se lavaron con 1 litro de H_{2}O destilada y desionizada a 70ºC, usando succión. Cuando se hubo drenado la mayor parte del agua de lavado, las fibras se lavaron con 1 litro de etanol al 95% a temperatura ambiente, y se aplicó vacío. Después, se quitó la membrana de filtro sobre la que se había recogido la membrana de fibra blanca, de la unidad de filtración y la membrana y su soporte de membrana se secaron en un horno de secado a 58ºC durante 20 minutos, después de lo cual la membrana y su soporte se pusieron en un desecador durante 16 horas.

Después de este procedimiento de purificación, el rendimiento de la p-GlcNAc a partir de un cultivo de 1000 ml fue 6,85 miligramos por litro de cultivo de diatomeas.

7. Ejemplo Purificación de p-GlcNAc usando el método de purificación biológico/químico

En esta sección, la p-GlcNAc se purificó usando dos de las técnicas químicas/biológicas descritas en la Sección 5.1, véase antes. Brevemente, la p-GlcNAc se purificó por tratamiento con HF en un caso, y por tratamiento con ácido/neutralización en el segundo caso.

7.1. Materiales y métodos/resultados

Condiciones de cultivo de las diatomeas: La especie de diatomea Thalassiosira fluviatilis se hizo crecer en cultivo de acuerdo con los procedimientos descritos en la patente de Estados Unidos 5.635.493, incorporada en el presente documento por referencia.

Procedimientos de SEM: La técnica usada en este estudio fue como se ha descrito antes.

Procedimiento de purificación: Primero, se purificó la p-GlcNAc por tratamiento con HF. Específicamente, se añadieron 2,42 ml de una solución de HF al 49% (29 N) al contenido de diatomeas del cultivo, bajo una campana de humos, a temperatura ambiente, para cada 1000 ml de volumen de cultivo celular original, dando como resultado una solución de HF 0,07 M. Después, la mezcla se agitó vigorosamente durante aproximadamente 30 segundos, haciendo que apareciera una espuma persistente encima del líquido. El recipiente se dejó reposar sin perturbar durante 5-6 horas para dejar que sedimentaran las partículas pesadas. Al final de este periodo de tiempo, se había formado una capa de espuma, mientras que el propio líquido se dividió en dos estratos: primero, una capa verde muy oscuro estrecha que reposaba en la parte inferior del recipiente debajo de una segunda fase de color verde-grisáceo mucho más clara y turbia que representaba, quizás el 85-90% del volumen total de líquido. La capa de espuma se sifonó cuidadosamente, usando un tubo de vidrio capilar y succión a vacío. Después, el líquido sobrenadante grisáceo turbio se sifonó con cuidado de no perturbar la capa inferior oscura, que consistía principalmente en los cuerpos celulares sedimentados, y se transfirió a un recipiente de plástico separado. El líquido sobrenadante grisáceo turbio se dejó reposar sin perturbar durante 16 horas adicionales. El líquido inicialmente era casi incoloro, gris claro, pero no transparente. Después de 16 horas de sedimentación, quedaba una pequeña cantidad de espuma en la parte superior de la parte principal del líquido y se había depositado una pequeña cantidad de materia verde en la parte inferior del recipiente. El líquido era de color más claro, pero todavía no era transparente. Se sifonó como antes la espuma de la parte superior del líquido. Después la parte principal del líquido se sifonó cuidadosamente, dejando detrás una pequeña cantidad de material verde sedimentado en la parte inferior del recipiente. El líquido que se aisló de esta forma, contenía la mayor parte de las fibras de p-GlcNAc y algunas impurezas.

Para separar las proteínas y otros materiales no deseados liberados por las diatomeas durante las etapas precedentes en el procedimiento del líquido que contenía las fibras, la suspensión del resto de fibras y células se lavó con dodecilsulfato sódico (SDS). Específicamente, se añadió el volumen necesario de una solución de SDS al 20% para llevar la concentración final del líquido de SDS al 0,5% en volumen. El recipiente que contenía el líquido se cerró, se aseguró en una posición horizontal en una máquina agitadora, y se agitó durante 24 horas a aproximadamente 100 agitaciones por minuto. Inmediatamente después de iniciar la agitación, empezaron a aparecer flóculos grandes de fibras de p-GlcNAc blancas en suspensión, y una cantidad considerable de espuma acumulada en la cámara de aire de los recipientes. Al final de los lavados con SDS, el contenido de los recipientes se transfirió a un equipo de filtración Buchner provisto de una membrana de filtro de poliéter-sulfona Supor-800, con un tamaño de poros de 0,8 micrómetros (Gelman, Inc.) El líquido se filtró con succión, y las fibras de p-GlcNAc y el líquido se recogieron sobre la membrana de filtro.

Después, las fibras de p-GlcNAc recogidas sobre la membrana de filtro se lavaron más. Primero, las fibras se lavaron con H_{2}O destilada, desionizada caliente (70ºC), usando tres veces el volumen de la suspensión original. Mediante un chorro de agua usando H_{2}O destilada y desionizada, los terrones de fibras blancas recogidos en la membrana de filtro Buchner se transfirieron a un mezclador Warning y los terrones se desintegraron con aproximadamente 10 golpes de mezclado cortos. La suspensión de las fibras desintegradas se transfirió a un embudo de filtro Buchner equipado con una membrana de filtro de poliéter-sulfona como se ha descrito antes, y el líquido se separó con succión. Las fibras recogidas se lavaron con 1000 ml de solución de HCl 1 N (70ºC) caliente, y posteriormente se lavaron con 1000 ml de H_{2}O destilada y desionizada caliente (70ºC). Finalmente las fibras se lavaron con 1000 ml de etanol al 95% a temperatura ambiente, y se filtraron hasta sequedad. Después, la membrana de fibra y la membrana de filtro que soportaba la membrana de fibra se secaron en un horno de secado a 58ºC durante 20 minutos. Después, la membrana y el soporte de membrana se pusieron en un desecador durante 16 horas. Después la membrana se desprendió cuidadosamente de la membrana de filtro.

