ES2242448T3 - Metodos y composiciones para el tratamiento de trastornos proliferativos celulares. - Google Patents
Metodos y composiciones para el tratamiento de trastornos proliferativos celulares.Info
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Abstract
Una composición antitumoral que comprende al menos un antagonista de endotelina combinado con una poli/-1-4-N-acetilglucosamina, comprendiendo dicha poli-/-1-4-N-acetilglucosamina aproximadamente 4.000 a aproximadamente 150.000 monosacáridos de N-acetilglucosamina unidos covalentemente en una conformación /-1-4 libre de proteína, sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos o inorgánicos, y que tiene un peso molecular de aproximadamente 800.000 daltons a aproximadamente 30 millones de daltons.
Description
Métodos y composiciones para el tratamiento de
trastornos proliferativos celulares.
La presente invención se refiere a métodos y
composiciones que comprenden al menos un antagonista de endotelina
combinado con una matriz de polisacárido de
poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina
(p-GlcNAc), para usar en el tratamiento del cáncer y
otras enfermedades proliferativas. Más específicamente, el
antagonista de endotelina de la invención puede ser un compuesto
peptídico o no peptídico, y la matriz de p-GlcNAc de
la invención está compuesta de un polímero de alto peso molecular
cuyos azúcares monosacáridos constituyentes están unidos en una
conformación \beta-1-4, y la cual
está libre de proteínas, y sustancialmente libre de aminoácidos
sencillos, ni otros contaminantes orgánicos e inorgánicos. Las
composiciones y métodos de la invención son útiles para inhibir el
crecimiento de tumores y otras células neoplásicas y/o para inhibir
la metástasis de células neoplásicas in vivo.
Las endotelinas son una familia de péptidos de 21
aminoácidos, por ejemplo, ET-1, ET-2
y ET-3, que en principio se caracterizan por sus
potentes propiedades vasoconstrictoras y angiogénicas (véase, por
ejemplo, Luscher y col., 1995, Agents Actions Suppl. (Suiza)
45: 237-253; Yanagisawa y col., 1988, Nature 332:
411-415).
Además parece que estos péptidos están
relacionados con factores de crecimiento tales como bFGF, y a menudo
actúan de forma sinérgica con ellos (véase, p. ej., Halaban, 1996,
Seminars in Oncology 23: 673-681; Reid y
col., 1996, Development 122: 3911-3919;
Markewitz y col., 1995, Am. J. Physiol. 268:
L192-L200; y Nelson y col., 1996, Cancer Res.
56: 663-668). Además, estos péptidos presentan
propiedades reguladoras de tipo citoquina y pueden influir en ellos
hormonas tales como la insulina y la angiotensina II, así como
factores de crecimiento tales como TGF-\beta y
TNF-\alpha (Nelson y col., véase antes; Suzuki y
col., 1989, J. Biochem. 106: 736-741; y
Lundblad y col., 1996, Crit. Care Med. 24:
820-826). La actividad de la endotelina es mediada
por la unión, con afinidades preferentes, a dos receptores acoplados
a proteínas G distintos, ETA y ETB, de una forma autocrina/paracrina
(véase, p. ej., Hocher y col., 1997, Eur. J. Clin. Chem. Clin.
Biochem. 35(3): 175-189; Shichiri y col.,
1991, J. Cardiovascular Pharmacol.
17:S76-S78).
Hay una variedad de agonistas y antagonistas de
receptores de endotelina (Webb y col., 1997, Medicinal Research
Reviews 17 (1): 17-67), que se han usado para
estudiar el mecanismo de acción de las endotelinas. Debido a que se
sabe que la endotelina tiene una potente actividad vasoconstrictora,
los antagonistas de endotelina en particular (también denominados
"antagonistas del receptor de endotelina" en la técnica) se han
estudiado en relación con su posible papel en el tratamiento de
enfermedades humanas, más concretamente, enfermedades
cardiovasculares tales como la hipertensión, insuficiencia cardiaca
congestiva, ateroesclerosis, reestenosis e infarto de miocardio
(Mateo y col., 1997, Pharmacological Res. 36 (5):
339-351). Por ejemplo, actualmente se están
sometiendo a evaluación clínica antagonistas de endotelina no
basados en péptidos que pertenecen a la familia de la
pirimidinil-sulfonamida, tales como Ro
46-2005 y bosentán, que interaccionan con el
receptor de endotelina a través de sus anillos aromáticos, para el
tratamiento de la hipertensión, enfermedad vascular, e insuficiencia
cardiaca congestiva. Estos antagonistas se pueden unir tanto a ETA
como a ETB con diferentes afinidades, y tienen ventajas frente a los
antagonistas basados en péptidos, porque tienen una mayor
estabilidad metabólica (Webb y col., véase antes; y Parris y col.,
véase antes). Además, también se han estudiado los antagonistas de
endotelina en relación con su posible papel en el tratamiento de
enfermedades renales tales como la función renal deteriorada en
cirrosis hepática e insuficiencia renal aguda
(Gómez-Garre y col., 1996, Kidney Int. 50:
962-972; Hocher y col., véase antes).
Más recientemente, se ha implicado a las
endotelinas y receptores de endotelina en una serie de
procedimientos de crecimiento celular normal y patológico, por
ejemplo, evolución del ciclo celular, crecimiento celular, y
desarrollo celular (véase, p. ej., Parris y col., 1997, Vascular
Medicine 2: 31-43; Markewitz y col., véase
antes; Morbidelli y col., 1995, Am. J. Physiol. 269:
H686-H695; y Battistini y col. 1993, Peptides
14: 385-399). Se ha mostrado que ET1 y ET3 son
factores mitógenos y quimiocinéticos para los tejidos normales que
van de las células endoteliales y epiteliales a macrófagos (véase,
p. ej., Webb y col., 1997, Medicinal Research Reviews 17 (1):
17-67; y Gomez-Garre y col., véase
antes). Además, se ha mostrado que la unión de las endotelinas a sus
receptores produce la síntesis de ADN, proliferación y movilización
celular en células normales y neoplásicas (Webb y col., véase antes;
Ziche y col., 1995, Cardiovasc. Pharmacol. 26:
S284-S286; y Yamashita y col., 1991, Res. Comm.
in Chem. Pathol. and Pharmacol. 74 (3):
363-369).
Esta capacidad potencial de las endotelinas para
mediar el crecimiento celular y la evolución del ciclo celular ha
conducido a algunos estudios iniciales de la expresión de la
endotelina y/o la presencia del receptor de endotelina en células
cancerígenas. Por ejemplo, se ha mostrado que ET-1
es sobreexpresado en el cáncer de mama y líneas celulares
pancreáticas e induce la proliferación en el tejido de cáncer de
mama, líneas celulares de ovario y tumores de próstata (véase, p.
ej., Moriatis y col., 1997, Eur. J. Canc. 33 (4):
661-668; Nelson y col., 1996, Cáncer Res. 56:
663-668; Patel y col., 1995, Br. J. Cáncer
71: 442-447; Oikawa y col., 1994, Br. J.
Cáncer 69:55 1059-1064; Shichiri y col., véase
antes; y Yamashita y col., véase antes). Además, se ha demostrado la
presencia de receptores de tipo ETA, que tienen una afinidad mayor
por ET1 y ET2, en líneas celulares de ovario (Moriatis y col., véase
antes) y tejidos de cáncer de mama (Yamashita y col., véase antes).
Uno de los pocos tumores que expresan receptores ETB que tienen una
afinidad similar por las tres isoformas de la endotelina es el
melanoma (Yohn y col., 1994, Biochem. Biophys. Res. Comm. 201
(1): 449-457). Es interesante que los receptores ETB
son altamente expresados en melanomas primarios o recurrentes pero
menos en melanomas metastáticos (Kikuchi y col., 1996, Biochem.
Biophys. Res. Comm. 219: 734-739).
Aunque estos estudios sugieren que los
antagonistas de endotelina podrían tener potencialmente aplicaciones
terapéuticas en el tratamiento del cáncer, hasta la fecha no ha
habido estudios que demuestren ninguna de dichas aplicaciones
terapéuticas. De hecho, no está claro el papel que puede jugar la
endotelina en promover la enfermedad proliferativa tal como
diferentes enfermedades proliferativas vasculares e hipertrofia
prostática benigna (HPB) (Webb y col., véase antes y Kenny y col.,
1997, J. Med. Chem. 40 (9): 1293-1315).
Además, aunque las patentes de Estados Unidos 5.550.110 y 5.641.752
describen el uso de antagonistas de endotelina hexapeptídicos
específicos para el tratamiento del cáncer, realmente no hay datos
en estas descripciones relativos al tratamiento del cáncer, ni
indicaciones de como llevar a cabo dicho tratamiento, o si realmente
dicho tratamiento tendría éxito (véase también, solicitudes PCT WO
97/37987, 97/08169, WO 96/11927, y WO 94/03483, solicitud de patente
canadiense 2072395, y patente de Estados Unidos 5.658.943).
El documento
WO-A-9639122 describe diferentes
compuestos antitumorales que se pueden encapsular con fibras de
p-GlcNAc para las composiciones de suministro lento
del fármaco. Dichos compuestos antitumorales incluyen agentes
alquilantes, antimetabolitos, compuestos sintéticos, productos
terapéuticos hormonales, fármacos de investigación, productos
biológicos y potenciadores de la radiación.
Los compuestos antagonistas de endotelina y los
métodos para usar dichos compuestos para tratar los trastornos
relacionados con la endotelina se describen con más detalle en los
documentos WO-A-9619459 y
US-A-5571821.
La presente invención se refiere a métodos y
composiciones para tratar trastornos proliferativos celulares tales
como el cáncer. Más específicamente, la invención se refiere a
composiciones que comprenden al menos un antagonista de endotelina
combinado con una matriz de polisacárido de
poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina
(p-GlcNAc), para usar en el tratamiento del cáncer y
otras enfermedades proliferativas. La presente invención se basa en
parte, en el descubrimiento de los autores de la invención, de que
cuando se administra un antagonista de endotelina in vivo,
solo con dosis altas o combinado con una matriz de polisacárido, se
inhiben significativamente el crecimiento de las células tumorales
y/o el crecimiento de metástasis de células neoplásicas.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, el antagonista de endotelina es un compuesto de
pirimidil-sulfonamida no basado en péptido, tal como
el representado en la siguiente figura I.
El compuesto de la Figura I es una sal de sodio
(1:2) de la
[6-(2-hidroxi-etoxi)-5-(2-metoxi-fenoxi)-2-[2-(1H-tetrazol-5-il)-piridin-4-il]-pirimidin-4-il]amida
del ácido
5-isopropil-piridina-2-sulfónico,
también denominada en el presente documento "Ro61" y tiene un
peso molecular de aproximadamente 650 kDa, Es un inhibidor no
específico y no peptídico de ambos receptores de endotelina, ETA y
ETB.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, la matriz de polisacárido es una matriz de polisacárido
de
poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina
(p-GlcNAc), o uno de sus derivados, como se describe
en la patente de Estados Unidos 5.635.493. La
p-GlcNAc o sus derivados se pueden usar en
diferentes reformulaciones, incluyendo membranas, filamentos, telas
no tejidas, esponjas, geles y matrices tridimensionales. De acuerdo
con una realización preferida, la p-GlcNAc está en
forma de un gel, preferiblemente está desacetilada, y opcionalmente
derivatizada a una sal de
p-GlcNAc-lactato, y se combina con
Ro61 para la administración in vivo.
Las composiciones de la invención son útiles para
los sistemas de suministro de fármacos, por ejemplo, el suministro
de fármaco de liberación lenta. Las composiciones de la invención
son una mejora frente a las formulaciones de fármacos tradicionales,
en cuanto que las composiciones de la invención proporcionan, por
ejemplo, mayor eficacia, menor toxicidad y mejor
biodisponibilidad.
Los métodos de la invención comprenden la
administración de cantidades terapéuticamente eficaces de las
composiciones de la invención in vivo, para tratar
enfermedades proliferativas celulares tales como el cáncer, en un
animal, incluyendo seres humanos. De acuerdo con una realización de
la invención, se disuelve al menos un antagonista de endotelina, tal
como Ro61, en un gel de
p-GlcNAc-lactato desacetilada, y se
administra en una cantidad terapéuticamente eficaz, a un paciente
in vivo, para tratar el cáncer u otras enfermedades o
trastornos proliferativos. Una realización particular de la
invención comprende la administración in vivo de un
antagonista de endotelina no basado en péptidos tal como un
antagonista de endotelina de pirimidil-sulfonamida,
para tratar el cáncer u otras enfermedades o trastornos
proliferativos. Las composiciones y métodos de la invención son
útiles para inhibir el crecimiento de tumores y/o de otras células
neoplásicas, y/o inhibir la metástasis de células neoplásicas in
vivo.
Fig. 1. Estructura química de la
p-GlcNAc 100%. "n" se refiere a un número
entero en el intervalo de aproximadamente 4.000 a aproximadamente
150.000, siendo preferido de aproximadamente 4.000 a aproximadamente
15.000.
Fig. 2. Análisis de carbohidratos de
p-GlcNAc, datos de cromatografía de
gases-espectrometría de masas. Los cuadrados negros
representan la p-GlcNAc purificada usando el
procedimiento de tratamiento con ácido/neutralización, descrito en
la Sección 5.1, véase más adelante.
Fig. 3. Micrografía electrónica de barrido que
representa una membrana de p-GlcNAc preparada por la
variación de tratamiento con ácido/neutralización del procedimiento
de purificación químico/biológico. Aumento: 10.000x.
Fig. 4. Diagrama que representa algunos de los
posibles derivados de p-GlcNAc y
p-GlcNAc desacetilada de la invención (adaptado de
S. Hirano, en "Chitin and Chitosan", 1989,
Skjak-Braek, Antonsen, and Sanford, eds.,
Elsevier Science Publishing Co., pp.
37-43).
Figs. 5A y 5B. Micrografías electrónicas de
barrido de una matriz de p-GlcNAc desacetilada.
Aumento: Fig. 5A: 1000x; Fig. 5B: 10.000x.
Figs. 6A y 6B. Micrografías electrónicas de
barrido de una membrana de p-GlcNAc disuelta en
dimetilacetamida/cloruro de litio y vuelta a precipitar en agua en
un material fibroso, como se describe en la Sección de Ejemplo 8,
véase más adelante.
Fig. 7. Inhibición de la proliferación celular de
melanoma B16 por el antagonista del receptor de endotelina Ro61,
in vitro. Ro61 se añadió con concentraciones crecientes a una
placa de cultivo de 96 pocillos a las que después se añadieron
células B16 (círculos negros) y esplenocitos (círculos blancos) de
ratones C57BL/6 (H-2b). La proliferación de las
células tratadas con Ro61 se expresa como un porcentaje de células
control no tratadas. Se determinaron los valores medios de los
pocillos por triplicado.
Fig. 8. Gráficos de barras que indican el
porcentaje de proliferación de células de melanoma B16 respecto a
controles no tratados, tras exposición de las células a diferentes
antagonistas de endotelina. Los resultados indican una inhibición de
la proliferación tras exposición de las células a los antagonistas
de endotelina. Las células FO son células B16 control que carecen de
un receptor ETA de longitud completa; el gráfico de barras marcado
como ET1 representa un control, en el que las células fueron
expuestas a un agonista de endotelina conocido.
Fig. 9. Gráficos de barras que indican el
porcentaje de proliferación de células de melanoma B16 respecto a
controles no tratados, tras exposición de las células a diferentes
antagonistas de endotelina. Los resultados indican una inhibición de
la proliferación tras exposición a los antagonistas de endotelina.
Las células FO son células B16 control que carecen de un receptor
ETA de longitud completa; los gráficos de barras marcados como ET1 y
BQ3020 representan controles, en los que las células son expuestas a
dos agonistas de endotelina conocidos.
Fig. 10. Inversión de la inhibición por Ro61 de
los agonistas de ETA y ETB de la proliferación de células de
melanoma B16 in vitro. Se cultivaron células B16 con el
agonista
BQ-3020-[Ac-[Ala11,Ala15]-endotelina(6,21)
(triángulos negros), agonista
[Ala^{1,3,11,15}]-endotelina-1
(rombos blancos), ambos agonistas (cuadrados blancos) o ninguno
(círculos negros), y después se añadió Ro61 a cada pocillo. La
proliferación de las células tratadas con Ro61 se expresa como un
porcentaje de las células control no tratadas. Se determinaron los
valores medios de los pocillos por triplicado.
Figs. 11A y 11B. Efecto de Ro61 en las células
B16 en cultivo. Micrografía óptica de células B16 con aumento 40x.
Fig. A: células B16 cultivadas en placas de 96 pocillos con
5x10^{4} células/pocillo durante 72 horas a 37ºC en medio
completo; Fig. B: células B16 cultivadas en medio completo que
contiene Ro61 5 \muM.
Fig. 12. Ro61 induce apoptosis. Se ensayó la
apoptosis de células B16 con un kit de detección de muerte celular
in situ con fluoresceína, después de cultivarlas con medio
común (control) o R061 (1 \muM) (\ding{110}) durante 0, 24, 48 y
72 horas a 37ºC.
