ES2219659T3

ES2219659T3 - Metodo para aislar poli-beta-1-4-n-acetilglucosamina.

Info

Publication number: ES2219659T3
Application number: ES95904174T
Authority: ES
Inventors: John N. Vournakis; Sergio Finkielsztein; Ernest R. Pariser; Mike Helton
Original assignee: Marine Polymer Technologies Inc
Current assignee: Marine Polymer Technologies Inc
Priority date: 1993-12-01
Filing date: 1994-12-01
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2014-12-01
Also published as: CA2177823A1; TW458987B; JP2009079223A; AU695850B2; EP1452546A3; NZ277662A; ATE263785T1; JPH09506126A; DE69433692T2; US5622834A; CA2177823C; EP0731812A1; DE69433692D1; EP0731812A4; PT731812E; AU1296995A; WO1995015343A1; EP1452546A2; CN1142833B; EP0731812B1

Abstract

SE DESCRIBE UN METODO PARA PRODUCIR Y PURIFICAR ESPECIES DE POLI{BE}-1- 4-N-ACETILGLUCOSAMINA{(}P-GLCNAC{POLISACARIDO Y SUS DERIVADOS. LOS POLISACARIDOS PRODUCIDOS POR ESTE METODO ESTAN LIBRES DE PROTEINAS, Y SUSTANCIALMENTE LIBRE DE AMINOACIDOS UNICOS, Y OTROS CONTAMINANTES ORGANICOS E INORGANICOS. ESTOS POLISACARIDOS P-GLCNAC PUEDEN USARSE COMERCIALMENTE POR LAS INDUSTRIAS BIOMEDICA, FARMACEUTICA Y COSMETICA, EN SISTEMAS DE DISTRIBUCION LENTA DE MEDICAMENTOS, SISTEMAS DE ENCAPSULACION DE CELULAS, Y TRATAMIENTOS PARA LA PREVENCION DE ADHESIONES POSQUIRURGICAS. LAS FIGURA MUESTRA LA ESTRUCTURA QUIMICA DE 00% DE P-GLCNAC, DONDE "N" ES UN NUMERO ENTERO DE APROXIMADAMENTE 4.000 A APROXIMADAMENTE 150.000.

Description

Método para aislar poli-\beta-1-4-N-acetilglucosamina.

1. Introducción

La presente invención se refiere a métodos para la purificación de la p-GlcNAc (poli-N-acetil-glucosamina) de la invención a partir de material de partida de microalgas, preferiblemente diatomeas. Aún más, la invención se refiere a métodos para la derivatización y reformulación de la p-GlcNAc. Adicionalmente, la presente invención se refiere a los usos de la p-GlcNAc pura, sus derivados, y/o sus reformulaciones.

2. Antecedentes de la invención

En la actualidad, existe una amplia bibliografía sobre las propiedades, actividades y usos de los polisacáridos que consisten, en parte, en p-GlcNAc. Una clase de tales materiales se ha denominado genéricamente "quitina", mientras que los derivados desacetilados de la quitina se han denominado "quitosano". Cuando estos términos se utilizaron por primera vez, alrededor de 1823, se creyó que la quitina y el quitosano siempre se producían en la naturaleza como especies químicas diferenciadas, bien definidas, únicas e invariables, siendo la quitina composiciones completamente acetiladas y siendo el quitosano composiciones completamente desacetiladas. Sin embargo, fue aproximadamente un siglo después cuando se descubrió que los términos "quitina" y "quitosano" son, de hecho, muy ambiguos. En lugar de referirse a compuestos bien definidos, estos términos en realidad se refieren a una familia de compuestos que muestran propiedades físicas y químicas ampliamente diferenciadas. Estas diferencias se deben a los diversos pesos moleculares de los productos, a los diversos grados de acetilación y a la presencia de contaminantes tales como contaminantes inorgánicos, aminoácidos individuales y proteínas específicas de especie unidas covalentemente. Incluso hoy, los términos "quitina" y "quitosano" se utilizan ambiguamente y en realidad se refieren a mezclas escasamente definidas de muchos compuestos diferentes.

Por ejemplo, las propiedades de las "quitinas" aisladas de orígenes convencionales, tales como los caparazones externos de los crustáceos y la maraña miceliar de los hongos, son imprevisiblemente variables. Tales variaciones se deben, no sólo a las diferencias entre las especies, sino que también se deben a los diversos efectos medioambientales y estacionales que determinan algunas de las características bioquímicas de las especies que producen "quitina". De hecho, la variabilidad imprevisible del material de partida es en buena parte responsable del lento crecimiento de las industrias basadas en la quitina.

En la bibliografía científica, no existen actualmente informes que describan el aislamiento y la producción, a partir de orígenes materiales, de p-GlcNAc pura y completamente acetilada, es decir, un producto o productos no contaminados por impurezas orgánicas o inorgánicas. Aunque McLachlan et al. (McLachlan A.G. et al., 1965, Can. J. Botany 43:707-7-13) informaron del aislamiento de la quitina, estudios posteriores han demostrado que la sustancia "pura" obtenida, contiene de hecho proteínas y otros contaminantes.

Falk et al., Canadian J. of Chemistry, Vol. 44, págs. 2269-2281 (1966), describen estudios sobre fibras de quitano (\beta-(1\rightarrow4) unido en 2-acetamido-2-desoxi-D-glucano) de la diatomea Thalassiosira Fluviatilis Hustedt.

Groboillot et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 42, págs. 1157-1163 (1993) describen la formación de la membrana mediante la reticulación interfacial del quitosano para la microencapsulación de Lactococcus lactis.

El documento EP-A-0 543 572 describe un método para atrapar el material activo en el quitosano.

Thanoo et al., J. Pharm. Pharmacol., Vol. 44, págs. 283-286 (1992) describen microesferas de quitosano reticulado y su preparación y evaluación como una matriz para la liberación sostenida de productos farmacéuticos.

El documento US-A-5.071.977, describe un oligosacárido purificado que consiste en hexasacárido con un peso molecular nativo de 959, que puede aislarse de la pared celular de Streptococcus sanguis.

Las preparaciones de quitina desacetilada y parcialmente desacetilada muestran propiedades químicas potencialmente beneficiosas, tales como elevada reactividad, cargas catiónicas densas, poderosa capacidad quelante de metales, capacidad de unirse covalentemente a proteínas y solubilidad en muchos disolventes acuosos. Sin embargo, la imprevisible variabilidad de estas preparaciones, tal como se describió anteriormente, limita gravemente la utilidad de estos compuestos heterogéneos. Por ejemplo, las "quitinas" y los "quitosanos" disponibles en la actualidad dan lugar a datos irreproducibles y a variaciones inaceptablemente amplias en resultados experimentales. Adicionalmente, las preparaciones disponibles no son suficientemente homogéneas o puras, y los constituyentes de la preparación no son lo suficientemente reproducibles como para que estas preparaciones sean aceptables para su uso en aplicaciones, especialmente en las médicas. Por tanto, aunque es extremadamente deseable, las preparaciones verdaderamente purificadas de quitina y quitosano, con propiedades que sean sumamente reproducibles y que se obtengan fácilmente, no existen en la actualidad.

3. Sumario de la invención

La p-GlcNAc de la invención es un polímero de alto peso molecular cuyos monosacáridos constituyentes se unen en una conformación \beta -(1\rightarrow4), y que está libre de proteínas, sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos, y sustancialmente libre de contaminantes inorgánicos.

La importancia de la presente invención reside en el hecho de que el problema de la impredecible variabilidad del material de partida se ha superado. Por primera vez es posible producir, mediante medios simples y a escala comercial, p-GlcNAc biomédicamente pura de alto peso molecular y propiedades constantes. El material producido en la presente invención es altamente cristalino y se produce a partir de cultivos asépticos, cuidadosamente controlados, de una de varias microalgas marinas, preferiblemente diatomeas, que se han hecho crecer en un medio definido.

La presente invención describe derivados y reformulaciones de p-GlcNAc, así como métodos para la producción de tales derivados y reformulaciones. Tales derivatizaciones pueden incluir, pero sin limitarse a, poliglucosamina y sus derivados, y tales reformulaciones pueden incluir, pero sin limitarse a, membranas, filamentos, textiles no tejidos, esponjas y matrices tridimensionales. Principalmente, la presente invención se refiere a métodos para la purificación de la p-GlcNAc de la invención a partir de fuentes de microalgas, preferiblemente diatomeas. Adicionalmente, la presente invención se refiere a los usos de p-GlcNAc purificada, a sus derivados y/o a sus reformulaciones. Entre estos usos hay aplicaciones comerciales novedosas relacionadas con industrias tales como la industria biomédica, farmacéutica y cosmética, requiriendo todas ellas materiales de partida del grado de pureza más alto. Por ejemplo, los materiales de p-GlcNAc de la invención pueden formularse para mostrar propiedades de biodegradación controlables y, además, pueden usarse como parte de sistemas de administración sostenida de fármacos, como sistemas de encapsulación celular y como tratamientos para la prevención de adherencias posquirúrgicas.

4. Breve descripción de las figuras

Figura 1. Estructura química de p-GlcNAc al 100%. "n" se refiere a un número entero que oscila desde aproximadamente 4.000 hasta aproximadamente 150.000, prefiriéndose desde aproximadamente 4.000 hasta aproximadamente 15.000.

Figura 2. Análisis de hidratos de carbono de p-GlcNAc, datos de cromatografía de gases -espectroscopia de masas. Los cuadrados pintados representan la p-GlcNAc purificada usando la variación de tratamiento ácido / neutralización del método químico / biológico, tal como se describe en la sección 5.3.2, más adelante.

Figura 3A. Espectros de dicroísmo circular de membranas sólidas de p-GlcNAc pura.

Figura 3B. Espectros de dicroísmo circular de membranas sólidas de p-GlcNAc desacetilada. La desaparición del mínimo a 211 nm y del máximo a 195 nm observados en la p-GlcNAc pura (figura 3A) indica la desacetilación completa en las condiciones usadas, tal como se describe en la sección 5.4, más adelante.

Figura 4A. Análisis de espectros infrarrojos de membranas delgadas de p-GlcNAc pura de diatomeas preparada mediante el método de purificación por fuerza mecánica, en la parte superior, y mediante el método químico / biológico de purificación, en la parte inferior.

Figura 4B. Análisis de espectros infrarrojos de dos preparaciones de "quitina" comercial proyectados en membranas según los métodos detallados en la sección 5.5, más adelante.

Figura 4C. Análisis de espectros infrarrojos de p-GlcNAc pura que se modificó mediante desnaturalización térmica (parte superior) y mediante desacetilación química (parte superior), según los métodos detallados en la sección 5.4, parte inferior.

Figura 4D. Análisis de espectro infrarrojo de una membrana de p-GlcNAc derivada de la diatomea Thallasiosira fluviatilis, usando el método químico / biológico de purificación, tal como se detalla en la sección 5.3.2, más adelante.

Figura 4E. Análisis de espectro infrarrojo de una membrana de p-GlcNAc preparada por el método de purificación de fuerza mecánica, tal como se describe en la sección 5.3.1, más adelante, tras someter al autoclave.

Figura 5A. Análisis de RMN de p-GlcNAc purificada usando el método químico / biológico de purificación tal como se describe en la sección 5.3.2, más adelante. Tabla que representa las razones, las áreas y las amplitudes pico en relación con los controles de referencia. Razón de áreas totales de los picos.

Figura 5B. Análisis de RMN de p-GlcNAc purificada usando el método químico / biológico de purificación tal como se describe en la sección 5.3.2. El gráfico representa las razones de las áreas totales de los picos.

Figuras 6A-6B. Micrografías electrónicas de transmisión (TEM) de una membrana de p-GlcNAc preparada por el método de purificación de fuerza mecánica tal como se describe en la sección 5.3.1, más adelante. Ampliación: 6A: 4190x; 6B: 16.250x.

Figuras 7A-7B. Micrografías electrónicas de transmisión (TEM) de una membrana de p-GlcNAc por tratamiento con HF (ácido fluorhídrico) tal como se describe en la discusión del método químico / biológico de purificación en la sección 5.3.2, más adelante. Ampliación: 7A: 5270x; 7B: 8150x.

Figura 8A-8B. Micrografías electrónicas de transmisión (TEM) de una membrana de p-GlcNAc preparada por la variación de tratamiento ácido / neutralización del método químico / biológico de purificación, tal como se describe en la sección 5.3.2, más adelante. Ampliación: 8A: 5270x; 8B: 16.700x.

Figura 9A. Micrografía electrónica de barrido que representa una membrana de p-GlcNAc preparada por la variación de tratamiento ácido / neutralización del método químico / biológico de purificación, tal como se describe en la sección 5.3.2, más adelante. Ampliación: 200x.

Figura 9B. Micrografía electrónica de barrido que representa una membrana de p-GlcNAc preparada por la variación de tratamiento ácido / neutralización del método químico / biológico de purificación, tal como se describe en la sección 5.3.2, más adelante. Ampliación: 1000x.

Figura 9C. Micrografía electrónica de barrido que representa una membrana de p-GlcNAc preparada por la variación de tratamiento ácido / neutralización del método químico / biológico de purificación, tal como se describe en la sección 5.3.2, más adelante. Ampliación: 5000x.

Figura 9D. Micrografía electrónica de barrido que representa una membrana de p-GlcNAc preparada por la variación de tratamiento ácido / neutralización del método químico / biológico de purificación, tal como se describe en la sección 5.3.2, más adelante. Ampliación: 10.000x.

Figura 9E. Micrografía electrónica de barrido que representa una membrana de p-GlcNAc preparada por la variación de tratamiento ácido / neutralización del método químico / biológico de purificación, tal como se describe en la sección 5.3.2, más adelante. Ampliación: 20.000x.

Figuras 10A-10B. Micrografías electrónicas de barrido de una membrana de p-GlcNAc pura hecha de un material que se produjo inicialmente usando el método de purificación de disolución / neutralización descrito en la sección 5.3, más adelante, diluida en dimetilacetamida / cloruro de litio, y precipitada de nuevo en H_{2}O en una maraña, tal como se describe más adelante en la sección 5.5. Ampliación: 10A: 1000x; 10B: 10.000x.

Figuras 11A-11B. Micrografías electrónicas de barrido de una maraña de p-GlcNAc desacetilada. Ampliación: 11A: 1000x; 11B: 10.000x.

Figuras 12A-12B. Fotografías de diatomeas. Obsérvense las fibras de p-GlcNAc que se extienden desde los cuerpos celulares de las diatomeas.

Figura 13. Diagrama que representa algunos de los posibles derivados de p-GlcNAc y p-GlcNAc desacetilada de la invención. (Adaptado de S. Hirano, "Production and Application of Chitin and Chitosan in Japan", in "Chitin and Chitosan", 1989, Skjak-Braek, Anthonsen, and Sanford, eds. Elsevier Science Publishing Co., págs. 37-43).

Figura 14. Estudio de viabilidad celular de células crecidas en presencia y ausencia de membranas de p-GlcNAc. Círculo cerrado (\bullet): células crecidas sobre matriz de p-GlcNAc; círculos abiertos (\circ): células crecidas en ausencia de matriz.

Figuras 15A-15B. Micrografías SEM de células de fibroblasto de ratón transformadas crecidas sobre membranas de p-GlcNAc. Ampliación: 15A: 1000x; 15B: 3000x.

Figura 16A. Micrografía electrónica de barrido (SEM) de un material de control exclusivamente de colágeno, preparado según el método descrito más adelante en la sección 13.1. Ampliación: 100x.

Figura 16B. Micrografía electrónica de barrido (SEM) de un material híbrido de colágeno / p-GlcNAc preparado según el método descrito más adelante en la sección 13.1. La razón suspensión de colágeno: suspensión de p-GlcNAc equivale a 3:1, con concentraciones finales de 7,5 mg/ml de colágeno y 0,07 mg/ml de p-GlcNAc. Ampliación: 100x.

Figura 16C. Micrografía electrónica de barrido (SEM) de un material híbrido de colágeno / p-GlcNAc preparado según el método descrito más adelante en la sección 13.1. La razón suspensión de colágeno: suspensión de p-GlcNAc equivale a 1:1, con concentraciones finales de 5,0 mg/ml de colágeno y 0,12 mg/ml de p-GlcNAc. Ampliación: 100x.

Figura 16D. Micrografía electrónica de barrido (SEM) de un material híbrido de colágeno / p-GlcNAc preparado según el método descrito más adelante en la sección 13.1. La razón suspensión de colágeno: suspensión de p-GlcNAc equivale a 2:2, con concentraciones finales de 10,0 mg/ml de colágeno y 0,25 mg/ml de p-GlcNAc. Ampliación: 100x.

Figura 16E. Micrografía electrónica de barrido (SEM) de un material híbrido de colágeno / p-GlcNAc preparado según el método descrito más adelante en la sección 13.1. La razón suspensión de colágeno: suspensión de p-GlcNAc equivale a 1:3, con concentraciones finales de 2,5 mg/ml de colágeno y 0,25 mg/ml de p-GlcNAc. Ampliación: 100x.

Figura 17A. SEM de fibroblastos de ratón 3T3 cultivados en el material de control exclusivamente de colágeno de la figura 16A, anterior. Ampliación 100x.

Figura 17B. SEM de fibroblastos de ratón 3T3 cultivados en el material de colágeno / p-GlcNAc de la figura 16B, anterior. Ampliación 100x.

Figura 17C. SEM de fibroblastos de ratón 3T3 cultivados en el material de colágeno / p-GlcNAc de la figura 16C, anterior. Ampliación 100x.

Figura 17D. SEM de fibroblastos de ratón 3T3 cultivados en el material de colágeno / p-GlcNAc de la figura 16D, anterior. Ampliación 100x.

Figura 18. Curvas de datos transformados de RMN, usados para obtener áreas para cada átomo de carbono y para calcular después las razones de CH3 (área) frente a átomo de C (área).

Figura 19. Espectro habitual de C^{13}-RMN de p-GlcNAc. Los picos individuales representan la contribución al espectro de cada átomo de carbono único en la molécula.

Figura 20. Datos transformados del espectro de RMN que representan los valores calculados para las razones de CH3 (área) frente a átomo de C (área). Parte superior: Representación gráfica de los datos; parte inferior: representación numérica de los datos.

Figura 21A-G. Matrices de p-GlcNAc tridimensionales producidas en diversos disolventes. Específicamente, las matrices de p-GlcNAc se produjeron en agua destilada (figura 21A, figura 21D), metanol al 10% en agua destilada (figura 21B), metanol al 25% en agua destilada (figura 21C), etanol al 10% en agua destilada (figura 21E), etanol al 25% en agua destilada (figura 21F) y etanol al 40% en agua destilada (figura 21G). Ampliación: 200x. Se indica una graduación de 200 micras en cada una de estas figuras.

Figuras 22A-G. Fibroblastos crecidos en matrices de p-GlcNAc tridimensionales preparadas mediante liofilización de p-GlcNAc en agua destilada. Ampliación: 100x (figuras 22A, 22E), 500x (figura 22B), 1000x (figuras 22C, 22F), 5000x (figuras 22D, 22G). Las graduaciones de 5, 20, 50 ó 200 micras, tal como se indica, están incluidas en cada una de las figuras.

Figura 23. Una curva estándar habitual obtenida usando el procedimiento descrito más adelante en la sección 18.1. Se utilizó una curva estándar como ésta en el ensayo de lisozima-quitinasa también descrito más adelante en la sección 18.1.

Figura 24. Datos de la digestión de p-GlcNAc con lisozima. El gráfico presentado aquí representa la acumulación de N-acetilglucosamina con el tiempo, a medida que las membranas de p-GlcNAc son digeridas con lisozima. El gráfico compara la tasa de degradación de la p-GlcNAc completamente acetilada con la de la p-GlcNAc parcialmente (50%) desacetilada, y demuestra que la tasa de degradación para la p-GlcNAc parcialmente desacetilada fue sustancialmente superior a la del material de p-GlcNAc completamente acetilado.

Figura 25. Datos de la digestión de p-GlcNAc con lisozima. El gráfico presentado aquí representa la acumulación de N-acetilglucosamina con el tiempo, a medida que las membranas de p-GlcNAc son digeridas con lisozima. El gráfico compara la tasa de degradación de dos membranas de p-GlcNAc parcialmente desacetilada (específicamente una membrana de p-GlcNAc desacetilada en un 25% y en un 50%). Los datos demuestran que la tasa de degradación aumenta a medida que aumenta el porcentaje de desacetilación, siendo la tasa de degradación de la membrana de p-GlcNAc desacetilada en un 50% sustancialmente superior que la de la membrana de p-GlcNAc desacetilada en un 25%.

Figuras 26A-26E. Datos de biodegradabilidad in vivo de p-GlcNAc. Las figuras 26A-26C representan ratas en las que se ha implantado abdominalmente la membrana prototipo 1 (p-GlcNAc completamente acetilada), tal como se describe más adelante en la sección 18.1. La figura 26A muestra una rata en el día 0 de la implantación; la figura 26B muestra una rata en el día 14 tras la implantación; la figura 26C muestra una rata en el día 21 tras la implantación. Las figuras 26D-26E representan ratas en las que se ha implantado abdominalmente el prototipo 3A (membrana de p-GlcNAc liofilizada y parcialmente desacetilada), tal como se describe más adelante en la sección 18.1. La figura 26D muestra una rata en el día 0 de la implantación; la figura 26E muestra una rata en el día 14 tras la implantación.

Figura 27. El gráfico representado aquí ilustra los datos relativos al porcentaje de aumento en el tamaño del tumor de animales que, o bien no han recibido tratamiento (\bullet) o recibieron lactato de p-GlcNAc / 5'fluorouracilo (FU) (\circ), tal como se describe más adelante en la sección 20.1.

Figura 28. El gráfico representado aquí ilustra los datos relativos al porcentaje de aumento en el tamaño del tumor de animales que, o bien recibieron lactato de p-GlcNAc solo (\bullet) o recibieron lactato de p-GlcNAc / 5'fluorouracilo (FU) (\circ), tal como se describe más adelante en la sección 20.1.

Figura 29. El gráfico representado aquí ilustra los datos relativos al porcentaje de aumento en el tamaño del tumor de animales que, o bien no recibieron tratamiento (\bullet) o recibieron lactato de p-GlcNAc / mitomicina (mito) (\circ), tal como se describe más adelante en la sección 20.1.

Figura 30. El gráfico representado aquí ilustra los datos relativos al porcentaje de aumento en el tamaño del tumor de animales que, o bien recibieron lactato de p-GlcNAc solo (\bullet) o recibieron lactato de p-GlcNAc / 5'mitomicina (mito) (\circ), tal como se describe más adelante en la sección 20.1.

Figura 31. El gráfico de barras representado aquí ilustra el cambio medio en porcentaje del tamaño del tumor por animal o animales tratados con p-GlcNAc / 5'FU de dosis alta (barra 1), p-GlcNAc / 5'FU de dosis baja (barra 2), membrana de p-GlcNAc solo (barra 3) y no tratados (barra 4). N = 4 para las barras 1 y 2, n = 2 para las barras 3 y 4.

5. Descripción detallada de la invención

A continuación se presenta, en primer lugar, una descripción de las características físicas de las especies de p-GlcNAc purificadas de la invención, de los derivados de p-GlcNAc, y de sus reformulaciones. Después, se describen los métodos para la purificación de las especies de p-GlcNAc de la invención a partir de microalgas, preferiblemente diatomeas, como materiales de partida. En tercer lugar, se presentan los derivados y reformulaciones de la p-GlcNAc y los métodos para la producción de tales derivados y reformulaciones. Finalmente, se presentan los usos para la p-GlcNAc, los derivados de p-GlcNAc y/o las reformulaciones de p-GlcNAc de la invención.