Segundo, la p-GlcNAc se purificó usando el procedimiento de tratamiento con ácido/neutralización descrito en la Sección 5.1, véase antes. Específicamente, la p-GlcNAc se procesó como se ha descrito antes en esta Sección, hasta antes de la etapa de lavado con SDS, momento en el que la solución se neutralizó a un pH de aproximadamente 7,0 por adición de una solución de Tris 2,9 M. El rendimiento de p-GlcNAc de este procedimiento de purificación particular fue 20,20 miligramos por litro de cultivo de diatomeas, aunque, como media, se obtuvieron aproximadamente 60 miligramos por litro de cultivo de diatomeas. En la Figura 3 se muestra una micrografía de SEM de una membrana formada como resultado del procedimiento de purificación por tratamiento con ácido/neutralización.

8. Ejemplo Desacetilación de p-GlcNAc

Se suspendió una membrana de p-GlcNAc en una solución acuosa de NaOH al 50%. La suspensión se calentó a 80ºC durante 2 horas. La membrana desacetilada resultante se secó y se estudió por microscopía electrónica de barrido, como se muestra en la Figura 5.

9. Ejemplo Reformulación de p-GlcNAc

Se disolvió una membrana de p-GlcNAc (16,2 mg) en 1 ml de una solución de dimetilacetamida que contenía LiCl al 5%. La solución que contenía p-GlcNAc se puso en una jeringuilla y se extruyó en 50 ml de agua pura para precipitar las fibras. El material de fibra resultante se estudió usando microscopía electrónica de barrido, como se muestra en la Figura 6.

10. Ejemplo Preparación de una composición de EA/ p-GlcNAc de la invención

Ro91-0612/001 (también denominado en el presente documento "Ro61") es un antagonista de endotelina no basado en péptido y no específico, con la estructura representada en la Fórmula I, véase antes. Su nombre químico, en forma de sal, es la sal de sodio (1:2) de la [6-(2-hidroxi-etoxi)-5-(2-metoxi-fenoxi)-2-[2-(1H-tetrazol-5-il)-piridin-4-il]-pirimidin-4-il]amida del ácido 5-isopropil-piridina-2-sulfónico, y su peso molecular es 649,59. Su solubilidad en agua es mayor que 3%. La potencia inhibidora de la unión de Ro61 (CI_{50}) al receptor ETA es 1-20 mM y al receptor ETB es 20-30 nM. Su potencia inhibidora funcional (pA2) con respecto al receptor ETA es 9,5 y con respecto al receptor ETB es 7,7. Su dosis in vivo recomendada es 1-30 mg/kg vía i.v. o ip. Su dosis in vitro recomendada es de 10^{9} a 10^{-5} M.

Ro61 para usar en una composición de la invención, inicialmente se proporcionó en forma de un polvo liofilizado de Acetilion Ltd., Allschwill, Suiza, que se suspendió en agua estéril, y el pH se ajustó a 4,0 con ácido clorhídrico estéril. Alternativamente, Ro61 se sintetizó usando técnicas conocidas en la técnica.

Se preparó una suspensión de fibras de p-GlcNAc como sigue: la p-GlcNAc preparada por el procedimiento biológico/químico descrito en la Sección de ejemplo 7, véase antes, se volvió a suspender en agua destilada-desionizada y se agitó para formar una suspensión fibrosa de aproximadamente 1 mg/ml. La suspensión de fibras después se secó en horno a 60ºC durante 2 h para formar membranas de polímero de p-GlcNAc. Las membranas se desacetilaron en solución de NaOH al 40% a 80ºC durante 2 h. Cuando se alcanzó el 100% de desacetilación de las membranas, se lavaron con agua destilada-desionizada hasta que se alcanzó un pH de 7,0.

Después, las membranas desacetiladas lavadas se convirtieron en la sal de lactato de la p-GlcNAc en presencia de ácido láctico, esencialmente como se describe en la patente de Estados Unidos 5.623.064, incorporada en el presente documento por referencia. Brevemente, se suspendió la p-GlcNAc desacetilada en un medio orgánico tal como 2-propanol (que contenía 10% de agua) para humedecer así todo el material de p-GlcNAc desacetilada. Se añadió con agitación, una cantidad adecuada de solución acuosa de ácido láctico al 50%. El ácido láctico debe ser de calidad reactivo y se debe analizar para determinar la concentración exacta de ácido láctico disponible presente (es decir, no esterificado. Esto se llevó a cabo generalmente por valoración con NaOH 0,1 N hasta el punto final de la fenolftaleína (pH 7,0). La mezcla se dejó agitar al menos dos horas a temperatura ambiente. Se puede aumentar un poco el calor para aumentar la velocidad de la reacción. El tiempo de reacción se puede prolongar, o se puede aumentar la cantidad de ácido láctico acuoso al 50% para asegurar que la reacción se completa. Después, la suspensión se filtró finamente a través de un embudo Buchner usando papel de filtro sin cenizas cuantitativo, y el material, en forma de una membrana, se lavó con 2-propanol anhidro. Después, la membrana se dejó secar al aire en una campana de humos durante 2 horas y después se puso en un horno a 40ºC toda la noche.

Después, se preparó un gel de EA/p-GlcNAc para inyección disolviendo las membranas de p-GlcNAc-lactato en agua destilada-desionizada a la concentración deseada, por ejemplo p-GlcNAc-lactato al 2% en peso, y añadiendo R061 a la solución. La concentración final de Ro61 en el gel se ajustó de forma que cada animal recibiera 3 mg/kg en una muestra de gel de 200 \mul. Opcionalmente, se puede añadir un propilenglicol (2-propanodiol) de calidad reactivo a la solución de p-GlcNAc a una concentración final de propilenglicol entre 1-10%. En algunos casos, se puede añadir un conservante para evitar la contaminación bacteriana y/o fúngica. De acuerdo con otras realizaciones, se pueden preparar concentraciones de p-GlcNAc-lactato en el intervalo de 0,1% a 4,0%, como se ha descrito antes. La viscosidad de estas preparaciones aumenta cuando aumenta el porcentaje de p-GlcNAc-lactato, de forma que las formulaciones que tienen 0,5% o más de p-GlcNAc-lactato se comportan como geles.