Figs. 13A y 13B. Inhibición por Ro61 de
carcinomatosis intraperitoneal. La Fig. 13A representa el efecto de
Ro61 IP en la carcinomatosis intraperitoneal de B16. Se inyectó en
ratones hembra C57BL/6 por vía IP 5 x 10^{4} células de melanoma
B16. Al día siguiente, se inyectó a los animales 100 \mul de:
diario x 6 HBSS (control), diario x 6 HBSS que contenía 3 mg/kg de
Ro61 (dosis baja), diario x 6 HBSS que contenía 30 mg/kg de Ro61
(dosis alta). La Fig. 13B muestra el efecto del suministro con
p-GlcNAc de Ro61. Los animales se estimularon con
tumor como en la Fig. 13A, y al día siguiente se trataron con 100
\mul de gel de p-GlcNAc inyectado por vía IP, SC o
IP, con 18 mg/kg de Ro61 (IP+Ro61). Después de 7 días, los animales
se sacrificaron y se evaluó la presencia de colonias de B16. Los
valores representan el número medio de colonias visibles y el error
típico para cada grupo (n = 11 para todos los grupos, excepto para
el grupo sin tratamiento, n = 13).
Fig. 14. Aparición retrasada del tumor en ratones
C57BL/6 tratados con Ro61 después de estimulación subcutánea de
tumor de melanoma B16. A los ratones hembra C57BL/6 se les inyectó
por vía SC 5 x 10^{4} células de melanoma B16. Al día siguiente,
los animales se separaron aleatoriamente en 4 grupos: sin
tratamiento (\ding{115}), una inyección IP de gel de
p-GlcNac solo (O), inyecciones IP diarias de 3 mg/kg
(durante 6 día), Ro61 en HBSS (\boxempty), una inyección IP de gel
de p-GlcNAc que contiene 18 mg/kg de Ro61
(\ding{110}). Se controló en los animales la presencia del tumor
durante 3 semanas (n = 10 en todos los grupos).
Fig. 15. Efecto de inhibición de diferentes
antagonistas de endotelina en la aparición de colonias tumorales B16
usando el modelo de carcinomatosis descrito más adelante. F10
representa las células control B16 no tratadas; mezcla de BQ
representa una mezcla del antagonista de ETA, BQ123 y el antagonista
de ETB, BQ788; mezcla de BQ/gel representa una mezcla de BQ123 y
BQ788 combinado con el gel de p-GlcNAc descrito más
adelante; Ro61 es el antagonista de endotelina ETA/ETB no específico
descrito más adelante; Ro61/gel es Ro61 combinado con
p-GlcNAc; y GRGDS/gel es una combinación del
antagonista de endotelina peptídico de ETA/ETB GRGDS combinado con
p-GlcNAc.
Fig. 16. Supervivencia a largo plazo de ratones
C57BL/6 tratados con Ro61 después de estimulación con melanoma B16
por vía intraperitoneal. Se inyectaron a los ratones C57BL/6 por vía
intraperitoneal células B16. Los animales se separaron
aleatoriamente en 4 grupos para cada uno de los siguientes
tratamientos: (a) sin tratamiento (cuadrados negros); (b) 100 \mul
de gel de p-GlcNAc solo (cruces); (c) 100 \mul de
HBSS diario que contienen 3 mg/kg de Ro61 (triángulos negros); o (d)
100 \mul de gel de p-GlcNAc que contiene 18 mg/kg
de Ro61 (cuadraros blancos). Los animales se controlaron diariamente
y se sacrificaron por razones humanitarias cuando se determinó que
estaban moribundos.
Figs. 17A y 17B. Fotomicrografías de la
morfología celular de las células B16 tratadas con Ro61 (Fig. 17A) y
no tratadas (Fig. 17B) con aumento 40X; Ro61 10^{-7} M, 10^{5}
células.
La presente invención se refiere a composiciones
que comprenden al menos un antagonista de endotelina combinado con
una matriz de polisacárido de
poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina
(p-GlcNAc), y a métodos para usar estas
composiciones en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades
proliferativas. Los antagonistas de endotelina de acuerdo con esta
invención, pueden ser específicos o no específicos para los
receptores ETA o ETB, o compuestos basados en péptidos o compuestos
no basados en péptidos. De acuerdo con una realización preferida de
la invención, el antagonista de endotelina es un antagonista de
endotelina no específico y no basado en péptido. De acuerdo con otra
realización preferida, el antagonista de endotelina es un compuesto
de pirimidil-sulfonamida no basado en péptido, tal
como el compuesto Ro61 representado en la siguiente figura I.
De acuerdo con la presente invención, al menos un
tipo de antagonista de endotelina, solo o combinado con uno o más
agentes antitumorales distintos, se une covalentemente o no
covalentemente, o combina con la p-GlcNAc descrita
con detalle en la Sección 5.1, véase más adelante. De acuerdo con
una realización preferida de la invención, se disuelve al menos un
antagonista de endotelina, tal como Ro61, en un gel de
p-GlcNAc desacetilada para formar una composición de
antagonista de endotelina ("EA")/p-GlcNAc de la
invención. De acuerdo con una realización preferida adicional, la
p-GlcNAc desacetilada se derivatiza con ácido
láctico para formar una sal de
p-GlcNAc-lactato.
Como se define en el presente documento, la
expresión "antagonista de endotelina" incluye antagonistas del
receptor de endotelina, y "composiciones de
EA/p-GlcNAc" incluye composiciones en las que al
menos un tipo de antagonista de endotelina se une covalentemente a
la p-GlcNAc o no se une covalentemente, se mezcla
con o encapsula dentro de la p-GlcNAc. Las
composiciones de la invención pueden comprender adicionalmente otros
agentes antitumorales, que combinados con el antagonista de
endotelina actúan para inhibir el crecimiento y/o metástasis del
tumor u otras células neoplásicas. Como se define en el presente
documento, "agente antitumoral" incluye cualquier compuesto que
inhibe el crecimiento o metástasis de células tumorales, células
cancerosas, o cualquier otro tipo de célula neoplásica.
Esta invención se basa en parte, en el
descubrimiento de los autores de la invención, de que los
antagonistas de endotelina combinados con la
p-GlcNAc descrito en el presente documento, inhiben
la proliferación de células neoplásicas in vitro y disminuyen
la metástasis y/o aumentan la supervivencia de animales que portan
células tumorales in vivo (véase las secciones de Ejemplos 12
a 16, véase más adelante). Además, la p-GlcNAc sola
de esta invención tiene un efecto inhibidor en la metástasis y
crecimiento celular neoplásico in vivo.
Por lo tanto, de acuerdo con los métodos de esta
invención, las composiciones farmacéuticas que comprenden
EA/p-GlcNAc de la invención, se administran en una
cantidad terapéuticamente eficaz a un paciente in vivo, para
tratar el cáncer u otras enfermedades proliferativas. Una
realización preferida de la invención comprende la administración
in vivo de un antagonista de endotelina, por ejemplo, un
antagonista de endotelina de pirimidil-sulfonamida
para el tratamiento de la enfermedad proliferativa.
Sólo para facilitar la descripción, la
descripción detallada de la invención se divide en las siguientes
subsecciones: (1) La p-GlcNAc de las composiciones y
métodos de la invención; (2) Antagonistas de endotelina de las
composiciones y métodos de la invención; (3) Formulaciones
preferidas de las composiciones de la invención; y (4) Usos de las
composiciones y métodos de la invención.
La matriz de polisacárido de
p-GlcNAc que se va a usar en las composiciones y
métodos de esta invención, comprende un polímero de alto peso
molecular en el intervalo de un peso medio de aproximadamente
800.000 daltons a aproximadamente 30 millones de daltons, basándose
en las mediciones de cromatografía de gel permeable. Dicho intervalo
de peso molecular representa una especie de p-GlcNAc
que tiene de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 150.000
monosacáridos de N-acetilglucosamina unidos en una
configuración \beta-1-4, siendo
preferido de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 15.000
monosacáridos de N-acetilglucosamina (Figura 1).
La variabilidad de la p-GlcNAc es
muy baja, y su pureza es muy alta, los cuales se ponen ambos de
manifiesto por criterios químicos y físicos. Entre estos están la
composición química y los contaminantes no polisacáridos. Primero,
los datos de la composición química para la p-GlcNAc
producida usando dos procedimientos de purificación diferentes se
muestran a continuación en la Tabla I. Como puede verse, la
composición química de la p-GlcNAc producida por
ambos procedimientos está dentro de los límites del error
experimental, al igual que las composiciones formuladas de la
p-GlcNAc. Segundo, como puede verse también en la
Tabla I, la p-GlcNAc producida está libre de
contaminantes proteicos detectables, está sustancialmente libre de
otros contaminantes orgánicos tales como aminoácidos libres, y está
sustancialmente libre de contaminantes inorgánicos, tales como
cenizas e iones metálicos (la p-GlcNAc de la
invención se puede desviar hasta aproximadamente el 2% de los
valores teóricos de carbono, hidrógeno, nitrógeno y oxígeno de la
p-GlcNAc pura). Por lo tanto, tal como se usa en el
presente documento, las expresiones "sustancialmente libre de
contaminantes orgánicos" y "sustancialmente libre de
contaminantes inorgánicos" se refiere a composiciones de
p-GlcNAc que tienen los perfiles de carbono,
hidrógeno, nitrógeno y oxígeno que no se desvían más de
aproximadamente 2% de los valores teóricos, y preferiblemente, la
p-GlcNAc de la invención contiene un perfil, como se
ejemplifica en los datos experimentales de las matrices de
p-GlcNAc en la Tabla I (dentro del porcentaje de
desviación). Además, la p-GlcNAc presenta un
porcentaje muy bajo de agua unida.
Datos de análisis químicos (% en peso) Valores teóricos para la p-GlcNAc pura: | |
Carbono - | 47,29 |
Hidrógeno - | 6,40 |
Nitrógeno - | 6,89 |
Oxígeno - | 39,41 |
Proteína - | 0,00 |
Procedimiento de fuerza mecánica | Método químico/biológico | |||
Normalizado | % Desv. | Normalizado^{1} | % Desv. | |
Carbono | 47,21 \pm 0,08 | -0,17 | 47,31 \pm 0,11 | +0,04 |
Hidrógeno | 6,45 \pm 0,08 | +0,78 | 6,34 \pm 0,08 | -0,94 |
Nitrógeno | 6,97 \pm 0,18 | +0,87 | 6,94 \pm 0,16 | +0,73 |
Oxígeno | 39,55 \pm 0,36 | +0,36 | 39,41 \pm 0,10 | 0,00 |
Valores medios | Valores medios | |||
Proteína | 0,00 | 0,00 | ||
Cenizas | 1,30 | 0,98 | ||
Humedad | 2,0 | 1,2 | ||
^{1} \begin{minipage}[t]{140mm} Los datos analíticos brutos se han normalizado para tener en cuenta el contenido de cenizas y humedad de las muestras. \end{minipage} |
La p-GlcNAc de las composiciones
de la invención presenta un perfil de análisis de carbohidratos
sustancialmente similar al mostrado en la Figura 2. El monosacárido
principal de la p-GlcNAc es la
N-acetilglucosamina. Además, la
p-GlcNAc no contiene el monosacárido glucosamina. Se
describen con detalle otras características físicas de
p-GlcNAc en la patente de Estados Unidos
5.635.493.
La p-GlcNAc de acuerdo con esta
invención, presenta un grado alto de biocompatibilidad, el cual se
puede determinar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin
limitar, procedimientos tales como el ensayo de elución,
implantación intramuscular, o inyección intracutánea o sistémica en
sujetos animales. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos
5.635.493 incorporada en el presente documento por referencia.
La p-GlcNAc se produce y se puede
purificar de microalgas, preferiblemente diatomeas. Las diatomeas
que se pueden usar como fuentes de partida para producir la
p-GlcNAc incluyen, pero no se limitan, miembros del
género Coscinodiscus, el género Cyclotella, y el
género Thalassiosira, prefiriéndose el género
Thalassiosira.
Del género Coscinodiscus, las especies de
diatomeas que se pueden usar incluyen, pero no se limita, especies
concinnus y radiatus. Entre las diatomeas del género
Cyclotella que se pueden usar se incluyen, pero no se
limitan, las especies caspia, cryptica y
meneghiniana. Las diatomeas Thalassiosira que se
pueden usar para producir el material de partida para la
p-GlcNAc de esta invención incluyen, pero no se
limita, las especies nitzschoides, aestivalis,
antarctica, deciphens, eccentrica,
floridana, fluviatilis, gravida,
guillardii, hyalina, minima,
nordenskioldii, oceanica, polychorda,
pseudonana; rotula, tubifera, tumida y
weissflogii, siendo las especies preferidas fluviatilis y
weissflogii. Las diatomeas tales como las descritas antes se
pueden obtener, por ejemplo, de la colección de cultivos del Bigelow
Laboratory for Ocean Sciences, Center for Collection of Marine
Phytoplankton (McKown Point, West Boothbay Harbor, Maine, 04575).
Cualquiera de estas diatomeas se puede hacer crecer usando los
métodos y el medio nutriente descrito en la patente de Estados
Unidos 5.635.493.
Las fibras de p-GlcNAc se pueden
obtener de cultivos de diatomeas tales como los descritos antes,
mediante una serie de métodos diferentes. De acuerdo con el método
de la fuerza mecánica, las fibras de p-GlcNAc se
pueden separar de los cuerpos celulares de las diatomeas sometiendo
el contenido del cultivo a una fuerza mecánica adecuada. Dicha
fuerza mecánica puede incluir, pero no se limita, una fuerza de
cizalladura generada, por ejemplo, con un molino coloidal, un
dispositivo de ultrasonidos, o un generador de burbujas, o una
fuerza cortante generada, por ejemplo, por una mezcladora
Waring.
Después se separa la suspensión resultante de
cuerpos celulares y fibras de p-GlcNAc de las
diatomeas. Por ejemplo, la suspensión se puede someter a una serie
de etapas de centrifugación que separan las fibras de
p-GlcNAc de los cuerpos celulares, dando un líquido
sobrenadante transparente que presenta poco, o nada, de material
floculante visible. Para las etapas de centrifugación se prefiere un
rotor de ángulo fijo y una temperatura de aproximadamente 10ºC. La
velocidad, duración y número total de etapas de centrifugación
necesarias pueden variar dependiendo, por ejemplo, del rotor de
centrifugación específico que se usa, pero la determinación de los
valores de dichos parámetros será evidente para un experto en la
técnica.
Después, las fibras de p-GlcNAc
en el líquido sobrenadante se pueden concentrar usando técnicas
conocidas por los expertos en la técnica. Dichas técnicas pueden
incluir, pero no se limitan, dispositivos de succión y filtración.
Finalmente, las fibras de p-GlcNAc concentradas se
lavan, por ejemplo, con agua destilada-desionizada,
HCl y etanol, u otros disolventes adecuados, preferiblemente
disolventes tales como alcoholes, en los que se disuelvan los
materiales tanto orgánicos como inorgánicos. Se expone un ejemplo
que demuestra el uso de este procedimiento para purificar la
p-GlcNAc en la Sección de ejemplo 6, véase más
adelante.
De acuerdo con el método químico/biológico, las
fibras de p-GlcNAc se separan de los cuerpos
celulares de diatomeas sometiéndolas a agentes químicos y/o
biológicos. Por ejemplo, los cultivos de diatomeas se pueden tratar
con un producto químico capaz de debilitar las paredes celulares de
las diatomeas, lo cual conduce a la liberación de las fibras de
p-GlcNAc sin alterar su estructura. Dicho producto
químico puede incluir, pero no se limita, ácido fluorhídrico (HF).
Alternativamente, un cultivo de diatomeas maduro se puede tratar con
un agente biológico capaz de alterar un proceso biológico, y se
puede usar para inhibir la síntesis de fibras de
p-GlcNAc, liberando así las fibras que ya están
presentes. Por ejemplo, dicho agente puede incluir, pero no se
limita, polioxina D, un inhibidor de la enzima
N-acetilglucosaminil-P-transferasa.
Después se separan los cuerpos celulares y las
fibras que contienen p-GlcNAc de los cultivos de
diatomeas tratados con un miembro de los agentes químicos o
biológicos antes descritos. Por ejemplo, el contenido de los
cultivos de diatomeas tratados se puede dejar sedimentar de modo que
se deja que el contenido de los cultivos forme dos capas distintas.
La capa superior contendrá principalmente las fibras de
p-GlcNAc, mientras que la capa inferior contendrá
los cuerpos celulares. La capa superior que contiene las fibras de
p-GlcNAc se puede sifonar, dejando detrás el
material celular sedimentado de la capa inferior. Después, la capa
sifonada que contiene las fibras de p-GlcNAc se
puede purificar más para separar las proteínas y otros materiales no
deseados por tratamiento con un detergente que no dañe las fibras de
p-GlcNAc. Dicho detergente puede incluir, pero no se
limita, dodecilsulfato sódico
(SDS).
(SDS).
Cuando se usa el tratamiento con ácido, tal como
el tratamiento con HF, para separar las fibras de
p-GlcNAc de los cuerpos celulares de las diatomeas,
se pude incluir una etapa para dispersar las fibras. Dicha etapa
puede incluir, pero no se limita, el uso de fuerza mecánica para
dispersar la fibra, tal como una etapa en la que las fibras se
someten a los movimientos de un agitador orbital.
Alternativamente, la suspensión tratada con
ácido, en una etapa opcional, se puede neutralizar antes de la
purificación adicional por tratamiento con detergente. Dicha
neutralización, en general, cambiará el pH de la suspensión de
aproximadamente 1,8 a aproximadamente 7,0, y se puede llevar a cabo,
por ejemplo, por adición de un volumen adecuado de Tris 1 M (pH 8,0)
o la adición de un volumen adecuado de hidróxido sódico (NaOH). En
general, la neutralización da fibras de p-GlcNAc
puras de una longitud sustancialmente mayor que los otros
procedimientos de purificación discutidos en el presente
documento.
