TW458987B

TW458987B - Poly-β-1→4-N-acetylglucosamine

Info

Publication number: TW458987B
Application number: TW083111374A
Authority: TW
Inventors: John N Vournakis; Sergio Finkielsztein; Ernest R Pariser; Mike Helton
Original assignee: Marinepolymer Tech Inc
Priority date: 1993-12-01
Filing date: 1995-02-28
Publication date: 2001-10-11
Also published as: JP2009079223A; JPH09506126A; DE69433692D1; DE69433692T2; JP3993633B2; AU695850B2; ATE263785T1; IL111825A0; EP0731812A4; CA2177823C; CN1142833A; JP2004211101A; ES2219659T3; PT731812E; EP0731812B1; EP1452546A3; EP1452546A2; CN1142833B; EP0731812A1; DK0731812T3

Description

經濟部中央橾隼局員工消費合作社印製 458987 A7 B7 五、發明説明（1 ) 1 .前言本發明係有闞一棰純化、易產生之多- e- W4-N-乙豳基葡萄糖胺（？-01〇“{；)多_類。本發明之p-GIcNAc係一種高分子量之聚合物 > 其成分單_糖類係M/S-1—4構形連結|及其不含蛋白質和完全不含單一胺基酸及其他有機和無機污染物。此外，亦描述p-GIcNAc之衍生物和再調配物。本發明進一步係有關自微薄*較佳地矽藻起始原純化本發明之P-GicNAc之方法。再進一步地*本發明係有關衍生化和再調配P-GIcN Ac之方法。附加地，本發明係有闞純 p-GlcNAc、其衍生物和/或其再調配物之用途。 2，發明背骨目前存在有多_類之特性、活性及用途之廣泛文獻，其部分包括p-GIcNAc。如此之物質類通常係稱為”幾丁質”，而去乙醢化幾丁質衍生物已稱為” _丁聚糖”。當此些名詞在約1823年第一次使用時•一般相信幾丁質和幾丁聚糖在自然中R胆顳、明ffi、獨特及不變之化學形式存在，且幾丁質係全乙醯化的及幾丁聚糖係全去乙醸化之姐成。約一世紀後•然而卻發琨”幾丁質”和‘'幾丁聚糖”名詞事實上係不明確的。與其指稱明確之化合物，此些名詞事宵上倒不如指稱一群展現廣泛不同物理和化學性質之化合物。此些差異係因為產物之不同分子最、不同乙藤化程度及污染物之存在•如共價结合，種特定蛋白質之單一胺基酸及無機污染物。甚至目前”幾丁質”和”幾丁聚糖”名詞仍不明確地使用及實際上係指不明確之許多不同化合物之混合物。 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ί ^ 裝訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 458987 A7 _B7___ 五、發明説明（2) 例如，自一般來源如甲妓顧外般和i菌之菌絲硬结分餹之”幾丁質“之性霣係不可預澜地不同。如此之變異係由於不僅種類不同，而且不同之環堍和季酣作用*其決定”幾丁質”產生種類之一些生化特性。事賁上，原料之不可預測之變異性則大大地造成嫌丁質基質之工業之緩慢成長。目前在科學文獻中並無存在之報告描述纯、f石里Jb P-G丨cNAc，即未由有櫬或無櫬不純物污染之產物·自物質源之分離和產生。然而McLachlan等人（KeLachlan等人· 1 965，Can, J. Botany ϋ:707-71 3)報導嫌丁質之分離，其後之研究巳顯示所得之”鈍”物質·事實上含蛋白質及其他污染物。 Μ濟部中央標準局員工消费合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 去乙齙化及部份去乙醚化幾丁質製備物展現潛在有益之化學性宵•如高反應性、密賜離子電荷、有效之金靨螯合性、與蛋白質共價埋結之能力及在許多水性溶劑中之溶解性。然而•如上述地，此些製備物之不可預澜變異性«重限制此些異質化合物之用途。例如，目前可獲得之”幾丁質"和"嫌丁聚糖”在實驗结果中造成不可再現之數據和不可接受之廣變異性。此外，可獲得之製備物並不足夠地均筲或純 > 及製備物成分對此些製備物並不足夠地再現，以可接受作為實施*特別地《藥實豳之用途。因此，雖然極裔要一棰純的，純化之幾丁質和嫌丁聚埔之製備物，其性宵係高度再現及其係易於製造的，但是目前並不存在。 3.發明簡要本發明係有關一種分離、易產生之純Ρ-GlcN Ac物質。本 -5 _ 本紙张尺度適用中國國家橾率（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 45 898 7 經濟部中央標华局員工消費合作杜印^ A7 B7 五、發明説明（3 ) 發明之Ρ-G丨cNAc係一棰高分子量聚合物·其成分單醣係Μ /3-104構形連結*及其不含蛋白質，完全不含其他有機污染物和完全不含無機污染物。本發明之重要性事實上肄於已卑服不可預測原料變異性之問題。此係第一次藉簡單方法及在商業規模下*可能地產生在生物《學上純之高分子量和一致性質之P-G丨cN Ac。