11A. Ejemplo B16 como un modelo de tumor sensible a la endotelina

Se evaluaron las células B16 para usar como un sistema de modelo de tumor sensible a la endotelina. Las células B16, es decir, de línea celular de melanoma murino B16 (de origen fibroblástico), se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville MD) en forma de una solución madre congelada. Las células se cultivaron en medio completo (CM): RPMI 1640 (Irvine Scientific, Santa Ana CA) complementado con suero bovino fetal inactivado con calor al 10% (Summit Biotechnologies, Ft. Collins CO), penicilina (50 unidades/ml), estreptomicina (50 \mug/ml), L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales en MEM 0,1 mM (Gibco BRL, Gaithesburg MD), piruvato sódico 1 mM, y 2-mercaptoetanol 0,05 mM (Sigma Immunochemicals, St Louis MO)). Las células se hicieron crecer a 37ºC en un incubador humidificado con CO_{2} al 5% y ajustado a 1 x 10^{5} células/ml cada segundo día.

Se analizaron los niveles de endotelina y expresión del receptor de endotelina (ETR) en las células B16, como sigue: se midió la ET1 en los líquidos sobrenadantes del cultivo de B16 por un radioinmunoensayo competitivo (RPA 545, Emersham, Milford Ma) con ligando radiactivo y un anticuerpo específico para ET1. Se hicieron reaccionar la ET unida y libre con un segundo sistema de fase de anticuerpo seguido de separación magnética. Se determinó una curva patrón calculando el porcentaje de ligando unido/patrón cero (B/B_{0}), y se pudo leer la concentración de ET a partir de esta curva patrón. La recuperación del procedimiento de extracción fue 75 \pm 5% basado en los patrones de plasma (4-20 fmoles/ml). La variación entre ensayos era 10%, y la variación dentro del ensayo era 9%, para el procedimiento de radioinmunoensayo de ET.

Usando este ensayo en un experimento, se encontró que los niveles de ET1 iniciales en líquidos sobrenadantes de cultivos de B16 de 24 h eran 1,269 fmol/ml. La adición a los cultivos de agonista ETA o ETB 10 \muM o ambos indujo una mayor proliferación de las células B16, del 137%, 117% y 164% de los controles no tratados, respectivamente, con los correspondientes niveles de ET1 de 34,01, 1,158, y 34,01 fmol/ml, respectivamente. En un experimento posterior, los niveles iniciales de ET1 en cultivos de B16 de 24 h eran 597 \pm 58 fmol/ml y la adición de un agonista no selectivo (ET1), un agonista del receptor ETB selectivo (BQ3020) 10 \muM o ambos, aumentó la proliferación de las células B16 comparado con los controles no tratados, en el 154%, 116% y 141%, respectivamente (véase la Tabla 1 a continuación). Estos datos indican que las células de melanoma B16 murino expresan los ETR, que son sensibles a los antagonistas de la endotelina establecidos.

TABLA 1

	Ligando (Receptor)	% de proliferación comparado con controles no tratados
Agonistas	ET1(ETA>ETB)	154 (\pm 20,9)
	BQ 3020 (ETB)	116 (\pm 0,8)
	ET1 + BQ 3020	141 (\pm 4,1)

Además, se determinó que las células B16 expresaban receptores de endotelina mediante tinción de inmunofluorescencia usando el kit de citrometría de flujo intracelular de Pharmigen con anticuerpos anti-receptor de la endotelina citoplasmáticos, es decir, dirigidos contra la región citoplasmática del receptor (Research Diagnostics Inc., Flanders NJ) y controles de anticuerpo isotípico IgG anti-ratón de oveja (Sigma Immunchemicals, St. Louis MO). De acuerdo con este procedimiento, las células B16 se lavaron en tampón de Cytofix/Cytoperm (del kit de Pharmingen) y se incubaron durante 20 min con una solución de permeabilización (Triton al 0,1% x 100, en citrato sódico al 0,1%). Después, las células se incubaron a 4ºC en la oscuridad durante 30 min con anticuerpos del receptor de endotelina primarios o control isotipo, y se lavaron e incubaron 30 min adicionales con el anticuerpo secundario marcado con FITC (IgG anti-oveja de ratón; Sigma). Las células se visualizaron y se fotografiaron usando un microscopio de investigación Axioplan (Carl Zeiss Unc, Jena Alemania) equipado con una fuente de luz de mercurio de 100 vatios y un objetivo Plan-Neufluar na 1.3.

Estos experimentos de teñido de inmunofluorescencia mostraron que las células de melanoma B16 expresaban niveles detectables de receptores de ETA y ETB.

Los ensayos de unión con ET-1^{125} también sugerían que las células B16 expresen receptores de ET. Estos ensayos se llevaron a cabo como sigue: se suspendieron células musculares lisas vasculares aórticas denominadas células A10, células B16 y células CHO con una concentración de 2 x 10^{6} células/ml en tampón de unión (Tris/HCl 50 mM, pH = 7,4, EDTA 5 mM, y BSA al 0,5%) en tubos individuales. Las células A10 se usaron como un control positivo de ETA, mientras que las células CHO se usaron como un control negativo, demostrando que no había unión de ET1 marcado, de acuerdo con la ausencia de ETR en esta linea celular.