5.1 p-GlcNAc

La especie del polisacárido p-GlcNAc de la invención es un polímero de alto peso molecular que oscila desde un promedio en peso de aproximadamente 800.000 dalton hasta aproximadamente 30 millones de dalton, basado en las medidas de cromatografía de permeación en gel. Tal oscilación de peso molecular representa una especie de p-GlcNAc que tiene de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 150.000 monosacáridos de N-acetilglucosamina unidos en una configuración \beta-1\rightarrow4, prefiriéndose de aproximadamente 4.000 hasta aproximadamente 15.000 monosacáridos de N-acetilglucosamina (figura 1).

La variabilidad de la p-GlcNAc de la invención es muy baja y su pureza es muy alta, evidenciándose ambas mediante criterios físicos y químicos. Entre éstos están los de composición química y contaminantes distintos a los polisacáridos. En primer lugar, los datos de la composición química para la p-GlcNAc producida usando dos métodos de purificación diferentes, que se describen ambos en la sección 5.3 más adelante, se muestran en la tabla I, a continuación. Como puede observarse, la composición química de la p-GlcNAc producida mediante ambos métodos es, dentro de los límites del error experimental, igual a las composiciones de la fórmula de p-GlcNAc. En segundo lugar, como también se muestra en la tabla I, la p-GlcNAc producida está libre de contaminantes proteicos detectables, está sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos tales como aminoácidos libres, y está sustancialmente libre de contaminantes inorgánicos tales como ceniza e iones metálicos (la p-GlcNAc de la invención puede contener hasta aproximadamente un 0,05% de oligoelementos). Además, la p-GlcNAc de la invención muestra un porcentaje muy bajo de agua unida.

TABLA I

1

Datos experimentales en marañas de p-GlcNAc: (Siendo el número de lotes experimentales para cada membrana tipo mayor que 30 para cada membrana tipo).

2

La p-GlcNAc pura de la invención muestra un perfil de análisis de hidratos de carbono similar al mostrado en la figura 2. El monosacárido principal de la p-GlcNAc pura de la invención es N-acetilglucosamina. Además, la p-GlcNAc pura de la invención no contiene el monosacárido glucosamina.

Los espectros de dicroísmo circular (DC) e infrarrojo (IR) agudos de la p-GlcNAc de la invención se muestran en las figuras 3A, y en las figuras 4A y 4D, respectivamente, que presentan los análisis del material producido usando los métodos descritos en la sección 5.3, más adelante. Tales datos físicos corroboran que la p-GlcNAc de la invención es de alta pureza y cristalinidad. Los métodos usados para obtener los datos de DC e IR se describen, más adelante, en el ejemplo de trabajo de la sección 6.

El análisis de RMN de la p-GlcNAc pura de la invención muestra un patrón sustancialmente similar al observado en las figuras 5A, 5B, 18A y 18B. Tal patrón de RMN indica, no sólo datos que son coherentes con la p-GlcNAc de la invención que es un polímero completamente acetilado, sino también demuestra la falta de materia orgánica contaminante dentro de la especie de p-GlcNAc.

La estructura micrográfica electrónica de la p-GlcNAc de la invención, producida usando los métodos descritos en la sección 5.3 más adelante, y demostrada en los ejemplos de trabajo presentados más adelante en la sección 8 y 9, se representa en las figuras de la 6A a la figura 9E.

La p-GlcNAc de la invención muestra un alto grado de biocompatibilidad. La biocompatibilidad puede determinarse mediante una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a, procedimientos tales como la prueba de elución, la implantación intramuscular o la inyección sistémica o intracutánea en sujetos animales. En resumen, una prueba de elución (Farmacopea de los EE.UU. XXII, 1990, págs. 1415-1497; Farmacopea de los EE.UU. XXII, 1991, Suplemento 5, págs. 2702-2703) está diseñada para evaluar la biocompatibilidad de extractos de artículos de prueba, y somete a ensayo la reactividad biológica de una línea de cultivo de células de mamífero que es sensible a artículos citotóxicos extraíbles (tal como, por ejemplo, la línea celular L929) en respuesta al artículo de prueba. El ejemplo de trabajo presentado en la sección 10 más adelante, demuestra la alta biocompatibilidad de la p-GlcNAc de la invención.

5.2 Métodos de producción de microalgas fuente de p-GlcNAc 5.2.1 Microalgas fuente de p-GlcNAc

La p-GlcNAc de la invención se produce, y puede purificarse, a partir de microalgas, preferiblemente diatomeas. Pueden utilizarse diatomeas de varios géneros y numerosas especies dentro de tales géneros como fuentes de partida de p-GlcNAc. Cada una de estas diatomeas produce fibras compuestas de p-GlcNAc que se extienden desde sus cuerpos celulares. Véanse las figuras 12A-12B para fotografías de tales diatomeas. Las diatomeas que pueden utilizarse como fuentes de partida para la producción de p-GlcNAc de la invención incluyen, pero sin limitarse ellos, miembros del género Coscinodiscus, el género Cyclotella y el género Thalassiosira, prefiriéndose el género Thalassiosira.

Entre el género Coscinodiscus, las especies de diatomea que pueden usarse para producir la p-GlcNAc de la invención incluyen, pero sin limitarse a, las especies concinnus y radiatus. Las diatomeas entre el género Cyclotella que pueden usarse incluyen, pero sin limitarse a, las especies caspia, cryptica y meneghiniana. Las diatomeas Thalassiosira que pueden utilizarse para producir el material de partida para la p-GlcNAc de la invención incluyen, pero sin limitarse a, las especies nitzschoides, aestivalis, antarctica, deciphens, eccentrica, floridana, fluviatilis, gravida, guillardii, hyalina, minima, nordenskioldii, oceánica, polychorda, pseudonana, rotula, tubifera, tumida y weissflogii, prefiriéndose las especies fluviatilis y weissflogii.

Diatomeas tales como las descritas anteriormente pueden obtenerse, por ejemplo, de la colección de cultivos del Bigelow Laboratory for Ocean Sciences, Center for Collection of Marine Phytoplankton (McKown Point, West Boothbay Harbor, Maine, 04575).

5.2.2 Métodos para el crecimiento de diatomeas

Cualquiera de las diatomeas descritas en la sección 5.2.1 anterior puede hacerse crecer utilizando, por ejemplo, los métodos descritos en esta sección. Los nuevos cultivos de diatomeas se inician inoculando, en condiciones estériles, medio nutritivo con una alícuota de un cultivo de diatomea madura. El medio nutritivo debe estar libre de otros microorganismos; por tanto, todos los materiales, incluyendo agua, componentes orgánicos y componentes inorgánicos usados en la preparación del medio nutritivo deben ser estériles. Además, es obligatorio que todos los procedimientos implicados en esta operación se realicen en condiciones estrictamente estériles, es decir, todos los recipientes, todas las transferencias de sustancias de un vaso a otro, etc., deben realizarse en un entorno estéril. La cantidad de medio nutritivo que ha de prepararse de una vez no debe superar la necesaria para comenzar un nuevo cultivo. Por ejemplo, pueden usarse matraces Fembach, que ocupan aproximadamente un pie cuadrado de superficie, como vasos para los cultivos de diatomeas, y tales vasos requieren un litro de medio nutritivo para el crecimiento óptimo del organismo de la diatomea.

La preparación de los medios nutrientes incluye las siguientes operaciones:

a): Adquisición y tratamiento de agua de mar.

b): Preparación de agua destilada y desionizada.

c): Preparación de disoluciones madre de nutrientes principales.

d): Preparación de disoluciones madre de trabajo de nutrientes.

e): Preparación del medio nutritivo final.

El agua de mar filtrada puede obtenerse, por ejemplo, del Marine Biology Laboratory (Woods Hole, Massachussets). Los recipientes para el agua de mar deben almacenarse a 5ºC. Cuando se requiera, el volumen necesario de agua puede filtrarse mediante una unidad de filtración Buchner, usando una membrana de filtro de nitrocelulosa con un tamaño de poro de 0,45 micras (Millipore, Inc.). El agua de mar se esteriliza entonces en un autoclave a, por ejemplo, 121ºC durante 15 minutos por litro. A la finalización del proceso de esterilización, la parte superior se enfría inmediatamente, preferiblemente mediante transferencia a una cámara fría capaz de permitir que las disoluciones alcancen una temperatura de aproximadamente 5ºC. Cuando han de utilizarse, se permite que las disoluciones alcancen la temperatura ambiente.

El agua corriente se destila y se desioniza usando equipo y procedimientos estándar, y se recoge y almacena en recipientes estériles, bien tapados, preferiblemente de vidrio.

A continuación, se enumeran las fórmulas que pueden seguirse en la preparación de las disoluciones madre necesarias para la preparación del medido nutritivo. Ha de entenderse que, aunque tales fórmulas han de usarse como guías, se pretende que las variaciones habituales de tales fórmulas que contribuyen a la preparación de un medio nutritivo capaz de mantener un crecimiento de microalgas diatomeas, suficiente para los procesos de preparación de p-GlcNAc descritos en el presente documento, también estén dentro del alcance de la presente invención.

I. Disoluciones madre principales de oligoelementos (TMPS)

a.: 39 mM de CuSO_{4}.5H_{2}O (Sulfato de cobre [II] pentahidratado) (9,8 g de sulfato de cobre [II]/L).

b.: 7,5 mM de ZnSO_{4}.7H_{2}O (Sulfato de zinc heptahidratado) (22 g de sulfato de zinc/L).

c.: 42 mM de CoCl_{2}.6H_{2}O (Cloruro de cobalto [II] hexahidratado) (10 g de cloruro de cobalto [II]/L).

d.: 91 mM de MnCl_{2}.4H_{2}O (Cloruro de manganeso [II] tetrahidratado) (18 g de cloruro de manganeso [II]/L).

e.: 26 mM de NaMoO_{4}.2H_{2}O (Molibdato de sodio dihidratado) (6,3 g de molibdato de sodio/L).

f.: 153,5 mM de H_{2}SeO_{3} (Ácido selenioso) (12,9 g de ácido selenioso/L).

Se filtra cada nutriente en condiciones estériles con un filtro de tamaño de poro no superior a 0,2 mm.

II. Disoluciones madre principales de vitaminas (VPS)

a.: 1 mg/ml de vitamina B12.

b.: 0,1 mg/ml de biotina.

Se filtran ambas disoluciones madre en condiciones estériles con un filtro de tamaño de poro no superior a 0,2 mm.

III. Disoluciones madre de trabajo de sales de sodio (SSWS)

a.: Disolución madre de trabajo de nitrato de sodio: 0,88 M (75 g de NaNO_{3}/L).

b.: Disolución madre de trabajo de fosfato monobásico de sodio monohidratado: 36,2 mM de NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O (5 g de NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O/L).

c.: Disolución madre de trabajo de metasilicato de sodio monohidratado: 0,11 M de Na_{2}SiO_{3}.9H_{2}O (30 g de Na_{2}SiO_{3}.9H_{2}O/L).

Se filtra cada una de las SSWS en condiciones estériles con un filtro de tamaño de poro no superior a 0,2 mm.

IV. Disoluciones madre de trabajo de oligoelementos (TMWS)

11,7 mM de Na_{2}EDTA (Ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica dihidratada) (4,36 g/L).

11,7 mM de FeCl_{3}.6H_{2}O (Cloruro de hierro [III] hexahidratado) (3,15 g/L).

1 ml/L de cada una de las seis disoluciones madre de oligoelementos principales enumeradas anteriormente.

Se filtra en condiciones estériles con un filtro de tamaño de poro no superior a 0,2 mm. Obsérvese que la disolución madre de trabajo de oligoelementos debe prepararse de nuevo cada vez que se constituya un nuevo medio nutritivo.

V. Disolución madre de trabajo de vitaminas (VWS)

1,0 \mug/ml de biotina (1,0 ml de disolución madre principal de biotina/100 ml).

1,0 \mug/ml de vitamina B12 (0,1 ml de disolución madre principal de vitamina B12/100 ml).

20 mg de tiamina HCl (clorhidrato de tiamina/100 ml). Se filtra en condiciones estériles con un filtro de tamaño de poro no superior a 0,2 mm. Obsérvese que debe prepararse de nuevo una disolución madre de trabajo de vitaminas cada vez que se esté constituyendo un nuevo medio nutritivo.

A continuación se describen las técnicas que pueden seguirse para la preparación del medio nutritivo y para el cultivo de diatomeas. Ha de entenderse que, además de estas técnicas, se pretende que cualquier variación habitual en las fórmulas y/o en los procedimientos descritos en el presente documento, que den como resultado un medio nutritivo y procedimientos capaces de mantener un crecimiento de diatomeas suficiente para los procesos de preparación descritos en el presente documento, esté dentro del alcance de la presente invención.

El medio nutritivo puede prepararse, por ejemplo, tal como sigue: A cada litro de agua de mar filtrada y esterilizada puede añadirse 1 ml de disolución madre de trabajo de NaNO_{3}, 1 ml de disolución madre de trabajo de NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O, 1 ml de disolución madre de oligoelementos y 1 ml de disolución madre de Na_{2}SiO_{3}.9H_{2}O. Simultáneamente a la adición de Na_{2}SiO_{3}.9H_{2}O, pueden añadirse 2 ml de HCl 1N y la disolución puede agitarse hasta su mezcla. A continuación, pueden añadirse 1,5 ml de NaOH 1N y la disolución puede agitarse de nuevo hasta su mezcla. Finalmente, pueden añadirse 0,5 ml de la disolución de trabajo de vitaminas.

Con el fin de hacer crecer un nuevo cultivo de diatomeas, pueden transferirse 7 ml de cultivo maduro (que tiene una densidad de células de aproximadamente 1 x 10^{5} células/ml) a un recipiente estéril que contiene 100 ml de medio nutritivo estéril, que puede prepararse según los métodos descritos anteriormente. El cultivo inoculado puede incubarse entonces durante 8 días en las condiciones siguientes:

Temperatura: 20 grados centígrados.

Iluminación constante.

Agitación: Agitado suave de los matraces una vez durante dos o tres segundos cada mañana y cada tarde.

Tras 8 días de incubación, 80 ml de este cultivo incubado pueden transferirse, en condiciones estériles, a 1000 ml de medio nutritivo, que puede estar contenido, por ejemplo, en un matraz Fernbach de 2,8 L, protegido con un tapón de algodón hidrófilo cubierto por estopilla. Este cultivo puede dejarse incubar y crecer hasta obtener la densidad de células deseada o, alternativamente, puede usarse para inocular nuevos cultivos de diatomeas. Una vez que un cultivo alcanza una densidad de células deseada, pueden recogerse las fibras de p-GlcNAc del cultivo, y puede purificarse la p-GlcNAc de la invención, usando métodos tales como los descritos más adelante en la sección 5.3, más adelan-
te.

Puede disolverse CO_{2} en la disolución del cultivo con el fin de mantener un pH del cultivo de aproximadamente 7 a 8, prefiriéndose aproximadamente 7,4. El mantenimiento de tal entorno de pH neutro aumenta enormemente el rendimiento de p-GlcNAc que puede obtenerse a partir de cada cultivo de diatomeas.

5.3 Métodos para el aislamiento, la purificación y la concentración de las fibras de p-GlcNAc

En esta sección se presentan los métodos que pueden utilizarse para la preparación de las fibras de p-GlcNAc a partir de cultivos de diatomeas, tales como los descritos anteriormente en la sección 5.2.

Aunque cada uno de los métodos descritos a continuación para la purificación de p-GlcNAc a partir de microalgas, preferiblemente diatomeas, como fuentes de partida, produce p-GlcNAc muy pura, cristalina y sin adulterar, cada uno de los métodos da p-GlcNAc que tiene características específicas y rasgos distintivos ventajosos. Por ejemplo, la p-GlcNAc de la invención, purificada mediante el método de fuerza mecánica presentado en la sección 5.3.1 más adelante, produce una membrana de p-GlcNAc que proporciona un sustrato superior para la unión de células a la p-GlcNAc. El segundo método, descrito más adelante en la sección 5.3.2, el método químico / biológico, produce un rendimiento medio mucho mayor que el rendimiento medio de p-GlcNAc producido por el método de fuerza mecánica. Además, la variación de tratamiento ácido / neutralización descrito como parte del método químico / biológico de la sección 5.3.2 más adelante, produce fibras de p-GlcNAc extremadamente largas, teniendo algunas fibras más de 100 \mum, y un peso molecular muy alto, de hasta 20 - 30 millones de dalton.

5.3.1 Método de fuerza mecánica para la preparación de p-GlcNAc pura

Las fibras de p-GlcNAc pueden separarse de los cuerpos celulares de las diatomeas sometiendo el contenido del cultivo a una fuerza mecánica apropiada. Tal fuerza mecánica puede incluir, pero sin limitarse a, un esfuerzo cortante generado por, por ejemplo, un molino coloidal, un dispositivo de ultrasonidos o un generador de burbujas, o una fuerza de corte generada por, por ejemplo, una mezcladora comercial (Waring blender).

Después, se separa la suspensión resultante de cuerpos celulares de las diatomeas y las fibras de p-GlcNAc. Por ejemplo, la suspensión puede someterse a una serie de etapas de centrifugación que separan las fibras de p-GlcNAc de los cuerpos celulares dando un sobrenadante claro que muestra poco material floculento visible, si lo hay. Para las etapas de centrifugación, se prefiere un rotor angular fijo y una temperatura de aproximadamente 10ºC. La velocidad, la duración y el número total de etapas de centrifugación requeridas puede variarse dependiendo de, por ejemplo, el rotor de centrifugación específico que se esté usando, aunque la determinación de los valores para tales parámetros será evidente para un experto habitual en la técnica.

Las fibras de p-GlcNAc en el sobrenadante pueden concentrarse entonces usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Tales técnicas pueden incluir, pero no se limitan a dispositivos de succión y filtración.

Finalmente, las fibras de p-GlcNAc concentradas se lavan con, por ejemplo agua destilada-desionizada, HCl y etanol u otros disolventes apropiados, preferiblemente disolventes, tales como alcoholes, en los que se disuelven tanto los materiales orgánicos como los inorgánicos.

El ejemplo de trabajo presentado en la sección 7 más adelante, demuestra el uso de este método en la purificación de p-GlcNAc.

5.3.2 Método químico / biológico para la purificación de p-GlcNAc

En este método, las fibras de p-GlcNAc se separan de los cuerpos celulares de las diatomeas sometiéndolas a agentes químicos y/o biológicos tal como se describe en más detalle más adelante.

Los cultivos de diatomeas pueden tratarse con un producto químico capaz de debilitar las paredes celulares de las diatomeas, lo que conduce a una liberación de fibras de p-GlcNAc sin alterar su estructura. Tal producto químico puede incluir, sin limitarse a, ácido fluorhídrico (HF).

Alternativamente, un cultivo de diatomeas maduro puede tratarse con un agente biológico capaz de alterar un proceso biológico y que puede usarse para inhibir la síntesis de fibras de p-GlcNAc, liberando así las fibras ya presentes. Por ejemplo, tal agente puede incluir, pero sin limitarse a, polioxina D, un inhibidor de la enzima N-acetilclucosaminil-P-transferasa.

Después, se separan los cuerpos celulares y las fibras que contienen p-GlcNAc de los cultivos de diatomeas tratados con un miembro de los agentes biológicos o químicos descritos anteriormente. Por ejemplo, el contenido de los cultivos de diatomeas tratadas puede dejarse sedimentar de manera que se permita que el contenido de los cultivos forme dos capas distintas. La capa superior contendrá principalmente fibras de p-GlcNAc, mientras que la capa inferior contendrá cuerpos celulares. La capa superior que contiene fibras de p-GlcNAc puede trasvasarse, dejando atrás el material celular sedimentado de la capa inferior.

La capa que contiene fibras de p-GlcNAc trasvasadas puede purificarse entonces adicionalmente para eliminar las proteínas y otras materias no deseadas mediante tratamiento con un detergente que no dañará las fibras de p-GlcNAc. Tal detergente puede incluir, pero sin limitarse a, dodecil sulfato sódico (SDS).

Cuando se usa el tratamiento ácido, tal como el tratamiento con HF, para separar las fibras de p-GlcNAc de los cuerpos celulares de diatomeas, puede incluirse una etapa para dispersar las fibras. Tal etapa puede incluir, pero sin limitarse a, el uso de fuerza mecánica para la dispersión de las fibras, tal como una etapa en la que las fibras se someten a una dispersión en mezcladora comercial (Waring blender).

Alternativamente, la suspensión tratada con ácido puede neutralizarse, en una etapa opcional, antes de la purificación adicional mediante tratamiento con detergente. Tal neutralización, en general, cambiará el pH de la suspensión desde aproximadamente 1,8 hasta aproximadamente 7,0 y puede realizarse mediante, por ejemplo, la adición de un volumen apropiado de Tris 1M (pH 8,0) o la adición de un volumen apropiado de hidróxido de sodio (NaOH). La neutralización, en general, da fibras de p-GlcNAc puras de una longitud sustancialmente mayor que otros métodos de purificación tratados en el presente documento.

Las fibras de p-GlcNAc purificadas pueden concentrarse entonces usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, tal como mediante la utilización de un dispositivo de succión y de filtración. Finalmente, las fibras de p-GlcNAc se lavan, en una serie de etapas con agua destilada-desionizada, HCl y etanol, u otros disolventes apropiados, preferiblemente disolventes tales como alcoholes, en los que se disuelven tanto los materiales orgánicos como los inorgánicos.

El ejemplo de trabajo presentado más adelante en la sección 8, demuestra la utilización satisfactoria de tal método de purificación.

5.4 Derivatización de p-GlcNAc

La p-GlcNAc pura y completamente acetilada de la invención, puede derivatizarse mediante la utilización de una variedad de condiciones y procedimientos controlados, en una gran variedad de compuestos diferentes. Véase la figura 13 para un diagrama que representa algunos de estos compuestos. Tales compuestos derivatizados pueden incluir, pero sin limitarse a, p-GlcNAc parcial o completamente desacetilada, que se ha modificado mediante medios químicos y/o enzimáticos, tal como se describe en más detalle más adelante. Además, la p-GlcNAc, o su derivado desacetilado, puede derivatizarse haciéndola sulfatada, fosforilada y/o nitrada. Además, tal como se detalla más adelante, puede prepararse O-sulfonilo, N-acilo, O-alquilo, N-alquilo, desoxihalógeno y N-alquilideno y N-arilideno y otros derivados a partir de la p-GlcNAc o de la p-GlcNAc desacetilada de la invención. La p-GlcNAc desacetilada de la invención también puede usarse parar preparar una variedad de sales orgánicas y/o quelatos metálicos. Además, la p-GlcNAc o un derivado de la misma de la invención pueden tener unida, covalente o no covalentemente, cualquiera de una variedad de moléculas. Todavía adicionalmente, la p-GlcNAc de la invención o un derivado de la misma, pueden someterse a condiciones de hidrólisis controlada que da grupos de moléculas que tienen características de peso molecular uniforme y diferenciado.