Después, las fibras de p-GlcNAc
purificadas se pueden concentrar usando técnicas conocidas por los
expertos en la técnica, tal como usando un dispositivo de succión y
filtración. Finalmente, las fibras de p-GlcNAc se
lavan, en una serie de etapas con agua
destilada-desionizada, HCl y etanol, u otros
disolvente adecuados, preferiblemente disolvente tales como
alcoholes, en los que se disuelvan tanto los materiales orgánicos
como los inorgánicos. Se expone un ejemplo que demuestra el uso
satisfactorio de dicho método de purificación en la Sección de
ejemplo 7, véase más adelante.
Aunque cada uno de estos métodos para purificar
la p-GlcNAc de las fuentes de partida, las
microalgas preferiblemente diatomeas como fuentes de partida,
producen p-GlcNAc cristalina, muy pura y sin
adulterar, cada uno de los procedimientos produce
p-GlcNAc que tiene características específicas y
características ventajosas. Por ejemplo, la p-GlcNAc
purificada por el método de la fuerza mecánica produce una membrana
de p-GlcNAc que proporciona un sustrato superior
para la unión de las células a la p-GlcNAc. El
procedimiento químico/biológico produce un rendimiento medio mucho
mayor que el rendimiento medio de p-GlcNAc producida
por el método de la fuerza mecánica. Adicionalmente, la variación
del tratamiento con ácido/neutralización del procedimiento
químico/biológico produce fibras de p-GlcNAc
extremadamente largas, siendo algunas de las fibras de más de 100
\mum, y conteniendo moléculas de polímero p-GlcNAc
de peso molecular muy alto, tan alto como 20-30
millones de daltons.
La estructura por micrografía electrónica de la
p-GlcNAc que se va a usar en las composiciones y
métodos de esta invención, producido usando la variación del
tratamiento con ácido/neutralización del método de purificación
químico/biológico se representa en la Figura 3. A menudo, la
purificación de las fibras de p-GlcNAc da como
resultado la formación de membranas fibrosas como se representa en
la Figura 3.
La p-GlcNAc totalmente acetilada
de la invención se puede derivatizar, usando una variedad de
condiciones y procedimientos controlados, en una amplia variedad de
compuestos diferentes. Véase en la Figura 4 un diagrama que
representa algunos de estos compuestos. Dichos compuestos
derivatizados pueden incluir, pero no se limitan,
p-GlcNAc parcialmente o completamente desacetiladas,
que se ha modificado por medios químicos y/o enzimáticos como se
describe con más detalle a continuación. De acuerdo con una
realización preferida de la invención, la p-GlcNAc
es una p-GlcNAc 100% desacetilada.
Adicionalmente, la p-GlcNAc, o su
derivado desacetilado, se puede derivatizar mediante sulfatación,
fosforilación y/o nitración. Además, como se detalla a continuación,
los derivados de O-sulfonilo,
N-acilo, O-alquilo,
N-alquilo, desoxihalogenado, y
N-alquilideno y N-arilideno, y otros
derivados, se pueden preparar a partir de la
p-GlcNAc o p-GlcNAc desacetilada de
la invención. La p-GlcNAc desacetilada de la
invención también se puede usar para preparar una variedad de sales
orgánicos y/o quelatos de metales.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, se pueden desacetilar una o más unidades de monosacárido
de la p-GlcNAc, para formar una especie de
poli-\beta-1-4-N-glucosamina
desacetilada. Una especie de
poli-\beta-1-4-N-glucosamina
desacetilada en la que cada una de las unidades de monosacárido de
la especie de
poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina
se ha desacetilado, es decir, un derivado 100% desacetilado, tendrá
un peso molecular de aproximadamente 640.000 daltons a
aproximadamente 24 millones de daltons, siendo preferido de
aproximadamente 640.000 daltons a aproximadamente 2,4 millones de
daltons. Una especie con dicho intervalo de peso molecular
representa una especie que tiene de aproximadamente 4000 a
aproximadamente 150.000 monosacáridos de glucosamina unidos
covalentemente en una configuración
\beta-1-4.
La p-GlcNAc se puede desacetilar
por tratamiento con una base para dar las glucosaminas con grupos
amino libres. Este procedimiento de hidrólisis se puede llevar a
cabo con soluciones concentradas de hidróxido sódico o hidróxido
potásico a temperaturas elevadas. Véase, por ejemplo, la Sección de
ejemplo 8, véase más adelante. Alternativamente, se puede usar un
procedimiento enzimático que usa una enzima de quitina desacetilasa,
para desacetilar la p-GlcNAc. Dicho procedimiento
enzimático con la desacetilasa es conocido por los expertos en la
técnica, y se puede llevar a cabo como en la patente de Estados
Unidos nº 5.219.749.
Además, se puede derivatizar una o más de las
unidades de monosacárido de la p-GlcNAc de la
invención para que contenga al menos un grupo sulfato, o
alternativamente, se puede fosforilar o nitrar, como se representa a
continuación:
donde, R y/o R_{1} en lugar de un
hidrógeno, y/o R_{2} en lugar de -COCH_{3}, pueden ser un grupo
sulfato (-SHO_{3}), un fosfato (-P(OH)_{2}), o un
nitrato
(-NO_{2}).
A continuación se describen métodos mediante los
cuales se pueden preparar dichos derivados de
p-GlcNAc. Antes de llevar a cabo estos métodos,
puede ser ventajoso primero liofilizar, congelar en nitrógeno
líquido y pulverizar el material de partida de la
p-GlcNAc.
Los derivados de p-GlcNAc
sulfatados se pueden generar, por ejemplo, por un procedimiento en
dos etapas. En la primera etapa, se puede preparar la
p-GlcNAc O-carboximetilada, a
partir de la p-GlcNAc y/o derivados de
p-GlcNAc de la invención, por ejemplo, usando
técnicas tales como las descritas por Tokura y col. (Tokura, S. y
col., 1983, Polym. J. 15:485). Segundo, la etapa de
sulfatación se puede llevar a cabo, por ejemplo, con
N,N-dimetilformamida-trióxido de
azufre, de acuerdo con técnicas conocidas por los expertos en la
técnica, tales como las descritas por Schweiger (Schweiger, R.G.,
1972, Carbohydrate Res. 21:219). El producto resultante se
puede aislar en forma de la sal de sodio.
Los derivados de p-GlcNAc
fosforilados se pueden preparar, por ejemplo, usando técnicas
conocidas por los expertos en la técnica, tales como las descritas
por Nishi y col. (Nishi, N. y col., 1986, en "Chitin in Nature and
Technology", Muzzarelli y col., eds. Plenum Press, New York, pp.
297-299). Brevemente, se puede tratar una mezcla de
p-GlcNAc/ácido metanosulfónico con pentóxido de
fósforo (aproximadamente con 0,5 a 4,0 equivalentes molares) con
agitación, a una temperatura de aproximadamente 0ºC a
aproximadamente 5ºC. El tratamiento puede ser durante
aproximadamente 2 horas. Después, el producto resultante se puede
precipitar y lavar usando técnicas patrón conocidas por los expertos
en la técnica. Por ejemplo, se puede precipitar la muestra con un
disolvente tal como éter, centrifugar, lavar con un disolvente tal
como éter, acetona o metanol, y secar.
Los derivados de p-GlcNAc
nitrados se pueden preparar usando técnicas conocidas por los
expertos en la técnica, tales como las descritas por Schorigin y
Halt (Schorigin, R. and Halt, E., 1934, Chem. Ber. 67:1712).
Brevemente, la p-GlcNAc y/o un derivado de
p-GlcNAc se puede tratar con ácido nítrico
concentrado para formar un producto nitrado estable.
Uno o más de las unidades de monosacárido de la
p-GlcNAc de la invención, pueden contener un grupo
sulfonilo, como se representa a continuación:
donde R_{3} puede ser un resto
alquilo, un arilo, un alquenilo o un alquinilo. Dicho derivado se
puede generar por métodos conocidos tales como el método descrito
por Kurita y col. (Kurita, K. y col., 1990, Polym. Prep
[Am. Chem. Soc, Div. Polym. Chem.]
31:624-625). Brevemente, se puede hacer reaccionar
una solución acuosa alcalina de p-GlcNAc con una
solución de cloruro de tosilo en cloroformo, y después la reacción
se puede dejar evolucionar suavemente a bajas
temperaturas.
Uno o más de los monosacáridos de la
p-GlcNAc de la invención o su derivado acetilado,
puede contener uno o más grupos O-acilo, como se
representa a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde, R_{4} y/o R_{5} en lugar
de hidrógeno, puede ser un resto alquilo, un alquenilo o un
alquinilo, y R_{6} puede ser un resto alquilo, un alquenilo o un
alquinilo. Se puede generar un ejemplo de dicho derivado por métodos
conocidos tales como los descritos por Komai (Komai, T. y col.,
1986, in "Chitin in Nature and Technology", Muzzarelli y col.,
eds., Plenum Press, New York, pp. 497-506).
Brevemente, se puede hacer reaccionar la p-GlcNAc
con cualquiera de una serie de cloruros de acilo adecuados en ácido
metanosulfónico para dar los derivados de p-GlcNAc
que incluyen, pero no se limitan, derivados de caproilo, caprilo,
lanoilo, o
benzoilo.
Uno o más de los monosacáridos de la
p-GlcNAc desacetilada de la invención pueden
contener un grupo N-acilo, como se representa a
continuación:
donde, R puede ser un resto
alquilo, un alquenilo o un alquinilo. Dicha derivatización se puede
obtener usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica,
tales como la técnica descrita por Hirano y col. (Hirano, S. y col.,
1976, Carbohydrate Research 47:315-320). La
p-GlcNAc desacetilada es soluble en una serie de
soluciones acuosas de ácidos orgánicos. La adición de anhídridos
carboxílicos seleccionados a dichas soluciones que contienen
p-GlcNAc, en ácido acético en metanol acuoso, da
como resultado la formación de derivados de N-acilo
de la p-GlcNAc. La p-GlcNAc
N-acilada es un derivado preferido para producir
sistemas de suministro de fármaco de liberación
controlada.
Uno o más de los monosacáridos de la
p-GlcNAc de la invención o de su derivado
desacetilado, puede contener un grupo O-alquilo,
como se representa a continuación:
donde, R_{8} puede ser un resto
alquilo, un alquenilo o un alquinilo. Dicha derivatización se puede
obtener usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
Por ejemplo el procedimiento descrito por Maresh y col. (Maresh, G.
y col., en "Chitin and Chitosan," Skjak-Braek,
G. y col., eds., 1989, Elsevier Publishing Co., pp.
389-395). Brevemente, la p-GlcNAc
desacetilada se puede dispersar en dimetoxietano (DME) y hacer
reaccionar con un exceso de óxido de propileno. El periodo de
reacción puede ser 24 horas, y la reacción se lleva a cabo en un
autoclave de 40 a 90ºC. Después, la mezcla se puede diluir con agua
y filtrar. El DME se puede separar por destilación. Finalmente, el
producto final se puede aislar por liofilización. La
p-GlcNAc O-alquilada y su derivado
desacetilado también es un derivado preferido para producir sistemas
de suministro de fármacos de liberación
controlada.
Una o más de las unidades de monosacárido de la
p-GlcNAc de la invención puede ser un derivado
alcalino, como se representa a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Dicho derivado se puede obtener usando técnicas
conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar
un método tal como el descrito por Noguchi y col. (Noguchi, J. y
col., 1969, Kogyo Kagaku Zasshi 72:796-799).
Brevemente, la p-GlcNAc se remojó a vacío en NaOH
(43%, preferiblemente) durante un periodo de aproximadamente dos
horas a aproximadamente 0ºC. Después se puede separar el exceso de
NaOH, por ejemplo, por centrifugación en una centrífuga de cesta y
por prensado mecánico.
Una o más de las unidades de monosacárido del
derivado desacetilado de la p-GlcNAc de la
invención puede contener un grupo N-alquilo, como se
representa a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
donde R_{9} puede ser un resto
alquilo, un alquenilo o un alquinilo. Dicha derivatización se puede
obtener usando, por ejemplo, un procedimiento tal como el de Maresh
y col. (Maresh, G. y col., in "Chitin and Chitosan,"
Skjak-Brack, G. y col., eds. 1989, Elsevier
Publishing Co., pp. 389-395), como se ha descrito
antes, para la producción de los derivados de
p-GlcNAc
N-alquilados.
Una o más de las unidades de monosacárido del
derivado desacetilado de la p-GlcNAc de la
invención pueden contener al menos un derivado desoxihalogenado,
como se representa a continuación:
donde R_{10} puede ser F, Cl, Br
o I, siendo preferido el I. Dicho derivado se puede obtener usando
técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se
puede usar un procedimiento tal como el descrito por Kurita y col.
(Kurita, K. y col., 1990, Polym. Prep. [Am. Chem. Soc. Div.
Polym. Chem.] 31:624-625). Brevemente, se hace
reaccionar una p-GlcNAc tosilada con un haluro
sódico en dimetilsulfóxido, dando un derivado desoxihalogenado. La
tosilación de la p-GlcNAc se puede llevar a cabo
haciendo reaccionar una solución acuosa de p-GlcNAc
alcalino con una solución de cloruro de tosilo en cloroformo. Dicha
reacción puede avanzar suavemente a temperaturas
bajas.
Una o más de las unidades de monosacárido del
derivado desacetilado de la p-GlcNAc de la
invención pueden formar una sal, como se representa a
continuación:
donde, R_{11} puede ser un resto
alquilo, un alquenilo o un alquinilo. Dicha derivatización se puede
obtener usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
Por ejemplo, se puede usar un procedimiento tal como el descrito por
Austin y Sennett (Austin, P.R. and Sennett, S., in "Chitin in
Nature and Technology," 1986, Muzzarelli, R.A.A. y col., eds.
Plenum Press, pp. 279-286). Brevemente, se puede
suspender la p-GlcNAc desacetilada en un medio
orgánico, tal como por ejemplo, acetato de etilo o isopropanol, al
que se puede añadir un ácido orgánico adecuado, tal como por
ejemplo, ácido fórmico, acético, glicólico o láctico. La mezcla se
puede dejar reposar durante un periodo de tiempo (de 1 a 3 horas,
por ejemplo). La temperatura de la reacción y secado pueden variar
de aproximadamente 12ºC a aproximadamente 35ºC, siendo preferida de
20ºC a 25ºC. Después las sales se pueden separar por filtración,
lavar con medio reciente, y evaporar el medio
residual.
Una o más de las unidades de monosacárido del
derivado desacetilado de la p-GlcNAc de la
invención pueden formar un quelato con metal, como se representa a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde R_{12} puede ser un ion
metálico, particularmente uno de los metales de transición, y X es
un enlace dativo establecido por los electrones del nitrógeno
presentes en los grupos amino y amino sustituido presentes en la
p-GlcNAc
desacetilada.
Una o más de las unidades de monosacárido del
derivado desacetilado de la p-GlcNAc de la
invención pueden contener un grupo N-alquilideno o
N-arilideno, como se representa a continuación:
donde R_{13} puede ser un resto
alquilo, un alquenilo o un alquinilo. Dicha derivatización se puede
obtener usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
Por ejemplo, se puede usar un procedimiento tal como el
procedimiento descrito por Hirano y col. (Hirano, S. y col., 1981,
J. Biomed. Mat. Res. 15:903-911). Brevemente,
se puede llevar a cabo una reacción de N-sustitución
de la p-GlcNAc desacetilada con anhídridos
carboxílicos y/o arilaldehídos para dar derivados de acil- y/o
arilideno.
Además, la p-GlcNAc, o su
derivado desacetilado, se puede someter a condiciones de hidrólisis
controladas, que dan grupos de moléculas que tienen peso molecular
discreto y uniforme y otras características físicas. Dichas
condiciones de hidrólisis pueden incluir, por ejemplo, el
tratamiento con la enzima, lisozima. La p-GlcNAc se
puede exponer a la lisozima durante periodos diferentes de tiempo,
con el fin de controlar el grado de hidrólisis. Además, la tasa de
hidrólisis se puede controlar como una función del grado que se ha
desacetilado la p-GlcNAc que está siendo tratado con
lisozima. Las condiciones de desacetilación pueden ser como las que
se han descrito antes. Cuanto más se haya desacetilado una molécula
de p-GlcNAc, entre aproximadamente 20 y
aproximadamente 90 por ciento de desacetilación, más completamente
se hidrolizará la molécula en un tiempo dado. Mediante los
tratamientos de hidrólisis y/o desacetilación se pueden provocar
cambios en las características físicas, además de disminuir el peso
molecular. La hidrólisis extensiva produce licuefacción de la
p-GlcNAc.
Además, la desnaturalización térmica puede
modificar la estructura cristalina de la p-GlcNAc.
Dicha modificación de la estructura cristalina del producto
p-GlcNAc puede afectar ventajosamente, por ejemplo,
a la reactividad de la p-GlcNAc.
Además, se pueden formar híbridos que comprenden
p-GlcNAc y/o derivados de p-GlcNAc.
Dichos híbridos pueden contener cualquiera de una serie de
materiales naturales y/o sintéticos, además de la
p-GlcNAc y/o derivados de la
p-GlcNAc.