Se añadió una parte alícuota de 21 \mul de (3-[^{125}I] yodotirosil)endotelina-1 (ET1-I^{125}, de Amersham Life Science Inc, Arlington Heights, IL) a cada tubo con una concentración final de 10^{-12} M. Después las células marcadas se dividieron en partes alícuotas en tubos de microcentrífuga y se añadieron 18 \mul de ET1 sin marcar (con una concentración final de 10^{-8} M) o HBSS. Se mezclaron los tubos y cada muestra se dividió en partes alícuotas de 300 pl, se pusieron en tubos siliconizados y se agitaron durante 2,5 horas a 37ºC. Después de incubación, los tubos se centrifugaron a 10.000 rpm durante 6 minutos, se volvieron a suspender los sedimentos celulares mediante mezcla vortical en 300 \mul de tampón de unión, y se lavaron dos veces otra vez en tampón de unión. Después del lavado final, las células se volvieron a suspender en 500 \mul de NaOH 1 N, se agitaron durante 10 minutos a 37ºC y se pusieron en tubos de centelleo para el recuento en un sistema de recuento gamma Packard Cobra Auto-gamma 5000 Series (Modelo 5002) (Packard Instrument Co., Meridea, CT).

Los resultados de estos ensayos de unión de ET1, que demuestran que las células B16 expresan ETR, se muestran en la Tabla 2 a continuación.

TABLA 2

Unión de ET1 a células tumorales B16
	A10	B16	CHO
Unión de ET1*	53885	25605	119 (\pm91)
	(\pm 2555)	(\pm 3801)
Unión de ET1 con competidor**	1135	1398	346 (\pm 259)
	(\pm 120)	(\pm 691)
Los resultados se expresan como cpm medios por 10^{6} células (\pm ETM)
* Se añadió ET1-I^{125} con una concentración final de 10^{-12} M.
** El competidor era ET1 sin marcar añadido con una concentración final de 10^{-8} M.

11B. Ejemplo Inhibición por Ro61 de la proliferación celular de melanoma in vitro

Los esplenocitos normales no muestran niveles visibles de ETR cuando se detectan por inmunofluorescencia como se ha descrito antes. Debido a la facilidad de aislamiento de los esplenocitos y de cultivo, se usaron como células control para evaluar los efectos de Ro61 en la proliferación celular. Se recogieron esplenocitos de ratones hembra de 6-8 semanas de edad C57BL/6 (H-2b) (Jackson Laboratories, Bar Harbor MA) como sigue: se sacaron los bazos, se pusieron en CM, y sus células se dispersaron con un émbolo de jeringa de 3 cc. Después, la suspensión celular se filtró a través de un filtro celular de 70 \mum y se lisaron los eritrocitos con solución de lisis de cloruro amónico (preparada mezclando 9 partes de cloruro amónico 8,3 g/l; 1 parte de Tris 20,59 g/l, pH 7,65, inmediatamente antes de usar). Después los esplenocitos se lavaron y se volvieron a suspender en CM.

Ro61 se obtuvo en forma de polvo liofilizado de Acetelion Ltd, Allschwill, Suiza, como se ha descrito antes, y se llevaron a cabo ensayos de proliferación para evaluar el efecto de Ro61 en la proliferación de células B16 in vitro. Más específicamente, se añadió Ro61 en HBSS con concentraciones crecientes a una placa de cultivo de 96 pocillos. Después, se añadieron las células B16 o los esplenocitos control como se ha descrito antes, a los pocillo con una concentración de 10^{5} células por pocillo, y se hicieron crecer durante 72 h. La proliferación celular se ensayó usando el kit de CellTiter 96 para la medición de la proliferación celular no radiactiva (Promega, Madison WI) como sigue: Brevemente, las células se incubaron con 15 ml de colorante MTT (de Promega kit) durante 4 horas, después de lo cual era visible la formación de cristales de formazán. Los cristales se disolvieron en 50 ml de solución de solubilización/parada (de Promega kit) durante 30 min a temperatura ambiente, y se midieron los cambios de color como DO a 570 nm. Se restó la DO de fondo a 630 automáticamente. Se determinaron los valores medios de los pocillos por triplicado. La proliferación o muerte celular también se registró por fotografía de microscopía óptica con una potencia focal 40X.

En la Figura 7 se representa el efecto inhibidor de Ro61 en las células de melanoma B16. La proliferación de las células tratadas con Ro61 se expresa como un porcentaje de las células control no tratadas. Se determinaron los valores medios de los pocillos por triplicado. Como puede verse en la Figura 7, Ro61 inhibió la proliferación de las células B16 (círculos negros) pero no inhibió los esplenocitos normales (círculos blancos). Además, cuando se añadió Ro61 con concentraciones crecientes a las células en el cultivo, se observó una inhibición dependiente de la dosis. Este efecto se observó con concentraciones 0,1 \muM (22% de inhibición comparado con los controles no tratados) y era máximo con 10 \muM (83% de inhibición). Por el microscopio, a la concentración más alta de Ro61, las células B16 ya no tenían una forma del huso de tipo fibroblasto normal, si no que eran redondas y dispersas con poca viabilidad (véase las Figs. 17A-17B). En contraste con esto, la adición de la concentración incluso más alta de Ro61 (10 \muM) sólo afectó mínimamente a los esplenocitos.

También se encontró que los niveles de endotelina en los líquidos sobrenadantes del cultivo de B16 aumentaron (de 513 \pm 27 fmol/l con 50 nM de Ro61 a 954 \pm 31 fmol/l con 5 \muM de Ro61) de una forma dependiente de la dosis (p<0,001). Esta observación está de acuerdo con el bloqueo de ETR por Ro61, que da como resultado la interrupción de un bucle de retroalimentación mediado por el receptor.

Puesto que Ro61, un inhibidor del receptor de ET, producía la inhibición de la proliferación de células B16, era interesante determinar si la adición de agonistas peptídicos específicos para ETA o ETB podía invertir este efecto, es decir, por competición con Ro61 por los sitios de unión al receptor. El agonista, BQ-3020-[Ac-[Ala11,15]-endotelina(6,21), es decir, BQ3020 (Novabiochem, nº de catálogo A1 4534) y el agonista, [Ala^{1,3,11,15}]-endotelina1 (Sigma Immunochemicals, St. Louis MO, nº de catálogo: E6877), se suspendieron en HBSS para usar. Se cultivaron 5 x 10^{4} células con agonista solo, como ambos agonistas juntos o sin ninguno, con una concentración 10 nM en cada pocillo, y después se añadió Ro61 con diferentes concentraciones en los pocillos.