Una o más de las unidades de monosacárido de la p-GlcNAc de la invención pueden desacetilarse para formar una especie de poli-\beta-1\rightarrow4-N-glucosamina. Una especie de poli-\beta-1\rightarrow4-N-glucosamina de la invención, en la que cada una de las unidades de monosacárido de la especie de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina de la invención se ha desacetilado, tendrá un peso molecular de aproximadamente 640.000 dalton a aproximadamente 24 millones de dalton, prefiriéndose de aproximadamente 640.000 dalton a aproximadamente 2,4 millones de dalton. Una especie con tal intervalo de peso molecular representa una especie que tiene de aproximadamente 4000 a aproximadamente 150.000 monosacáridos de glucosamina unidos covalentemente en una configuración \beta-1\rightarrow4, prefiriéndose de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 15.000 monosacáridos de glucosamina. Al menos una de las unidades de monosacárido de la especie de poli-\beta-1\rightarrow4-N -glucosamina puede permanecer acetilada, prefiriéndose de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 75% de acetilación, y siendo más preferido aproximadamente un 30% de acetilación.

La p-GlcNAc de la invención puede desacetilarse mediante tratamiento con una base para dar glucosaminas con tres grupos amino libres. Este proceso de hidrólisis puede llevarse a cabo con disoluciones de hidróxido de sodio o hidróxido de potasio concentrado a temperaturas elevadas. Sin embargo, para controlar de manera precisa el grado de desacetilación y para evitar la degradación de la cadena principal de hidratos de carbono de la molécula de polisacárido, es preferible que se use un procedimiento enzimático que utilice una enzima quitina desacetilasa para la desacilación de p-GlcNAc. Tal procedimiento enzimático con desacetilasa es bien conocido por los expertos en la técnica y puede realizarse como en la patente de los EE.UU. número 5.219.749, que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad.

Una o más de las unidades de monosacárido de la p-GlcNAc de la invención, puede derivatizarse para que contenga al menos un grupo sulfato o, alternativamente, puede fosforilarse o nitrarse, tal como se representa a continuación:

3

donde R y/o R_{1}, en lugar de un hidrógeno, y/o R_{2}, en lugar de -COCH_{3}, pueden ser un grupo sulfato (-SHO_{3}), fosfato (-P(OH)_{2}) o nitrato (-NO_{2}).

A continuación se describen métodos mediante los cuales pueden prepararse tales derivados de p-GlcNAc. Antes de llevar a cabo métodos tales como los descritos en esta sección, puede ser ventajoso primero liofilizar, congelar en nitrógeno líquido y pulverizar el material de partida de p-GlcNAc.

Los derivados sulfatados de p-GlcNAc pueden generarse, por ejemplo, mediante un proceso de dos etapas. En la primera etapa, puede prepararse O-carboximetil-p-GlcNAc a partir de p-GlcNAc y/o los derivados de p-GlcNAc de la invención, por ejemplo, mediante la utilización de técnicas tales como las descritas por Tokura et al., (Tokura, S. et al, 1983, Polym. J. 15:485). En segundo lugar, la etapa de sulfatación puede llevarse a cabo, por ejemplo, con N,N-dimetil-formamida-trióxido de azufre, según técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, tal como se describe en Schweiger (Schweiger, R.G., 1972, Carbohydrate Res. 21:219). El producto resultante puede aislarse como una sal sódica.

Los derivados fosforilados de p-GlcNAc de la invención pueden prepararse, por ejemplo, utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, tales como las descritas por Nishi et al. (Nishi, N. et al., 1986, en "Chitin in Nature and Technology", Muzzarelli et al., eds. Plenum Press, Nueva York, págs. 297-299). En resumen, la mezcla de p-GlcNAc / ácido metanosulfónico puede tratarse con pentóxido de fósforo (en un equivalente molar de aproximadamente 0,5 a 4,0) con agitación, a una temperatura de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 5ºC. El tratamiento puede realizarse durante aproximadamente 2 horas. El producto resultante puede precipitarse entonces y lavarse usando técnicas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la muestra puede precipitarse con un disolvente tal como éter, centrifugarse, lavarse con un disolvente tal como éter, acetona o metanol, y secarse.

Los derivados nitrados de p-GlcNAc pueden prepararse utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, tales como las descritas por Schorigin y Halt (Schorigin, R. y Halt, E., 1934, Chem. Ber. 67:1712). En resumen, la p-GlcNAc y/o un derivado de p-GlcNAc pueden tratarse con ácido nítrico concentrado para formar un producto nitrado estable.

Una o más de las unidades de monosacárido de la p-GlcNAc de la invención pueden contener un grupo sulfonilo, tal como se representa a continuación:

4

donde R_{3} puede ser un resto alquilo, arilo, alquenilo o alquinilo. Tal derivado puede generarse mediante métodos bien conocidos tales como el método descrito en Kurita et al. (Kurita, K. et al., 1990, Polym. Prep. [Am. Chem. Soc., Div. Polym. Chem.] 31:624-625). En resumen, una disolución acuosa y alcalina de p-GlcNAc puede hacerse reaccionar con una disolución en cloroformo de cloruro de tosilo, y la reacción puede dejarse continuar entonces suavemente a temperaturas bajas.

Uno o más de los monosacáridos de p-GlcNAc de la invención o su derivado desacetilado pueden contener uno o más grupos O-acilo, tal como se describe a continuación:

5

donde R_{4} y/o R_{5}, en lugar de hidrógeno, pueden ser un resto alquilo, alquenilo o alquinilo, y R_{6} puede ser un resto alquilo, alquenilo o alquinilo. Un ejemplo de tal derivado puede generarse mediante métodos bien conocidos tales como los descritos por Komai (Komai, T. et al., 1986, en "Chitin in Nature and Technology", Muzzarelli et al., eds. Plenum Press, Nueva York, págs. 497-506). En resumen, la p-GlcNAc puede hacerse reaccionar con cualquiera de varios cloruros de acilo adecuados en ácido metanosulfónico para dar derivados de p-GlcNAc que incluyen, pero sin limitarse a, derivados de caproílo, caprilo, lanroílo o benzoílo.

Uno o más de los monosacáridos de la p-GlcNAc de la invención pueden contener un grupo N-acilo, tal como se representa a continuación:

6

donde R_{7} puede ser un resto alquilo, alquenilo o alquinilo. Tal derivatización puede obtenerse utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, tal como la técnica descrita en Hirano et al. (Hirano, S. et al., 1976, Carbohydrate Research 47:315-320).

La p-GlcNAc desacetilada es soluble en varias disoluciones acuosas de ácidos orgánicos. La adición de anhídridos carboxílicos seleccionados a tales disoluciones que contienen p-GlcNAc, en ácido acético metanólico acuoso, da como resultado la formación de derivados N-acil-p-GlcNAc.

Uno o más de los monosacáridos de la p-GlcNAc desacetilada de la invención o de su derivado desacetilado, puede contener un grupo O-alquilo, tal como se representa a continuación:

7

donde R_{8} puede ser un resto alquilo y alquenilo o alquinilo. Tal derivatización puede obtenerse usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el procedimiento descrito por Maresh et al. (Maresh, G. et al., en "Chitin and Chitosan", Skjak-Braek, G. et al., eds., 1989, Elsevier Publishing Co., págs. 389-395). En resumen, la p-GlcNAc desacetilada puede dispersarse en dimetoxietano (DME) y hacerse reaccionar con un exceso de óxido de propileno. El periodo de reacción puede ser de 24 horas y la reacción tiene lugar en un autoclave a 40 hasta 90ºC. La mezcla puede diluirse entonces con agua y filtrarse. El DME puede eliminarse por destilación. Finalmente, el producto final puede aislarse mediante liofilización.

Una o más de las unidades de monosacárido de la p-GlcNAc de la invención puede ser un derivado alcalino, tal como se representa a continuación:

8

Tal derivado puede obtenerse usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse un método tal como el descrito por Noguchi et al. (Noguchi, J. et al., 1969, Kogyo Kagaku Zasshi 72:796-799). En resumen, la p-GlcNAc puede remojarse, al vacío, en NaOH (preferiblemente al 43%) durante un periodo de aproximadamente dos horas a aproximadamente 0ºC.

El exceso de NaOH puede eliminarse entonces, por ejemplo, mediante centrifugación en una centrífuga de cesta y mediante prensado mecánico.

Una o más de las unidades de monosacárido del derivado desacetilado de la p-GlcNAc de la invención puede contener un grupo N-alquilo, tal como se representa a continuación:

9

donde R_{9} puede ser un resto alquilo, alquenilo o alquinilo. Tal derivatización puede obtenerse utilizando, por ejemplo, un procedimiento tal como el de Maresh et al. (Maresh, G. et al., en "Chitin and Chitosan", Skjak-Braek, G. et al., eds., 1989, Elsevier Publishing Co., págs. 389-395), tal como se describió anteriormente, para la producción de los derivados O-alquil-p-GlcNAc.

Una o más de las unidades de monosacárido del derivado desacetilado de la p-GlcNAc de la invención puede contener al menos un derivado desoxihalogenado, tal como se representa a continuación:

10

donde R_{10} puede ser F, Cl, Br o I, prefiriéndose el I. Tal derivado puede obtenerse mediante el uso de técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse un procedimiento tal como el descrito por Kurita et al. (Kurita, K. et al., 1990, Polym. Prep. [Am. Chem. Soc. Div. Polym. Chem.] 31:624-625). En resumen, una p-GlcNAc tosilada se hace reaccionar con un haluro de sodio en dimetilsulfóxido, dando un derivado desoxihalogenado. La tosilación de p-GlcNAc puede llevarse a cabo haciendo reaccionar una disolución acuosa y alcalina de p-GlcNAc con una disolución en cloroformo de cloruro de tosilo. Tal reacción puede continuarse suavemente a temperaturas bajas.

Una o más de las unidades de monosacárido del derivado desacetilado de la p-GlcNAc de la invención puede formar una sal, tal como se representa a continuación:

11

donde R_{11} puede ser un resto alquilo, alquenilo o alquinilo. Tal derivatización puede obtenerse usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse un procedimiento tal como el descrito por Austin y Sennett (Austin, P.R. y Sennett, S., en "Chitin in Nature and Technology", 1986, Muzzarelli, R.A.A. et al., eds. Plenum Press, págs. 279-286). En resumen, puede suspenderse p-GlcNAc desacetilada en un medio orgánico, tal como, por ejemplo, acetato de etilo o isopropanol, al que puede añadirse un ácido orgánico apropiado tal como, por ejemplo, ácido fórmico, acético, glicólico o láctico.

La mezcla puede dejarse reposar durante un periodo de tiempo (de 1 a 3 horas, por ejemplo). La temperatura de reacción y de secado puede variar desde aproximadamente 12º hasta aproximadamente 35ºC, prefiriéndose de 20º a 25ºC. Las sales pueden separarse entonces por filtración, lavarse con medio nuevo y evaporarse el medio residual.

Una o más unidades de monosacárido del derivado desacetilado de la p-GlcNAc de la invención, pueden formar un quelato metálico, tal como se representa a continuación:

12

donde R_{12} puede ser un ión metálico, particularmente uno de los metales de transición, y X es el enlace dativo establecido por los electrones del nitrógeno presentes en los grupos amino y amino sustituidos presentes en la p-GlcNAc desacetilada.

Una o más de las unidades de monosacárido del derivado desacetilado de la p-GlcNAc de la invención, puede contener un N-alquilideno o un grupo N-arilideno, tal como se representa a continuación:

13

donde R_{13} puede ser un resto alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo. Tal derivatización puede obtenerse usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse un procedimiento tal como el descrito por Hirano et al. (Hirano, S. et al., 1981, J. Biomed. Mat. Res. 15:903-911). En resumen, puede realizarse una reacción de N-sustitución de p-GlcNAc desacetilada con anhídridos carboxílicos y/o arilaldehídos para dar derivados de acilo y/o arilideno.

Además, la p-GlcNAc de la invención, o su derivado desacetilado, puede someterse a condiciones de hidrólisis controlada, lo que da grupos de moléculas que tienen peso molecular uniforme y diferenciado y otras características físicas. Tales condiciones de hidrólisis pueden incluir, por ejemplo, tratamiento con la enzima lisozima. La p-GlcNAc puede exponerse a lisozima durante diversos periodos de tiempo, con el fin de controlar el grado de hidrólisis. Además, la tasa de hidrólisis puede controlarse como una función del grado en el que la p-GlcNAc que se está tratando con lisozima se ha desacetilado. Las condiciones de desacetilación pueden ser tal como se describió anteriormente en esta sección. Cuanto más completamente se desacetile una molécula de p-GlcNAc, más completamente se hidrolizará la molécula. Los cambios en las características físicas, además de la disminución del peso molecular, pueden provocarse por tratamientos de hidrólisis y/o desacetilación. La hidrólisis exhaustiva produce licuación de la p-GlcNAc. Los resultados de un procedimiento de hidrólisis / desacetilación se presentan más adelante en el ejemplo de trabajo de la sección 9, más adelante.

Además, la desnaturalización térmica puede funcionar para modificar la estructura cristalina de la p-GlcNAc. Tal modificación de la estructura cristalina del producto de p-GlcNAc puede afectar ventajosamente, por ejemplo, a la reactividad de la p-GlcNAc.

Además, una variedad de moléculas pueden unirse funcionalmente, covalente y no covalentemente, a los derivados desacetilados de la p-GlcNAc de la invención. Tales moléculas pueden incluir, pero sin limitarse a, polipétidos tales como los factores de crecimiento, tal como el factor de crecimiento nervioso, proteasas tales como pepsina, hormonas o secuencias de reconocimiento de péptidos tales como las secuencias RGD (arginina-glicina-ácido aspártico), secuencias de reconocimiento de fibronectina, laminina, integrinas, moléculas de adhesión celular y similares. La unión covalente de las moléculas a las aminas primarias expuestas de la p-GlcNAc desacetilada puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante unión química utilizando reactivos de reticulación bifuncionales que actúan como separadores químicos de longitud específica. Tales técnicas son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden ser similares, por ejemplo, a los métodos de Davis y Preston (Davis, M. y Preston, J.F. 1981, Anal. Biochem. 116:404-407) y Staros et al. (Staros, J.V. et al., 1986, Anal. Biochem. 156:220-222). En resumen, los residuos carboxílicos del péptido que ha de unirse a la p-GlcNAc desacetilada o parcialmente desacetilada de la invención pueden activarse y luego reticularse a la p-GlcNAc. La activación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la adición de una disolución tal como EDC carbodiimida (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida) a una disolución peptídica en un tampón fosfato. Preferiblemente, esta disolución contendría adicionalmente un reactivo tal como sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida) para potenciar el acoplamiento. El péptido activado puede reticularse a la p-GlcNAc desacetilada mezclándose en un tampón de alto pH, tal como el tampón carbonato (pH 9,0 - 9,2).

Alternativamente, moléculas tales como las descritas anteriormente pueden unirse no covalentemente a la p-GlcNAc desacetilada usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, una molécula o moléculas de elección pueden mezclarse con una disolución de p-GlcNAc desacetilada antes de la liofilización.

Alternativamente, pueden formarse híbridos que comprendan p-GlcNAc y/o derivados de p-GlcNAc. Tales híbridos pueden contener cualquiera de varios materiales naturales y/o sintéticos, además de p-GlcNAc y/o derivados de p-GlcNAc. Por ejemplo, los híbridos pueden formarse de p-GlcNAc y/o derivados de p-GlcNAc más uno o más componentes de la matriz extracelular (MEC). Tales componentes de la MEC pueden incluir, pero sin limitarse a, colágeno, fibronectina, glucosaminoglucanos y/o péptidoglicanos. También pueden formarse híbridos de p-GlcNAc y/o derivados de p-GlcNAc más uno o más materiales sintéticos tales como, por ejemplo, polietileno. Tal híbrido de p-GlcNAc /
polietileno o derivado de p-GlcNAc / polietileno puede obtenerse uniendo térmicamente los componentes híbridos sometiéndolos, por ejemplo, al autoclave.

Adicionalmente, un derivado yodo-p-GlcNAc puede copolimerizarse con, por ejemplo, estireno, para la fabricación de materiales plásticos novedosos. La yodo-p-GlcNAc puede prepararse mediante un proceso similar al descrito por Kurita e Inoue (Kurita, K. e Inoue, S., 1989, en "Chitin and Chitosan", Skjak -Braek et al., eds., Elsevier Science Publishing Co., Inc., pág. 365), mediante tosilación y yodación de la p-GlcNAc. El derivado yodado de la p-GlcNAc puede dispersarse entonces en nitrobenceno y hacerse reaccionar con estireno, usándose cloruro de estaño (IV) como catalizador.

En el caso de un híbrido colágeno / p-GlcNAc, en resumen, puede mezclarse una suspensión de p-GlcNAc y una suspensión de colágeno y liofilizarse, y reticularse, preferiblemente reticularse deshidrotérmicamente. Las especies de colágeno de tales híbridos pueden ser nativas o sintéticas, y pueden ser de origen humano o no humano, tales como bovino, por ejemplo. Los materiales híbridos p-GlcNAc / colágeno y/o derivado de p-GlcNAc / colágeno muestran propiedades uniformes y forman una matriz porosa que puede actuar, por ejemplo, como una matriz tridimensional eficaz para la unión y el crecimiento de células. El ejemplo de trabajo presentado en la sección 13 más adelante, muestra la formación, las propiedades y la utilidad de tal híbrido de p-GlcNAc / colágeno.

Híbridos que comprenden combinaciones de p-GlcNAc desacetilada y compuestos tales como, por ejemplo, heparina, alginato de sodio y carboximetil-p-GlcNAc, pueden formularse utilizando técnicas tales como las descritas en el presente documento. Tales combinaciones pueden formarse o reformarse, por ejemplo, en membranas y fibras.

Pueden formularse complejos de p-GlcNAc desacetilada con polianiones tales como, por ejemplo, ácido poliacrílico o pectina, que poseen tanto cargas positivas como negativas. La formación de tales complejos puede llevarse a cabo según un método similar al descrito por Mireles et al. (Mireles, C. et al., 1992, en "Advances in Chitin and Chitosan", Brine, C.J. et al., eds., Elsevier Publishers, Ltd.). La p-GlcNAc desacetilada y el ácido poliacrílico, la carragenina o la pectina, por ejemplo, se disuelven en HCl y NaCl, respectivamente, y las disoluciones reactivas, con igual pH, se mezclan. Esta operación produce moléculas floculantes eficaces que poseen tanto características positivas como negativas útiles, por ejemplo, en el tratamiento de aguas residuales.

5.5 Reformulaciones

La p-GlcNAc de la invención, así como sus derivados desacetilados y/o sus derivatizaciones, tal como los descritos anteriormente en la sección 5.4, puede disolverse y reformularse posteriormente en una variedad de formas y de configuraciones.

La disolución de p-GlcNAc de la invención puede obtenerse mediante tratamiento con dimetilacetamida (DMA) / cloruro de litio. La p-GlcNAc puede disolverse fácilmente mediante agitación en una disolución de DMA que contiene LiCl al 5% (en peso de la DMA). Los derivados de p-GlcNAc solubles en agua, tales como las sales de p-GlcNAc, pueden disolverse en agua. La p-GlcNAc que se ha desacetilado al menos en un 75%, puede ponerse en disolución, por ejemplo, en una disolución ácida suave, tal como ácido acético al 1%. Los derivados de p-GlcNAc que son insolubles en agua pueden ponerse en disolución en disolventes orgánicos.

La derivatización de p-GlcNAc en DMA:LiCl con fenilisocianatos puede usarse para producir carbanilatos. Además, la derivatización de p-GlcNAc en DMA:LiCl con cloruro de tolueno-p-sulfonilo puede usarse para producir p-sulfonato de tolueno.

La p-GlcNAc de la invención, sus derivados desacetilados y/o sus derivatizaciones en disolución pueden precipitarse entonces y reformularse en formas que incluyan, pero sin limitarse a, marañas, hilos, cabos, microesferas, microperlas, membranas, fibras, polvos y esponjas. Además, pueden formularse membranas uniformes y ultrafinas (es decir, inferiores a aproximadamente 1 micra de espesor).

Tales reformulaciones pueden lograrse, por ejemplo, aprovechándose del hecho de que la p-GlcNAc pura es insoluble en disoluciones tales como en agua y en alcohol, preferiblemente en etanol. La introducción, mediante medios convencionales, tal como mediante inyección, por ejemplo, de la mezcla de DMA / LiCl que contenga p-GlcNAc en tal disolución en agua o alcohol, preferiblemente en etanol, provocará la nueva precipitación y, por tanto, la reformulación de la p-GlcNAc disuelta. Tal reformulación de p-GlcNAc pura se demuestra en el ejemplo de trabajo presentado más adelante en la sección 11. En el caso de derivados de p-GlcNAc solubles en agua, pueden lograrse las reformulaciones volviendo a precipitar en disolventes orgánicos tales como, por ejemplo, acetato de etilo o isopropanol. Las reformulaciones de p-GlcNAc que se han desacetilado en al menos aproximadamente el 75%, pueden lograrse volviendo a precipitar en una disolución alcalina. Los derivados de p-GlcNAc insolubles en agua pueden reformularse mediante nueva precipitación en disoluciones acuosas tales como, por ejemplo, agua.

La p-GlcNAc desacetilada, junto con la celulosa oxidada, pueden formularse para producir materiales híbridos de p-GlcNAc / celulosa que mejoran la resistencia en húmedo de los productos de papel. Un sustrato de algodón oxidado puede aproximarse mucho a la cadena de p-GlcNAc desacetilada que tiene una forma similar a una cinta plana, similar a la del algodón. Tal proximidad maximiza la contribución de las fuerzas de van der Waals a las fuerzas que promueven la adsorción, potenciando así las propiedades de resistencia en húmedo de los materiales híbridos de p-GlcNAc-celulosa.

Las membranas de p-GlcNAc y las matrices de p-GlcNAc tridimensionales pueden producirse mediante métodos que proporcionan la formación de tamaños de poro promedio controlados dentro de las membranas o las matrices. El tamaño de poro puede controlarse en las membranas y matrices variando la cantidad de material de p-GlcNAc usado y mediante la adición de ciertos disolventes tales como el metanol o el etanol, prefiriéndose el etanol, en cantidades específicas que oscilan desde aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el 40%, antes de la formación de las membranas y/o matrices. En general, cuanto mayor sea el porcentaje de disolvente, menor será el tamaño de poro promedio. El ejemplo presentado más adelante en la sección 15, demuestra la síntesis y la caracterización de tales estructuras porosas de p-GlcNAc.

5.6 Usos

La p-GlcNAc de la invención, así como sus derivados desacetilados y sus derivatizaciones, tales como las descritas anteriormente en la sección 5.4, y las reformulaciones tales como las descritas anteriormente en la sección 5.5, tienen una variedad de usos. Por ejemplo, las propiedades no tóxicas, no pirogénicas, biodegradables y biocompatibles de las moléculas de la invención, además de las propiedades ventajosas de la p-GlcNAc y de sus derivados, tal como se describe en el presente documento, conducen por sí mismas a aplicaciones en campos diversos tales como la agricultura, los cosméticos, la industria biomédica, la nutrición y salud animal, y las industrias alimenticia, química, fotográfica y farmacéutica.