Por ejemplo, se pueden formar híbridos de
p-GlcNAc y/o derivados de p-GlcNAc
más uno o más componentes de matriz extracelulares (ECM). Dichos
componentes ECM pueden incluir, pero no se limita, colágeno,
fibronectina, glicosaminoglicanos, y/o peptidoglicanos. Los híbridos
también se pueden formar de p-GlcNAc y/o derivados
de p-GlcNAc más uno o más materiales sintéticos
tales como, por ejemplo, polietileno. Dicho híbrido de
p-GlcNAc/polietileno o derivado de
p-GlcNAc/polietileno se puede hacer uniendo
térmicamente los componentes híbridos, por ejemplo, mediante
autoclave.
Los derivados de p-GlcNAc
preferidos para usar en la invención reivindicada son derivados de
sales de p-GlcNAc desacetilada tales como un
derivado de p-GlcNAc-lactato,
especialmente un derivado de gel de
p-GlcNAc-lactato. Como se usa en el
presente documento, la expresión
"p-GlcNAc-lactato" significa
que el resto de ácido láctico está unido funcionalmente a una
p-GlcNAc parcial o totalmente desacetilada. Dichos
derivados de p-GlcNAc-lactato se
pueden obtener como se ha descrito antes (por ejemplo, por
derivatización con ácido láctico) y formular en forma de un gel
usando propilenglicol y agua, como se describe en la Sección de
ejemplo 10, véase más adelante. Los derivados de
p-GlcNAc-lactato se pueden producir
con viscosidades altas y bajas, lo cual permite poder adaptar la
p-GlcNAc a la indicación específica que interese.
Por ejemplo, puede ser útil usar una p-GlcNAc que
tenga una viscosidad inferior para suministrar mediante una
jeringuilla o mediante un pulverizador.
Como se describe con mayor detalle en la Sección
5.3, véase más adelante, la p-GlcNAc y/o sus
derivados descritos antes, se pueden derivatizar más mediante la
unión covalente o no covalente, o combinación con, moléculas o
fármacos de interés tales como antagonistas de endotelina.
La p-GlcNAc, sus derivados
desacetilados y/o sus derivatizaciones tales como las descritas
antes, que se van a usar en las composiciones de la invención, se
puede disolver y posteriormente reformular en una variedad de formas
y configuraciones.
La solución de la p-GlcNAc se
puede lograr mediante tratamiento con dimetilacetamida (DMA)/cloruro
de litio. La p-GlcNAc se puede disolver fácilmente
agitando en una solución de DMA que contiene LiCl al 5% (en peso del
DMA). Los derivados de p-GlcNAc solubles en agua,
tales como las sales de p-GlcNAc, por ejemplo, los
derivados de lactato o carboximetilo, se pueden disolver en agua. La
p-GlcNAc que se ha desacetilado al menos
aproximadamente el 75%, se puede poner en solución, por ejemplo, en
una solución ácida suave, tal como ácido acético al 1%. Los
derivados de p-GlcNAc que son insolubles en agua se
pueden poner en solución en disolventes orgánicos.
La derivatización de la p-GlcNAc
en DMA:LiCl con isocianatos de fenilo, se puede usar para producir
carbanilatos. Además, la derivatización de la
p-GlcNAc en DMA:LiCl con cloruro de
p-toluenosulfonilo se puede usar para producir
p-toluenosulfonato.
Después, la p-GlcNAc, sus
derivados desacetilados, y/o sus derivatizaciones, en solución se
pueden precipitar y reformular en formar que incluyen, pero no se
limitan, matrices, cuerdas, microesferas, microperlas, membranas,
fibras, polvos, esponjas y geles. Además, se pueden formular
membranas ultrafinas uniformes (es decir, menos de aproximadamente 1
micrómetro de grosor). Adicionalmente, se pueden preparar
formulaciones farmacéuticas tales como píldoras, comprimidos y
cápsulas.
Dichas reformulaciones se pueden lograr, por
ejemplo, aprovechando el hecho de que la p-GlcNAc
pura es insoluble en soluciones tales como agua y alcohol,
preferiblemente etanol. La introducción, por medios convencionales,
tales como por inyección, por ejemplo de la mezcla de DMA/LiCl que
contiene p-GlcNAc en dicha solución de agua o
alcohol, preferiblemente etanol, producirá la reprecipitación, y por
lo tanto la reformulación, de la p-GlcNAc disuelta.
La reformulación de una membrana de p-GlcNAc en un
material fibroso se demuestra en la Sección de ejemplo 9, véase más
adelante. En el caso de los derivados de p-GlcNAc
solubles en agua, las reformulaciones se pueden lograr por
reprecipitación en disolventes orgánicos tales como, por ejemplo,
acetato de etilo o isopropanol. Las reformulaciones de la
p-GlcNAc que se ha desacetilado al menos
aproximadamente el 75%, se pueden lograr volviéndolos a precipitar
en una solución alcalina. Los derivados de p-GlcNAc
insolubles en agua se pueden reformular volviendo a precipitar en
soluciones acuosas, tales como, por ejemplo, agua.
Las membranas de p-GlcNAc y
matrices de p-GlcNAc tridimensionales se pueden
producir por procedimientos que proporcionan la formación de tamaños
de poros medios controlados en las membranas o las matrices. El
tamaño de los poros se puede controlar en las membranas y matrices
variando la cantidad de material de p-GlcNAc usado,
y por adición de determinados disolventes tales como metanol o
etanol, siendo preferido el etanol, en cantidades específicas, que
están en el intervalo de aproximadamente 5% a aproximadamente 40%,
antes de la formación de las membranas y/o matrices. En general,
cuanto mayor es el porcentaje de disolvente, menor será el tamaño
medio de los poros formados.
De acuerdo con una reformulación preferida de la
invención, un derivado de
p-GlcNAc-lactato se formula en un
gel como se describe con detalle en la Sección de ejemplo 10, véase
más adelante.
Los antagonistas de endotelina que se van a usar
en las composiciones y métodos de la invención incluyen, pero no se
limitan, antagonistas de endotelina basados en péptidos,
antagonistas de endotelina no basados en péptidos, antagonistas de
endotelina específicos para ETA, específicos para ETB o no
específicos. Los ejemplos de antagonistas del receptor de endotelina
basados en péptidos útiles en las composiciones y métodos de la
invención incluyen BQ-123
(Ciclo(-D-Trp-D-Asp-L-Pro-D-Val-L-Leu-),
BQ-153, BQ-238,
BQ-485, BQ-610,
BQ-788, BQ-928,
TAK-044, FR139317
(Perhidroazepin-1-ilcarbonil-L-leucil-(1-metil)-D-triptofil-[3-(2-piridil)]-D-alanina),
RES-701-1 (Novabiochem), PD 142893
(Acetil-(3,3-difenil-D-alanina)-L-Leu-L-Asp-L-Ile-L-Ile-L-Trp),
PD 145065, CP 170687,
Ac-DBhgI6-Leu-Asp-lle,
IRL-1038
((Cys11-Cys15)-Endotelina-1
(11 -21)), el pentapéptido GRGDS, y ET-1
[Dprl-Asp 15]. Muchos de estos péptidos están
disponibles en el comercio, por ejemplo, en the American Peptide
Company, Sunnyvale CA o Calbiochem-Novabiochem
Company, San Diego CA.
Los ejemplos de antagonistas del receptor de
endotelina no basado en péptidos para usar en las composiciones y
métodos de la invención incluyen Ro 61-0612, Ro
61-1790, Ro 42-2005, Ro
46-2005, Ro 46-8443, Ro
47-0203 (también conocido en la técnica como
bosentán), PD 155080, PD 156707, SB 209670, SB 217242,
L-744.453, L-749.329,
L-754.142, CGS 27830, BMS 182874, LU 135252,
S-1039, mA386, A-127722, TBC11251,
Nz-arg-3-(isoxazidilsulfamil)-2-tiofenocarboxamida,
y EQ 123. Véase, p. ej., en Webb y col., véase antes, y Ohlstein y
col., véase antes, las estructuras de muchos de estos antagonistas
de endotelina conocidos.
De acuerdo con esta invención, pueden ser
preferidos los antagonistas de endotelina no basados en péptidos
porque presentan propiedades farmacocinéticas más favorables que los
antagonistas basados en péptidos, por ejemplo, mayor estabilidad
metabólica y mejor biodisponibilidad y actividad oral. De acuerdo
con una realización preferida de la invención, el antagonista de
endotelina usado es Ro61 representado en la Figura I, véase
antes.
De acuerdo con la invención, un antagonista de
endotelina como se ha descrito antes ("EA") se une
funcionalmente covalente o no covalentemente, o se combina con la
p-GlcNAc, o uno o más de sus derivados o
reformulaciones, como se ha descrito antes. De acuerdo con una
realización, al menos un tipo de antagonista de endotelina se
combina covalente, no covalentemente o de otra forma o se mezcla con
una p-GlcNAc desacetilada. A continuación se
discuten otros agentes antitumorales que se pueden usar junto con
las composiciones de EA/p-GlcNAc de la
invención.
El antagonista de endotelina u otro agente
antitumoral se puede unir covalentemente a las aminas primarias
expuestas de la p-GlcNAc desacetilada, por ejemplo,
por unión química usando reactivos de reticulación bifuncionales que
actúan como espaciadores químicos de longitud específica. Dichas
técnicas son conocidas por los expertos en la técnica, y se pueden
parecer, por ejemplo, a los métodos de Davis y Preston (Davis, M.
and Prestan, J.F. 1981, Anal. Biochem.
116:404-407) y Staros y col. (Staros, J. V. y col.,
1986, Anal. Biochem. 156:220-222). Por
ejemplo, en el caso de los compuestos basados en péptidos, los
restos carboxílicos en el péptido que se van a unir a la
p-GlcNAc desacetilada o parcialmente desacetilada,
se pueden activar y después reticular con la
p-GlcNAc. La activación se puede llevar a cabo, por
ejemplo, por adición de una solución tal como de carbodiimida EDC
(1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida)
a una solución de péptido en un tampón de fosfato. Preferiblemente,
esta solución contiene adicionalmente un reactivo tal como
sulfo-NHS
(N-hidroxisulfosuccinimida) para potenciar el
acoplamiento. El péptido activado se puede reticular a la
p-GlcNAc desacetilada mezclándolo en un tampón de pH
alto, tal como tampón de carbonato (pH 9,0-9,2).
La actividad biológica de la molécula unida se
puede mantener variando la longitud de la molécula conectora (por
ejemplo, el compuesto reticulador bifuncional) utilizado para unir
la molécula a la p-GlcNAc. Se puede determinar de
forma rutinaria una longitud adecuada del conector para una molécula
dada que se va a unir, que no altere la actividad biológica de la
molécula. Por ejemplo, la actividad biológica (por ejemplo, un nivel
terapéuticamente eficaz de actividad biológica) de una molécula que
se ha unido mediante un conector de una longitud dada, se puede
ensayar usando ensayos conocidos específicos para la molécula dada
que se va a unir. Adicionalmente, con el fin de mantener la
actividad biológica de la molécula que se va a unir, puede ser
necesario usar un conector que se pueda escindir mediante una enzima
natural adecuada para liberar la molécula unida. Se pueden usar
ensayos usados normalmente por los expertos en la técnica, para
ensayar la retención de la actividad biológica de la molécula
particular que se va a unir para asegurar que se retiene un nivel
aceptable de actividad (por ejemplo, un nivel de actividad
terapéuticamente eficaz).
Alternativamente, los antagonistas de endotelina
basados en péptidos o no basados en péptidos, solos o combinados con
otros agentes antitumorales, se pueden mezclar o unir no
covalentemente a la p-GlcNAc y/o sus derivados para
formar las composiciones de la invención, usando técnicas conocidas
por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede mezclar una
moléculas o moléculas que se elijan, por ejemplo, un antagonista de
endotelina, con suspensiones de p-GlcNAc, con una
solución de p-GlcNAc desacetilada o parcialmente
desacetilada, con una solución de la sal de p-GlcNAc
desacetilada o parcialmente desacetilada, por ejemplo, con una
solución de p-GlcNAc-lactato
(parcial o totalmente desacetilada), o con una solución de cualquier
derivado de p-GlcNAc. Opcionalmente, las mezclas se
pueden liofilizar. Después de la liofilización, las moléculas quedan
unidas de forma no covalente a las matrices de
p-GlcNAc, supuestamente mediante interacciones
hidrófobas, electrostáticas y otras interacciones no covalentes.
Dichas formulaciones de p-GlcNAc son muy fáciles de
producir. Además, dichas formulaciones se pueden lograr eficazmente
con una amplia variedad de moléculas que tienen un amplio espectro
de características físicas y propiedades de solubilidad en agua, que
van desde las más hidrófobas a las más hidrófilas. Tras la unión de
la molécula o moléculas, se pueden usar los ensayos usados
normalmente por los expertos en la técnica para ensayar la actividad
de la molécula o moléculas particulares unidas de forma no
covalente, para asegurar que se logra un nivel de actividad
aceptable (por ejemplo, una actividad terapéuticamente eficaz) con
la molécula
unida.
unida.
Además, los antagonistas de endotelina, solos o
combinados con otros agentes antitumorales, se pueden encapsular en
la p-GlcNAc usando procedimientos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, un procedimiento para lograr la encapsulación
puede implicar el procedimiento indicado por Hwang y col. (Hwang, C.
y col. in Muzzarelli, R. y col., eds., 1985, "Chitin in Nature and
Technology", Plenum Press, pp. 389-396).
La encapsulación también se puede lograr, por
ejemplo, siguiendo una modificación de la variación del tratamiento
con ácido/neutralización del método de purificación
químico/biológico presentado antes. En lugar de aumentar el pH de la
solución de p-GlcNAc a un intervalo de pH
aproximadamente neutro (es decir, aproximadamente 7,4), se puede
crear un entorno de pH básico, aumentando el pH a aproximadamente
9,0 después de completar la purificación de la
p-GlcNAc. A un pH más básico, la estructura de la
p-GlcNAc o uno de sus derivados, adopta una
configuración más tridimensional o "abierta". Cuando se baja el
pH, la configuración de la molécula revierte a una configuración
"cerrada" más compacta. Por lo tanto, se puede añadir un
compuesto o fármaco de interés, tal como un antagonista de
endotelina a una solución de p-GlcNAc a un pH alto,
y después se puede bajar el pH de la suspensión de
p-GlcNAc/fármaco, "atrapando" o encapsulando
así el fármaco de interés dentro de una matriz de
p-GlcNAc. Tras la encapsulación de la molécula, se
pueden usar los ensayos usados normalmente por los expertos en la
técnica para ensayar la actividad de la molécula o moléculas
particulares encapsuladas, asegurando así que la molécula
encapsulada retiente un nivel de actividad biológica aceptable (por
ejemplo, una actividad terapéuticamente eficaz).
Se muestra un ejemplo de la preparación de una
composición de EA/p-GlcNAc de la invención en la
Sección de ejemplo 10, véase a continuación, en la que se mezcla un
antagonista de endotelina con un gel de
p-GlcNAc-lactato. Alternativamente,
se puede preparar una composición de EA (sin
p-GlcNAc acompañando), por ejemplo, disolviendo el
antagonista de endotelina en PBS, HBSS o como se describe en las
instrucciones del fabricante, y ajustando la solución a la
concentración deseada.
Las composiciones de la invención, incluyendo las
composiciones de EA/p-GlcNAc, se pueden formular
para administrar en forma de composiciones farmacéuticas, por
ejemplo, por inhalación o insuflación (a través de la boca o la
nariz), o administración oral, bucal, parenteral o rectal. De
acuerdo con una realización preferida, la composición de
EA/p-GlcNAc de la invención se administra por
inyección en forma de un gel como se describe en la Sección de
ejemplo 10, véase más adelante. En esta realización de la invención,
en la que la composición farmacéutica comprende la administración de
un antagonista de endotelina, por ejemplo, un antagonista de
endotelina no peptídico tal como una
pirimidil-sulfonamida, para tratar la enfermedad
proliferativa, por ejemplo, el cáncer, la composición puede
comprender una cantidad terapéuticamente eficaz del antagonista de
endotelina combinado con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Para administración oral, las composiciones
farmacéuticas pueden tener forma, por ejemplo, de comprimidos o
cápsulas preparados por medios convencionales con excipientes o
vehículos farmacéuticamente aceptables tales como agentes
aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado,
polivnilpirrolidona o hidroxipropil-metilcelulosa);
cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o
hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato
magnésico, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de
patata o almidón-glicolato sódico); o agentes
humectantes (por ejemplo, laurilsulfato sódico). La
p-GlcNAc se puede usar en lugar de, o además de, los
excipientes, vehículos y cargas. Los comprimidos se pueden revestir
usando p-GlcNAc, usando procedimientos conocidos en
la técnica.
Las preparaciones líquidas para administración
oral pueden tener forma, por ejemplo, de soluciones, jarabes o
suspensiones, o se pueden presentar en forma de un producto seco
para reconstituir con agua u otros vehículos adecuados antes de
usar. Dichas preparaciones líquidas se pueden preparar por medios
convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como
agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de
celulosa o grasas hidrogenadas comestibles); agentes emulsionantes
(por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por
ejemplo, aceite de almendras, ésteres aceitosos, alcohol etílico o
aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo,
p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido
sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales de tampón,
agentes de sabor, colorantes y edulcorantes según sea adecuado.