Como se demuestra en la Figura 10, se evitó la inhibición por Ro61 de la proliferación de B16 por adición de agonistas del receptor de ET. La proliferación de células tratadas con Ro61 se expresa como un porcentaje de las células control no tratadas. Se determinaron los valores medios de los pocillos por triplicado. Primero, como se indica en el eje Y de la Figura 10 (0 concentración de Ro61), la adición del agonista BQ3020 (triángulos negros) o del agonista de ET-1 (rombos blancos) solo, o de los dos agonistas combinados (cuadrados blancos), inducían la proliferación de las células B16. Para el agonista BQ3020, la proliferación era el 137% de los controles no tratados, para el agonista de ET1, la proliferación era el 117% de los controles no tratados, y para la combinación de agonistas, la proliferación era el 164% de los controles no tratados.

Como se indica además en la Figura 10, la adición de estos agonistas también contrarrestaba la inhibición inducida por dosis crecientes de Ro61. Por ejemplo, la adición de ET1 con una concentración 10 nM invirtió completamente los efectos de Ro61 con una concentración 1 nM, y disminuyó la inhibición por Ro61 al 50% con 5 \muM. El agonista BQ3020 podía invertir significativamente los efectos de Ro61 5 \muM (sólo 12% de inhibición de la proliferación con 5 \muM). El efecto más significativo se observó con la combinación de los agonistas que inducían proliferación (el 123% de los controles no tratados), incluso con la adición de Ro61 0,1 \muM. Estos descubrimientos dependientes de la dosis definían una respuesta de proliferación mediada por el receptor de endotelina para las células B16 murinas que podía ser inhibida por un antagonista del ETR.

En otros experimentos, se ensayó Ro61, un antagonista tanto de ETA como de ETB que tenía una afinidad aproximadamente 10 veces mayor para ETA, junto con BQ123, un antagonista de ETA, y BQ788, un antagonista de ETB (ambos obtenidos en American Peptide Co., Sunnyvale, CA) para determinar el efecto de estos antagonistas en la proliferación de células B16 usando en ensayo de proliferación celular descrito antes. La presencia de BQ123, BQ788, BQ123 + BQ788, o Ro61-0612/001 (cada uno con una concentración total 10 \muM) en cultivo, dio como resultado la inhibición significativa de la proliferación (16, 18, 19 y 50%, respectivamente, comparado con los controles no tratados; p = 0,001, véase la siguiente Tabla 3).

TABLA 3

	Ligando (Receptor)	% de proliferación comparado con los controles no tratados
Antagonistas	BQ 123(ETA)	84 (\pm 6,6)
	BQ 788 (ETB)	82 (\pm 1,9)
	BQ123 + BQ788	81 (\pm 4,5)
	Ro61 (ETA>ETB)	50 (\pm 4,8)

Todavía en otros ensayos de proliferación, descritos antes, se ensayaron diferentes antagonistas de endotelina para determinar su efecto en la proliferación de células B16. Se compararon las células B16, que se habían depositado diez veces en animales y expresan un ETR de longitud completa de tipo salvaje, con células B16 control, denominadas FO, que expresan un ARNm de ETA truncado y parece que producen un receptor de ETA incompleto.

Como se representa en las Figuras 8 y 9, los antagonistas de endotelina, IRL, BQ123, BQ610, BQ485, BQ788, RES con concentración 10^{-6} M, inhibían todos la proliferación de células B16 comparado con los controles FO y los controles de agonistas de endotelina, ET1 y BQ3020.

12. Ejemplo Inducción por Ro61 de la muerte celular apoptótica del tumor de melanoma B16

Los estudios in vitro indicaban que el tratamiento con Ro61 no sólo contribuía a una inhibición de la proliferación celular, si no que también había un componente significativo de muerte celular o necrosis. De hecho, las células B16 tratadas con Ro61 mostraron un grado significativo de cambios morfológicos acordes con la muerte celular programada (véase la Figura 11).

Por lo tanto, se investigó el efecto de R061 en la muerte celular apoptótica de B16. Las células B16 se hicieron crecer en CM en matraces de cultivo de 25 ml, con o sin Ro61 1 \muM, a 37ºC en un incubador con CO_{2} al 5% durantes hasta 72 h. Se ensayó la apoptosis o muerte celular de las células usando el kit de detección de muerte celular in situ con fluoresceína (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) como sigue: Brevemente, las células se tripsinizaron y se lavaron con PBS que contenía albúmina de suero bovino al 1% (BSA). Después de fijarlas con una solución de paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7,4) durante 30 min, las células se permeabilizaron con una solución de Triton X100 al 0,1% en citrato sódico al 0,1% durante 2 min en hielo. Después, las células se lavaron y se marcaron con mezcla de reacción TUNEL (kit de Boehringer) durante 1 h a 37ºC y se lavaron. Se analizó la fluorescencia en un citómetro de flujo EPICS XL Coulter (Coulter, Miami FL). Las mediciones se compararon con un control positivo usando DNasa I 100 \mug/ml (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) durante 10 min a temperatura ambiente, para inducir la rotura del ADN bicatenario.