5.6.1 Usos biomédicos de los materiales de p-GlcNAc 5.6.1.1 Usos en inmovilización / administración de fármacos

Los usos biomédicos del material de p-GlcNAc pueden incluir, por ejemplo, métodos de inmovilización / administración de enzimas y/o fármacos. Por ejemplo, la p-GlcNAc de la invención o sus derivados, pueden tener péptidos de interés (factores de crecimiento, por ejemplo) unidos covalentemente a los mismos, tal como se describió anteriormente en la sección 5.4. La p-GlcNAc que contiene péptidos puede administrarse a un paciente usando procedimientos habituales bien conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, pero sin limitarse a, inyección, implantación, medios artroscópicos, laparoscópicos o similares. Mediante la introducción de la p-GlcNAc que contiene péptidos en un paciente, la p-GlcNAc de la invención se biodegrada, de manera que los péptidos unidos se liberan poco a poco en el torrente sanguíneo del paciente, proporcionando así un método para la administración sostenida del fármaco.

Las especies de p-GlcNAc desacetiladas o parcialmente desacetiladas pueden producirse de manera que tengan una tasa predecible de biodegradabilidad. Por ejemplo, el porcentaje de desacetilación afecta a la velocidad a la que se degrada la especie de p-GlcNAc. En general, cuanto mayor sea el porcentaje de desacetilación, mayor será la velocidad de biodegradabilidad y reabsorción. Por tanto, el grado de biodegradabilidad de la p-GlcNAc y la tasa de reabsorción in vivo pueden controlarse durante la producción de la p-GlcNAc. Ejemplos de la producción y caracterización de tales materiales de p-GlcNAc se presentan en la sección 18, más adelante. Los materiales de p-GlcNAc que tienen tales tasas de biodegradabilidad controlables pueden formularse en membranas, geles, esponjas, microesferas, fibras y similares. Estos productos de p-GlcNAc se adhieren a los tejidos y los moldean, tanto a tejidos blandos como duros, en el cuerpo humano sin necesidad de puntos de sutura. Los materiales de p-GlcNAc pueden aplicarse, por ejemplo, durante la intervención quirúrgica general o mínimamente invasiva, tal como la cirugía laparoscópica.

Los materiales de p-GlcNAc que tienen una tasa controlable de biodegradación pueden ser útiles, por ejemplo, para estimular la hemostasia en los vasos sanguíneos, órganos y tejidos con hemorragia, para proporcionar barreras periodontales para la separación del tejido blando y el duro durante el proceso de reparación que sigue a la cirugía periodontal, para proporcionar materiales de relleno del espacio quirúrgico, para estimular el aumento del tejido blando, particularmente en la piel para reducir las arrugas de la piel y aumento del esfínter urinario, para controlar la incontinencia. El ejemplo presentado en la sección 19 más adelante, demuestra el uso de tales materiales de p-GlcNAc en una de tales aplicaciones, concretamente, para estimular la hemostasia.

Además, las moléculas de la invención pueden servir como vehículos de administración sostenida de fármacos en los que el fármaco de interés se ha encapsulado por la p-GlcNAc, o un derivado de la misma. Una encapsulación fármaco / p-GlcNAc puede producirse, por ejemplo, tras una modificación de la variación de tratamiento ácido / neutralización del método químico / biológico de purificación presentado anteriormente en la sección 5.3.2. En lugar de elevar el pH de la disolución de p-GlcNAc hasta aproximadamente un intervalo de pH neutro (es decir, aproximadamente 7,4), se puede crear un entorno de pH básico, elevando el pH hasta aproximadamente 9,0 una vez completada la purificación de p-GlcNAc. A un pH más básico, la estructura de la p-GlcNAc de la invención, o un derivado de la misma, adquiere una configuración más tridimensional o "abierta". Según se disminuye el pH, la configuración de la molécula se vuelve una configuración más compacta o "cerrada". Por tanto, puede añadirse un fármaco de interés a una p-GlcNAc a un pH alto, después puede disminuirse el pH de la suspensión de p-GlcNAc / fármaco, "atrapando" o encapsulando así el fármaco de interés dentro de una matriz de p-GlcNAc.

Tales encapsulaciones por p-GlcNAc pueden administrarse a un paciente usando técnicas habituales bien conocidas por los expertos en la técnica, de manera que, tras la administración, el fármaco encapsulado se libera lentamente en el sistema del paciente según se degrada la p-GlcNAc de la encapsulación.

Los geles y membranas basados en p-GlcNAc tienen una variedad de aplicaciones como sistemas terapéuticos de administración de fármacos. Tales aplicaciones incluyen, por ejemplo, sistemas de administración de fármacos antitumorales. Los sistemas de administración de fármacos descritos en el presente documento son viables para su uso con cualquier fármaco antitumoral. Tales fármacos son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden formularse en geles o membranas de p-GlcNAc, por ejemplo, para proporcionar administración sostenida específica de sitio directamente al tumor o a la región desalojada por el tumor tras la intervención quirúrgica. Tal producto farmacológico con p-GlcNAc de liberación sostenida, inmovilizado, puede actuar como un importante procedimiento de defensa inicial tras la intervención quirúrgica. Tales sistemas de administración de fármacos antitumorales con p-GlcNAc son particularmente útiles en el tratamiento de tumores que son total o parcialmente inaccesibles mediante la intervención quirúrgica, tal como es el caso, por ejemplo, de ciertos tumores cerebrales.

Dianas adicionales para los sistemas antitumorales con p-GlcNAc incluyen, pero sin limitarse a, la piel, el tubo digestivo, el páncreas, los pulmones, mamas, las vías urinarias y los tumores uterinos, y los sarcomas de Kaposi relacionados con el VIH.

Los fármacos antitumorales que son potenciadores de la radiación se prefieren para los casos en los que se prescribe tratamiento de terapia de radiación, o bien tras la intervención quirúrgica o en lugar de ella. Ejemplos de tales fármacos incluyen, por ejemplo, 5'-fluorouracilo, mitomicina, cisplatino y sus derivados, taxol, adriamicina, actinomicina, bleomicinas, daunomicinas y metamicinas.

Los intervalos de dosis para los fármacos antitumorales pueden ser inferiores, iguales o superiores a las dosis diarias habituales prescritas para el tratamiento sistémico de los pacientes. Pueden tolerarse dosis más elevadas porque los fármacos se administran localmente en el sitio del tumor. Por tanto, los otros tejidos, incluyendo las células sanguíneas, no se exponen tan fácilmente a los fármacos. Las dosis de tales fármacos son bien conocidas por los expertos en la técnica, y pueden determinarse alternativamente de manera rutinaria usando técnicas habituales bien conocidas por los expertos en la técnica tal como, por ejemplo, se describe más adelante al final de esta sección.

Los sistemas de administración de p-GlcNAc / fármaco de la invención pueden usarse adicionalmente para el tratamiento de las infecciones. Para tal aplicación, pueden inmovilizarse / formularse antibióticos, solubles en agua o insolubles en agua, en materiales basados en p-GlcNAc tales como, por ejemplo, geles y membranas. Los antibióticos son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, penicilinas, cefalosporinas, tetraciclinas, ampicilina, aureoticina, bacitracina, cloranfenicol, cicloserina, eritromicina, gentamicina, gramacidinas, kanamicinas, neomicinas, estreptomicinas, tobramicina y vancomicina. Las dosis de tales fármacos son bien conocidas por los expertos en la técnica, y pueden determinarse alternativamente de manera rutinaria usando técnicas habituales bien conocidas por los expertos en la técnica, tal como se describe, por ejemplo, más adelante al final de esta sección.

Tales productos antibióticos de p-GlcNAc pueden usarse para tratar infecciones bacterianas que se producen, o bien externamente, por ejemplo en la piel, cuero cabelludo, úlceras cutáneas u ojos, o internamente, por ejemplo, infecciones localizadas del cerebro, los músculos y el abdomen. Una aplicación destacada es para el tratamiento de las infecciones oportunistas relacionadas con el VIH.

Los sistemas de administración de p-GlcNAc / fármaco de la invención pueden formularse con fármacos antiinflamatorios para controlar la actividad disfuncional de los procesos inflamatorios e inmunes. Por ejemplo, la p-GlcNAc puede formularse con fármacos antiinflamatorios no esteoideos (AINE) y usarse para la reducción del dolor y la inflamación locales inducidos por enfermedades tales como la artritis reumatoide, la osteoartritis y el lupus sistémico, por nombrar algunos. La administración localizada de tales AINE usando los sistemas de administración de gel o membrana de p-GlcNAc / fármaco de la invención, puede servir para reducir los efectos secundarios de los AINE, que pueden incluir irritación gástrica, azotemia, disfunción plaquetaria y anomalías de la función hepática. Los AINE son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen inhibidores de la ciclooxigenasa, tales como la aspirina, el etodolaco, el fenoprofeno y el naproxeno. Pueden utilizarse otros fármacos antiinflamatorios como parte de los sistemas de administración de p-GlcNAc / fármaco de la invención tales como, por ejemplo, inhibidores de los mediadores inflamatorios lipídicos, tales como los leucotrienos. Las dosis de tales fármacos son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden determinarse alternativamente de manera rutinaria usando técnicas habituales bien conocidas por los expertos en la técnica tal como se describe, por ejemplo, más adelante al final de esta
sección.

Los sistemas de administración de p-GlcNAc / fármaco de la invención, pueden formularse adicionalmente con agentes antifúngicos, usando las técnicas descritas anteriormente, para el tratamiento de enfermedades fúngicas específicas. Los agentes antifúngicos son bien conocidos por los expertos en la técnica, y pueden incluir, por ejemplo, anfotericina, anisomicina, antifungona, blastomicina, griseofulvinas y nistatina. Las dosis de tales fármacos son bien conocidas por los expertos en la técnica, y pueden determinarse alternativamente de manera rutinaria usando técnicas habituales bien conocidas por los expertos en la técnica, tal como se describe, por ejemplo, más adelante al final de esta sección.

Los sistemas de administración de p-GlcNAc / fármaco de la invención también pueden formularse con agentes antiprotozoarios, usando las técnicas descritas anteriormente, para el tratamiento de infecciones protozoarias específicas. Los agentes antiprotozoarios son bien conocidos por los expertos en la técnica, y pueden incluir, por ejemplo, antiamebina, antiprotozina, monomicina, paromomicina y tricomicina. Las dosis de tales fármacos son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden determinarse alternativamente de manera rutinaria usando técnicas habituales bien conocidas por los expertos en la técnica tal como se describe, por ejemplo, más adelante al final de esta sección.

Los sistemas de administración de p-GlcNAc / fármaco de la invención, pueden formularse con compuestos espermicidas, usando técnicas tales como las descritas anteriormente, para producir anticonceptivos eficaces. Espermicidas apropiados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las dosis de tales espermicidas son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden determinarse alternativamente de manera rutinaria usando técnicas habituales bien conocidas por los expertos en la técnica tal como se describe, por ejemplo, más adelante al final de esta sección.

Los sistemas de administración de p-GlcNAc / fármaco de la invención pueden formularse, todavía adicionalmente, usando agentes proteicos terapéuticos. Tales formulaciones pueden producirse, por ejemplo, usando técnicas tales como las descritas anteriormente. Mediante la utilización de tales sistemas proteicos terapéuticos de p-GlcNAc, es posible administrar proteínas específicas directamente a los sitios diana deseados y efectuar la liberación sostenida de las proteínas en tales sitios. Ejemplos de proteínas posibles incluyen, pero sin limitarse a, insulina, anticuerpos monoclonales, inmunotoxina de cáncer de mama, factor de necrosis tumoral, interferones, hormona de crecimiento humana, linfocinas, factor estimulante de colonias, interleucinas y albúmina sérica humana. Las dosis de tales agentes proteicos terapéuticos son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden determinarse alternativamente de manera rutinaria usando técnicas habituales bien conocidas por los expertos en la técnica, tal como se describe por ejemplo más adelante al final de esta sección.

Dado que los materiales de p-GlcNAc de la invención son por sí mismos "inmunoneutros", porque no provocan una respuesta inmune en humanos, tales dispositivos de p-GlcNAc, tal como se describió anteriormente, que comprenden membranas de p-GlcNAc, matrices y/o geles porosos tridimensionales que albergan fármacos inmovilizados, pueden administrar tales fármacos de manera que no haya respuesta inmune. Ciertos materiales adicionales, tales como los alginatos naturales y los polímeros sintéticos, pueden usarse en algunos casos para construir tales dispositivos en combinación con el material de p-GlcNAc.

Las dosis terapéuticamente eficaces de cualquiera de los fármacos o agentes descritos anteriormente, junto con los sistemas basados en p-GlcNAc descritos en el presente documento, pueden determinarse de manera rutinaria utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Una dosis "terapéuticamente eficaz" se refiere a aquella cantidad de compuesto suficiente para dar como resultado una mejora de los síntomas de los procesos y/o enfermedades descritas en el presente documento.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los fármacos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos habituales en cultivos celulares o con animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La razón de dosis entre los efectos tóxicos y los terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la razón DL_{50} / DE_{50}. Se prefieren los compuestos que muestran índices terapéuticos grandes. Aunque pueden usarse compuestos que muestren efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado en diseñar un sistema de administración que dirija tales compuestos al sitio del tejido afectado con el fin de minimizar la lesión potencial para las células no infectadas y así reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y de los estudios con animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en humanos. Las dosis de tales compuestos caen preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la DE_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede calcularse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis puede formularse en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante que incluya la CI_{50} (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logre una inhibición de los síntomas que sea la mitad de la máxima) tal como se determina en un cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar con más exactitud las dosis útiles en los humanos. Los niveles plasmáticos pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución.

5.6.1.2 Usos de la p-GlcNAc en encapsulación celular

Las células encapsuladas por p-GlcNAc pueden formularse, y tales células encapsuladas por p-GlcNAc pueden administrarse a un paciente, mediante técnicas habituales bien conocidas por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las técnicas de administración descritas anteriormente en la sección 5.6.1.1. Véase alternativamente, por ejemplo, Aebisher et al. (Aebisher, P. et al., en "Fundamentals of Animal Cell Encapsulation and Immobilization", 1993, CRC Press, págs. 197-224), que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. Las células pueden encapsularse mediante, sobre o dentro de membranas de p-GlcNAc o de p-GlcNAc parcialmente desacetilada, matrices porosas tridimensionales de p-GlcNAc o geles de p-GlcNAc.

Las matrices tridimensionales pueden formar cultivos con células y usarse en ciertas aplicaciones sin encapsulación adicional. Alternativamente, las células pueden encapsularse en microesferas o gotitas de geles poliméricos basados en p-GlcNAc tales como, por ejemplo, un polímero polielectrolítico de lactato de p-GlcNAc (un polímero policatiónico). Los geles, las gotitas o las microesferas en los que se han encapsulado las células pueden recubrirse entonces con un segundo polielectrolito de carga opuesta (por ejemplo, con un polianión, tal como un alginato) para formar una cápsula externa que proporcione inmunoaislamiento a las células encapsuladas, reduciendo así el riesgo de rechazo inmune por el organismo huésped.

Adicionalmente, las células atrapadas en los geles de p-GlcNAc, las matrices de p-GlcNAc tridimensionales, o en ambos, pueden cargarse en cápsulas termoplásticas en todavía otro método de formulación. Las cápsulas basadas en materiales termoplásticos también pueden utilizarse para proporcionar inmunoprotección para las células implantadas en un organismo huésped. Tales cápsulas termoplásticas están hechas de materiales tales como copolímero de metacrilato de hidroxietilo-metacrilato de metilo (HEMA-MMA). Las microcápsulas derivadas de material termoplástico se forman, por ejemplo, mediante la coextrusión de una disolución de HEMA-MMA en polietilenglicol y la matriz y/o medio en gel de p-GlcNAc que contiene las células, en un disolvente orgánico apropiado tal como hexadecano. Véase, por ejemplo, el método descrito por Aebisher et al. (Aebisher, P. et al., en "Fundamentals of Animal Cell Encapsulation and Immobilization", 1993, CRC Press, págs. 197-224).

Las encapsulaciones celulares con p-GlcNAc tienen una variedad de aplicaciones. En primer lugar, pueden utilizarse para administrar compuestos terapéuticos, sintetizados y secretados por células unidas y encapsuladas en membranas, matrices o geles. Por ejemplo y en modo alguno como limitación, las encapsulaciones celulares / p-GlcNAc pueden usarse para administrar insulina en el tratamiento de la diabetes, factor de crecimiento nervioso para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, factor VIII y otros factores de coagulación para el tratamiento de la hemofilia, dopamina para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, encefalinas a través de las células cromafines de la glándula suprarrenal para el tratamiento del dolor crónico, distrofina para el tratamiento de la distrofia muscular y hormona de crecimiento humano para el tratamiento del crecimiento anómalo.

Además, dado que los materiales de p-GlcNAc de la invención son por sí mismos inmunoneutros, ya que no provocan una respuesta inmune en humanos, es posible proyectar y construir dispositivos que consistan en membranas de p-GlcNAc, matrices de p-GlcNAc porosas y tridimensionales y/o geles de p-GlcNAc que alberguen células unidas que puedan administrar agentes terapéuticos basados en células de una forma tal que las células estén inmunoaisladas, es decir, que no se provoque ninguna respuesta inmune contra la célula huésped. Ciertos materiales adicionales, tales como por ejemplo, alginatos naturales y polímeros sintéticos, pueden utilizarse para construir tales dispositivos además del propio material de p-GlcNAc.

Las composiciones de encapsulación de p-GlcNAc / célula pueden utilizarse adicionalmente para la administración de células para la regeneración tisular en cultivo. Las aplicaciones de los tipos de células específicas encapsuladas para el crecimiento de las células en cultivo que conduce a la regeneración tisular en el sitio de una lesión, pueden incluir, pero sin limitarse a, la regeneración de piel, cartílago, nervios, hueso, hígado y vasos sanguíneos. Las aplicaciones de regeneración tisular de células encapsuladas en materiales de p-GlcNAc son ventajosas, en parte por la capacidad del material de p-GlcNAc para adherirse al tejido lesionado, para proporcionar un sustrato para el crecimiento de células de mamíferos y para someter a la reabsorción biológica coincidente con el crecimiento de nuevo tejido sano durante el proceso de regeneración tisular en el sitio de la lesión. Ejemplos incluyen, pero sin limitarse a, la regeneración de tejidos de piel, hueso, cartílago, hígado, tendones y ligamentos.

5.6.1.3 Utilización de materiales de p-GlcNAc para la prevención de adherencias posquirúrgicas

Adicionalmente, las membranas de p-GlcNAc pueden usarse para proporcionar una barrera mecánica biocompatible y biodegradable para evitar las adherencias posquirúrgicas. El ejemplo presentado en la sección 17 más adelante, demuestra tal aplicación de la p-GlcNAc. La p-GlcNAc o los derivados de p-GlcNAc sólidos formulados en membranas o esponjas pueden utilizarse para tal aplicación. Las membranas preferidas son finas, generalmente inferiores a aproximadamente 1 mm de espesor. Los derivados de p-GlcNAc preferibles son derivados de p-GlcNAc que se han desacetilado en aproximadamente el 50 - 80%. Generalmente, tales derivados de p-GlcNAc se reabsorberán aproximadamente 7 - 21 días tras la implantación.

Los derivados de p-GlcNAc líquidos también son adecuados para su uso en la prevención de adherencias posquirúrgicas. Derivados de p-GlcNAc líquidos preferibles para tal aplicación son derivados de la sal de p-GlcNAc desacetilada y derivados de carboximetil-p-GlcNAc. Un derivado de p-GlcNAc que es particularmente preferido para la prevención de las adherencias posquirúrgicas es un derivado de lactato de p-GlcNAc, especialmente un derivado en gel de lactato de p-GlcNAc. Tales derivados de lactato de p-GlcNAc pueden formularse usando propilenglicol y agua tal como se describe, por ejemplo, en la sección 17.1. Los derivados de lactato de p-GlcNAc pueden producirse para que tengan viscosidades altas y bajas, lo que permite la capacidad de adaptación del p-GlcNAc usado a la indicación específica de interés. Por ejemplo, puede ser útil usar un producto de p-GlcNAc que tenga una menor viscosidad para administrarse a través de una jeringa o mediante un aerosol, mientras que puede ser deseable usar un producto de p-GlcNAc que tenga una mayor viscosidad y, por tanto, mayores propiedades de lubricación, cuando la indicación es ortopédica.

Para prevenir las adherencias posquirúrgicas, las formulaciones de p-GlcNAc sólidas son adecuadas para sitios de heridas claramente limitadas. Tales formulaciones de p-GlcNAc deben aplicarse tras la intervención quirúrgica y el material debe cubrir completamente el tejido con traumatismo. Puede aplicarse junto con cualquier intervención quirúrgica general o mínimamente invasiva (por ejemplo, laparoscópica). Las formulaciones de p-GlcNAc sólidas pueden cortarse y aplicarse usando instrumentación y procedimientos quirúrgicos habituales bien conocidos por los expertos en la técnica.

Las formulaciones de p-GlcNAc líquidas pueden aplicarse, para la prevención de las adherencias posquirúrgicas, en grandes áreas propensas a formar tales adherencias posoperatorias. El gel de lactato de p-GlcNAc, por ejemplo, puede aplicarse antes de la intervención quirúrgica para proporcionar lubricación adicional y reducir así la cantidad de tejido con traumatismo. Alternativamente, la formulación de p-GlcNAc líquida, tal como el lactato de p-GlcNAc, puede aplicarse tras la intervención quirúrgica para formar una barrera física para evitar la formación de adherencia posoperatoria.

El material de p-GlcNAc puede administrarse en capas, pulverizarse o administrarse como gotitas desde un dispositivo de jeringuilla en los sitios lesionados. En los procedimientos laparoscópicos, pueden administrarse materiales de baja viscosidad, por ejemplo, con dispositivos de succión / irrigación habituales. Los materiales de viscosidad mayor requerirán presión para alcanzar su objetivo. La presión puede proporcionarse mediante un pistón propulsado con gas comprimido o un dispositivo de tipo jeringuilla.

La cantidad de formulación de p-GlcNAc líquida, tal como la formulación en gel de lactato de p-GlcNAc, requerida para evitar las adherencias posquirúrgicas, es proporcional a la extensión de tejido con traumatismo. El material de p-GlcNAc administrado debe aplicarse en el intervalo de 0,1 ml a 1,5 ml por cm cuadrado de área superficial.

5.6.1.4 Otros usos biomédicos de los materiales de p-GlcNAc

Otros usos biomédicos de los materiales de p-GlcNAc incluyen, por ejemplo, el uso de tales materiales como sustratos de cultivo celular. Por ejemplo, tal como se muestra en el ejemplo de trabajo presentado en la sección 12 más adelante, la p-GlcNAc de la invención actúa como un sustrato muy eficaz para las células de mamífero crecidas en cultivo. Además, pueden usarse configuraciones tridimensionales de p-GlcNAc como componentes del medio, lo que permitirá el crecimiento del cultivo celular tridimensional.

Las capacidades de sustrato celular de la p-GlcNAc de la invención también pueden utilizarse in vivo. Aquí, la p-GlcNAc de la invención, o un derivado de la misma, tal como se describe en el presente documento, pueden actuar para facilitar la regeneración tisular (por ejemplo, la regeneración del tejido conectivo que cubre los dientes cerca de la línea de las encías, los injertos vasculares, ligamentos, tendones, cartílago, hueso, piel y tejidos nerviosos). Por tanto, las moléculas de p-GlcNAc de la invención pueden tener amplias aplicaciones en la cirugía plástica.