Los usos biomédicos de las composiciones de la
invención incluyen su uso como sistemas de suministro de fármacos
para antagonistas de la endotelina, así como otros agentes
terapéuticos tales como otros agentes antitumorales. Las
formulaciones que contienen p-GlcNAc de la invención
proporcionan beneficios adicionales comparados con las formulaciones
de fármaco conocidas, incluyendo, por ejemplo, mayor eficacia, menor
toxicidad y menor biodisponibilidad. De hecho, hay numerosas
ventajas en el uso de los sistemas de suministro de fármaco basados
en la p-GlcNAc de la invención. Por ejemplo,
normalmente se usa la administración de fármacos tradicionales por
inyección con proteínas y otros muchos fármacos. Sin embargo, las
dosis repetidas conducen a concentraciones de fármaco en la sangre
que oscilan y afectan a la comodidad y observancia del paciente. La
administración oral puede ser ventajosa puesto que permite una carga
más variada de fármaco para ser liberada y es menos incómodo para el
paciente. Sin embargo, las proteínas y otros compuestos son
desnaturalizados y degradados en el estómago.
Sin embargo, se logra una mejor administración
oral mediante las composiciones que contienen la
p-GlcNAc de la invención, proporcionando un entorno
protector para el fármaco una vez que se ha administrado. Por
ejemplo, la p-GlcNAc protege un antagonista de la
endotelina basado en péptidos del entorno ácido y enzimático del
estómago. El sistema de p-GlcNAc libera el compuesto
por difusión y/o degradación de la encapsulación una vez que llega a
la región intestinal, donde es absorbido eficazmente en el torrente
sanguíneo. Estos sistemas de p-GlcNAc de la
invención se pueden usar, por ejemplo, para suministrar proteínas
así como muchos otros compuestos. Se prefieren los liposomas
revestidos con derivados de p-GlcNAc o las
encapsulaciones de derivados de
p-GlcNAc-alginato, para dichos
procedimientos de suministro oral.
Además, tras la introducción de las composiciones
de la invención en un paciente, la p-GlcNAc se
biodegrada con el tiempo, de forma que los compuestos unidos o
encerrados son liberados gradualmente en el torrente sanguíneo del
paciente, proporcionando así un procedimiento para el suministro de
fármaco con liberación lenta y controlada.
Se pueden producir especies de
p-GlcNac desacetiladas o parcialmente desacetiladas
que tengan una velocidad de biodegradabilidad predecible. Por
ejemplo, el porcentaje de desacetilación afecta a la velocidad a la
cual se degrada la especie de p-GlcNAc. En general,
cuanto mayor es el porcentaje de desacetilación, más rápido será la
velocidad de biodegradabilidad y resorción. Por lo tanto, el grado
de biodegradabilidad de la p-GlcNAc y la velocidad
de resorción in vivo se pueden controlar durante la
producción de las p-GlcNAc.
Los materiales de p-GlcNAc que
tienen dichas velocidades de biodegradabilidd controlables se pueden
formular en membranas, geles, esponjas, microesferas, fibras y
similares. De acuerdo con una realización preferida de la invención,
se puede usar una p-GlcNAc 100% desacetilada o
parcialmente desacilada que tenga una velocidad de biodegradabilidad
predecible.
Las composiciones de
p-GlcNAc/fármaco de la invención se pueden
suministrar a un paciente mediante una variedad de vías usando
procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica.
Por ejemplo, dicho suministro puede ser administración en un sitio
específico, oral, nasal, intravenosa, subcutánea, intradérmica,
transdérmica, intramuscular o intraperitoneal. Con respecto al
suministro en un sitio específico, los métodos de administración
pueden incluir, pero no se limitan, inyección, implantación, medios
artroscópicos, laparoscópicos o similares. Se prefieren las
membranas y/o geles de p-GlcNAc así como las
microesferas y esponjas para dichos métodos de suministro en un
sitio específico.
Como se ha indicado antes, las composiciones de
p-GlcNAc de la invención se pueden formular en
membranas, geles, esponjas, microesferas, fibras y similares. Estos
productos de p-GlcNAc se adhieren y moldean al
tejido, tanto a tejidos blandos como duros, en el cuerpo humano sin
necesidad de sutura. Por ejemplo, los materiales de
p-GlcNAc se pueden aplicar durante la cirugía
general o mínima invasiva, tal como la cirugía laparoscópica.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, la p-GlcNAc está en forma de un gel en el
que se disuelve o incorpora de otra forma el antagonista de
endotelina y/u otro agente antitumoral. Los geles y membranas
basados en p-GlcNAc tienen una variedad de
aplicaciones como sistemas de suministro de fármacos terapéuticos,
por ejemplo, para proporcionar el suministro de liberación lenta
específico en un sitio directamente a un tumor o a la región dejada
vacía por un tumor después de cirugía. Dicha composición de
liberación lenta inmovilizada puede actuar como un procedimiento
defensivo inicial importante después de cirugía. Además, dichos
sistemas de suministro de fármacos antitumorales pueden ser
particularmente útiles para tratar tumores que son total o
parcialmente inaccesibles a la cirugía tales como, por ejemplo,
ciertos tumores cerebrales.
Por lo tanto, las composiciones de
EA/p-GlcNAc de la invención son útiles como sistemas
de suministro de fármacos terapéuticos para el tratamiento del
cáncer y otras enfermedades proliferativas. Estas composiciones
pueden incluir adicionalmente otros agentes antitumorales, que se
pueden unir o encapsular dentro de la p-GlcNAc de la
invención para proporcionar un efecto sinérgico. Dichos agentes
antitumorales son conocidos por los expertos en la técnica, e
incluyen, pero no se limitan, las siguientes categorías y compuestos
específicos: agentes alquilantes, agentes antimetabolitos,
antibióticos antitumorales, alcaloides de la vinca y agentes
epidofilotoxinas, nitrosoureas, enzimas, productos sintéticos,
productos biológicos terapéuticos hormonales y fármacos de
investigación.
Dichos agentes alquilantes pueden incluir, pero
no se limitan, mostazas nitrogenadas, clorambucil, ciclofosfamida,
ifosfamida, melfalán, tiptea y busulfán.
Los antimetabolitos pueden incluir, pero no se
limitan, metotrexato, 5-fluorouracilo, arabinósido
de citosina (ara-C), 5-azacitidina,
6-mercaptopurina, 6-tioguanina, y
fosfato de fludarabina. Los antibióticos antitumorales pueden
incluir, pero no se limita, doxorrubicina, daunorrubicina,
dactinomicina, bleomicina, mitomicina C, plicamicina, idarrubicina,
y mitoxantreno. Los alcaloides de la vinca y las epipodofilotoxinas
pueden incluir, pero no se limitan, vincristina, vinblastina,
vindesina, etopósido, y tenipósido.
Las nitrosoureas incluyen carmustina, lomustina,
semustina y estreptozocina. Las enzimas pueden incluir, pero no se
limitan, L-asparagina. Los productos sintéticos
pueden incluir, pero no se limitan, Dacrabazina, hexametilmelamina,
hidroxiurea, mitotano procabazina, cisplatino y carboplatino.
Los productos terapéuticos hormonales pueden
incluir, pero no se limitan, corticoesteroides (acetato de
cortisona, hidrocortisona, prednisona, prednisolona,
metil-prednisolona y dexametasona), estrógenos,
(dietilestibesterol, estradiol, estrógenos esterificados, estrógenos
conjugados, clorotiasneno), progestinas (acetato de
medroxiprogesterona, caproato de
hidroxi-progesterona, acetato de megestrol),
antiestrógenos (tamoxifeno), inhibidores de aromatasa
(aminoglutetimida), andrógenos (propionato de testosterona,
metiltestosterona, fluoximesterona, testolactona), antiandrógenos
(flutamida), análogos de LHRH (acetato de leuprolida), y productos
endocrinos para el cáncer de próstata (ketoconazol).
Los productos biológicos pueden incluir, pero no
se limitan, interferones, interleuquinas, factor de necrosis
tumoral, y modificadores de la respuesta biológica.
Los fármacos de investigación pueden incluir,
pero no se limitan, agentes alquilantes tales como nimustina AZQ,
BZQ, Cyclodisone, DADAG, CB10-227, CY233, maleato de
DABIS, EDMN, fotemustina, hepsulfamo, hexametilmelamina, mafosamida,
MDMS, PCNU, espiromustina, TA-077, TCNU y
temozolomida; antimetabolitos, tales como acivicina, azacitidina,
5-aza-desoxicitidina,
A-TDA, benciliden-glucosa,
carbetimer, CB3717, mesilato de desazaguanina, DODOX, doxifluridina,
DUP-785, 10-EDAM, fazarabina,
fludarabina, MZPES, MMPR, PALA, PLAC, TCAR, TMQ,
TNC-P y piritrexim; anticuerpos antitumorales, tales
como AMPAS, BWA770U, BWA773U, BWA502U, amonafida,
m-AMSA, CI-921, datelliptium,
mitonafida, piroxantrona, aclarrubicina, cytorhodin, epirrubicina,
esorrubicina, idarrubicina, yodo-doxorrubicina,
marcelomicina, menaril, morfolino-antraciclinas,
pirarrubicina, y SM-5887; inhibidores del huso de
los microtúbulos, tales como amfetinila, navelbina y taxol; los
alquil-lisofosfolípidos tales como
BM41-440,
ET-18-OCH_{3}, y
hexaciclofosfocolina; compuestos metálicos tales como nitrato de
galio, CL286558, CL287110, cicloplatam, DWA2114R, NK121,
iproplatino, oxaliplatino, espiroplatino, espirogermanio, y
compuestos de titanio; y compuestos nuevos tales como, por ejemplo
glicinato de afidoicolina, ambazona, BSO, caracemida, DSG,
didemnina, B, DMFO, elsamicina, espertatrucina, ácido
flavona-acético, HMBA, HHT,
ICRF-187, yodo-desoxiuridina,
ipomeanol, liblomicina, lonidamina, LY186641, MAP, MTQ, Merabarona
SK&F104864, suramina, talisomicina, tenipósido, THU y WR2721; y
toremifeno, trilosano, y zindoxifeno.
Se prefieren los fármacos antitumorales que son
potenciadores de la radiación para los casos en los que se prescribe
el tratamiento con terapia de radiación, en lugar de o después de
cirugía. Los ejemplos de dichos fármacos incluyen, por ejemplo, los
agentes quimioterapéuticos 5'-fluorouracilo,
mitomicina, cisplatino y sus derivados, taxol, doxorrubicina,
actinomicina, bieomicinas, daunomicinas, y metamicinas.
Se pueden obtener efectos sinérgicos adicionales
usando las composiciones de EA/p-GlcNAc de la
invención combinadas con uno o más agentes antitumorales distintos
tales como la tioguanina combinada con arabinósido de citosina
(ara-C) para el tratamiento mejorado de la leucemia
no linfocítica aguda, tamoxifeno con cisplatino para el cáncer de
mama, y prostaglandinas con cisplatino para el cáncer de mama y
próstata. Se pueden usar muchas otras combinaciones sinérgicas de
fármacos anticancerígenos conocidas por los expertos en la técnica,
con las formulaciones de EA/p-GlcNAc y EA/derivado
de p-GlcNAc de la invención.
Adicionalmente, es conveniente el uso de las
composiciones que contienen la p-GlcNAc de la
invención, dado que el polímero de p-GlcNAc tiene
propiedades químicas y características que permiten que se pueda
formular y suministrar algunos fármacos que hasta ahora han sido
difíciles de formular y suministrar. Por ejemplo, el taxol, un
fármaco inhibidor del huso de los microtúbulos para tratar el cáncer
de mama, es hidrófobo y requiere la adición de aceite de ricino
polioxietilado con el fin de solubilizarlo como una infusión líquida
para el suministro intravenoso. La naturaleza hidrófoba del taxol
hace que sea un compuesto ideal para formularlo con materiales
polímeros de p-GlcNAc para el suministro tópico de
liberación controlada. La patente de Estados Unidos 5.635.493 en la
Sección 23, presenta una de dichas formulaciones de
p-GlcNAc/taxol. Otros objetivos adicionales para los
sistemas antitumorales de p-GlcNAc incluyen, pero no
se limitan, tumores de piel, tubo digestivo, pancreáticos, de
pulmón, mama, tracto urinario y tumores uterinos, y sarcomas de
Kaposi relacionados con el VIH.
Debido a que los materiales de
p-GlcNAc de la invención son inmunoneutros por si
mismos, en cuanto que no provocan una respuesta inmunitaria en seres
humanos, dichos dispositivos de p-GlcNAc, como se ha
descrito antes, que comprenden membranas de
p-GlcNAc, matrices porosas 3D y/o geles que albergan
fármacos inmovilizados, pueden suministrar dichos fármacos de forma
que no haya respuesta inmunitaria. Se pueden usar determinados
materiales adicionales, tales como alginatos naturales y polímeros
sintéticos en algunos casos, para construir dichos dispositivos,
combinados con el material de p-GlcNAc. Por
ejemplo, se puede fabricar un sistema de suministro de fármaco de
liberación retardada polímero de una forma similar a al sugerida por
A. Polk (Polk, A. y col., 1994, J. of Pharmaceutical
Sciences, 83(2):178-185). En dicho
procedimiento, se hace reaccionar la p-GlcNAc
desacetilada con alginato sódico en presencia de cloruro de calcio
para formar microcápsulas que contienen el fármaco que se va a
suministrar y liberar en las condiciones adecuadas y en un
determinado periodo de tiempo.
Las dosis terapéuticamente eficaces de cualquiera
de los fármacos o agentes descritos antes, junto con los sistemas
basados en p-GlcNAc descritos en el presente
documento, se pueden determinar de forma rutinaria usando técnicas
conocidas por el experto en la técnica. Una dosis
"terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del
compuesto suficiente para dar como resultado la mejora de los
síntomas de los procesos y/o enfermedades descritas en el presente
documento.
La toxicidad y eficacia terapéutica de los
fármacos se puede determinar por procedimientos farmacéuticos
estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por
ejemplo, determinando la DL_{50} (la dosis letal del 50% de la
población) y la DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el
50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos
y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la
relación DL_{50}/DE_{50}. Se prefieren los compuestos que
presentan índices terapéuticos grandes. Aunque se pueden usar
compuestos que presentan efectos secundarios tóxicos, hay que tener
cuidado para diseñar un sistema de suministro que dirija dichos
compuestos al sitio del tejido afectado, con el fin de minimizar el
potencial daño a las células no afectadas, y por lo tanto, reducir
los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos
celulares y estudios en animales se pueden usar para formular un
intervalo de dosificación para usar en seres humanos. La
dosificación de dichos compuestos está preferiblemente en un
intervalo de concentraciones en la circulación que incluyen la
DE_{50} con poca toxicidad o sin toxicidad. La dosificación puede
variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de
dosificación usada y la vía de administración usada. Para cualquier
compuesto usado en el procedimiento de la invención, se puede
calcular inicialmente la dosis terapéuticamente eficaz a partir de
los ensayos de cultivos celulares. Se puede formular una dosis en
modelos animales para lograr un intervalo de concentración que
circula en el plasma que incluye la CI_{50} (es decir, la
concentración del compuesto de ensayo que logra una inhibición de
los síntomas que es la mitad del máximo) determinado en el cultivo
celular. Dicha información se puede usar para determinar con más
precisión las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en el
plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía líquida de
alta eficacia. De acuerdo con una realización preferida, el
intervalo de dosis de los antagonistas de endotelina usados en las
composiciones de la invención, es de aproximadamente 1 mg/kg a
aproximadamente 100 mg/kg.
Además, las dosis de muchos de los fármacos
antitumorales listados antes son conocidos por los expertos en la
técnica, y se pueden encontrar fácilmente en compendios tales como
PHYSICIANS DESK REFERENCE, Medical Economics Data Publishers;
REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co.; GOODMAN
& GILMAN, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, McGraw Hill
Publishers, THE CHEMOTHERAPY SOURCE BOOK, Williams y Wilkens
Publishers, servicios en línea tales como Cancer Lit®, base de datos
de U.S. National Cancer Institute, así como informes de estudios
farmacológicos tales como "A MultiCenter Randomized Trial of Trial
of Two Doses of Taxol" Nabholtz, J.M., Gelmon, K., Bontenbal, M.
y col. Medical Education Services Monograph -1994
Bristol-Myers Squibb Company Publication;
"Randomized Trial of Two Doses of Taxol in Metastatic Breast
Cáncer: An Interim Analysis" Nabholtz, J. M., Gelmon, K.,
Bontenbal, M., y col. 1993, Proc. Am. Clin. Oncol., 12:60.
Abstract 42.
Los intervalos de dosis para los fármacos
antitumorales en las composiciones de la invención pueden ser
menores, iguales o mayores que las dosis diarias típicas prescritas
para el tratamiento sistémico de los pacientes. Por ejemplo, las
dosificaciones de 5'-FU equivalentes al 50% de las
dosificaciones estándar usadas para tratar el cáncer colorrectal con
el 5'-FU en seres humanos (300-450
mg/m^{2} i.v., diario durante 5 días) dio como resultado una
reducción de 80-90% del volumen de implantes de
tumor cancerígeno de colon HT29 ectópico en ratones scid. El
uso de la membrana de p-GlcNAc como una matriz de
suministro del fármaco para la administración del
5'-FU redujo la dosificación requerida para reducir
espectacularmente el volumen del tumor en el 50% comparado con los
animales control de administración intravenosa. Se pueden encontrar
detalles relacionados con estos datos en la Sección de ejemplo 21 de
la patente de Estados Unidos 5.635.493. En los casos en los que son
necesarias dosis mayores, estas dosis mayores pueden ser toleradas
si los fármacos son suministrados localmente en el sitio del tumor,
y por lo tanto, otros tejidos incluyendo las células sanguíneas, no
son expuestos fácilmente a los fármacos.