Como se representa en la Figura 12, el antagonista de endotelina Ro61 indujo apoptosis en células de melanoma B16 en cultivo. Por ejemplo, la adición de Ro61 1 \muM a las células B16 aumentó significativamente el porcentaje de células que sufrían apoptosis comparado con los controles no tratados (p = 0,0007). El aumento del porcentaje de células positivas por el ensayo TUNEL antes descrito era detectable tan pronto como a las 24 h y todavía era detectable a las 72 h. El efecto de la duración después del cultivo con Ro61 no era significativo; sin embargo, la mayor apoptosis de las células tratadas con Ro61 comparado con los controles no tratados era muy importante (12,7%, 95% intervalo de confianza: 11,7%-13,8%). Estos resultados establecían la presencia de señalización de células apoptóticas mediada por el ETR que podía ser inducido mediante un antagonista de ETR. Por lo tanto, la apoptosis contribuye al menos en parte a la inhibición de la proliferación celular y la muerte celular observada.

13. Ejemplo Inhibición de carcinomatosis intraperitoneal de melanoma B16 in vivo por un antagonista de endotelina o una composición de EA/p-GlcNAc de la invención

Los notables efectos de Ro61 en células B16 in vitro condujeron a estudios adicionales para evaluar el impacto del antagonismo de ETR en el crecimiento tumoral in vivo, usando un modelo de metástasis/carcinomatosis de melanoma B16 intraperitoneal (IP) agresivo. De acuerdo con este modelo, se inyectó por vía intraperitoneal en ratones hembra C57BL/6 5 x 10^{4} células B16 en 100 ml HBSS. Un día más tarde, se inyectaron a los ratones 100 \mul de HBSS solo (sin tratamiento), HBSS que contenía 3 mg/kg de Ro61 (administrado diariamente), HBSS que contenía 30 mg/kg de Ro61 (administrado diariamente), gel de p-GlcNAc (al 2%) solo, o gel de p-GlcNAc (al 2%) que contenía Ro61 18 mg/kg.

Los animales en los grupos tratados con HBSS que contenía Ro61 3 mg/kg o 30 mg/kg solo, también recibieron inyecciones i.p. diarias, mientras que todos los demás grupos se trataron sólo una vez. El gel de p-GlcNAc solo que se usó en este experimento se preparó como se indica en la Sección del ejemplo 10, véase antes, salvo la adición de Ro61. El Ro61/p-GlcNAc usado en este experimento también se preparó como se detalla en la Sección 10 anterior. Los ratones se sacrificaron después de 7 días y se evaluó la presencia de enfermedad intraperitoneal. Más específicamente, se contaron las colonias de tumores individuales con un microscopio de disección para cada animal en la superficie peritoneal, mesenterio, hígado, bazo, y páncreas. Los estudios se llevaron a cabo en condiciones de doble ciego. Se tomaron fotografías del peritoneo y órganos digestivos así como de secciones del mesenterio, hígado, bazo y grasa pancreática y peritoneo, para el análisis histológico mediante tinción con H y E así como melanina.

La Figura 13A muestra que los ratones que recibieron inyecciones IP diarias de Ro61 con una dosis baja, por ejemplo, 3 mg/kg durante 6 días (para un total de 18 mg/kg) no presentaban un número significativamente menor de metástasis o colonias tumorales por animal. (Tal como se usa en el presente documento, el término metástasis se refiere a colonias tumorales detectadas en el peritoneo y órganos digestivos de ratones a los que se han inyectado células de melanoma B16 de acuerdo con el modelo de carcinomatosis descrito antes).

En contraste, las inyecciones diarias de dosis mayores de Ro61 solo de 30 mg/kg durante 6 días (para una dosis total de 180 mg/kg) disminuyeron significativamente el número medio de colonias tumorales el día 7 después de la inyección del tumor.

Además, como se representa en la Figura 13B, el gel de p-GlcNAc solo, redujo el número medio de colonias tumorales comparado con los controles no tratados, cuando se inyectó IP, pero no tuvo ningún efecto significativo en el crecimiento de las colonias cuando se inyectó por vía subcutánea (SC). La Figura 13B también muestra que la mayor reducción de las colonias tumorales se produjo con la administración de una sola dosis (18 mg/kg) de Ro61 formulado en el gel de p-GlcNAc (número medio de colonias = 2,7 \pm 1,4). La composición de gel/Ro61 dio como resultado significativamente menos colonias comparado tanto con la dosis alta de Ro61 (p = 0,001) como con el gel de p-GlcNAc solo IP (p = 0,02). El tratamiento con dosis baja de Ro61 y p-GlcNAc sola por vía SC no eran significativamente diferentes de los controles no tratados.

Para determinar si Ro61 tenía un efecto no sólo local debido a la p-GlcNAc si no también un efecto sistémico, se investigaron los efectos del tratamiento con Ro61 IP en un modelo de melanoma B16 subcutáneo, SC. Se inyectó por vía SC a ratones hembra C57BL/6 en el costado 5 x 10^{4} células de melanoma B16 en 100 \mul de HBSS. Después de 24 horas, los animales recibieron uno de los siguientes tratamientos (100 \mul, IP): HBSS (diario x 6), Ro61 30 mg/kg en HBSS (diario x 6), gel de p-GlcNAc (una administración) o Ro61 18 mg/kg en gel de p-GlcNAc (una administración). Se controló en los animales la aparición de tumor y el crecimiento durante un periodo de 3 semanas después de la inyección del tumor (n = 10 en todos los grupos).

Como se demuestra en la Figura 14, el modelo de melanoma B16 SC mostró que todos los animales que recibían Ro61 IP en HBSS desarrollaban tumores el día 17; sin embargo, había un retraso significativo en la aparición de tumor (el 50% de los ratones portaban tumor el día 15 comparado con el 100% de los ratones que portaban tumor el día 15 en los controles no tratados). La combinación de Ro61 más p-GlcNAc dio como resultado un retraso en la aparición del tumor (el 50% de los ratones portaban tumor el día 13) así como el 10% de los ratones sin tumor 21 días después de la inyección de tumor, lo cual sugería que la liberación sostenida de Ro61, en un compartimento separado del tumor, puede afectar significativamente al crecimiento del melanoma B16. No había diferencias en la aparición y crecimiento del tumor entre el grupo control no tratado y el grupo de p-GlcNAc IP.