Se prefiere la p-GlcNAc desacetilada para su uso como sellante de injertos vasculares. Se prefieren los derivados de p-GlcNAc desacetilada tales como N-carboximetil y N-carboxibutil-p-GlcNAc desacetilada como reactivos de regeneración tisular. Por ejemplo, la N-carboximetil-p-GlcNAc desacetilada puede inocularse en la córnea e inducir neovascularización.

Aplicaciones biomédicas adicionales de la p-GlcNAc de la invención o de sus derivados, tal como se describe en el presente documento, pueden incluir el uso de las moléculas en vendajes para heridas, pomadas para la curación de heridas, puntos de sutura quirúrgicos, esponjas y similares.

Todavía adicionalmente, tales moléculas pueden usarse, por ejemplo, en el tratamiento de la osteoartritis, en la reducción de los niveles plasmáticos de colesterol, como agentes antivíricos, como agentes antibacterianos, como inmunomoduladores, como anticoagulantes, como membranas de diálisis y ultrafiltración, como agentes antitumorales, como material para lentes de contacto, y como adsorbentes orales para toxinas urémicas cuando se administran a pacientes con insuficiencia renal. Las suspensiones de p-GlcNAc microcristalinas o los derivados de p-GlcNAc solubles en agua se prefieren para el tratamiento de la artritis, por ejemplo mediante inyección directamente en las articulaciones artríticas.

La p-GlcNAc tiene aplicaciones adicionales como un componente de piel artificial o donante. Por ejemplo, la p-GlcNAc, preferiblemente como películas de p-GlcNAc no tejidas, puede aplicarse a sitios donantes de piel dérmica - epidérmica, sobre, por ejemplo, la dermis del donante.

La p-GlcNAc desacetilada a la que se ha unido una proteasa, tal como una pepsina, puede usarse para la digestión controlada de proteínas en contacto con tales compuestos de p-GlcNAc / proteasa.

Ciertas derivatizaciones de la p-GlcNAc de la invención, o de sus derivados, pueden preferirse para aplicaciones específicas. (Las derivatizaciones se describen en la sección 5.4, anteriormente). Por ejemplo, los derivados de la p-GlcNAc sulfatados, fosforilados y/o nitrados pueden preferirse como anticoagulantes o como activadores de la lipoproteína lipasa. Los derivados N-acil-p-GlcNAc también pueden preferirse para anticoagulantes, además de preferirse, por ejemplo, para su uso en la producción de vasos sanguíneos artificiales, compuestos antivíricos, compuestos antitumorales (específicamente, compuestos que se agregan a células cancerígenas), membranas para diálisis y ultrafiltración y en la producción de sistemas de administración de fármacos de liberación sostenida. Los derivados O-alquil-p-GlcNAc y desacetilados también pueden preferirse en la producción de sistemas de administración de fármacos de liberación sostenida. Los derivados N-alquil-p -GlcNAc pueden preferirse como agentes antibacterianos. Los derivados óxido -desaminados pueden preferirse como agentes anticancerígenos, específicamente su uso junto con un tratamiento inmunológico para células cancerígenas. Los derivados de p-GlcNAc desacetilados pueden preferirse como agentes de cicatrización de heridas. Los derivados N-alquiliden-p-GlcNAc y N-ariliden-p -GlcNAc pueden preferirse para aplicaciones de inmovilización de enzimas.

5.6.2 Usos en agricultura de los materiales de p-GlcNAc

La p-GlcNAc de la invención o sus derivados también pueden usarse en diversas aplicaciones agrícolas. Tales aplicaciones incluyen, pero sin limitarse a, aplicaciones como insecticida, fungicida, bactericida y nematocida. Los derivados N-carboximetílicos de la p-GlcNAc desacetilada se prefieren para su uso como reactivos bacteriostáticos eficaces. Los derivados N-alquil-p-GlcNAc pueden preferirse para aplicaciones fungicidas. Adicionalmente, las moléculas de la invención pueden usarse en diversas aplicaciones de tratamiento de suelos incluyendo, pero sin limitarse a, composiciones fertilizantes. Además, la liberación sostenida de productos agroquímicos puede lograrse atrapando tales productos químicos mediante la inmovilización, encapsulación y otros métodos descritos anteriormente en esta sección. Adicionalmente, análogos de, por ejemplo, los factores de nodulación y/o los inductores de la fijación del nitrógeno de Rhizobium pueden inmovilizarse en, y administrarse a través de, la p-GlcNAc y/o los derivados de la p-GlcNAc de la invención.

5.6.3 Usos en nutrición / industria alimenticia de los materiales de p-GlcNAc

La p-GlcNAc de la invención y sus derivados tal como se describen en el presente documento adicionalmente tienen aplicaciones en los campos de la nutrición animal y humana. Por ejemplo, las moléculas de la invención pueden usarse como componentes alimenticios. Pueden usarse técnicas tales como las descritas anteriormente en esta sección en la producción de productos de liberación sostenida en sistemas animales. Adicionalmente, pueden utilizarse las aplicaciones biomédicas descritas anteriormente en sistemas animales incorporando modificaciones de rutina bien conocidas por los expertos habituales en la técnica.

Las aplicaciones en la industria alimenticia de la p-GlcNAc de la invención y de sus derivados, tal como se describen en el presente documento, pueden incluir, pero sin limitarse a, compuestos anticolesterol (es decir, compuestos hipocolesterolémicos), de unión a lípidos, emulsionantes, vehículos, conservantes, condimentos y agentes para dar textura a los alimentos, además de revestimientos de frutas y productos de envasado de alimentos.

5.6.4 Usos cosméticos de los materiales de p-GlcNAc

Las aplicaciones cosméticas de la p-GlcNAc de la invención pueden incluir, pero sin limitarse a, la producción de productos para el cuidado del cabello y la piel. Los productos para el cuidado de la piel pueden incluir, por ejemplo, cosméticos que utilizan sales de p-GlcNAc desacetilada, productos que contienen carboximetil-p-GlcNAc y grupos de cosméticos que contienen p-GlcNAc desacetilada y derivados tales como derivados de hidroxipropil-p-GlcNAc, N-succinil-p-GlcNAc y p-GlcNAc cuaternaria. Los productos para el cabello pueden incluir, por ejemplo, productos que contengan carboximetil-p-GlcNAc y derivados de p-GlcNAc formadores de película.

5.6.5 Aplicaciones en ingeniería química de los materiales de p-GlcNAc

La p-GlcNAc de la invención y sus derivados tienen una variedad de aplicaciones que son útiles en la industria de la ingeniería química. Por ejemplo, la p-GlcNAc puede utilizarse como un agente de acoplamiento para la adhesión de metales a polímeros, las membranas formadas por glicol-p-GlcNAc pueden usarse en las aplicaciones de desalinización y las membranas formadas por otros derivados de la p-GlcNAc pueden usarse para el transporte de iones de halógeno. Otras aplicaciones pueden incluir la producción de retardadores de la llama y la fabricación de compuestos quelantes de metales y de compuestos capaces de eliminar oligoelementos y metales pesados de líquidos, así como contaminantes industriales solubles en agua, tales como los PCB (bifenilos policlorados), por ejemplo. La p-GlcNAc y/o los derivados de la p-GlcNAc pueden usarse en aplicaciones fotográficas. Por ejemplo, la capacidad de la p-GlcNAc y/o de los derivados de la p-GlcNAc para quelar metales, tales como haluros de plata, puede utilizarse poniendo en contacto disoluciones fotográficas para reestructurar marañas, tales como membranas finas, de p-GlcNAc y/o derivados de p-GlcNAc.

6. Ejemplo

Caracterización física de preparaciones puras de p-GlcNAc

En este ejemplo se presentan análisis de dicroísmo circular (DC) y de espectros infrarrojos (IR) de membranas de p-GlcNAc y p-GlcNAc desacetilada.

6.1 Materiales y métodos Preparaciones de "quitina" comercial y p-GlcNAc

La p-GlcNAc usada en los estudios de DC se preparó usando el método de purificación de fuerza mecánica descrito anteriormente en la sección 5.3.1.

La "quitina" comercial se adquirió de NovaChem, Ltd., apartado de correos 1030 Armdale, Halifax, Nueva Escocia, Canadá, B3L 4K9.

Las membranas de p-GlcNAc usadas en los estudios de IR se prepararon, o bien mediante el método de purificación de fuerza mecánica tal como se describió anteriormente en la sección 5.3.1, o mediante el método químico / biológico de purificación, tal como se describió anteriormente en la sección 5.3.2, tal como se indica.

Las preparaciones comerciales de "p-GlcNAc" se moldearon en membranas disolviéndolas en una disolución de dimetilacetamida que contenía cloruro de litio al 5% y formando capas sobre agua destilada y desionizada hasta que las membranas precipitaron.

Derivados de p-GlcNAc y tratamientos

La p-GlcNAc desacetilada utilizada en los estudios de DC e IR se preparó mediante el tratamiento de la p-GlcNAc con NaOH al 50% a 60ºC durante 2 horas. Las membranas de p-GlcNAc desnaturalizadas térmicamente usadas en los estudios de IR se modificaron hirviendo en EDTA 0,2 mM durante 3 minutos. La p-GlcNAc se trató en autoclave durante 30 minutos a 122ºC.

Técnicas de DC: Se llevaron a cabo técnicas de DC en estado sólido esencialmente según Domard (Domard, A., 1986, Int. J. Macromol. 8:243-246).

6.2 Resultados 6.2.1 Análisis de DC

En los espectros de DC obtenidos a partir de la p-GlcNAc no tratada (figura 3A), se observaron las transiciones electrónicas esperadas ópticamente activas n-\pi* y \pi-\pi** (220 - 185 nM) debido a la presencia del grupo carbonilo en el resto acetilo de la p-GlcNAc. Tales picos están completamente ausentes en el espectro de DC obtenido a partir del producto de p-GlcNAc desacetilada, tal como se muestra en la figura 3B.

6.2.2 Análisis de los espectros IR

Los espectros IR obtenidos en este estudio concuerdan con la estructura química de la p-GlcNAc. Adicionalmente, la clara definición de cada pico IR es indicativo de la presencia de una estructura ordenada y regular (es decir, seudocristalina) en las fibras de p-GlcNAc. Véase la figura 4A para el espectro IR de la p-GlcNAc purificada mediante el método de purificación de fuerza mecánica, y la figura 4D para el espectro IR de la p-GlcNAc purificada mediante el método químico / biológico. Para comparación, véase la figura 4B, que demuestra el espectro IR de una preparación de "quitina" comercial.

El espectro IR obtenido a partir del material de p-GlcNAc tratado en autoclave (figura 4E) no difiere visiblemente del espectro IR observado en la figura 4A. Estos datos indican que el material de p-GlcNAc puede esterilizarse tratándolo en autoclave sin pérdida de la estructura del polímero.

7. Ejemplo

Purificación de p-GlcNAc usando el método de purificación de fuerza mecánica

En esta sección, la p-GlcNAc se purificó usando la técnica de fuerza mecánica descrita anteriormente, en la sección 5.3.1.

7.1. Materiales y métodos / resultados

Condiciones del cultivo de diatomeas: La especie de diatomeas Thallasiosira fluviatilis se hizo crecer en cultivo según los procedimientos descritos anteriormente en las secciones 5.1 y 5.2.

Procedimientos de SEM: Las técnicas de SEM utilizadas aquí son tal como se describen más adelante en la sección 12.1.

Procedimiento de purificación de la p-GlcNAc: La p-GlcNAc se purificó a partir del cultivo de diatomeas utilizando la técnica de fuerza mecánica descrita anteriormente en la sección 5.3.1. Específicamente, las fibras de p-GlcNAc se separaron de los cuerpos celulares de las diatomeas sometiendo el contenido del cultivo a tres cortas ráfagas de movimiento de mezclado de velocidad superior en una mezcladora comercial (Waring blender). El tiempo total de las tres ráfagas fue de aproximadamente un segundo. La suspensión resultante se centrífugo a 3500 rpm en un rotor angular fijo Sorvall GS-4, durante 20 minutos a aproximadamente 10ºC. El sobrenadante se decantó y se centrífugo de nuevo, esta vez a 4000 rpm en un rotor angular fijo Sorvall GS-4 durante 20 minutos a aproximadamente 10ºC. Una vez más, el sobrenadante se decantó y se centrífugo a 4000 rpm a 10ºC. El sobrenadante final de la tercera centrifugación fue transparente, con pocos flóculos visibles, en caso de haber alguno, flotando en el líquido. El sobrenadante transparente se decantó a una unidad de filtración Buchner dotada con nitrocelulosa con un tamaño de poro de 0,8 \mum, después se aplicó succión y el líquido se filtró a partir de la suspensión de fibras, permitiendo que las fibras se acumularan en la membrana. Las fibras acumuladas se lavaron con 1 litro de H_{2}O destilada y desionizada a 70ºC. Cuando casi todo el agua se había drenado, las fibras se lavaron, con succión, con 1 litro de HCl 1 N a 70ºC. Cuando la mayor parte de la disolución ácida se había drenado, las fibras se lavaron con 1 litro de H_{2}O destilada y desionizada a 70ºC, usando succión. Cuando la mayor parte del agua de lavado se había drenado, las fibras se lavaron con 1 litro de etanol al 95% a temperatura ambiente y se aplicó vacío. La membrana del filtro sobre la que se había acumulado la membrana de fibras blancas se extrajo entonces de la unidad de filtración y la membrana y su soporte de membrana se secaron en una estufa de secado a 58ºC durante 20 minutos, tras lo que la membrana y su soporte se colocaron en un desecador durante 16 horas.

Tras este procedimiento de purificación, el rendimiento de p-GlcNAc a partir de 1000 ml de cultivo fue de 6,85 miligramos por litro de cultivo de diatomeas. Las micrografías SEM de la membrana formada por la acumulación de fibras de p-GlcNAc mediante esta técnica se muestran en las figuras 6A-6B.

8. Ejemplo

Purificación de p-GlcNAc usando el método químico / biológico de purificación

En esta sección, la p-GlcNAc se purificó usando dos de las técnicas químicas / biológicas descritas anteriormente en la sección 5.3.2. En resumen, la p-GlcNAc se purificó mediante tratamiento con HF en un caso, y mediante tratamiento ácido / neutralización en el segundo caso.

8.1 Materiales y métodos / resultados

Procedimientos de SEM: Las técnicas utilizadas en este estudio fueron tal como se describen más adelante en la sección 12.1.

Procedimiento de purificación: En primer lugar, la p-GlcNAc se purificó mediante tratamiento con HF, cuyos resultados se muestran en las figuras 7A-7B. Específicamente, bajo una vitrina extractora, se añadieron 2,42 ml de una disolución de HF al 49% (29 N) al contenido de diatomeas del cultivo, a temperatura ambiente, por cada 1000 ml del volumen del cultivo celular original, dando como resultado una disolución de HF 0,07 M. La mezcla se agitó entonces vigorosamente durante aproximadamente 30 segundos, haciendo que apareciera espuma persistente sobre el líquido. Se dejó reposar el recipiente sin tocar durante 5 - 6 horas para permitir que sedimentaran las partículas pesadas. Al final de este tiempo, se había formado una capa de espuma, mientras que el propio líquido se había dividido en dos estratos: en primer lugar, una estrecha capa de color verde muy oscuro que descansaba sobre el fondo del recipiente por debajo de una segunda fase de color verde-grisáceo mucho más claro y turbia que representaba quizás el 85 - 90% del volumen total del líquido. La capa de espuma se trasvasó cuidadosamente usando un tubo de vidrio capilar y succión a vacío. El sobrenadante turbio y grisáceo se trasvasó entonces, teniendo cuidado de no alterar la capa oscura del fondo, que consistía principalmente en cuerpos celulares sedimentados, y se transfirió a un recipiente de plástico separado. Se dejó reposar el sobrenadante turbio y grisáceo sin tocarlo durante 16 horas adicionales. El líquido era inicialmente casi incoloro, gris claro, pero no transparente. Tras 16 horas de tiempo de sedimentación, una pequeña cantidad de espuma permanecía en la parte superior del cuerpo principal del líquido y una pequeña cantidad de materia verde había sedimentado sobre el fondo del recipiente. El líquido era de color más claro, pero todavía no era transparente. La espuma sobre la parte superior del líquido se trasvasó como antes. El cuerpo principal del líquido se trasvasó entonces cuidadosamente, dejando atrás una pequeña cantidad de material verde sedimentado en el fondo del recipiente. El líquido que se había aislado de esta forma, contenía la mayoría de las fibras de p-GlcNAc y algunas impurezas.

Para eliminar las proteínas y otra materia no deseada liberada por las diatomeas durante las etapas anteriores en el procedimiento a partir del líquido que contiene la fibra, la suspensión de fibras y restos de células se lavó con dodecilsulfato sódico (SDS). Específicamente, se añadió el volumen necesario de una disolución de SDS al 20% para tener una concentración final de SDS líquido al 0,5% en volumen. El recipiente que contenía el líquido se selló, se aseguró en una posición horizontal en un agitador, y se agitó durante 24 horas a aproximadamente 100 agitaciones por minuto. Poco después de comenzar la agitación, aparecieron grandes flóculos de fibras de p-GlcNAc blancas en la suspensión y una considerable cantidad de espuma se acumuló en el espacio de cabeza de los recipientes. Al final del lavado con SDS, el contenido de los recipientes se transfirió a un equipo de filtración Buchner dotado con una membrana de filtro de 0,8 \mum (Supor Filter, Gelman). El líquido se filtró con succión, y las fibras de p-GlcNAc en el líquido se acumularon sobre la membrana de filtro.

Las fibras de p-GlcNAc acumuladas sobre la membrana de filtro se lavaron entonces adicionalmente. En primer lugar las fibras se lavaron con H_{2}O caliente (70ºC) destilada y desionizada, usando tres veces el volumen de la suspensión original. Con un chorro de agua que usaba H_{2}O destilada y desionizada, los grupos de fibras blancas acumulados sobre la membrana de filtro del filtro Buchner se transfirieron a una mezcladora comercial (Waring blender) y los grupos de fibras se disgregaron con aproximadamente 10 ráfagas cortas de mezclado. La suspensión de fibras disgregadas se transfirió a un embudo Buchner de filtración dotado con una membrana de filtro de nitrocelulosa tal como se describió anteriormente y el líquido se extrajo con succión. Las fibras acumuladas se lavaron con 1000 ml de disolución caliente (70ºC) de HCl 1N y posteriormente se lavaron adicionalmente con 1000 ml de H_{2}O caliente (70ºC) destilada y desionizada. Finalmente, las fibras se lavaron con 1000 ml de etanol al 95% a temperatura ambiente y se filtraron hasta sequedad. La membrana de fibras y la membrana de filtro que soporta la membrana de fibras se secaron entonces en una estufa de secado a 58ºC durante 20 minutos. La membrana y el soporte de membrana se colocaron entonces en un desecador durante 16 horas. La membrana se separó después cuidadosamente de la membrana de filtro.

En segundo lugar, la p-GlcNAc se purificó usando el método de tratamiento ácido / neutralización descrito anteriormente en la sección 5.3.2. Específicamente, la p-GlcNAc se trató tal como se describió anteriormente en esta sección, hasta antes de la etapa de lavado con SDS, punto en el que la disolución se neutralizó hasta alcanzar un pH de aproximadamente 7,0 mediante la adición de una disolución de Tris 2,9 M. El rendimiento de la p-GlcNAc obtenida a partir de este procedimiento de purificación fue de 20,20 miligramos por litro de cultivo de diatomeas. Como promedio, se obtuvieron aproximadamente 60 miligramos por litro de cultivo de diatomeas. Las micrografías SEM de las membranas formadas durante el procedimiento de purificación se muestran en las figuras 8A-8B y 9A-9B.

9. Ejemplo

Desacetilación de p-GlcNAc

Una membrana de p-GlcNAc se suspendió en una disolución que contenía NaOH al 50%. La suspensión se calentó a 80ºC durante 2 horas. La membrana desacetilada resultante se secó y se estudió por microscopía electrónica de barrido, tal como se muestra en las figuras 11A-11B.

10. Ejemplo

Biocompatibilidad de p-GlcNAc

En este ejemplo, se demuestra que la p-GlcNAc de la invención no muestra reactividad biológica detectable, tal como se ensayó por pruebas de elución, implantación intramuscular en conejos, inyección intracutánea en conejos e inyecciones sistémicas en ratones.

10.1 Materiales y métodos 10.1.1. Prueba de elución

Las condiciones para la prueba de elución se ajustaron a las especificaciones expuestas en la Farmacopea de los EE.UU. XXII, 1990, págs. 1415-1497 y a la Farmacopea de los EE.UU. XXII, Suplemento 5, 1991, págs. 2702-2703.

Cultivo celular: Se utilizó la línea celular L929 de fibroblastos de ratón (American Type Culture Collection, Rochville, MD; ATCC nº CCL1; NCTC clon 929). Una monocapa confluente de 24 h de células L929 se propagó en medio esencial mínimo (MEM) completo.

p-GlcNAc: Se extrajo una membrana sólida de p-GlcNAc que se había preparado según el método de purificación de fuerza mecánica descrito anteriormente en la sección 5.3.1, en 20 ml de MEM complementado con suero según los requisitos de la Farmacopea de los EE.UU. XXII (1990).

Controles: Se usó caucho natural como control positivo y se usó silicona como control negativo. Los controles se probaron de la misma manera que el artículo de prueba, p-GlcNAc.

Extractos: Los extractos se prepararon a 37ºC, en una atmósfera humidificada que contenía dióxido de carbono al 5%, durante 24 horas. Los extractos se evaluaron para determinar un cambio en el pH y se realizaron ajustes para llevar el pH hasta dentro de +/- 0,2 unidades de pH del medio original. Se realizaron ajustes con HCl para disminuir el pH del extracto o con NaHCO_{3} para elevar el pH del extracto. Los extractos se filtraron en condiciones estériles haciéndolos pasar a través de un filtro de 0,22 micras, antes de aplicarse a la monocapa de células.

Dosis: Se usaron 3 ml de los extractos de p-GlcNAc o control para reemplazar el medio de mantenimiento de los cultivos celulares. Todos los extractos se probaron por duplicado.

Criterios de evaluación: La respuesta de la monocapa de células se evaluó visualmente o bajo un microscopio. La reactividad biológica, es decir, la degeneración y/o malformación celular se clasificó en una escala de 0 a 4, tal como se muestra a continuación. El sistema de prueba es adecuado si no se observan signos de reactividad celular (grado 0) para el artículo de control negativo, y el artículo de control positivo muestra una reactividad mayor que leve (grado 2). El artículo de prueba (es decir, la p-GlcNAc) cumple la prueba de biocompatibilidad si ninguno de los cultivos tratados con el artículo de prueba muestran una reactividad mayor que leve.

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10.1.2. Implantaciones intramusculares

Animales: Se usaron conejos blancos de Nueva Zelanda, sanos, machos y hembras (Eastern Rabbit Breeding Laboratory, Taunton, MA). Los conejos se alojaron individualmente utilizando jaulas suspendidas de acero inoxidable. Tras su recepción, se pusieron los animales en cuarentena durante 8 días, en las mismas condiciones que para la prueba real. Se utilizaron viruta de madera dura (Sani-chip^{MR}, J. P. Murphy Forest Products, Montvale, NJ) como camas sin contacto bajo las jaulas. La instalación de los animales se mantuvo a una temperatura de 68º +/- 3ºF, con una humedad relativa de 30 - 70%, un mínimo de 10 - 13 intercambios completos de aire por hora y un ciclo de 12 horas de luz /
oscuridad utilizando luces fluorescentes de espectro completo. A los animales se les suministró alimento comercial (Agway ProLab, Waverly, NJ) en condiciones controladas y agua del grifo, municipal a voluntad. No estaban presentes contaminantes conocidos en el alimento, las camas o el agua que podría esperarse que interfirieran con los resultados de las pruebas. Se escogieron los animales seleccionados para el estudio de un conjunto mayor de animales. Se pesaron los conejos con una precisión de 10 g y se identificaron individualmente mediante un tatuaje en la oreja.

p-GlcNAc: Se utilizó la p-GlcNAc tal como se describió, anteriormente, en la sección 10.1.1.