Determinados agentes antitumorales son
vesicantes, incluyendo dactinomicina, daunomicina, doxorrubicina,
estramustina, mecloretamina, mitomicina C, vinblastina, vincristina
y vindesina; mientras que determinados agentes antitumorales son
irritantes incluyendo la carmustina, decarbazina, etopósido,
mitramicina, estreptozocina y tenipósido. Los vesicantes e
irritantes producen efectos secundarios adversos, incluyendo la
extravasación e irritación de tejidos con dolor, enrojecimiento,
hinchazón, y otros síntomas. Además, de algunos de los efectos
secundarios puede resultar la necrosis tisular. La membrana de
p-GlcNAc y los materiales de gel de las
composiciones de la invención usados para la liberación tópica y
controlada de los fármacos antitumorales tiene propiedades de
curación de heridas. Por lo tanto, los tejidos normales que están en
contacto con los fármacos antitumorales vesicantes o irritantes
suministrados por la membrana de p-GlcNAc y
formulaciones de gel de la invención, no son dañados tan fácilmente
y se curarán más rápido debido a los efectos activos de curación del
componente de p-GlcNAc de las composiciones que
contienen p-GlcNAc de la invención.
En esta sección, la p-GlcNAc se
purificó usando la técnica de la fuerza mecánica descrita en la
Sección 5.1, véase antes.
Condiciones del cultivo de diatomeas: La
especie diatomea Thalassiosira fluviatilis se hizo crecer en
cultivo de acuerdo con los procedimientos descritos en la patente de
Estados Unidos 5.635.493, incorporada en el presente documento por
referencia.
Procedimientos de SEM: Las técnicas de SEM
usadas aquí fueron las siguientes: Se usó un instrumento Zeiss 962
con un voltaje acelerador de 10 kV, y una distancia de trabajo de 15
mm. Se usó un aparato Polaroid tipo 55 p/n (u4) con diferentes
aumentos, como se indica. Revestimiento de la muestra: revestimiento
de carbón (100 \ring{A}) y 100 \ring{A} aupd.
(a) Preparación de la muestra: Para la fijación
principal, el medio de crecimiento del cultivo se sustituyó por
glutaraldehído al 2% en DMEM de Eagle sin suero. Se llevaron a cabo
varios cambios para asegurar una transición completa del medio de
crecimiento al fijador. La fijación se produjo en 0,5 horas a
temperatura ambiente. Los cubreobjetos se transfirieron a viales
recientes que contenían glutaraldehído al 2% en cacodilato de Na 0,1
M a pH 7,2 con sacarosa 0,1 M y fijado durante 1,5 horas adicionales
a temperatura ambiente.
Procedimiento de purificación de la
p-GlcNAc: la p-GlcNAc se
purificó del cultivo de diatomeas usando la técnica de la fuerza
mecánica descrita en la sección 5.1, véase antes. Específicamente,
se separaron las fibras de p-GlcNAc de los cuerpos
celulares de las diatomeas sometiendo el contenido del cultivo a
tres golpes cortos de movimiento de mezcla a la velocidad superior
en un mezclador Waring. El tiempo total de los tres golpes fue
aproximadamente un segundo. La suspensión resultante se centrifugó a
3500 rpm en un rotor de ángulo fijo Sorvall GS-4,
durante 20 minutos a aproximadamente 10ºC. El líquido sobrenadante
se decantó, y se volvió a centrifugar, esta vez a 4000 rpm, en un
rotor de ángulo fijo Sorvall GS-4 durante 20 minutos
a aproximadamente 10ºC. Otra vez se decantó el líquido sobrenadante
y se centrifugó a 4000 rpm a 10ºC. El líquido sobrenadante final de
la tercera centrifugación era transparente, con pocos o ningún
flóculo flotante visible en el líquido. El líquido sobrenadante
transparente se decantó en una unidad de filtración Buchner equipada
con una membrana de filtro de poliéter-sulfona
Supor-800 con un tamaño de poros de 0,8 \mum
(Gelman, Inc.), después se aplicó succión y el líquido se filtró de
la suspensión de fibra, permitiendo recoger las fibras sobre la
membrana. Las fibras recogidas se lavaron con 1 litro de H_{2}O
destilada y desionizada a 70ºC. Cuando se hubo drenado prácticamente
toda el agua, las fibras se lavaron, con succión, con 1 litro de HCl
1 N a 70ºC. Cuando se hubo drenado la mayor parte de la solución
ácida, las fibras se lavaron con 1 litro de H_{2}O destilada y
desionizada a 70ºC, usando succión. Cuando se hubo drenado la mayor
parte del agua de lavado, las fibras se lavaron con 1 litro de
etanol al 95% a temperatura ambiente, y se aplicó vacío. Después, se
quitó la membrana de filtro sobre la que se había recogido la
membrana de fibra blanca, de la unidad de filtración y la membrana y
su soporte de membrana se secaron en un horno de secado a 58ºC
durante 20 minutos, después de lo cual la membrana y su soporte se
pusieron en un desecador durante 16 horas.
Después de este procedimiento de purificación, el
rendimiento de la p-GlcNAc a partir de un cultivo de
1000 ml fue 6,85 miligramos por litro de cultivo de diatomeas.
En esta sección, la p-GlcNAc se
purificó usando dos de las técnicas químicas/biológicas descritas en
la Sección 5.1, véase antes. Brevemente, la p-GlcNAc
se purificó por tratamiento con HF en un caso, y por tratamiento con
ácido/neutralización en el segundo caso.
Condiciones de cultivo de las diatomeas:
La especie de diatomea Thalassiosira fluviatilis se hizo
crecer en cultivo de acuerdo con los procedimientos descritos en la
patente de Estados Unidos 5.635.493, incorporada en el presente
documento por referencia.
Procedimientos de SEM: La técnica usada en
este estudio fue como se ha descrito antes.
Procedimiento de purificación: Primero, se
purificó la p-GlcNAc por tratamiento con HF.
Específicamente, se añadieron 2,42 ml de una solución de HF al 49%
(29 N) al contenido de diatomeas del cultivo, bajo una campana de
humos, a temperatura ambiente, para cada 1000 ml de volumen de
cultivo celular original, dando como resultado una solución de HF
0,07 M. Después, la mezcla se agitó vigorosamente durante
aproximadamente 30 segundos, haciendo que apareciera una espuma
persistente encima del líquido. El recipiente se dejó reposar sin
perturbar durante 5-6 horas para dejar que
sedimentaran las partículas pesadas. Al final de este periodo de
tiempo, se había formado una capa de espuma, mientras que el propio
líquido se dividió en dos estratos: primero, una capa verde muy
oscuro estrecha que reposaba en la parte inferior del recipiente
debajo de una segunda fase de color verde-grisáceo
mucho más clara y turbia que representaba, quizás el
85-90% del volumen total de líquido. La capa de
espuma se sifonó cuidadosamente, usando un tubo de vidrio capilar y
succión a vacío. Después, el líquido sobrenadante grisáceo turbio se
sifonó con cuidado de no perturbar la capa inferior oscura, que
consistía principalmente en los cuerpos celulares sedimentados, y se
transfirió a un recipiente de plástico separado. El líquido
sobrenadante grisáceo turbio se dejó reposar sin perturbar durante
16 horas adicionales. El líquido inicialmente era casi incoloro,
gris claro, pero no transparente. Después de 16 horas de
sedimentación, quedaba una pequeña cantidad de espuma en la parte
superior de la parte principal del líquido y se había depositado una
pequeña cantidad de materia verde en la parte inferior del
recipiente. El líquido era de color más claro, pero todavía no era
transparente. Se sifonó como antes la espuma de la parte superior
del líquido. Después la parte principal del líquido se sifonó
cuidadosamente, dejando detrás una pequeña cantidad de material
verde sedimentado en la parte inferior del recipiente. El líquido
que se aisló de esta forma, contenía la mayor parte de las fibras de
p-GlcNAc y algunas impurezas.
Para separar las proteínas y otros materiales no
deseados liberados por las diatomeas durante las etapas precedentes
en el procedimiento del líquido que contenía las fibras, la
suspensión del resto de fibras y células se lavó con dodecilsulfato
sódico (SDS). Específicamente, se añadió el volumen necesario de una
solución de SDS al 20% para llevar la concentración final del
líquido de SDS al 0,5% en volumen. El recipiente que contenía el
líquido se cerró, se aseguró en una posición horizontal en una
máquina agitadora, y se agitó durante 24 horas a aproximadamente 100
agitaciones por minuto. Inmediatamente después de iniciar la
agitación, empezaron a aparecer flóculos grandes de fibras de
p-GlcNAc blancas en suspensión, y una cantidad
considerable de espuma acumulada en la cámara de aire de los
recipientes. Al final de los lavados con SDS, el contenido de los
recipientes se transfirió a un equipo de filtración Buchner provisto
de una membrana de filtro de poliéter-sulfona
Supor-800, con un tamaño de poros de 0,8 micrómetros
(Gelman, Inc.) El líquido se filtró con succión, y las fibras de
p-GlcNAc y el líquido se recogieron sobre la
membrana de filtro.
Después, las fibras de p-GlcNAc
recogidas sobre la membrana de filtro se lavaron más. Primero, las
fibras se lavaron con H_{2}O destilada, desionizada caliente
(70ºC), usando tres veces el volumen de la suspensión original.
Mediante un chorro de agua usando H_{2}O destilada y desionizada,
los terrones de fibras blancas recogidos en la membrana de filtro
Buchner se transfirieron a un mezclador Warning y los terrones se
desintegraron con aproximadamente 10 golpes de mezclado cortos. La
suspensión de las fibras desintegradas se transfirió a un embudo de
filtro Buchner equipado con una membrana de filtro de
poliéter-sulfona como se ha descrito antes, y el
líquido se separó con succión. Las fibras recogidas se lavaron con
1000 ml de solución de HCl 1 N (70ºC) caliente, y posteriormente se
lavaron con 1000 ml de H_{2}O destilada y desionizada caliente
(70ºC). Finalmente las fibras se lavaron con 1000 ml de etanol al
95% a temperatura ambiente, y se filtraron hasta sequedad. Después,
la membrana de fibra y la membrana de filtro que soportaba la
membrana de fibra se secaron en un horno de secado a 58ºC durante 20
minutos. Después, la membrana y el soporte de membrana se pusieron
en un desecador durante 16 horas. Después la membrana se desprendió
cuidadosamente de la membrana de filtro.
Segundo, la p-GlcNAc se purificó
usando el procedimiento de tratamiento con ácido/neutralización
descrito en la Sección 5.1, véase antes. Específicamente, la
p-GlcNAc se procesó como se ha descrito antes en
esta Sección, hasta antes de la etapa de lavado con SDS, momento en
el que la solución se neutralizó a un pH de aproximadamente 7,0 por
adición de una solución de Tris 2,9 M. El rendimiento de
p-GlcNAc de este procedimiento de purificación
particular fue 20,20 miligramos por litro de cultivo de diatomeas,
aunque, como media, se obtuvieron aproximadamente 60 miligramos por
litro de cultivo de diatomeas. En la Figura 3 se muestra una
micrografía de SEM de una membrana formada como resultado del
procedimiento de purificación por tratamiento con
ácido/neutralización.
Se suspendió una membrana de
p-GlcNAc en una solución acuosa de NaOH al 50%. La
suspensión se calentó a 80ºC durante 2 horas. La membrana
desacetilada resultante se secó y se estudió por microscopía
electrónica de barrido, como se muestra en la Figura 5.
Se disolvió una membrana de
p-GlcNAc (16,2 mg) en 1 ml de una solución de
dimetilacetamida que contenía LiCl al 5%. La solución que contenía
p-GlcNAc se puso en una jeringuilla y se extruyó en
50 ml de agua pura para precipitar las fibras. El material de fibra
resultante se estudió usando microscopía electrónica de barrido,
como se muestra en la Figura 6.
Ro91-0612/001 (también denominado
en el presente documento "Ro61") es un antagonista de
endotelina no basado en péptido y no específico, con la estructura
representada en la Fórmula I, véase antes. Su nombre químico, en
forma de sal, es la sal de sodio (1:2) de la
[6-(2-hidroxi-etoxi)-5-(2-metoxi-fenoxi)-2-[2-(1H-tetrazol-5-il)-piridin-4-il]-pirimidin-4-il]amida
del ácido
5-isopropil-piridina-2-sulfónico,
y su peso molecular es 649,59. Su solubilidad en agua es mayor que
3%. La potencia inhibidora de la unión de Ro61 (CI_{50}) al
receptor ETA es 1-20 mM y al receptor ETB es
20-30 nM. Su potencia inhibidora funcional (pA2) con
respecto al receptor ETA es 9,5 y con respecto al receptor ETB es
7,7. Su dosis in vivo recomendada es 1-30
mg/kg vía i.v. o ip. Su dosis in vitro recomendada es de
10^{9} a 10^{-5} M.
Ro61 para usar en una composición de la
invención, inicialmente se proporcionó en forma de un polvo
liofilizado de Acetilion Ltd., Allschwill, Suiza, que se suspendió
en agua estéril, y el pH se ajustó a 4,0 con ácido clorhídrico
estéril. Alternativamente, Ro61 se sintetizó usando técnicas
conocidas en la técnica.
Se preparó una suspensión de fibras de
p-GlcNAc como sigue: la p-GlcNAc
preparada por el procedimiento biológico/químico descrito en la
Sección de ejemplo 7, véase antes, se volvió a suspender en agua
destilada-desionizada y se agitó para formar una
suspensión fibrosa de aproximadamente 1 mg/ml. La suspensión de
fibras después se secó en horno a 60ºC durante 2 h para formar
membranas de polímero de p-GlcNAc. Las membranas se
desacetilaron en solución de NaOH al 40% a 80ºC durante 2 h. Cuando
se alcanzó el 100% de desacetilación de las membranas, se lavaron
con agua destilada-desionizada hasta que se alcanzó
un pH de 7,0.
Después, las membranas desacetiladas lavadas se
convirtieron en la sal de lactato de la p-GlcNAc en
presencia de ácido láctico, esencialmente como se describe en la
patente de Estados Unidos 5.623.064, incorporada en el presente
documento por referencia. Brevemente, se suspendió la
p-GlcNAc desacetilada en un medio orgánico tal como
2-propanol (que contenía 10% de agua) para
humedecer así todo el material de p-GlcNAc
desacetilada. Se añadió con agitación, una cantidad adecuada de
solución acuosa de ácido láctico al 50%. El ácido láctico debe ser
de calidad reactivo y se debe analizar para determinar la
concentración exacta de ácido láctico disponible presente (es decir,
no esterificado. Esto se llevó a cabo generalmente por valoración
con NaOH 0,1 N hasta el punto final de la fenolftaleína (pH 7,0). La
mezcla se dejó agitar al menos dos horas a temperatura ambiente. Se
puede aumentar un poco el calor para aumentar la velocidad de la
reacción. El tiempo de reacción se puede prolongar, o se puede
aumentar la cantidad de ácido láctico acuoso al 50% para asegurar
que la reacción se completa. Después, la suspensión se filtró
finamente a través de un embudo Buchner usando papel de filtro sin
cenizas cuantitativo, y el material, en forma de una membrana, se
lavó con 2-propanol anhidro. Después, la membrana se
dejó secar al aire en una campana de humos durante 2 horas y después
se puso en un horno a 40ºC toda la noche.
Después, se preparó un gel de
EA/p-GlcNAc para inyección disolviendo las membranas
de p-GlcNAc-lactato en agua
destilada-desionizada a la concentración deseada,
por ejemplo p-GlcNAc-lactato al 2%
en peso, y añadiendo R061 a la solución. La concentración final de
Ro61 en el gel se ajustó de forma que cada animal recibiera 3 mg/kg
en una muestra de gel de 200 \mul. Opcionalmente, se puede añadir
un propilenglicol (2-propanodiol) de calidad
reactivo a la solución de p-GlcNAc a una
concentración final de propilenglicol entre 1-10%.
En algunos casos, se puede añadir un conservante para evitar la
contaminación bacteriana y/o fúngica. De acuerdo con otras
realizaciones, se pueden preparar concentraciones de
p-GlcNAc-lactato en el intervalo de
0,1% a 4,0%, como se ha descrito antes. La viscosidad de estas
preparaciones aumenta cuando aumenta el porcentaje de
p-GlcNAc-lactato, de forma que las
formulaciones que tienen 0,5% o más de
p-GlcNAc-lactato se comportan como
geles.