Usando los modelos de carcinomatosis descritos antes, se evaluó el efecto de otros antagonistas de endotelina diferentes en la formación de colonia tumoral B16. En estos experimentos, se inyectó a los animales 100 \mul de muestras que contenían 14,3 mg/ml de cada fármaco o mezcla de fármacos en una sola dosis. Como se demuestra en la Figura 15, una mezcla de BQ123 (un antagonista de ETA) y BQ788 (un antagonista de ETB) con una concentración total final igual a la de Ro61 (un antagonista de ETA y ETB) disminuyó significativamente el número de colonias tumorales a un nivel similar al demostrado por Ro61, cuando se compara con las células B16 control no tratadas. Además, cuando la mezcla de BQ se combinó con p-GlcNAc como se ha descrito antes, el número de colonias tumorales disminuyó más a un nivel casi equivalente al observado con Ro61 más p-GlcNAc. Finalmente, el antagonista de ETA/ETB mixto, GRGDS, un pentapéptido disponible en el comercio (American Peptide Co.), cuando se combinó con p-GlcNAc, demostró una disminución incluso mayor del número de colonias tumorales que Ro61/p-GlcNAc (véase la Figura 15, última columna).

14. Ejemplo Supervivencia a largo plazo de ratones C57BL/6 después de estimulación de melanoma B16 intraperitoneal, con un antagonista de la endotelina solo o una composición de EA/p-GlcNAc de la invención

También se evaluó la terapia de antagonismo de la endotelina en experimentos in vivo de supervivencia a largo plazo. Los resultados se muestran en la Figura 16. Se inyectaron en ratones hembra C57BL/6 por vía intraperitoneal, 5 x 10^{4} células B16 en 100 ml de HBSS. Los animales se separaron aleatoriamente en 4 grupos para cualquiera de los siguientes tratamientos: (a) sin tratamiento (cuadrados negros); (b) 100 \mul de gel de p-GlcNAc solo (cruces); (c) 100 \mul de HBSS diario que contenía Ro61 3 mg/kg (triángulos negros); o (d) 100 \mul de gel de p-GlcNAc que contenía Ro61 3 mg/kg (cuadrados blancos). Se controló a los animales diariamente y se sacrificaron por razones humanitarias cuando se determinó que estaban moribundos.

Es interesante indicar que el melanoma B16 es un tumor extremadamente virulento, que da como resultado una tasa de supervivencia del 0% sistemáticamente en 19-20 días después de inyectar el tumor. Como se indica en la Figura 10, la inyección de p-GlcNAc sola retrasó la muerte 5 días pero no aumentó la tasa de supervivencia de los animales. Sin embargo, la combinación de p-GlcNAc y Ro61 con una dosis baja (3 mg/kg) también retrasó la muerte y el 33% de los animales no mostró pruebas de tumor a los 33 días después de inyectar el tumor. Las inyecciones diarias de la misma dosis baja de Ro61 solo, no afectaron a la supervivencia de los ratones.

15. Discusión de los resultados

Los estudios llevados a cabo en el presente documento muestran la prueba directa de que la inhibición de la unión de las endotelinas a sus receptores puede afectar a la proliferación normal de una línea celular de melanoma murino, tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, el antagonista de endotelina, Ro61, es un inhibidor de los receptores tanto ETA como ETB con una afinidad aproximadamente 10 veces mayor para ETA. Esto se correlaciona bien con la inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de células de melanoma por Ro61 en los experimentos, así como el efecto contrapuesto más fuerte a esta inhibición obtenido por la adición de un agonista de ETA a diferencia de un agonista de ETB. Además, en este documento también se ha demostrado que numerosos antagonistas de endotelina diferentes inhiben la proliferación celular de melanoma, incluyendo antagonistas específicos tanto de ETA como de ETB, por ejemplo BQ123, BQ485, BQ610, BQ788, RES e IRL.

Es interesante indicar que se ha mostrado que las células de melanoma expresan niveles altos de receptores de ET y son más susceptibles a la inhibición del antagonista de endotelina que los esplenocitos normales, que se sabe que tienen muchos menos receptores de ET de membrana. Por lo tanto, las pruebas presentadas en el presente documento apuntan a que los antagonistas de endotelina, tales como Ro61, BQ123, BQ485, BQ610, BQ788, RES e IRL tienen un efecto antiproliferativo en las células tumorales en cultivo, cuya inhibición del crecimiento de células tumorales es mediado por la unión a los receptores de endotelina que responde a agonistas peptídicos específicos para ETA y/o ETB.

Además, los presentes estudios indican que los antagonistas de endotelina solos o combinados con la p-GlcNAc descrita en el presente documento, reducen significativamente la carcinomatosis in vivo. Además, las composiciones de EA/p-GlcNAc de esta invención, por ejemplo Ro61/p-GlcNAc, aumentan notablemente la tasa de supervivencia de los animales portadores de células tumorales in vivo. El efecto de Ro61 parece que implica un mecanismo apoptótico de acción, que no contradice algunos de los mecanismos conocidos de acción de las endotelinas y sus mecanismos de transducción de señales.

Los estudios farmacocinéticos con Ro61 indican que es metabolizado relativamente rápido in vivo, por ejemplo, en 2-4 horas; sin embargo, cuando Ro61 se combina con el polímero p-GlcNAc de esta invención, Ro61 es retenido en el gel y es liberado más lentamente, y se puede detectar, por ejemplo, durante al menos 48 horas. Además, si la concentración del antagonista de endotelina en el gel aumenta, el antagonista se puede retener en el gel durante al menos 72 horas (no se muestran los datos). Por lo tanto, modificando la concentración del antagonista de endotelina en la p-GlcNAc de la invención, se puede obtener la liberación lenta deseada, y por lo tanto un efecto potenciado, del antagonista en el tratamiento de la enfermedad proliferativa.