Prueba de implantación: Se utilizaron dos conejos para cada prueba de implantación. En el día de la prueba, se cortó el pelo sobre la piel del animal en ambos lados de la columna vertebral. Se anestesió cada animal para evitar el movimiento muscular. Utilizando estiletes y agujas hipodérmicas estériles, se implantaron cuatro tiras de la p-GlcNAc de prueba (1 mm x 1 mm x 10 mm) en el músculo paravertebral en un lado de la columna de cada uno de los dos conejos (2,5 a 5 cm desde la línea media, paralelo a la columna vertebral, y aproximadamente a 2,5 cm entre sí). De una manera similar, se implantaron dos tiras del RS de plástico de control negativo de la USP (1 mm x 1 mm x 10 mm) en el músculo opuesto de cada animal. Se mantuvieron los animales durante un periodo de 7 días. Al final del periodo de observación, se pesaron los animales y se sacrificaron mediante un barbitúrico inyectable, Eutanasia-5 (Veterinary Laboratories, Inc., Lenexa, KS). Se permitió que transcurriera el tiempo suficiente para cortar el tejido sin hemorragia. La zona del tejido que rodea la parte central de cada tira de implante se examinó macroscópicamente utilizando una lente de aumento. Se puntuaron la formación de hemorragias, necrosis, decoloraciones e infecciones utilizando la siguiente escala: 0 = normal, 1 = leve, 2 = moderado y 3 = grave. Se puntuó la encapsulación, si estaba presente, midiendo en primer lugar la anchura de la cápsula (es decir, la distancia desde la periferia del implante hasta la periferia de la cápsula) redondeando hasta una precisión de 0,1 mm. Se puntuó la encapsulación tal como sigue:

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Se calcularon las diferencias entre las puntuaciones promedio para la p-GlcNAc y el artículo de control positivo. La prueba se considera negativa si, en cada conejo, la diferencia entre las puntuaciones promedio para cada categoría de reacción biológica para los sitios de la p-GlcNAc y el implante de plástico de control positivo no sobrepasan de 1,0; o si la diferencia entre las puntuaciones medias para todas las categorías de reacción biológica para cada artículo de p-GlcNAc y la puntuación promedio para todas las categorías para todos los sitios de la p-GlcNAc de implante de plástico de control positivo no sobrepasan de 1,0, para no más de uno de cuatro tiras de p-GlcNAc.

10.1.3. Inyecciones intracutáneas

Animales: Se utilizaron conejos blancos de Nueva Zelanda y se mantuvieron tal como se describió anteriormente en la sección 10.1.2.

p-GlcNAc: Se colocó una membrana sólida de p-GlcNAc que se había preparado según el método de purificación de fuerza mecánica descrito anteriormente, en la sección 5.3.1, en un matraz de extracción, al que se añadieron 20 ml del medio apropiado. Se realizaron extracciones calentando hasta 70º durante 24 horas. Tras este procedimiento, se enfriaron los extractos hasta temperatura ambiente. Cada botella de extracción se agitó vigorosamente antes de la administración.

Prueba intracutánea: En el día de la prueba, se cortó el pelo de los animales en el lado dorsal. Se inyectó por vía intracutánea un volumen de 0,2 ml de cada extracto de p-GlcNAc en cinco sitios en una ijada de cada uno de los dos conejos. Se utilizó más de un extracto de p-GlcNAc por conejo. En cinco sitios en la otra ijada de cada conejo, se inyectaron 0,2 ml del control correspondiente. Se observaron los sitios de inyección para determinar signos de eritema, edema y necrosis 24, 48 y 72 horas después de la inyección. Se puntuaron las observaciones de acuerdo con la escala de Draize para la puntuación de reacciones cutáneas (Farmacopea de los EE.UU. (USP) XXII, 1990, 1497-1500; Farmacopea de los EE.UU. XXII, Suplemento 5, 1991, 2703-2705) tal como se muestra en la tabla II, a continuación:

TABLA II

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Se sumaron todas las puntuaciones de eritema y edema a las 24, 48 y 72 horas por separado y se dividieron entre 12 (es decir, 2 animales x 3 periodos de puntuación x 2 categoría de puntuación) para determinar la puntuación media global para la p-GlcNAc frente al control correspondiente. Se pesaron los animales al final del periodo de observación y se sacrificaron mediante la inyección de un barbitúrico, Eutanasia-5 (Veterinary Laboratories, Inc., Lenexa, KS). Los resultados de la prueba son satisfactorios si la diferencia entre las puntuaciones de reacción (eritema / edema) de la p-GlcNAc y el medio de control es de 1,0 o inferior.

10.1.4 Inyecciones sistémicas

Animales: Se utilizaron ratones albinos suizos (Mus musculus), hembras, (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA). Se alojaron grupos de 5 ratones en jaulas de polipropileno dotadas de tapas de acero inoxidable. Se utilizó viruta de madera dura (Sani-chips^{MR}, J. P. Murphy Forest Products, Montvale, NJ) como camas de contacto en las jaulas. La instalación de los animales se mantuvo como una zona de acceso restringido. Las salas de los animales se mantuvieron a una temperatura de 68 +/- 3ºF, con una humedad relativa del 30 - 70%, un mínimo de 10 - 13 intercambios completos de aire por hora y un ciclo de 12 horas de luz / oscuridad utilizando luces fluorescentes de espectro completo. Se suministró a los ratones alimento comercial y agua del grifo, municipal a voluntad. No estaban presentes contaminantes conocidos en el alimento, las camas o el agua que podría esperarse que interfirieran con los resultados de las pruebas. Se escogieron los animales seleccionados para el estudio de un conjunto mayor de animales. Se pesaron los ratones con una precisión de 10 g y se identificaron individualmente mediante un perforador para marcar las orejas.

p-GlcNAc: Las muestras utilizadas eran tal como se describió anteriormente en la sección 10.1.1. Se prepararon extractos según el procedimiento descrito en la sección 10.1.3, anteriormente.

Prueba de inyección sistémica: Se inyectó a grupos de 5 ratones un extracto de p-GlcNAc o un artículo de control correspondiente, en las mismas cantidades y mediante las mismas vías expuestas a continuación:

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Los animales se observaron inmediatamente tras la inyección, a las 24 horas, 48 horas y 72 horas después de la inyección. Se pesaron los animales al final del periodo de observación y se sacrificaron mediante exposición a gas de dióxido de carbono. Los requisitos de la prueba se cumplen si ninguno de los animales tratados con p-GlcNAc muestra una reactividad biológica significativamente superior que los animales tratados con el artículo de control.

10.2 Resultados 10.2.1 Prueba de elución

Se evaluó la respuesta de la monocapa celular frente al artículo de prueba p-GlcNAc visualmente y con un microscopio. No se utilizaron tinciones histoquímicas en la evaluación. No se observaron signos de reactividad biológica celular (grado 0) a las 48 horas tras la exposición al artículo de control negativo o a la p-GlcNAc. Se observó reactividad grave (grado 4) para el artículo de control positivo, tal como se muestra a continuación en la tabla III:

TABLA III

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Por tanto, la p-GlcNAc de la invención pasa los requisitos de la prueba de elución para la biocompatibilidad y, por tanto, no es citotóxico.

10.2.2 Implantaciones intramusculares

Ambos conejos (A y B) probados aumentaron de peso corporal y no mostraron signos de toxicidad. Véase la tabla IV para más datos. Además, no se observaron signos manifiestos de toxicidad en ningún animal. La evaluación macroscópica de los sitios de implante del artículo de prueba y de control no mostraron inflamación, encapsulación, hemorragia, necrosis ni decoloración. Véase la tabla IV, para los resultados. Por tanto, la prueba demuestra que la p-GlcNAc ensayada no muestra reactividades biológicas, porque en cada ratón, la diferencia entre las puntuaciones promedio para todas las categorías de reacción biológica para todos los sitios de implante de p-GlcNAc y la puntuación promedio para todas las categorías de reacción biológica para todos los sitios de implante del control no sobrepasa de 1,0.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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10.2.3 Prueba intracutánea

Todos los animales aumentaron de peso. Véase la tabla V para más datos. No se observaron signos de eritema o edema en ninguno de los sitios del artículo de control ni de la p-GlcNAc. No se observaron signos manifiestos de toxicidad en ningún animal. Debido a que la diferencia entre las puntuaciones medias de reacción (eritema / edema) del artículo de control y de la p-GlcNAc fue inferior a 1,0, la p-GlcNAc cumple los requisitos de la prueba intracutánea. Véase la tabla VI, para los resultados. Por tanto, tal como se ensaya mediante esta prueba, la p-GlcNAc no demuestra reactividad biológica.

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10.2.4. Prueba sistémica

Todos los ratones tratados con el extracto de p-GlcNAc o el artículo de control aumentaron de peso. Véase la tabla VII para ver los datos. Además, no se observaron signos manifiestos de toxicidad en ninguno de los animales con p-GlcNAc o control. Véase la tabla VI para ver los resultados. Por tanto, se concluye que ninguno de los animales de prueba con p-GlcNAc mostró una reactividad biológica significativamente superior que los animales tratados con el artículo de control.

TABLA VII

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11. Ejemplo

Reformulación de p-GlcNAc

En el ejemplo de trabajo presentado en esta sección, se disolvió una membrana de p-GlcNAc (16,2 mg) en 1 ml de una disolución de dimetilacetamida que contenía un 5% de LiCl. La disolución que contenía la p-GlcNAc se colocó en una jeringa y se extruyó a 50 ml de agua pura para precipitar una fibra. Se estudió la fibra resultante con microscopía electrónica de barrido tal como se muestra en las figuras 10A-10B.

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12. Ejemplo

Unión celular a p-GlcNAc

En este ejemplo de trabajo, se demuestra que la p-GlcNAc representa un sustrato eficaz para la unión celular y el crecimiento en cultivo.

12.1 Materiales y métodos

Células: Se utilizó la línea celular de fibroblastos de ratón 3T3 y se hizo crecer en DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco) complementado con 10% de suero bovino fetal (SBF).

Membranas de p-GlcNAc: la p-GlcNAc se preparó según los métodos descritos, anteriormente, en las secciones 5.3.1 y 8.

Las membranas de p-GlcNAc se pegaron inicialmente a un cubreobjetos de Corning nº 1 (18 mm) utilizando una gota de agua y se unieron mediante tratamiento en autoclave a 121ºC durante 30 minutos. Las membranas preparadas de esta manera se colocaron entonces en pocillos de cultivo de placas de cultivo de 6 pocillos.

Recuentos celulares: El número de células se determinó en los medios mediante recuento directo con un hemocitómetro y en la matriz, aclarando las membranas en primer lugar con nuevo medio (DMEM + 10% de SBF) seguido por tratamiento con tripsina (10%, a 37ºC durante 5 minutos) antes del recuento.

Condiciones de funcionamiento del SEM: Se utilizó un instrumento Zeiss 962 con una tensión de aceleración de 10 kV y una distancia de trabajo de 15 mm. Se utilizó Polaroid tipo 55 p/n (u4) con diversos aumentos, tal como se indica. Recubrimiento de la muestra: recubrimiento de carbono (100 \ring{a}) y 100 \ring{a} de AuPd.

Preparación de la muestra: para la fijación principal, se sustituyó el medio de crecimiento en cultivo por glutaraldehído al 2% en medio DMEM de Eagle sin suero. Se realizaron varios cambios para garantizar una transición completa desde los medios de cultivo al de fijación. La fijación avanzó durante 0,5 horas a temperatura ambiente. Se transfirieron los cubreobjetos a viales nuevos que contenían glutaraldehído al 2% en cacodilato de Na 0,1 M, pH 7,2 con sacarosa 0,1 M y se fijaron durante 1,5 horas más a temperatura ambiente.

Deshidratación, CPD, montaje y recubrimiento por bombardeo iónico

Las muestras se aclararon con cacodilato de Na 0,1 M, pH 7,2 y se transfirieron los cubreobjetos a un soporte CPD. La deshidratación se realizó en series de etanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95% y 3 x 100%, 5 minutos cada uno) y las muestras se secaron en el punto crítico. Entonces, se montaron los cubreobjetos sobre portamuestras de Al, recubiertos de carbono, utilizando un evaporador a vacío (a 100 \ring{A}) y se recubrió por bombardeo iónico con 100 \ring{A} de
AuPd.

12.2 Resultados

Se probaron las membranas de p-GlcNAc para determinar la capacidad para formar un sustrato sobre el que puedan hacer crecer células en cultivo. Se hicieron crecer fibroblastos de ratón en pocillos en presencia o ausencia de las membranas de p-GlcNAc y se realizaron los recuentos celulares diariamente para ensayar la viabilidad de los cultivos. Los resultados de una de tales series de recuentos celulares se muestran en la figura 14. Tal como se indica, en el día 5 tras el cultivo en placas, sólo los pocillos que contenían membranas de p-GlcNAc pudieron continuar manteniendo células viables, lo que demuestra que las membranas de p-GlcNAc pueden actuar como sustratos eficaces para el crecimiento continuado de células en cultivo.

Además, las micrografías SEM representadas en las figuras 15A - 15B muestran células sanas unidas fuertemente a las membranas de p-GlcNAc.

13. Ejemplo

Híbridos de p-GlcNAc / colágeno

En este ejemplo de trabajo, se presenta la formación y caracterización de un material híbrido de p-GlcNAc / colágeno.

13.1 Materiales y métodos

Materiales: Se utilizó colágeno bovino tipo I en la preparación de los híbridos descritos en este estudio. La p-GlcNAc se preparó según el método de fuerza mecánica descrito, anteriormente, en la sección 5.3.2.

Preparación del híbrido: Se mezclaron suspensiones de colágeno (10 miligramos/ml) y p-GlcNAc (0,25 miligramos/ml), en diferentes razones, se congelaron en N_{2} líquido (-80ºC), se sometieron a inmersión térmica a -9ºC durante 4 horas y se liofilizaron. El material se reticuló deshidrotérmicamente a vacío (aproximadamente de 0,030 torr) a 60ºC durante 3 días.

Cultivo celular: Se hicieron crecer fibroblastos de ratón 3T3 en los híbridos de colágeno / p-GlcNAc producidos. Se siguieron procedimientos de cultivo habituales y las micrografías SEM se tomaron tras 8 días en cultivo.

13.2 Resultados

Se mezclaron las suspensiones de colágeno y p-GlcNAc en diferentes razones (concretamente, razones de la suspensión de colágeno:p-GlcNAc de 3:1, 1:1, 2:2 y 1:3), se congelaron, se liofilizaron y se reticularon. Tal procedimiento proporcionó placas de colágeno / p-GlcNAc. Las micrografías SEM de los materiales resultantes se muestran en las figuras 16B-E. La figura 16A representa un material control sólo de colágeno. Obsérvese la estructura porosa del material híbrido.

Los híbridos de colágeno / p-GlcNAc de la invención proporcionan una estructura tridimensional eficaz para la unión y crecimiento de células, tal como se muestra en las micrografías SEM de las figuras 17A-D.

14. Ejemplo

Caracterización por rmn de preparaciones puras de p-GlcNAc

En este ejemplo, se presenta un análisis por RMN (resonancia magnética nuclear) de preparaciones puras de p-GlcNAc.

14.1 Materiales y métodos

Preparaciones de p-GlcNAc: La p-GlcNAc usada en los estudios de RMN descritos en el presente documento se preparó utilizando el método químico de purificación descrito anteriormente en la sección 5.3.2, utilizándose ácido fluorhídrico como reactivo químico.

Técnicas de RMN: Se obtuvieron los datos de RMN en estado sólido utilizando un espectrómetro de RMN Broker 500MH. Se utilizó el análisis de imágenes por ordenador para transformar los datos del espectro de RMN sin procesar de modo que se elimine el fondo y se normalicen las líneas base. En la figura 18, se muestra un ejemplo de tales datos transformados. Las curvas de RMN transformadas tales como las de la figura 18 se utilizaron para obtener las áreas para cada tipo de átomo de carbono y para calcular después las razones de CH3 (área) con respecto al átomo de C (área). Tales valores, obtenidos como se describe, se facilitan en la figura 20.

14.2 Resultados

Los datos de RMN en estado sólido se obtuvieron midiendo el espectro de ^{13}C-RMN de una muestra de 500 mg de p-GlcNAc. En la figura 19, se muestra un espectro típico de RMN. Los picos individuales representan la contribución al espectro de cada átomo de carbono único en la molécula. El porcentaje relativo de cada tipo de átomo de carbono en la molécula se determinó dividiendo el área del pico generado por esa especie de carbono entre la suma total de las áreas bajo todos los picos obtenidos en el espectro. Por tanto, fue posible calcular la razón de cada uno de los átomos de la molécula medida mediante un átomo de referencia. Todas las moléculas de p-GlcNAc consisten en residuos de glucosamina N-acetilada que tienen átomos C1, C2, C3, C4, C5 y C6, por definición. Entonces, la razón del área del pico del átomo de carbono CH3 del N-acetilo con respecto a las áreas de cualquiera de los picos de los átomos de carbono del residuo de glucosamina, anteriormente, debe ser de 1,0 si todos los residuos de glucosamina en el polímero están N-acetilados. Se utilizaron datos como los de la figura 20 para obtener valores para las razones de CH3 (área).

Las razones calculadas en la figura 20 son en muchos casos iguales a o casi iguales a 1,0, dentro del error experimental, por ejemplo, CH3 / C2 = 1,097, CH3 / C6 = 0,984, CH3 / C5 = 1,007, CH3 / C1 = 0,886. Estos resultados concuerdan con la conclusión de que el material de p-GlcNAc de la invención está libre de contaminantes y está completamente acetilado (es decir, que esencialmente el 100% de los residuos de glucosamina están N-acetilados).

15. Ejemplo

Síntesis y caracterización biológica de matrices de p-GlcNAc tridimensionales de tamaño de poro controlado

A continuación, se describen métodos para la producción de matrices porosas basadas en p-GlcNAc tridimensionales que tienen tamaños medios de poro controlados. Tales matrices tienen una variedad de aplicaciones importantes, particularmente, por ejemplo, como medio para la encapsulación de células. Tales composiciones de encapsulación de células son útiles como agentes terapéuticos basados en células transplantables y en otras aplicaciones de técnicas en células y tejidos tales como la regeneración de cartílago. La capacidad para manipular la morfología y la dimensionalidad de los materiales de p-GlcNAc, tal como se demuestra en el presente documento, proporciona una herramienta poderosa en la expansión de las aplicaciones potenciales del material de p- GlcNAc de la invención.

15.1 Materiales y métodos

Material de partida de p-GlcNAc: La p-GlcNAc se preparó usando el método químico de purificación descrito, anteriormente, en la sección 5.3.2, utilizándose ácido fluorhídrico como reactivo químico.

Formación de la matriz: Se prepararon suspensiones (5 ml) que contenían muestras de p-GlcNAc de 20 mg en los disolventes enumerados más adelante en la sección 15.2, antes de la liofilización. Entonces, se vertieron las muestras en los pocillos de placas de cultivo tisular y se congelaron a -20ºC. Después, las muestras congeladas se liofilizaron hasta sequedad y se extrajeron las matrices tridimensionales resultantes.

Técnicas de microscopía electrónica de barrido: Se realizaron los procedimientos utilizados en el presente documento tal como se describieron, anteriormente, en la sección 12.1. Las imágenes mostradas en las figuras 21A-G son aumentos de 200X del material de matriz y se indica una marca de la escala de 200 micras en cada una de estas figuras.

15.2 Resultados

Se obtuvieron muestras de p-GlcNAc en cada uno de los siguientes disolventes, tal como se describió anteriormente en la sección 15.1:

A. Agua destilada

B. Metanol al 10% en agua destilada

C. Metanol al 25% en agua destilada

D. Agua destilada sólo

E. Etanol al 10% en agua destilada

F. Etanol al 25% en agua destilada

G. Etanol al 40% en agua destilada

Las muestras de la matriz formada utilizando cada uno de los disolventes se sometieron a exploración de análisis mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), tal como se muestra en las figuras 21A-G. Estas figuras revelan que el tamaño medio de poro de la matriz disminuye según aumenta el porcentaje de metanol o etanol en cada suspensión.

Específicamente, el diámetro de poro en las dos suspensiones acuosas (figuras 21A y 21D) se aproxima a 200 micras de promedio. El tamaño de poro en las muestras representadas en las figuras 21C y 21F (metanol y etanol al 25%, respectivamente) es de entre 30 y 50 micras de promedio.

Los resultados mostrados en el presente documento sugieren que, aunque tanto el etanol como el metanol pueden utilizarse satisfactoriamente para controlar el tamaño de poro de la p-GlcNAc, el etanol puede ser más eficaz que el metanol en permitir el control del tamaño de poro de la matriz de p-GlcNAc.

16. Ejemplo

Crecimiento de células en las matrices de p-GlcNAc porosas tridimensionales

En esta sección, se describen resultados que demuestran el uso satisfactorio de las matrices porosas de p-GlcNAc tridimensionales como sustratos para el cultivo de células.

16.1 Materiales y métodos

Material de partida de p-GlcNAc: Se preparó la p-GlcNAc utilizando el método químico de purificación descrito anteriormente en la sección 5.3.2, utilizándose ácido fluorhídrico como reactivo químico.

Formación de la matriz: Se prepararon matrices de p-GlcNAc tridimensionales mediante la liofilización de suspensiones de p-GlcNAc en agua, o mezclas de agua-etanol o agua-metanol.

Se prepararon suspensiones (5 ml) que contenían 20 mg de p-GlcNAc en los disolventes siguientes antes de la liofilización:

1. Agua destilada sólo

2. Metanol al 10% en agua destilada

3. Metanol al 25% en agua destilada

4. Agua destilada sólo

5. Etanol al 10% en agua destilada

6. Etanol al 25% en agua destilada

7. Etanol al 40% en agua destilada

Se vertieron las muestras en pocillos circulares de placas de cultivo tisular de plástico y se congelaron a -20ºC. Las muestras congeladas se liofilizaron entonces hasta sequedad y se extrajeron las matrices tridimensionales resultantes. Se sometieron muestras de cada matriz a análisis mediante microscopía electrónica de barrido (SEM).

Células: Se utilizó la línea celular de fibroblastos BALBC/3T3 de embrión de ratón (clon A31), obtenida a partir del ATCC, para su cultivo en las matrices de p-GlcNAc porosas tridimensionales.

Condiciones de cultivo: Se colocaron muestras de un cm^{2} de las matrices porosas en pocillos de cultivo tisular y se cubrieron con un medio de crecimiento en cultivo de tejido habitual. Cada pocillo se sembró y se cultivaron las células durante 6 días a 37ºC en un incubador de CO_{2} (5% de CO_{2}).