Se evaluaron las células B16 para usar como un
sistema de modelo de tumor sensible a la endotelina. Las células
B16, es decir, de línea celular de melanoma murino B16 (de origen
fibroblástico), se obtuvieron de la American Type Culture Collection
(Rockville MD) en forma de una solución madre congelada. Las células
se cultivaron en medio completo (CM): RPMI 1640 (Irvine Scientific,
Santa Ana CA) complementado con suero bovino fetal inactivado con
calor al 10% (Summit Biotechnologies, Ft. Collins CO), penicilina
(50 unidades/ml), estreptomicina (50 \mug/ml),
L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales en MEM
0,1 mM (Gibco BRL, Gaithesburg MD), piruvato sódico 1 mM, y
2-mercaptoetanol 0,05 mM (Sigma Immunochemicals, St
Louis MO)). Las células se hicieron crecer a 37ºC en un incubador
humidificado con CO_{2} al 5% y ajustado a 1 x 10^{5} células/ml
cada segundo día.
Se analizaron los niveles de endotelina y
expresión del receptor de endotelina (ETR) en las células B16, como
sigue: se midió la ET1 en los líquidos sobrenadantes del cultivo de
B16 por un radioinmunoensayo competitivo (RPA 545, Emersham, Milford
Ma) con ligando radiactivo y un anticuerpo específico para ET1. Se
hicieron reaccionar la ET unida y libre con un segundo sistema de
fase de anticuerpo seguido de separación magnética. Se determinó una
curva patrón calculando el porcentaje de ligando unido/patrón cero
(B/B_{0}), y se pudo leer la concentración de ET a partir de esta
curva patrón. La recuperación del procedimiento de extracción fue 75
\pm 5% basado en los patrones de plasma (4-20
fmoles/ml). La variación entre ensayos era 10%, y la variación
dentro del ensayo era 9%, para el procedimiento de radioinmunoensayo
de ET.
Usando este ensayo en un experimento, se encontró
que los niveles de ET1 iniciales en líquidos sobrenadantes de
cultivos de B16 de 24 h eran 1,269 fmol/ml. La adición a los
cultivos de agonista ETA o ETB 10 \muM o ambos indujo una mayor
proliferación de las células B16, del 137%, 117% y 164% de los
controles no tratados, respectivamente, con los correspondientes
niveles de ET1 de 34,01, 1,158, y 34,01 fmol/ml, respectivamente. En
un experimento posterior, los niveles iniciales de ET1 en cultivos
de B16 de 24 h eran 597 \pm 58 fmol/ml y la adición de un agonista
no selectivo (ET1), un agonista del receptor ETB selectivo (BQ3020)
10 \muM o ambos, aumentó la proliferación de las células B16
comparado con los controles no tratados, en el 154%, 116% y 141%,
respectivamente (véase la Tabla 1 a continuación). Estos datos
indican que las células de melanoma B16 murino expresan los ETR, que
son sensibles a los antagonistas de la endotelina establecidos.
Ligando (Receptor) | % de proliferación comparado con controles no tratados | |
Agonistas | ET1(ETA>ETB) | 154 (\pm 20,9) |
BQ 3020 (ETB) | 116 (\pm 0,8) | |
ET1 + BQ 3020 | 141 (\pm 4,1) |
Además, se determinó que las células B16
expresaban receptores de endotelina mediante tinción de
inmunofluorescencia usando el kit de citrometría de flujo
intracelular de Pharmigen con anticuerpos
anti-receptor de la endotelina citoplasmáticos, es
decir, dirigidos contra la región citoplasmática del receptor
(Research Diagnostics Inc., Flanders NJ) y controles de anticuerpo
isotípico IgG anti-ratón de oveja (Sigma
Immunchemicals, St. Louis MO). De acuerdo con este procedimiento,
las células B16 se lavaron en tampón de Cytofix/Cytoperm (del kit de
Pharmingen) y se incubaron durante 20 min con una solución de
permeabilización (Triton al 0,1% x 100, en citrato sódico al 0,1%).
Después, las células se incubaron a 4ºC en la oscuridad durante 30
min con anticuerpos del receptor de endotelina primarios o control
isotipo, y se lavaron e incubaron 30 min adicionales con el
anticuerpo secundario marcado con FITC (IgG
anti-oveja de ratón; Sigma). Las células se
visualizaron y se fotografiaron usando un microscopio de
investigación Axioplan (Carl Zeiss Unc, Jena Alemania) equipado con
una fuente de luz de mercurio de 100 vatios y un objetivo
Plan-Neufluar na 1.3.
Estos experimentos de teñido de
inmunofluorescencia mostraron que las células de melanoma B16
expresaban niveles detectables de receptores de ETA y ETB.
Los ensayos de unión con
ET-1^{125} también sugerían que las células B16
expresen receptores de ET. Estos ensayos se llevaron a cabo como
sigue: se suspendieron células musculares lisas vasculares aórticas
denominadas células A10, células B16 y células CHO con una
concentración de 2 x 10^{6} células/ml en tampón de unión
(Tris/HCl 50 mM, pH = 7,4, EDTA 5 mM, y BSA al 0,5%) en tubos
individuales. Las células A10 se usaron como un control positivo de
ETA, mientras que las células CHO se usaron como un control
negativo, demostrando que no había unión de ET1 marcado, de acuerdo
con la ausencia de ETR en esta linea celular.
Se añadió una parte alícuota de 21 \mul de
(3-[^{125}I] yodotirosil)endotelina-1
(ET1-I^{125}, de Amersham Life Science Inc,
Arlington Heights, IL) a cada tubo con una concentración final de
10^{-12} M. Después las células marcadas se dividieron en partes
alícuotas en tubos de microcentrífuga y se añadieron 18 \mul de
ET1 sin marcar (con una concentración final de 10^{-8} M) o HBSS.
Se mezclaron los tubos y cada muestra se dividió en partes alícuotas
de 300 pl, se pusieron en tubos siliconizados y se agitaron durante
2,5 horas a 37ºC. Después de incubación, los tubos se centrifugaron
a 10.000 rpm durante 6 minutos, se volvieron a suspender los
sedimentos celulares mediante mezcla vortical en 300 \mul de
tampón de unión, y se lavaron dos veces otra vez en tampón de unión.
Después del lavado final, las células se volvieron a suspender en
500 \mul de NaOH 1 N, se agitaron durante 10 minutos a 37ºC y se
pusieron en tubos de centelleo para el recuento en un sistema de
recuento gamma Packard Cobra Auto-gamma 5000 Series
(Modelo 5002) (Packard Instrument Co., Meridea, CT).
Los resultados de estos ensayos de unión de ET1,
que demuestran que las células B16 expresan ETR, se muestran en la
Tabla 2 a continuación.
Unión de ET1 a células tumorales B16 | |||
A10 | B16 | CHO | |
Unión de ET1* | 53885 | 25605 | 119 (\pm91) |
(\pm 2555) | (\pm 3801) | ||
Unión de ET1 con competidor** | 1135 | 1398 | 346 (\pm 259) |
(\pm 120) | (\pm 691) | ||
Los resultados se expresan como cpm medios por 10^{6} células (\pm ETM) | |||
* Se añadió ET1-I^{125} con una concentración final de 10^{-12} M. | |||
** El competidor era ET1 sin marcar añadido con una concentración final de 10^{-8} M. |
Los esplenocitos normales no muestran niveles
visibles de ETR cuando se detectan por inmunofluorescencia como se
ha descrito antes. Debido a la facilidad de aislamiento de los
esplenocitos y de cultivo, se usaron como células control para
evaluar los efectos de Ro61 en la proliferación celular. Se
recogieron esplenocitos de ratones hembra de 6-8
semanas de edad C57BL/6 (H-2b) (Jackson
Laboratories, Bar Harbor MA) como sigue: se sacaron los bazos, se
pusieron en CM, y sus células se dispersaron con un émbolo de
jeringa de 3 cc. Después, la suspensión celular se filtró a través
de un filtro celular de 70 \mum y se lisaron los eritrocitos con
solución de lisis de cloruro amónico (preparada mezclando 9 partes
de cloruro amónico 8,3 g/l; 1 parte de Tris 20,59 g/l, pH 7,65,
inmediatamente antes de usar). Después los esplenocitos se lavaron y
se volvieron a suspender en CM.
Ro61 se obtuvo en forma de polvo liofilizado de
Acetelion Ltd, Allschwill, Suiza, como se ha descrito antes, y se
llevaron a cabo ensayos de proliferación para evaluar el efecto de
Ro61 en la proliferación de células B16 in vitro. Más
específicamente, se añadió Ro61 en HBSS con concentraciones
crecientes a una placa de cultivo de 96 pocillos. Después, se
añadieron las células B16 o los esplenocitos control como se ha
descrito antes, a los pocillo con una concentración de 10^{5}
células por pocillo, y se hicieron crecer durante 72 h. La
proliferación celular se ensayó usando el kit de CellTiter 96 para
la medición de la proliferación celular no radiactiva (Promega,
Madison WI) como sigue: Brevemente, las células se incubaron con 15
ml de colorante MTT (de Promega kit) durante 4 horas, después de lo
cual era visible la formación de cristales de formazán. Los
cristales se disolvieron en 50 ml de solución de
solubilización/parada (de Promega kit) durante 30 min a temperatura
ambiente, y se midieron los cambios de color como DO a 570 nm. Se
restó la DO de fondo a 630 automáticamente. Se determinaron los
valores medios de los pocillos por triplicado. La proliferación o
muerte celular también se registró por fotografía de microscopía
óptica con una potencia focal 40X.
En la Figura 7 se representa el efecto inhibidor
de Ro61 en las células de melanoma B16. La proliferación de las
células tratadas con Ro61 se expresa como un porcentaje de las
células control no tratadas. Se determinaron los valores medios de
los pocillos por triplicado. Como puede verse en la Figura 7, Ro61
inhibió la proliferación de las células B16 (círculos negros) pero
no inhibió los esplenocitos normales (círculos blancos). Además,
cuando se añadió Ro61 con concentraciones crecientes a las células
en el cultivo, se observó una inhibición dependiente de la dosis.
Este efecto se observó con concentraciones 0,1 \muM (22% de
inhibición comparado con los controles no tratados) y era máximo con
10 \muM (83% de inhibición). Por el microscopio, a la
concentración más alta de Ro61, las células B16 ya no tenían una
forma del huso de tipo fibroblasto normal, si no que eran redondas y
dispersas con poca viabilidad (véase las Figs.
17A-17B). En contraste con esto, la adición de la
concentración incluso más alta de Ro61 (10 \muM) sólo afectó
mínimamente a los esplenocitos.
También se encontró que los niveles de endotelina
en los líquidos sobrenadantes del cultivo de B16 aumentaron (de 513
\pm 27 fmol/l con 50 nM de Ro61 a 954 \pm 31 fmol/l con 5 \muM
de Ro61) de una forma dependiente de la dosis (p<0,001). Esta
observación está de acuerdo con el bloqueo de ETR por Ro61, que da
como resultado la interrupción de un bucle de retroalimentación
mediado por el receptor.
Puesto que Ro61, un inhibidor del receptor de ET,
producía la inhibición de la proliferación de células B16, era
interesante determinar si la adición de agonistas peptídicos
específicos para ETA o ETB podía invertir este efecto, es decir, por
competición con Ro61 por los sitios de unión al receptor. El
agonista,
BQ-3020-[Ac-[Ala11,15]-endotelina(6,21),
es decir, BQ3020 (Novabiochem, nº de catálogo A1 4534) y el
agonista, [Ala^{1,3,11,15}]-endotelina1 (Sigma
Immunochemicals, St. Louis MO, nº de catálogo: E6877), se
suspendieron en HBSS para usar. Se cultivaron 5 x 10^{4} células
con agonista solo, como ambos agonistas juntos o sin ninguno, con
una concentración 10 nM en cada pocillo, y después se añadió Ro61
con diferentes concentraciones en los pocillos.
Como se demuestra en la Figura 10, se evitó la
inhibición por Ro61 de la proliferación de B16 por adición de
agonistas del receptor de ET. La proliferación de células tratadas
con Ro61 se expresa como un porcentaje de las células control no
tratadas. Se determinaron los valores medios de los pocillos por
triplicado. Primero, como se indica en el eje Y de la Figura 10 (0
concentración de Ro61), la adición del agonista BQ3020 (triángulos
negros) o del agonista de ET-1 (rombos blancos)
solo, o de los dos agonistas combinados (cuadrados blancos),
inducían la proliferación de las células B16. Para el agonista
BQ3020, la proliferación era el 137% de los controles no tratados,
para el agonista de ET1, la proliferación era el 117% de los
controles no tratados, y para la combinación de agonistas, la
proliferación era el 164% de los controles no tratados.
Como se indica además en la Figura 10, la adición
de estos agonistas también contrarrestaba la inhibición inducida por
dosis crecientes de Ro61. Por ejemplo, la adición de ET1 con una
concentración 10 nM invirtió completamente los efectos de Ro61 con
una concentración 1 nM, y disminuyó la inhibición por Ro61 al 50%
con 5 \muM. El agonista BQ3020 podía invertir significativamente
los efectos de Ro61 5 \muM (sólo 12% de inhibición de la
proliferación con 5 \muM). El efecto más significativo se observó
con la combinación de los agonistas que inducían proliferación (el
123% de los controles no tratados), incluso con la adición de Ro61
0,1 \muM. Estos descubrimientos dependientes de la dosis definían
una respuesta de proliferación mediada por el receptor de endotelina
para las células B16 murinas que podía ser inhibida por un
antagonista del ETR.
En otros experimentos, se ensayó Ro61, un
antagonista tanto de ETA como de ETB que tenía una afinidad
aproximadamente 10 veces mayor para ETA, junto con BQ123, un
antagonista de ETA, y BQ788, un antagonista de ETB (ambos obtenidos
en American Peptide Co., Sunnyvale, CA) para determinar el efecto de
estos antagonistas en la proliferación de células B16 usando en
ensayo de proliferación celular descrito antes. La presencia de
BQ123, BQ788, BQ123 + BQ788, o Ro61-0612/001 (cada
uno con una concentración total 10 \muM) en cultivo, dio como
resultado la inhibición significativa de la proliferación (16, 18,
19 y 50%, respectivamente, comparado con los controles no tratados;
p = 0,001, véase la siguiente Tabla 3).
Ligando (Receptor) | % de proliferación comparado con los controles no tratados | |
Antagonistas | BQ 123(ETA) | 84 (\pm 6,6) |
BQ 788 (ETB) | 82 (\pm 1,9) | |
BQ123 + BQ788 | 81 (\pm 4,5) | |
Ro61 (ETA>ETB) | 50 (\pm 4,8) |
Todavía en otros ensayos de proliferación,
descritos antes, se ensayaron diferentes antagonistas de endotelina
para determinar su efecto en la proliferación de células B16. Se
compararon las células B16, que se habían depositado diez veces en
animales y expresan un ETR de longitud completa de tipo salvaje, con
células B16 control, denominadas FO, que expresan un ARNm de ETA
truncado y parece que producen un receptor de ETA incompleto.
Como se representa en las Figuras 8 y 9, los
antagonistas de endotelina, IRL, BQ123, BQ610, BQ485, BQ788, RES con
concentración 10^{-6} M, inhibían todos la proliferación de
células B16 comparado con los controles FO y los controles de
agonistas de endotelina, ET1 y BQ3020.
Los estudios in vitro indicaban que el
tratamiento con Ro61 no sólo contribuía a una inhibición de la
proliferación celular, si no que también había un componente
significativo de muerte celular o necrosis. De hecho, las células
B16 tratadas con Ro61 mostraron un grado significativo de cambios
morfológicos acordes con la muerte celular programada (véase la
Figura 11).
Por lo tanto, se investigó el efecto de R061 en
la muerte celular apoptótica de B16. Las células B16 se hicieron
crecer en CM en matraces de cultivo de 25 ml, con o sin Ro61 1
\muM, a 37ºC en un incubador con CO_{2} al 5% durantes hasta 72
h. Se ensayó la apoptosis o muerte celular de las células usando el
kit de detección de muerte celular in situ con fluoresceína
(Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) como sigue: Brevemente,
las células se tripsinizaron y se lavaron con PBS que contenía
albúmina de suero bovino al 1% (BSA). Después de fijarlas con una
solución de paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7,4) durante 30 min,
las células se permeabilizaron con una solución de Triton X100 al
0,1% en citrato sódico al 0,1% durante 2 min en hielo. Después, las
células se lavaron y se marcaron con mezcla de reacción TUNEL (kit
de Boehringer) durante 1 h a 37ºC y se lavaron. Se analizó la
fluorescencia en un citómetro de flujo EPICS XL Coulter (Coulter,
Miami FL). Las mediciones se compararon con un control positivo
usando DNasa I 100 \mug/ml (Boehringer Mannheim, Mannheim,
Alemania) durante 10 min a temperatura ambiente, para inducir la
rotura del ADN bicatenario.
Como se representa en la Figura 12, el
antagonista de endotelina Ro61 indujo apoptosis en células de
melanoma B16 en cultivo. Por ejemplo, la adición de Ro61 1 \muM a
las células B16 aumentó significativamente el porcentaje de células
que sufrían apoptosis comparado con los controles no tratados (p =
0,0007). El aumento del porcentaje de células positivas por el
ensayo TUNEL antes descrito era detectable tan pronto como a las 24
h y todavía era detectable a las 72 h. El efecto de la duración
después del cultivo con Ro61 no era significativo; sin embargo, la
mayor apoptosis de las células tratadas con Ro61 comparado con los
controles no tratados era muy importante (12,7%, 95% intervalo de
confianza: 11,7%-13,8%). Estos resultados establecían la presencia
de señalización de células apoptóticas mediada por el ETR que podía
ser inducido mediante un antagonista de ETR. Por lo tanto, la
apoptosis contribuye al menos en parte a la inhibición de la
proliferación celular y la muerte celular observada.