Finalmente, como se indica en la siguiente Tabla 4, otros tipos de células que expresan el receptor ETA también reaccionan con el antagonista de endotelina Ro61 como se describe en el presente documento, es decir, para presentar una inhibición de la proliferación celular tras la exposición al antagonista de endotelina. Estos datos correlacionan, en diferentes tipos de células, la presencia, por ejemplo, del receptor ETA con el efecto de antagonistas de endotelina en la proliferación celular. Por ejemplo, estos resultados indican que si un tumor tal como un tumor pancreático, de mama o próstata, expresa el receptor ETA, se puede tratar con un antagonista de endotelina sensible a ETA, como se describe en el presente documento.

TABLA 4

	ETA	efecto de Ro61
control negativo	CHO	NO	NO (5/5)
melanoma de melanocitos	melanocito	SI	SI (2/2)
	B16F10	SI	SI (5/5)
	MEL 501	NO	NO
	MEL 888	SI	SI (2/3)
cáncer pancreático	ASPC I	SI	SI (5/5)
	ASPC4	NO	NO (5/5)
	CAPAN 1	NO	NO (4/5)
	PANC I	SI	SI (4/5)
	BXPC3	SI	SI (3/4)
cáncer de mama	MDA 231	NO	NO (3/3)
	MDA 453	SI	SI (3/3)
cáncer de próstata	DUI45	NO	NO (5/5)
	LN CAP	NO	NO (5/5)

La presente invención no está limitada en su alcance por las realizaciones específicas descritas en el presente documento, que sólo son ilustraciones de aspectos individuales de la invención, y los métodos y componentes funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. De hecho, diferentes modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en el presente documento, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción precedente y los dibujos que acompañan. Se pretende que dichas modificaciones estén dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Una composición antitumoral que comprende al menos un antagonista de endotelina combinado con una poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina, comprendiendo dicha poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina aproximadamente 4.000 a aproximadamente 150.000 monosacáridos de N-acetilglucosamina unidos covalentemente en una conformación \beta-1-4 libre de proteína, sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos o inorgánicos, y que tiene un peso molecular de aproximadamente 800.000 daltons a aproximadamente 30 millones de daltons.

2. Una composición antitumoral que comprende al menos un antagonista de endotelina combinado con una poli-\beta-1-4-glucosamina, comprendiendo dicha poli-\beta-1-4-glucosamina aproximadamente 4.000 a aproximadamente 150.000 monosacáridos de glucosamina unidos covalentemente en una conformación \beta-1-4 libre de proteína, sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos o inorgánicos, y que tiene un peso molecular de aproximadamente 640.000 daltons a aproximadamente 24 millones de daltons.

3. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en la que el antagonista de endotelina es un antagonista de endotelina no específico.

4. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en la que el antagonista de endotelina es un antagonista de endotelina específico de ETA.

5. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en la que el antagonista de endotelina es un antagonista de endotelina específico de ETB.

6. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en la que el antagonista de endotelina es un antagonista de endotelina basado en péptido.

7. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en la que el antagonista de endotelina es un antagonista de endotelina no basado en péptido.

8. La composición de la reivindicación 7, en la que el antagonista de endotelina no basado en péptido es un compuesto de pirimidil-sulfonamida.

9. La composición de la reivindicación 8, en la que el compuesto de pirimidil-sulfonamida es Ro61.

10. La composición de la reivindicación 1, en la que la poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina comprende un derivado de poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina en el que se ha desacetilado al menos un monosacárido de N-acetilglucosamina.

11. La composición de la reivindicación 10, en la que el monosacárido desacetilado se derivatiza a una sal de lactato.

12. La composición de la reivindicación 10, en la que se han desacetilado al menos aproximadamente del 25% a aproximadamente 75% de los monosacáridos de N-acetilglucosamina.

13. La composición de la reivindicaciones 1, 10 u 11, en la que la poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina se formula como un gel.

14. La composición de la reivindicación 1 ó 10, en la que la poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina es una matriz, hebra, cuerda, membrana, fibra o esponja.

15. La composición de la reivindicación 13, en la que el antagonista de endotelina se disuelve en el gel de poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina.

16. La composición de la reivindicación 2, en la que la poli-\beta-1-4-glucosamina se derivatiza a la sal de lactato.

17. La composición de la reivindicación 2 ó 16, en la que la poli-\beta-1-4-glucosamina se formula como un gel.

18. La composición de la reivindicación 2, en la que la poli-\beta-1-4-glucosamina es una matriz, hebra, cuerda, membrana, fibra o esponja.

19. La composición de la reivindicación 17, en la que el antagonista de endotelina se disuelve en el gel de poli-\beta-1-4-glucosamina.

20. La composición de la reivindicación 18, en la que el antagonista es el Ro61 y el gel de poli-\beta-1-4-glucosamina es un gel al 2%.

21. Uso de al menos un antagonista de la endotelina combinado con una poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina, comprendiendo dicha poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina aproximadamente 4.000 a aproximadamente 150.000 monosacáridos de N-acetilglucosamina unidos covalentemente en una conformación \beta-1-4, libre de proteína, sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos o inorgánicos, y que tiene un peso molecular de aproximadamente 800.000 daltons a aproximadamente 30 millones de daltons, para preparar una composición farmacéutica para usar en un método para tratar una enfermedad proliferativa, que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del mismo.

22. Uso de al menos un antagonista de endotelina combinado con una poli-\beta-1-4-glucosamina, comprendiendo dicha poli-\beta-1-4-glucosamina aproximadamente 4.000 a aproximadamente 150.000 monosacáridos de glucosamina unidos covalentemente en una conformación \beta-1-4, libre de proteína, sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos o inorgánicos, y que tiene un peso molecular de aproximadamente 640.000 daltons a aproximadamente 24 millones de daltons, para preparar una composición farmacéutica para usar en un método para tratar una enfermedad proliferativa, que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del mismo.

23. El uso de la reivindicación 21 ó 22, en el que la enfermedad proliferativa es el cáncer.