Procedimientos SEM: Se fijaron las muestras de matriz y se sometieron al análisis SEM tal como se describió anteriormente en la sección 12.1. Se prepararon las matrices liofilizando p-GlcNAc en agua destilada. Las imágenes varían en su aumento desde 100X hasta 5000X, tal como se indica en las leyendas de la figura (figuras 22A-G).

16.2 Resultados

En las figuras 22A-G, se muestran las micrografías SEM de las matrices de p-GlcNAc que contienen fibroblastos de ratón unidos. Estas micrografías muestran que las matrices de p-GlcNAc tridimensionales contienen fibroblastos de ratón unidos. Además, las micrografías revelan que existe una interacción y conexión próximas entre las células y el material de matriz de p-GlcNAc. También es notable que las células tienen una morfología tridimensional redondeada que es diferente de la forma plana y extendida de las células cuando se cultivan directamente sobre placas de cultivo de plástico. Se determinó que las viabilidades de las células eran superiores al 95%.

17. Ejemplo

La p-GlcNAc evita satisfactoriamente adherencias posquirúrgicas

El ejemplo presentado en el presente documento demuestra el uso satisfactorio de materiales de p-GlcNAc, específicamente una membrana de p-GlcNAc y una formulación de gel, para evitar la formación de adherencias posquirúrgicas en una serie de modelos animales de tales adherencias.

17.1 Materiales y métodos

Síntesis de lactato de p-GlcNAc: Se produjo el material de partida de la membrana de p-GlcNAc mediante el método químico, tal como se describió anteriormente en la sección 5.3.2, utilizándose ácido fluorhídrico como reactivo químico.

La p-GlcNAc se convirtió en p-GlcNAc desacetilada mediante el método siguiente. (Debe observarse que se necesitan aproximadamente 1,4 g de p-GlcNAc para producir cada gramo de lactato de p-GlcNAc, dada la pérdida en masa esperada de aproximadamente el 15% que se produce tras la desacetilación). Se mezclaron vigorosamente 200 mg, aproximadamente, de material de membrana de p-GlcNAc con aproximadamente 200 ml de NaOH al 60%. La agitación vigorosa sirvió para separar el material de membrana de p-GlcNAc hasta el grado posible. La disolución de NaOH utilizada se preparó al menos 12 horas antes de utilizarla. Las muestras se colocaron en un baño de agua a 80ºC durante 6 horas, con agitación periódica para separar y humedecer el material de p-GlcNAc. Tras 6 horas, se sacaron las muestras del baño de agua y se eliminó inmediatamente la disolución de NaOH. Los materiales de membrana se lavaron con ddH_{2}O, a temperatura ambiente, hasta que se alcanzó un pH de 7. Se sacaron las membranas del agua y se secaron sobre una lámina de teflón.

En este punto, se recogió una muestra de 2 mg para el análisis de C, H, N con el fin de determinar el grado de desacetilación. Además, se comprobó la solubilidad en ácido acético al 1%, indicando una solubilidad de 1 mg/ml que el material de p-GlcNAc estaba desacetilado apropiadamente.

La p-GlcNAc parcialmente desacetilada se convirtió después en lactato de p-GlcNAc mediante el método siguiente: se añadió 2-propanol suficiente (que contenía un 10% de agua) para humedecer todo el material de p-GlcNAc parcialmente desacetilada y permitir la agitación a 1 g de la p-GlcNAc parcialmente desacetilada en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. (Aproximadamente son necesarios 30 ml de 2-propanol). El 2-propanol debe ser de calidad para reactivo y nuevo antes de cada síntesis. Con agitación, 1,1 ml de disolución acuosa de ácido láctico al 50%. El ácido láctico debe ser de calidad para reactivo y debe analizarse para determinar la concentración exacta de ácido láctico disponible (es decir, no esterificado) presente. Esto se lleva a cabo generalmente mediante valoración con NaOH 0,1 N hasta el punto final de la fenoftaleína (pH 7,0). La concentración de ácido láctico utilizada debe ser constante, es decir, debe estar en el +/- 1 por ciento, para cada síntesis de p-GlcNAc. Se dejó la mezcla con agitación durante al menos dos horas. Es posible añadir calor suave con el fin de elevar la velocidad de reacción. Puede prolongarse el tiempo de reacción o puede aumentarse la cantidad de ácido láctico acuoso al 50% de modo que la reacción llegue a su finalización. Tras la agitación, se vertió el contenido del matraz a través de un embudo Buchner utilizando un papel de filtro cuantitativo, sin cenizas. El material se lavó con 15 ml de 2-propanol anhidro. Se dejó que el material se secara al aire en una vitrina extractora durante 2 horas y luego se colocó en un horno a 40ºC durante la noche. Por cada gramo de material de partida de p-GlcNAc parcialmente desacetilada, debe obtenerse un peso final de lactato de p-GlcNAc de aproximadamente 1,4 g (es decir, un aumento del 40% en masa).

Formulación de lactato de p-GlcNAc como un gel: El material de lactato de p-GlcNAc se formuló en un gel tal como sigue: se disolvió el lactato de p-GlcNAc de partida en agua dd-desionizada hasta una concentración de entre 0,1 -
4,0% de lactato de p-GlcNAc en peso. Entonces, se añadió propilenglicol (2-propanodiol) de calidad para reactivo hasta una concentración final de propilenglicol de entre el 1 - 10%. En algunos casos, se añadió un conservante para evitar la contaminación bacteriana y/o fúngica del producto. Normalmente, se prepararon concentraciones de lactato de p-GlcNAc de entre el 0,1 - 4,0%. La viscosidad de estas preparaciones aumentó bruscamente según aumentaba el porcentaje de lactato de p-GlcNAc, de tal manera que las formulaciones que tienen un 0,5% o más del lactato de p-GlcNAc se comportan como geles.

Modelos animales

Ratas Sprague-Dawley: Se producen adherencias en este modelo excoriando o irritando la superficie serosa del ciego y yuxtaponiéndola a una zona del peritoneo parietal. Se notifica que la tasa de éxito para inducir adherencias en animales control con este método es del 80% de promedio.

Específicamente, el procedimiento quirúrgico para inducir adherencias posquirúrgicas en estas ratas implicó lo siguiente. Se pusieron los animales en decúbito supino y se prepararon y cubrieron en consecuencia para la cirugía aséptica. Se expuso la cavidad abdominal mediante una incisión en la línea media. Se extirpó cuidadosamente una zona, de aproximadamente 0,5 cm x 1,0 cm, de peritoneo parietal en la pared abdominal izquierda, extrayendo una delgada capa de músculo junto con el peritoneo.

Entonces, se elevó el ciego y se aisló. Se excorió una zona, de aproximadamente 0,5 cm x 1,0 cm, en la superficie lateral del extremo proximal del ciego frotándolo diez veces con una gasa seca. Luego, se raspó el ciego con una hoja de bisturí para producir hemorragias petequiales mínimas. La excoriación cecal y la incisión peritoneal se dejaron expuestas durante 15 minutos.

Tras 15 minutos, se aplicó el artículo de prueba (es decir, el material de p-GlcNAc) o el artículo de control a la herida cecal. La excoriación cecal y la herida peritoneal se enfrentaron entonces y se pusieron en contacto con pinzas de tejido de Allis durante 15 minutos adicionales.

Después, se volvió a poner el ciego dentro del abdomen de tal manera que la zona excoriada del ciego fuese adyacente al sitio peritoneal. Se cerró la incisión peritoneal y se dejó que se recuperase el animal de la anestesia.

Catorce días después de la intervención quirúrgica, se sacrificaron los animales y se examinó la zona excoriada para determinar la formación de adherencias posquirúrgicas. Si había adherencias presentes, se diseccionó la zona completa involucrada en la adherencia (es decir, la pared corporal, el artículo de prueba o control y los órganos internos) del animal.

El grado de implicación y la tenacidad de las adherencias se evaluaron de acuerdo con las siguientes escalas:

27

28

Modelos animales adicionales: Se utilizaron modelos de intestino de animales grandes como el cerdo y el caballo para evaluar la prevención de las adherencias peritoneales.

Procedimiento quirúrgico: Se pusieron los animales en decúbito supino y se prepararon y cubrieron en consecuencia para la cirugía aséptica. Se expuso la cavidad abdominal mediante una incisión en la línea media. Se elevó el intestino delgado y se identificó una sección de 2 cm x 2 cm, se excorió intensamente (aproximadamente 200 golpes utilizando un bisturí) y se dejó secar durante 10 minutos. El artículo de prueba (es decir, el material de p-GlcNAc) o el artículo de control se aplicó luego a la herida excoriada y la sección lesionada del intestino delgado se volvió a poner dentro del abdomen. En tal tipo de intestino de modelo animal grande, seis heridas, cada una separada por 4 pulgadas de intestino de la herida adyacente proporciona un entorno sumamente propenso a formar adherencias. Después de la última herida, se cerró la cavidad abdominal y se dejó que se recuperase el animal de la anestesia.

Análisis de las adherencias peritoneales: Veintiún días después de la intervención quirúrgica, se sacrificaron los animales y se examinó la zona excoriada, evaluándose la formación de adherencias siguiendo un procedimiento similar al del modelo de ciego de rata Sprague-Dawley.

17.2 Resultados

Cuando se produce una lesión, el organismo pone en marcha un conjunto complejo de respuestas diseñadas para restaurar la zona lesionada. En las fases finales de la cicatrización, se forma tejido conjuntivo en el sitio de la herida para regenerar la estructura corporal y proteger la zona afectada frente a un daño adicional. En algunos casos, esta cascada de acontecimientos no funciona adecuadamente y puede conducir a estados potencialmente mortales.

Por ejemplo, según cicatriza un órgano visceral tras una intervención quirúrgica, un coágulo de fibrina generado durante la intervención quirúrgica puede invadir la superficie de órganos colindantes formando una unión que permite la migración de fibroblastos. Esta migración conduce a la deposición de colágeno y el crecimiento de tejido, que a su vez hace que los órganos implicados se adhieran entre sí.

Tales adherencias, denominadas adherencias posquirúrgicas, producen dolor, obstrucción y mal funcionamiento al deformar el órgano u órganos implicados. Las articulaciones inmovilizadas, la obstrucción abdominal y la esterilidad se relacionan a menudo con la formación de adherencias posquirúrgicas. Además, la adherencia posquirúrgica complicará y prolongará la duración de intervenciones quirúrgicas futuras en la región circundante. Esta última cuestión es de particular relevancia para iniciar intervenciones quirúrgicas cardiacas y procedimientos obstétricos de cesárea, en los que pueden requerirse intervenciones quirúrgicas adicionales. La formación de adherencias es muy común tras intervenciones quirúrgicas abdominales, cardiovasculares y ortopédicas.

Cuando las adherencias se vuelven patológicas e interfieren gravemente en la función del órgano, la adherenciolisis quirúrgica (disección incisiva o roma de la adherencia junto con técnicas quirúrgicas meticulosas) es el tratamiento que se utiliza actualmente para eliminar las adherencias. En 1991, se realizaron aproximadamente 500.000 procedimientos de adherenciolisis. Sin embargo, este procedimiento es de notoria ineficacia, notificándose que la frecuencia de reaparición de la formación de adherencias es de hasta el 90%. Además, ninguna otra técnica o composición ha demostrado ser eficaz en la prevención de tales adherencias posquirúrgicas.

Por tanto, los resultados presentados en el presente documento son significativos porque demuestran la eficacia de los materiales de p-GlcNAc de la invención para la prevención de adherencias posquirúrgicas. Específicamente, los resultados presentados en el presente documento demuestran la eficacia de las formulaciones basadas en p-GlcNAc sólidas y líquidas como barreras frente a la formación de adherencias posquirúrgicas abdominales en sistemas de modelo animal de rata y cerdo aceptados.

Uno de los modelos animales aceptados utilizados para estudiar la formación de adherencias emplea adherencias peritoneales parietales-viscerales en ratas Sprague-Dawley. Tanto las membranas de p-GlcNAc parcialmente desacetilada como las formulaciones de gel de lactato de p-GlcNAc evitaron y/o redujeron considerablemente la incidencia de formación de adherencias, en comparación con cualquiera de los controles no tratados, tratados con InterCEED^{MR} (Johnson & Johnson), el único producto disponible comercialmente para esta indicación.

Específicamente, se utilizó un total de 18 ratas para probar las formulaciones de gel de lactato de p-GlcNAc. Se utilizaron 12 animales como controles, 6 sin recibir tratamiento y 6 recibiendo InterCEED^{MR}. Seis animales recibieron gel de lactato de p-GlcNAc al 0,25%, 10% de propilenglicol y agua. Los animales que recibieron el tratamiento con gel de lactato de p-GlcNAc mostraron una incidencia significativamente reducida de formación de adherencias posquirúrgicas, en comparación con cualquiera de los controles, tal como se muestra a continuación, en la tabla
VIII.

TABLA VIII

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También se probaron las membranas de p-GlcNAc parcialmente desacetilada para determinar su capacidad para evitar la reaparición de adherencias posquirúrgicas en el modelo animal de rata. Se utilizó un total de 22 ratas en el estudio. Se utilizaron 12 animales como controles, 6 sin recibir tratamiento y 6 recibiendo InterCEED^{MR}. Diez animales recibieron, cada uno, una membrana de 1 cm x 1 cm de una formulación de p-GlcNAc desacetilada aproximadamente en un 60%. Los animales que recibieron la membrana de p-GlcNAc parcialmente desacetilada mostraron una reducción significativa en la incidencia de la formación de adherencias posquirúrgicas en comparación con los controles no tratados y con InterCEED^{MR}, tal como se muestra a continuación, en la tabla IX.

TABLA IX

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También se utilizaron modelos de intestino de animales grandes para la prevención de adherencias peritoneales, para probar las composiciones de p-GlcNAc. Específicamente, se utilizaron seis cerdos y un caballo para estudiar tanto la membrana de p-GlcNAc parcialmente desacetilada como el gel de lactato de p-GlcNAc. La membrana de p-GlcNAc parcialmente desacetilada consistía en una pieza de 2 cm x 2 cm de membrana de p-GlcNAc parcialmente desacetilada, mientras que el gel de lactato de p-GlcNAc consistía en un lactato de p-GlcNAc al 0,25% formulado con un 10% de propilenglicol y agua. Los animales control no recibieron tratamiento en el sitio lesionado.

Los resultados de estos estudios con animales grandes revelaron que, mientras que en los sitios control se formaban múltiples adherencias y tejido cicatricial en la zona circundante, tanto la membrana como las formulaciones de gel de p-GlcNAc evitaron eficazmente la formación de adherencias.

Las muestras de los sitios control y tratados se examinaron adicionalmente utilizando SEM, que mostró un aumento de la cantidad de fibrosis en los sitios control en comparación con los tejidos tratados.

18. Ejemplo

Biodegradabilidad de los materiales de p-GlcNAc

El ejemplo presentado en esta sección demuestra que pueden prepararse materiales de p-GlcNAc de la invención que muestran una biodegradabilidad in vitro e in vivo y tasas de reabsorción controlables.

18.1 Materiales y métodos

Materiales de p-GlcNAc: Se preparó el prototipo I mediante el método descrito anteriormente en la sección 5.3.2, a través del método químico, utilizándose ácido fluorhídrico como reactivo químico. El prototipo I representó la p-GlcNAc acetilada en un 100%.

El material de partida de p-GlcNAc del prototipo 3A se preparó mediante el método descrito anteriormente en la sección 5.3.2, a través del método químico, utilizándose ácido fluorhídrico como reactivo químico. El material de partida de p-GlcNAc se desacetiló mediante el método descrito anteriormente en la sección 5.4. Específicamente, el material de p-GlcNAc se trató con una disolución de NaOH al 40% a 60ºC durante 30 minutos. Se determinó que el prototipo 3A resultante estaba desacetilado en un 30%.

El material de partida de p-GlcNAc del prototipo 4 se preparó mediante el método descrito anteriormente, en la sección 5.3.2, a través del método químico, utilizándose ácido fluorhídrico como reactivo químico. El material de p-GlcNAc se desacetiló mediante tratamiento con una disolución de NaOH al 40% a 60ºC durante 30 minutos. A continuación, las fibras se suspendieron en agua destilada, se congelaron a -20ºC y se liofilizaron hasta sequedad. También se determinó que el prototipo 4 estaba desacetilado en un 30%.

Modelo de implantación abdominal: Se utilizaron ratas albinas Sprague-Dawley para los estudios del modelo de implantación abdominal. Se anestesiaron los animales y se prepararon para la intervención quirúrgica, y se realizó una incisión en la piel y los músculos abdominales. Se localizó el ciego y se elevó. Se colocó una membrana de 1 cm x 1 cm de material de p-GlcNAc sobre el ciego y se cerró la incisión con nylon. Los animales control fueron aquellos en los que no se colocó material sobre el ciego.

Se abrieron los animales en los días 14 y 21 tras la implantación. Se tomaron fotografías durante los procedimientos de implante y explante (figuras 23A-E). Se prepararon muestras del ciego para histopatología tras el procedimiento de explante.

Ensayo de lisozima-quitinasa de degradación in vitro de p-GlcNAc: El ensayo es un ensayo colorimétrico para la N-acetilglucosamina y se realizó tal como sigue: se pipetearon 150 \mul de una muestra de reacción en tubos de ensayo de 13 x 100 mm, de vidrio y desechables, por duplicado. Se añadieron 25 \mul de tampón fosfato de potasio 0,25 M (pH 7,1) a cada tubo de ensayo, seguido por la adición de 35 \mul de disolución de borato de potasio 0,8 M (pH 9,8). Inmediatamente, los tubos se sumergieron en un baño de hielo durante un mínimo de 2 minutos. Entonces, es extrajeron muestras del baño de hielo, se añadió 1 ml de reactivo DMAB recién preparado y se agitaron las muestras en un vórtex (agitador vibrador de tubos). El reactivo DMAB (dimetilaminobenzaldehído) se preparó añadiendo 70 ml de ácido acético glacial y 10 ml de HCl 11,6 N (concentrado) a 8 gramos de p-dimetilaminobenzaldehído. Entonces, se incubaron las muestras a 37ºC durante 20 minutos.

Para preparar una curva patrón, se utilizó el siguiente procedimiento. Se diluyó una disolución madre de p-GlcNAc hasta 0,1 mg/ml con tampón acetato de sodio 0,010 M (pH 4,5) y se añadieron 0 \mul, 20 \mul, 30 \mul, 90 \mul o 120 \mul de la disolución diluida de p-GlcNAc a un conjunto de tubos de ensayo. Esto estuvo seguido por la adición de 150 \mul, 130 \mul, 60 \mul o 30 \mul, respectivamente, de tampón acetato de sodio 0,010 M (pH 4,5) a los tubos de ensayo. A continuación, se añadieron 25 \mul de tampón fosfato de potasio 0,25 M (pH 7,1) y 35 \mul de tampón borato de potasio 0,8 M (pH 9,8) a cada tubo de ensayo. Se preparó un conjunto duplicado de tubos de ensayo mediante el mismo procedimiento.

Los tubos de ensayo se taparon y se llevaron a ebullición a 100ºC durante 3 minutos exactamente. Entonces, se sumergieron los tubos en un baño de hielo. Se sacaron los tubos del baño de hielo y se añadió a cada tubo 1 ml de reactivo DMAB, recién preparado según el método descrito anteriormente en la sección. Los tubos se incubaron a 37ºC durante 20 minutos. Se lee la absorbancia del contenido de cada tubo a 585 nM. La absorbancia debe leerse tan rápido como sea posible. Se representa la curva patrón sobre papel milimetrado y se utiliza para determinar la concentración de N-acetilglucosamina en las muestras de reacción. En la figura 23, se muestra una curva patrón típica.

18.2 Resultados

Se estudió la biodegradabilidad in vitro de los materiales de p-GlcNAc en experimentos que ensayaron la vulnerabilidad relativa de los materiales de membrana de p-GlcNAc a la degradación por lisozima. Se expusieron las membranas de p-GlcNAc a un exceso de lisozima en un tampón acetato 10 mM y la posterior liberación de la N-acetilglucosamina se determinó utilizando el ensayo descrito anteriormente en la sección 18.1.

Los resultados de estos experimentos indicaron que las membranas parcialmente desacetiladas son más susceptibles a la digestión por lisozima (véase la figura 24) y, además, que la tasa de degradación por lisozima se relaciona directamente con el grado de desacetilación (véase la figura 25, que compara las tasas de degradación de una membrana de p-GlcNAc desacetilada en un 50% con una desacetilada en un 25%).

Adicionalmente, se realizaron experimentos que trataban la biodegradabilidad in vivo de materiales de p-GlcNAc. Tales experimentos utilizaron un modelo de implantación abdominal. Se probaron tres materiales de p-GlcNAc, tal como se enumera más adelante.

Materiales de p-GlcNAc probados

1): p-GlcNAc, totalmente acetilada (designado como prototipo 1);

2): membrana de p-GlcNAc parcialmente desacetilada (designada como prototipo 3A); y

3): membrana de p-GlcNAc parcialmente desacetilada y liofilizada (designada como prototipo 4).

La membrana de p-GlcNAc totalmente acetilada (prototipo 1) se reabsorbió en un plazo de 21 días, tal como se muestra en las figuras 26A-26C. La membrana de p-GlcNAc parcialmente desacetilada (prototipo 3A) se reabsorbió completamente en un plazo de 14 días, tal como se muestra en las figuras 26D - 26E. La membrana de p-GlcNAc parcialmente desacetilada y liofilizada (prototipo 4) aún no se había reabsorbido completamente tras 21 días después de la implantación.

Los análisis de histopatología mostraron que una vez que el material de p-GlcNAc se hubo reabsorbido, no hubo diferencias histológicas que se pudieran detectar entre las muestras de tejido obtenidas a partir de los animales tratados y de los control.

19. Ejemplo

Estudios de hemostasia de p-GlcNAc

Los experimentos descritos en el presente documento estudian la eficacia de los materiales de p-GlcNAc de la invención para el control de las hemorragias. El éxito de los materiales de p-GlcNAc en controlar hemorragias se comparó, adicionalmente, frente a productos hemostáticos disponibles comercialmente.

19.1 Materiales y métodos

Materiales control y de p-GlcNAc: Se prepararon membranas de p-GlcNAc parcialmente desacetilada (aproximadamente en un 70%) utilizando la técnica de separación química descrita anteriormente en la sección 5.3.2, utilizando ácido fluorhídrico como reactivo químico, y las técnicas descritas anteriormente en la sección 5.4. Se utilizaron dos piezas de 2 cm x 1 cm. Se produjo gel de lactato de p-GlcNAc (lactato de p-GlcNAc al 4%, formulado en propilenglicol y agua) siguiendo los métodos descritos anteriormente en la sección 17.1. El material control utilizado para el estudio de las hemorragias en el bazo y el hígado fue Gelfoam^{MR} (Upjohn Company). Gelfoam^{MR} y Avitene^{MR} (Medchem Products, Inc.) fueron los materiales control utilizados en el estudio de las hemorragias de vasos sanguíneos pequeños.

Animales de prueba: Se utilizaron conejos blancos de Nueva Zelanda. Tres animales recibieron dos heridas en el bazo y una herida en el hígado. Cuatro animales recibieron cinco heridas quirúrgicas en vasos sanguíneos de tamaño similar en el sistema de la arteria mesentérica caudal.