Los notables efectos de Ro61 en células B16 in
vitro condujeron a estudios adicionales para evaluar el impacto
del antagonismo de ETR en el crecimiento tumoral in vivo,
usando un modelo de metástasis/carcinomatosis de melanoma B16
intraperitoneal (IP) agresivo. De acuerdo con este modelo, se
inyectó por vía intraperitoneal en ratones hembra C57BL/6 5 x
10^{4} células B16 en 100 ml HBSS. Un día más tarde, se inyectaron
a los ratones 100 \mul de HBSS solo (sin tratamiento), HBSS que
contenía 3 mg/kg de Ro61 (administrado diariamente), HBSS que
contenía 30 mg/kg de Ro61 (administrado diariamente), gel de
p-GlcNAc (al 2%) solo, o gel de
p-GlcNAc (al 2%) que contenía Ro61 18 mg/kg.
Los animales en los grupos tratados con HBSS que
contenía Ro61 3 mg/kg o 30 mg/kg solo, también recibieron
inyecciones i.p. diarias, mientras que todos los demás grupos se
trataron sólo una vez. El gel de p-GlcNAc solo que
se usó en este experimento se preparó como se indica en la Sección
del ejemplo 10, véase antes, salvo la adición de Ro61. El
Ro61/p-GlcNAc usado en este experimento también se
preparó como se detalla en la Sección 10 anterior. Los ratones se
sacrificaron después de 7 días y se evaluó la presencia de
enfermedad intraperitoneal. Más específicamente, se contaron las
colonias de tumores individuales con un microscopio de disección
para cada animal en la superficie peritoneal, mesenterio, hígado,
bazo, y páncreas. Los estudios se llevaron a cabo en condiciones de
doble ciego. Se tomaron fotografías del peritoneo y órganos
digestivos así como de secciones del mesenterio, hígado, bazo y
grasa pancreática y peritoneo, para el análisis histológico mediante
tinción con H y E así como melanina.
La Figura 13A muestra que los ratones que
recibieron inyecciones IP diarias de Ro61 con una dosis baja, por
ejemplo, 3 mg/kg durante 6 días (para un total de 18 mg/kg) no
presentaban un número significativamente menor de metástasis o
colonias tumorales por animal. (Tal como se usa en el presente
documento, el término metástasis se refiere a colonias tumorales
detectadas en el peritoneo y órganos digestivos de ratones a los que
se han inyectado células de melanoma B16 de acuerdo con el modelo de
carcinomatosis descrito antes).
En contraste, las inyecciones diarias de dosis
mayores de Ro61 solo de 30 mg/kg durante 6 días (para una dosis
total de 180 mg/kg) disminuyeron significativamente el número medio
de colonias tumorales el día 7 después de la inyección del
tumor.
Además, como se representa en la Figura 13B, el
gel de p-GlcNAc solo, redujo el número medio de
colonias tumorales comparado con los controles no tratados, cuando
se inyectó IP, pero no tuvo ningún efecto significativo en el
crecimiento de las colonias cuando se inyectó por vía subcutánea
(SC). La Figura 13B también muestra que la mayor reducción de las
colonias tumorales se produjo con la administración de una sola
dosis (18 mg/kg) de Ro61 formulado en el gel de
p-GlcNAc (número medio de colonias = 2,7 \pm 1,4).
La composición de gel/Ro61 dio como resultado significativamente
menos colonias comparado tanto con la dosis alta de Ro61 (p = 0,001)
como con el gel de p-GlcNAc solo IP (p = 0,02). El
tratamiento con dosis baja de Ro61 y p-GlcNAc sola
por vía SC no eran significativamente diferentes de los controles no
tratados.
Para determinar si Ro61 tenía un efecto no sólo
local debido a la p-GlcNAc si no también un efecto
sistémico, se investigaron los efectos del tratamiento con Ro61 IP
en un modelo de melanoma B16 subcutáneo, SC. Se inyectó por vía SC a
ratones hembra C57BL/6 en el costado 5 x 10^{4} células de
melanoma B16 en 100 \mul de HBSS. Después de 24 horas, los
animales recibieron uno de los siguientes tratamientos (100 \mul,
IP): HBSS (diario x 6), Ro61 30 mg/kg en HBSS (diario x 6), gel de
p-GlcNAc (una administración) o Ro61 18 mg/kg en gel
de p-GlcNAc (una administración). Se controló en los
animales la aparición de tumor y el crecimiento durante un periodo
de 3 semanas después de la inyección del tumor (n = 10 en todos los
grupos).
Como se demuestra en la Figura 14, el modelo de
melanoma B16 SC mostró que todos los animales que recibían Ro61 IP
en HBSS desarrollaban tumores el día 17; sin embargo, había un
retraso significativo en la aparición de tumor (el 50% de los
ratones portaban tumor el día 15 comparado con el 100% de los
ratones que portaban tumor el día 15 en los controles no tratados).
La combinación de Ro61 más p-GlcNAc dio como
resultado un retraso en la aparición del tumor (el 50% de los
ratones portaban tumor el día 13) así como el 10% de los ratones sin
tumor 21 días después de la inyección de tumor, lo cual sugería que
la liberación sostenida de Ro61, en un compartimento separado del
tumor, puede afectar significativamente al crecimiento del melanoma
B16. No había diferencias en la aparición y crecimiento del tumor
entre el grupo control no tratado y el grupo de
p-GlcNAc IP.
Usando los modelos de carcinomatosis descritos
antes, se evaluó el efecto de otros antagonistas de endotelina
diferentes en la formación de colonia tumoral B16. En estos
experimentos, se inyectó a los animales 100 \mul de muestras que
contenían 14,3 mg/ml de cada fármaco o mezcla de fármacos en una
sola dosis. Como se demuestra en la Figura 15, una mezcla de BQ123
(un antagonista de ETA) y BQ788 (un antagonista de ETB) con una
concentración total final igual a la de Ro61 (un antagonista de ETA
y ETB) disminuyó significativamente el número de colonias tumorales
a un nivel similar al demostrado por Ro61, cuando se compara con las
células B16 control no tratadas. Además, cuando la mezcla de BQ se
combinó con p-GlcNAc como se ha descrito antes, el
número de colonias tumorales disminuyó más a un nivel casi
equivalente al observado con Ro61 más p-GlcNAc.
Finalmente, el antagonista de ETA/ETB mixto, GRGDS, un pentapéptido
disponible en el comercio (American Peptide Co.), cuando se combinó
con p-GlcNAc, demostró una disminución incluso
mayor del número de colonias tumorales que
Ro61/p-GlcNAc (véase la Figura 15, última
columna).
También se evaluó la terapia de antagonismo de la
endotelina en experimentos in vivo de supervivencia a largo
plazo. Los resultados se muestran en la Figura 16. Se inyectaron en
ratones hembra C57BL/6 por vía intraperitoneal, 5 x 10^{4} células
B16 en 100 ml de HBSS. Los animales se separaron aleatoriamente en 4
grupos para cualquiera de los siguientes tratamientos: (a) sin
tratamiento (cuadrados negros); (b) 100 \mul de gel de
p-GlcNAc solo (cruces); (c) 100 \mul de HBSS
diario que contenía Ro61 3 mg/kg (triángulos negros); o (d) 100
\mul de gel de p-GlcNAc que contenía Ro61 3 mg/kg
(cuadrados blancos). Se controló a los animales diariamente y se
sacrificaron por razones humanitarias cuando se determinó que
estaban moribundos.
Es interesante indicar que el melanoma B16 es un
tumor extremadamente virulento, que da como resultado una tasa de
supervivencia del 0% sistemáticamente en 19-20 días
después de inyectar el tumor. Como se indica en la Figura 10, la
inyección de p-GlcNAc sola retrasó la muerte 5 días
pero no aumentó la tasa de supervivencia de los animales. Sin
embargo, la combinación de p-GlcNAc y Ro61 con una
dosis baja (3 mg/kg) también retrasó la muerte y el 33% de los
animales no mostró pruebas de tumor a los 33 días después de
inyectar el tumor. Las inyecciones diarias de la misma dosis baja de
Ro61 solo, no afectaron a la supervivencia de los ratones.
Los estudios llevados a cabo en el presente
documento muestran la prueba directa de que la inhibición de la
unión de las endotelinas a sus receptores puede afectar a la
proliferación normal de una línea celular de melanoma murino, tanto
in vitro como in vivo. Por ejemplo, el antagonista de
endotelina, Ro61, es un inhibidor de los receptores tanto ETA como
ETB con una afinidad aproximadamente 10 veces mayor para ETA. Esto
se correlaciona bien con la inhibición dependiente de la dosis de la
proliferación de células de melanoma por Ro61 en los experimentos,
así como el efecto contrapuesto más fuerte a esta inhibición
obtenido por la adición de un agonista de ETA a diferencia de un
agonista de ETB. Además, en este documento también se ha demostrado
que numerosos antagonistas de endotelina diferentes inhiben la
proliferación celular de melanoma, incluyendo antagonistas
específicos tanto de ETA como de ETB, por ejemplo BQ123, BQ485,
BQ610, BQ788, RES e IRL.
Es interesante indicar que se ha mostrado que las
células de melanoma expresan niveles altos de receptores de ET y son
más susceptibles a la inhibición del antagonista de endotelina que
los esplenocitos normales, que se sabe que tienen muchos menos
receptores de ET de membrana. Por lo tanto, las pruebas presentadas
en el presente documento apuntan a que los antagonistas de
endotelina, tales como Ro61, BQ123, BQ485, BQ610, BQ788, RES e IRL
tienen un efecto antiproliferativo en las células tumorales en
cultivo, cuya inhibición del crecimiento de células tumorales es
mediado por la unión a los receptores de endotelina que responde a
agonistas peptídicos específicos para ETA y/o ETB.
Además, los presentes estudios indican que los
antagonistas de endotelina solos o combinados con la
p-GlcNAc descrita en el presente documento, reducen
significativamente la carcinomatosis in vivo. Además, las
composiciones de EA/p-GlcNAc de esta invención, por
ejemplo Ro61/p-GlcNAc, aumentan notablemente la tasa
de supervivencia de los animales portadores de células tumorales
in vivo. El efecto de Ro61 parece que implica un mecanismo
apoptótico de acción, que no contradice algunos de los mecanismos
conocidos de acción de las endotelinas y sus mecanismos de
transducción de señales.
Los estudios farmacocinéticos con Ro61 indican
que es metabolizado relativamente rápido in vivo, por
ejemplo, en 2-4 horas; sin embargo, cuando Ro61 se
combina con el polímero p-GlcNAc de esta invención,
Ro61 es retenido en el gel y es liberado más lentamente, y se puede
detectar, por ejemplo, durante al menos 48 horas. Además, si la
concentración del antagonista de endotelina en el gel aumenta, el
antagonista se puede retener en el gel durante al menos 72 horas (no
se muestran los datos). Por lo tanto, modificando la concentración
del antagonista de endotelina en la p-GlcNAc de la
invención, se puede obtener la liberación lenta deseada, y por lo
tanto un efecto potenciado, del antagonista en el tratamiento de la
enfermedad proliferativa.
Finalmente, como se indica en la siguiente Tabla
4, otros tipos de células que expresan el receptor ETA también
reaccionan con el antagonista de endotelina Ro61 como se describe en
el presente documento, es decir, para presentar una inhibición de la
proliferación celular tras la exposición al antagonista de
endotelina. Estos datos correlacionan, en diferentes tipos de
células, la presencia, por ejemplo, del receptor ETA con el efecto
de antagonistas de endotelina en la proliferación celular. Por
ejemplo, estos resultados indican que si un tumor tal como un tumor
pancreático, de mama o próstata, expresa el receptor ETA, se puede
tratar con un antagonista de endotelina sensible a ETA, como se
describe en el presente documento.
ETA | efecto de Ro61 | ||
control negativo | CHO | NO | NO (5/5) |
melanoma de melanocitos | melanocito | SI | SI (2/2) |
B16F10 | SI | SI (5/5) | |
MEL 501 | NO | NO | |
MEL 888 | SI | SI (2/3) | |
cáncer pancreático | ASPC I | SI | SI (5/5) |
ASPC4 | NO | NO (5/5) | |
CAPAN 1 | NO | NO (4/5) | |
PANC I | SI | SI (4/5) | |
BXPC3 | SI | SI (3/4) | |
cáncer de mama | MDA 231 | NO | NO (3/3) |
MDA 453 | SI | SI (3/3) | |
cáncer de próstata | DUI45 | NO | NO (5/5) |
LN CAP | NO | NO (5/5) |
La presente invención no está limitada en su
alcance por las realizaciones específicas descritas en el presente
documento, que sólo son ilustraciones de aspectos individuales de la
invención, y los métodos y componentes funcionalmente equivalentes
están dentro del alcance de la invención. De hecho, diferentes
modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas
en el presente documento, serán evidentes para los expertos en la
técnica a partir de la descripción precedente y los dibujos que
acompañan. Se pretende que dichas modificaciones estén dentro del
alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Claims (23)
1. Una composición antitumoral que comprende al
menos un antagonista de endotelina combinado con una
poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina,
comprendiendo dicha
poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina
aproximadamente 4.000 a aproximadamente 150.000 monosacáridos de
N-acetilglucosamina unidos covalentemente en una
conformación \beta-1-4 libre de
proteína, sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos o
inorgánicos, y que tiene un peso molecular de aproximadamente
800.000 daltons a aproximadamente 30 millones de daltons.
2. Una composición antitumoral que comprende al
menos un antagonista de endotelina combinado con una
poli-\beta-1-4-glucosamina,
comprendiendo dicha
poli-\beta-1-4-glucosamina
aproximadamente 4.000 a aproximadamente 150.000 monosacáridos de
glucosamina unidos covalentemente en una conformación
\beta-1-4 libre de proteína,
sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos o
inorgánicos, y que tiene un peso molecular de aproximadamente
640.000 daltons a aproximadamente 24 millones de daltons.
3. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en
la que el antagonista de endotelina es un antagonista de endotelina
no específico.
4. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en
la que el antagonista de endotelina es un antagonista de endotelina
específico de ETA.
5. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en
la que el antagonista de endotelina es un antagonista de endotelina
específico de ETB.
6. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en
la que el antagonista de endotelina es un antagonista de endotelina
basado en péptido.
7. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en
la que el antagonista de endotelina es un antagonista de endotelina
no basado en péptido.
8. La composición de la reivindicación 7, en la
que el antagonista de endotelina no basado en péptido es un
compuesto de pirimidil-sulfonamida.
9. La composición de la reivindicación 8, en la
que el compuesto de pirimidil-sulfonamida es
Ro61.
10. La composición de la reivindicación 1, en la
que la
poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina
comprende un derivado de
poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina
en el que se ha desacetilado al menos un monosacárido de
N-acetilglucosamina.
11. La composición de la reivindicación 10, en la
que el monosacárido desacetilado se derivatiza a una sal de
lactato.
12. La composición de la reivindicación 10, en la
que se han desacetilado al menos aproximadamente del 25% a
aproximadamente 75% de los monosacáridos de
N-acetilglucosamina.
13. La composición de la reivindicaciones 1, 10 u
11, en la que la
poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina
se formula como un gel.
14. La composición de la reivindicación 1 ó 10,
en la que la
poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina
es una matriz, hebra, cuerda, membrana, fibra o esponja.
15. La composición de la reivindicación 13, en la
que el antagonista de endotelina se disuelve en el gel de
poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina.
16. La composición de la reivindicación 2, en la
que la
poli-\beta-1-4-glucosamina
se derivatiza a la sal de lactato.
17. La composición de la reivindicación 2 ó 16,
en la que la
poli-\beta-1-4-glucosamina
se formula como un gel.
18. La composición de la reivindicación 2, en la
que la
poli-\beta-1-4-glucosamina
es una matriz, hebra, cuerda, membrana, fibra o esponja.
19. La composición de la reivindicación 17, en la
que el antagonista de endotelina se disuelve en el gel de
poli-\beta-1-4-glucosamina.
20. La composición de la reivindicación 18, en la
que el antagonista es el Ro61 y el gel de
poli-\beta-1-4-glucosamina
es un gel al 2%.
21. Uso de al menos un antagonista de la
endotelina combinado con una
poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina,
comprendiendo dicha
poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina
aproximadamente 4.000 a aproximadamente 150.000 monosacáridos de
N-acetilglucosamina unidos covalentemente en una
conformación \beta-1-4, libre de
proteína, sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos o
inorgánicos, y que tiene un peso molecular de aproximadamente
800.000 daltons a aproximadamente 30 millones de daltons, para
preparar una composición farmacéutica para usar en un método para
tratar una enfermedad proliferativa, que comprende administrar a un
paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del mismo.
22. Uso de al menos un antagonista de endotelina
combinado con una
poli-\beta-1-4-glucosamina,
comprendiendo dicha
poli-\beta-1-4-glucosamina
aproximadamente 4.000 a aproximadamente 150.000 monosacáridos de
glucosamina unidos covalentemente en una conformación
\beta-1-4, libre de proteína,
sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos o
inorgánicos, y que tiene un peso molecular de aproximadamente
640.000 daltons a aproximadamente 24 millones de daltons, para
preparar una composición farmacéutica para usar en un método para
tratar una enfermedad proliferativa, que comprende administrar a un
paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del mismo.
23. El uso de la reivindicación 21 ó 22, en el
que la enfermedad proliferativa es el cáncer.
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