Preparación quirúrgica: Se anestesiaron los animales con ketamina HCl y xilacina. Se pusieron los animales en decúbito supino y se eliminó todo el pelo del abdomen. Entonces, se restregó el abdomen con povidona yodada y alcohol isopropílico al 70% y se tendieron para la cirugía aséptica.

Intervenciones quirúrgicas en hígado / bazo: Se realizó una incisión en la línea media y se extrajo del cuerpo o el bazo o el hígado y se acondicionó con compresas quirúrgicas ("lap sponges") húmedas. Se utilizó un taladro ("cork bore") de 3-4 mm de diámetro para hacer una herida circular de aproximadamente 2 mm de profundidad en un extremo del órgano. Una vez que se extrajo el tejido esplénico, se utilizó una esponja de gasa de 4'' x 4'' pesada previamente para absorber toda la sangre perdida por la herida esplénica durante un periodo de un minuto. La esponja se volvió a pesar para cuantificar la cantidad de sangre perdida por esa herida particular. Entonces, el animal de prueba se trató mediante la aplicación a la herida de uno de los materiales de tratamiento. Se registró el tiempo hasta la hemostasia y la cantidad de sangre perdida antes de la hemostasia.

Tras obtenerse la hemostasia en la primera herida, se realizaron una segunda herida en el bazo y una herida en el hígado siguiendo el mismo procedimiento.

Intervención quirúrgica en vasos sanguíneos pequeños: Se realizó una incisión en la línea media y se extrajo del cuerpo el intestino delgado exponiendo el sistema de la arteria mesentérica caudal. Se acondicionó el intestino con compresas quirúrgicas húmedas y se identificaron cinco vasos sanguíneos de aproximadamente el mismo tamaño. Se utilizó un bisturí para realizar una herida de aproximadamente 1 mm de profundidad en uno de los vasos. Se utilizó una esponja de gasa de 4'' x 4'' pesada previamente para absorber toda la sangre perdida por la herida del vaso durante un periodo de un minuto. La esponja se volvió a pesar para cuantificar la cantidad de sangre perdida por esa herida particular. Entonces, el animal de prueba se trató mediante la aplicación a la herida de uno de los materiales de tratamiento. Se registró el tiempo hasta la hemostasia y la cantidad de sangre perdida antes de la hemostasia.

Tras obtenerse la hemostasia en la primera herida, se realizaron cuatro heridas más siguiendo el mismo procedimiento.

19.2 Resultados

Se probaron los materiales de p-GlcNAc para determinar su capacidad para controlar las hemorragias en el bazo y el hígado de modelos animales de rata. Los materiales de p-GlcNAc probados fueron: 1) p-GlcNAc parcialmente desacetilada (aproximadamente en un 70%); y 2) gel de lactato de p-GlcNAc (lactato de p-GlcNAc al 4%, formulado en propilenglicol y agua). La eficacia de estos materiales de p-GlcNAc se comparó con la de Gelfoam^{MR} (Upjohn Company).

Se probó cada material tres veces (dos veces en el bazo y una vez en el hígado). Ambos materiales basados en p-GlcNAc mostraron eficacia en controlar las hemorragias en el primer minuto tras su aplicación, lo que era comparable con la de Gelfoam^{MR}.

Los materiales basados en p-GlcNAc tienen ventajas adicionales. Específicamente, los materiales de p-GlcNAc no necesitan mantenerse en su sitio durante la intervención, pueden dejarse en el organismo, donde se reabsorberán en el plazo de dos a tres semanas (Gelfoam^{MR} no está indicado para este fin), son compatibles con las intervenciones quirúrgicas tanto generales como mínimamente invasivas.

A continuación, se estudió la eficacia de los materiales basados en p-GlcNAc en el control de hemorragias en vasos sanguíneos pequeños y se comparó frente a productos hemostáticos disponibles comercialmente.

Cada material se probó cinco veces (dos veces en uno de los animales y una vez en los otros tres animales). Las formulaciones de gel y membrana de p-GlcNAc se aplicaron fácilmente al sitio y controlaron la hemorragia en un plazo de 2 minutos. Gelfoam^{MR}, que tiene que mantenerse en su sitio con el fin de realizar su función, consiguió la hemostasia en el mismo intervalo de 2 minutos que los materiales de p-GlcNAc. Avitene^{MR}, un material fibroso fabricado de colágeno, fue difícil de manejar y requirió más de cinco minutos para controlar la hemorragia.

Por tanto, los resultados descritos en el presente documento demuestran que los materiales de p-GlcNAc probados en el presente documento representan agentes hemostáticos convenientes y eficaces.

20. Ejemplo

Sistemas de administración del fármaco de p-GlcNAc

En el presente documento, se describen estudios que demuestran el uso satisfactorio de los materiales de p-GlcNAc para administrar fármacos antitumorales al sitio de los tumores malignos de cáncer de piel y cáncer de colon de tal manera que los fármacos antitumorales administrados muestran un efecto terapéutico sobre los tumores.

20.1 Materiales y métodos Composiciones de administración de fármaco de lactato de p-GlcNAc

Se formularon mezclas de 5'-fluorouracilo (5'-FU) y lactato de p-GlcNAc tal como sigue: se mezclaron 0,5 ml de 5'-FU (50 mg/ml) con 0,5 ml de propilenglicol y se añadieron 2,0 ml de lactato de p-GlcNAc al 4% y se mezclaron. Se produjo el lactato de p-GlcNAc utilizando las técnicas descritas, anteriormente, en la sección. Incluso tras mezclado prolongado, el 5'-FU no se disolvió completamente en el gel de lactato de p-GlcNAc. Suponiendo el mezclado completo, la concentración final de 5'-FU será de 6,25 mg/ml.

Se formularon mezclas de mitomicina (Mito) y lactato de p-GlcNAc tal como sigue: se disolvieron 0,5 mg de Mito (polvo liofilizado) con 5 ml de propilenglicol y se mezclaron 0,5 ml de la disolución de Mito con 0,5 ml de la preparación de lactato de p-GlcNAc al 0,4% de MPT para dar una concentración final de Mito de 0,2 mg/ml y una concentración final de lactato de p-GlcNAc del 2%. Los materiales eran compatibles, disolviéndose Mito fácilmente en el gel de lactato de p-GlcNAc.

Composiciones de administración de 5'-FU en membrana de p-GlcNAc

Se inmovilizaron muestras de 5'-fluorouracilo (5'-FU) en discos de material de membrana de p-GlcNAc pura producida utilizando el método químico de separación descrito anteriormente en la sección 5.3.2, utilizando ácido fluorhídrico como reactivo químico. Cada disco descrito en el presente documento tenía un diámetro de 1,5 cm, tal como se describe en el presente documento.

Para la preparación de discos de dosis alta (DA), se mezclaron 0,64 ml de una disolución de 50 mg/ml de 5'-FU con suspensiones que contenían aproximadamente 8 mg de p-GlcNAc pura. Se dejaron en reposo las mezclas durante varias horas para estimular la absorción de 5'-FU en la p-GlcNAc, y luego se secaron a 55ºC durante 3,5 horas. Los discos de DA resultantes contenían un total de 32 mg de 5'-FU, que es equivalente a aproximadamente el doble de la dosis de 5'-FU total normal del día 14, administrada normalmente a un paciente con cáncer.

Se prepararon discos de p-GlcNAc que contenían dosis bajas (DB) de 5'-FU de la misma manera, excepto en que los discos de DB contenían 17 mg de 5'-FU, una cantidad de equivalente a igual de la dosis humana total normal para un periodo de 14 días, normalizada con respecto al peso de los ratones de experimentación, basado en la dosis normal de 5'-FU por kg de peso corporal en seres humanos.

Animales de prueba: Para el estudio con 5'-FU, se inocularon ratones SCID (con inmunodeficiencia combinada grave) con inyecciones subcutáneas en la ijada de células de cáncer de colon HT-29 (ATCC; 1 x 10^{5} células por inóculo) obtenidas mediante métodos de cultivo tisular habituales, con el fin de producir tumores de cáncer de colon HT-29. Estas inyecciones condujeron a tumores palpables que se recogieron en 14 - 21 días. Se diseccionaron los tumores y se cortó el tejido necrótico. Los tumores de cáncer de colon HT-29 se cortaron en piezas de 3 x 3 x 3 mm.

Los ratones SCID de experimentación se anestesiaron por medio de inyecciones intraperitoneales con una dosis habitual de Avetin y se implantó un corte del tumor de cáncer de colon HT-29 en el ciego de cada ratón. Específicamente, se abrió quirúrgicamente cada ratón para exponer su abdomen y se localizó el ciego, que se cortó con un bisturí para realizar una pequeña incisión. Se suturó el corte del tumor de 3 x 3 x 3 mm sobre la incisión en el ciego utilizando puntos de sutura de seda 5.0. El abdomen se cerró después utilizando grapas de Clay Adams.

Todos los ratones se enjaularon individualmente y se alimentaron durante dos semanas. Todos los ratones estaban sanos y ninguno tenía el colon obstruido al final del periodo de dos semanas.

En el día 14, se anestesió cada ratón y se volvió a abrir su abdomen. Se midieron los tumores en crecimiento (dimensiones horizontales y de longitud). Entonces, se trataron los tumores con el fármaco de p-GlcNAc / antitumoral o se utilizaron como controles.

Se utilizaron seis ratones para el estudio de 5'-Fu en lactato de p-GlcNAc y se usaron 15 ratones para el estudio de 5'-Fu en membrana de p-GlcNAc.

Para el estudio de la mitomicina, se inocularon nueve ratones SCID con inyecciones subcutáneas de células de cáncer de piel de células escamosas A431 (ATCC; 1 x 10^{5} células por inóculo). Se produjeron tumores en todos los ratones en un plazo de 14 días.

Tratamientos: Para el estudio de 5'-FU en lactato de p-GlcNAc, se trataron los animales una vez al día "pintando" la mezcla de gel de p-GlcNAc que contiene el 5'-fluorouracilo (5'-FU) en la zona de la piel sobre la masa tumoral. Se obtuvieron mediciones del tumor diariamente. Los animales control incluyeron animales tratados con p-GlcNAc sola, sin 5'-FU, y animales que no recibieron tratamiento.

Para el estudio de 5'-FU en membrana de p-GlcNAc, se trataron los tumores de colon HT-29 en los ratones SCID implantando quirúrgicamente discos del material de membrana de p-GlcNAc que contiene el fármaco directamente sobre su superficie, tras haber permitido que el tumor creciese en el colon durante 14 días. Se sacrificaron los ratones 14 días tras el procedimiento de implante. Se realizaron mediciones de los volúmenes tumorales inmediatamente antes de implantar las membranas de p-GlcNAc que contienen el fármaco en el día 0 y a la finalización del experimento en el día 14. Los animales control incluyeron los tratados con la membrana de p-GlcNAc sin 5'-FU y los controles que no recibieron ningún tratamiento. Adicionalmente, dos animales recibieron inyecciones sistémicas diarias de 5'-FU en dosis equivalentes a las de los regímenes de DA y DB.

Para el estudio de Mito en lactato de p-GlcNAc, los animales se trataron diariamente como en el estudio de 5'-FU en lactato de p-GlcNAc, tratándose 3 animales con la mezcla que contenía Mito. Además, 3 animales se trataron con p- GlcNAc menos Mito, 2 animales no recibieron ningún tratamiento y 1 animal recibió propilenglicol.

20.2 Resultados 20.2.1 5'-FU en lactato de p-GlcNAc

Se llevaron a cabo los experimentos diseñados para estudiar el efecto de los sistemas de administración de fármaco de 5'-FU en lactato de p-GlcNAc sobre el tamaño del tumor, tal como se describió anteriormente, en la sección 20.1.

Se midieron las dimensiones de longitud y anchura mayores para cada tumor y se calculó el área de la sección transversal utilizando estas dimensiones. Los valores del área de la sección transversal se muestran en la tabla X, a continuación.

TABLA X

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En las figuras 27 - 28, se muestran los datos que comparan los animales tratados con 5'-FU en lactato de p-GlcNAc con los controles. Los datos se resumen en la tabla X y las figuras 27 - 28 indican claramente que los tumores subcutáneos HT-29 en las ratas tratadas con los geles de lactato de p-GlcNAc que contienen 5'-FU tienen una tasa de crecimiento significativamente retardada en comparación con los controles. Su crecimiento se ha ralentizado 2,5 veces en comparación con los controles de gel de lactato de p-GlcNAc y 4 veces en comparación con los controles sin tratamiento.

20.2.2 Mito en lactato de p-GlcNAc

También se llevaron a cabo experimentos diseñados para estudiar el efecto de los sistemas de administración de fármaco de 5'-FU en lactato de p-GlcNAc sobre el tamaño del tumor, tal como se describió anteriormente, en la sección 20.1.

Se midieron las dimensiones de longitud y anchura mayores para cada tumor y se calculó el área de la sección transversal utilizando estas dimensiones. Los valores del área de la sección transversal se muestran en la tabla XI, a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA XI

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En las figuras 29 - 30, se muestran los datos que comparan los animales tratados con Mito en lactato de p-GlcNAc con los controles. Los datos se resumen en la tabla XI y las figuras 29 - 30 indican claramente que los tumores que crecen en las ratas tratadas con los geles de lactato de p-GlcNAc que contienen mitomicina tienen una tasa de crecimiento significativamente retardada. Su crecimiento se ha ralentizado 4 veces en comparación con los controles de gel de lactato de p-GlcNAc y 4 veces en comparación con los controles sin tratamiento.

20.2.3 5'FU en membrana de p-GlcNAc

A continuación, se llevaron a cabo los experimentos diseñados para estudiar el efecto de los sistemas de administración de fármaco de 5'-FU en membrana de p-GlcNAc sobre el tamaño del tumor de cáncer de piel, tal como se describió anteriormente, en la sección 20.1.

Los datos del volumen tumoral obtenidos durante el estudio, incluyendo el cambio en porcentaje del volumen producido por los diferentes tratamientos, se resumen en la tabla XII, a continuación. Se supuso que los tumores eran de forma cilíndrica. Sus volúmenes se determinaron midiendo su anchura y longitud, y utilizando la siguientes ecuación: V = \pir^{2}l, donde el radio r es 0,5 veces la anchura y l es la longitud.

33

34

La figura 31 resume una parte de los datos presentados anteriormente en la tabla XII. Tal como se muestra en la figura 31, los datos indican fuertemente que los tumores tratados con las membranas de p-GlcNAc que contienen 5'-FU en la dosis alta (DA) han detenido el crecimiento y, en todos los casos, se han hecho realmente más pequeños. Los materiales poliméricos de dosis baja (DB) dieron como resultado la estabilidad de la enfermedad y una ligera disminución del tamaño del tumor. Por el contrario, los tumores de los animales control continuaron aumentando rápidamente de tamaño. Es interesante observar que dos de los tres animales control tratados por vía i.v. murieron durante el estudio, lo que indica que la administración sistémica de la cantidad equivalente de 5'-FU es letal, mientras que la administración específica al sitio por medio del polímero de p-GlcNAc es eficaz en librar al animal de la enfermedad.

20.3 Conclusión

Los datos presentados en esta sección indican fuertemente que la administración específica al sitio de los fármacos antitumorales tiene un efecto positivo retrasando y revirtiendo el crecimiento tumoral. Se obtuvieron resultados satisfactorios utilizando las composiciones de administración de fármaco de p-GlcNAc producidas, que tienen dos formulaciones diferentes, concretamente, formulaciones de lactato de p-GlcNAc y de membrana de p-GlcNAc. Además, se obtuvieron resultados satisfactorios utilizando dos fármacos antitumorales diferentes, 5'-FU y Mito. Por tanto, los sistemas de administración de fármaco de p-GlcNAc de la invención muestran actividad antitumoral, útil por ejemplo, en la administración de fármacos específicamente al sitio de las células tumorales de interés.

Es evidente que pueden realizarse muchas modificaciones y variaciones de esta invención tal como se expone en el presente documento, sin apartarse del espíritu y el alcance de la misma. Las realizaciones específicas descritas anteriormente se facilitan únicamente a modo de ejemplo y la invención sólo está limitada por las condiciones de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Método para aislar poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina que comprende de 4.000 a 150.000 monosacáridos de N-acetilglucosamina unidos covalentemente en una conformación \beta-1\rightarrow4 y que tiene un peso molecular de 800.000 dalton a 30 millones de dalton, que comprende:

(a): cultivar una microalga que comprende un cuerpo celular y una fibra de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina, produciendo así un cultivo celular de microalgas;

(b): tratar el cultivo celular de microalgas de la etapa (a) con un agente químico que pueda debilitar la célula de la microalga a una concentración que no afecte a los cuerpos celulares durante un tiempo suficiente, de modo que la fibra de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina se libere de los cuerpos celulares, en el que dicho agente químico es ácido fluorhídrico en una concentración final de aproximadamente 0,07 M;

(c): segregar las fibras de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina desde los cuerpos celulares.

2. Método para aislar poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina que comprende de 4.000 a 150.000 monosacáridos de N-acetilglucosamina unidos covalentemente en una conformación \beta-1\rightarrow4 y que tiene un peso molecular de 800.000 dalton a 30 millones de dalton, que comprende:

(b): tratar el cultivo celular de microalgas de la etapa (a) con un agente biológico que pueda inhibir la síntesis de la fibra de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina durante un tiempo suficiente, de modo que la fibra de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina se libere de los cuerpos celulares, en el que dicho agente biológico es polioxina-D;

3. Método según la reivindicación 1, que comprende además tras la etapa (c): (d) eliminar toda la proteína, sustancialmente todos los demás contaminantes orgánicos y sustancialmente todos los contaminantes inorgánicos de la fibra de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina segregada, de modo que se aísle la especie de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina.

4. Método según la reivindicación 2, que comprende además tras la etapa (c): (d) eliminar toda la proteína, sustancialmente todos los demás contaminantes orgánicos y sustancialmente todos los contaminantes inorgánicos de la fibra de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina segregada, de modo que se aísle la especie de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en el que la microalga es una diatomea.

6. Método según la reivindicación 5, en el que la diatomea es del género Thalassiosira.

7. Método según la reivindicación 6, en el que la diatomea del género Thalassiosira es Thalassiosira fluviatilis o Thalassiosira weissflogi.

8. Método según la reivindicación 3, que comprende además neutralizar la fibra de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina segregada antes de la etapa (d).

9. Método según la reivindicación 3 ó 4, que comprende además tras la etapa (d): (e) poner la especie de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina aislada en un entorno de pH básico.

10. Método según la reivindicación 9, que comprende además:

(f): añadir un fármaco a la especie de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina aislada de modo que el fármaco y la especie estén en un entorno de pH básico; y

(g): disminuir el pH del entorno de pH básico, de modo que el fármaco se encapsule dentro de la especie de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, en el que la poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina aislada comprende de 4.000 a 15.000 monosacáridos de N-acetilglucosamina unidos covalentemente en una conformación \beta-1\rightarrow4 y que tiene de 800.000 a 3 millones de dalton.

12. Método según la reivindicación 1 ó 2, que comprende tras la etapa (c) una etapa de desacetilación adicional, tratando la p-GlcNAc obtenida en la etapa (c) con una base o una enzima desacetilasa.

13. Método según la reivindicación 12, en el que se ha desacetilado al menos un monosacárido de N-acetilglucosamina.

14. Método según la reivindicación 12 ó 13, en el que se han desacetilado al menos de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 75% de los monosacáridos de N-acetilglucosamina.

15. Método según la reivindicación 12, 13 ó 14, en el que se han desacetilado al menos aproximadamente el 70% de los monosacáridos de N-acetilglucosamina.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 - 15, en el que la especie desacetilada comprende de 4.000 a 150.000 monosacáridos de glucosamina unidos covalentemente en una conformación \beta-1\rightarrow4 y que tiene un peso molecular de 640.000 a 24 millones de dalton.

17. Método según la reivindicación 16, en el que la especie desacetilada comprende de 4.000 a 150.000 monosacáridos de glucosamina unidos covalentemente en una conformación \beta-1\rightarrow4, que tiene un peso molecular de 640.000 a 2,4 millones de dalton.

18. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la especie de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina de la microalga que se puede obtener mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 11, comprendiendo dicha especie de 4.000 a 150.000 monosacáridos de N-acetilglucosamina unidos covalentemente en una conformación \beta-1\rightarrow4, libre de proteína, sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos, y que tiene un peso molecular de 800.000 dalton a 30 millones de dalton y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Composición farmacéutica según la reivindicación 18, en la que la poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina de la microalga procede de una diatomea.

20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19, en la que la diatomea es del género Thalassiosira.

21. Composición farmacéutica según la reivindicación 20, en la que la diatomea del género Thalassiosira es Thalassiosira fluviatilis o Thalassiosira weissflogi.

22. Uso de la especie de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina de la microalga que se puede obtener mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 11, comprendiendo dicha especie de 4.000 a 150.000 monosacáridos de N-acetilglucosamina unidos covalentemente en una conformación \beta-1\rightarrow4, libre de proteína, sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos, y que tiene un peso molecular de 800.000 dalton a 30 millones de dalton para la preparación de una composición farmacéutica adecuada para estimular la hemostasia.

23. Uso según la reivindicación 22, en el que la poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina de la microalga procede de una diatomea.

24. Uso según la reivindicación 23, en el que la diatomea es del género Thalassiosira.

25. Uso según la reivindicación 24, en el que la diatomea del género Thalassiosira es Thalassiosira fluviatilis o Thalassiosira weissflogi.

26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 22 - 25, en el que la forma o configuración de la composición farmacéutica es un gel, esponja o membrana.

27. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco y la especie de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina de la microalga que se puede obtener mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 11, comprendiendo dicha especie de 4.000 a 150.000 monosacáridos de N-acetilglucosamina unidos covalentemente en una conformación \beta-1\rightarrow4, libre de proteína, libre de proteína, sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos, y que tiene un peso molecular de 800.000 dalton a 30 millones de dalton como vehículo farmacéuticamente aceptable.

28. Composición farmacéutica según la reivindicación 27, en la que la poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina de la microalga procede de una diatomea.

29. Composición farmacéutica según la reivindicación 28, en la que la diatomea es del género Thalassiosira.

30. Composición farmacéutica según la reivindicación 29, en la que la diatomea del género Thalassiosira es Thalassiosira fluviatilis o Thalassiosira weissflogi.

31. Especie de poli-\beta-1\rightarrow4-N-acetilglucosamina aislada que se puede obtener mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 11, comprendiendo dicha especie de 4.000 a 150.000 monosacáridos de N-acetilglucosamina unidos covalentemente en una conformación \beta-1\rightarrow4, libre de proteína, sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos, y que tiene un peso molecular de 800.000 dalton a 30 millones de dalton, en la que la especie es una especie de lactato de poli-\beta-1\rightarrow4-glucosamina.

32. Especie de poli-\beta-1\rightarrow4-N-glucosamina aislada que se puede obtener mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 12 - 16, comprendiendo dicha especie de 4.000 a 150.000 monosacáridos de glucosamina unidos covalentemente en una conformación \beta-1\rightarrow4, libre de proteína, sustancialmente libre de otros contaminantes orgánicos, sustancialmente libre de contaminantes inorgánicos, y que tiene un peso molecular de 640.000 dalton a 24 millones de dalton, en la que la especie es una especie de lactato de poli-\beta-1\rightarrow4-glucosamina.

33. Uso de la especie según la reivindicación 31 ó 32, para preparar una preparación para reducir las adherencias posquirúrgicas.