在本發明上所產生之物質係高度结晶的及係自小心控制、無菌之多數水生微薄之一，較佳地微蒲之無菌培養液產生，其已在合成培養基中生長。本發明進一步描述p-GIcNAc之衍生物和再調配物Μ及產生如此衍生物和再調配物之方法。如此之衍生化反應可包> 括，但不限於聚葡萄糖胺和其衍生物及如此之再調配物可包括，但不限於膜、纖铩、非編嫌之嫌物和海綿。再進一步地，本發明係有藺自微薄·較佳地矽薄來源純化本發明之P-GlcN Ac之方法。附加地·本發明係有閹純化之 P-G IcNAc、其衍生物和/或其再調配物之用途。在此些用途中包括新頚之商業應用，相關於如此工業如生物K學、槩學及化杻品工業，其所有皆箱求最高純度之起始物。 4.圓之_要說明圖11〇〇!1；0-〇1〇}</^之化學结構。”^’係指自約4.〇〇〇至約150.000範圍之整敝，而以約4,000至約15.000較佳〇圓2 P-GUN Ac之醣分析*氣相層析法-質譜法數據。實心方塊代表使用如在K下5.3.2節中所述之化學/生物方本紙張尺度適用中國國家標丰（CNS > Α4規格（2丨0 X 297公釐） vn flfl^^li mu ^^^^1 ^^1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 45 898 7 A7 B7 五、發明説明（4 ) 法之酸處理/中和化變法純化之P-G丨cHAc。圖3A純p-G丨cNAc固體膜之循環兩向色性。圖3B去乙釀化p-GlcNAc固體_之循環兩向色性。在純 ρ-GlcNAc(圖3A)中所覼察211毫微米最小值和195毫微米最大值之消失指出使用在如以下5.4節中所述之條件之完全去乙醢化。圖4A上圖由機械力純化方法及下圖由化學/生物純化方法製備之純矽藻Ρ-GlcNAc薄膜之紅外線光譜分析。圖4B兩棰商業”幾丁質”製備物根撺在Μ下5.5節中詳述之方法鏞成膜之紅外線光譜分析。圖4(：純口-01(；^(：之紅外線光譜分析*其根據在以下5.4 節中詳述之方法由熱變性（上圖）和由化學去乙醯化（下圖）修飾。圖 4 0 自砂薄（Thai lasiosira f 1 u v i a t i 1 is )使用如在 M 下5.3.2節中詳述之化學/生物純化方法衍生之 Ρ-GlcNAc硬结之紅外線光譜分析。圖4E由如在Μ下5 . 3 . 1節中所述之機械力純化方法，接著高壓蒸氣處理製備之Ρ-GlcNAc硬结之紅外線光譜分析。圖5A使用如在Μ下5.3.2節中所述之化學/生物純化方法純化之Ρ-GlcNAc之NMR分析。圖表描述峰振幅、囿積及相對於參比控制姐之比值Μ及峰在缌面積中之比值。圖5Β使用如在Μ下5.3.2節中所述之化學/生物純化方法純化之Ρ-GlcNAc之NMR分析。柱形圖描述峰在缌面積中之比值。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） ---------------ΐτ------^ (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4b 8^8 7 A7 B7 五、發明説明（5 ) 圖6由如在Μ下5.3.1節中所述之楗械力純化方法製備之P-G丨cHAc硬結之穿透電子顦微照Η(ΤΕΜ)。放大：上圖 ,4190χ ;下圈，16,250χ。圖7由如在Μ下5,3,2節中在化學/生物純化方法之討論中所述之HP慮理之p-GIcH Ac硬结之穿透電子顯微照片（ TEM)。放大：上圖，5270χί 下圖，8150x。圓8由在以下5.3.2節中所述之化學/生物純化方法之酸處理/中和化變法製備之p-GIcHAc硬結之穿透罨子顥微照片（TEM)。放大：上 5270x;下圖，I 6,700x 。國9 A描述由在以下5,3.2節中所述之化學/生物鈍化方法之酸處理/中和化變法製備之p-GlcNAc硬结之掃描馕子顯微照Η。畋大：200χ。圖9Β描述由在以下5.3.2節中所述之化學/生物純化方法之酸處理/中和化變法製備之P-GlcNAc硬结之掃描翟子願微照片。敗大：1 000 X。圄9C描述由在Μ下5.3.2節中所述之化學/生物純化方經濟部中央標準局員工消費合作社印策 ---------^— c請先閱讀背面之注項再填寫本頁) 旅法之酸處理/中和化變法製備之p-GlcNAc硬結之掃描電子顧微照Η。放大：5000χ。圖9D描述由在以下5,3.2節中所述之化學/生物純化方法之酸處理/中和化變法製備之p-GIcNAc硬結之掃描電子顯微照片。 ~ 8 - 本紙張尺度適用中國國家標华（CNS ) A4規格（2IOX297公楚）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 458987 A7 B7 五、發明説明（6 ) 放大：10 , OOOx。圖9E描述由在以下5.3.2節中所述之化學/生物純化方法之酸處理/中和化變法製備之p-GlcNAc硬結之掃描電子顯微照片。放大：20, OOOx。圖10純p-GlcNAc硬结之掃描電子顯微照片，其自材料製備，其最初係使用在Μ下5.3節中所述之细胞溶解/中和化鈍化方法產生，溶於二甲基乙醢胺/氧化鋰及如在Μ下 5.5節中所迷地再在。0中沉澱成硬结。放大：上圖： 1 0 0 0){，下圖 1 0 , 0 0 0 X 。圖11去乙醚化P-GlcNAc硬结之掃描電子顯微照Η。放大 :上圖，1000X,下圖：10,OOOx 。圖12矽薄之照Η。記述著自矽藻钿胞體延伸之P-G I cNAc纖維。圈13描述本發明之一些可能之p-GIcNAc和去乙S化p-GlcNAc衍生物之圖式。（改编自S. Hirano,”幾丁質和幾丁聚耱在曰本之產生和應用"，在"幾丁筲和幾丁聚糖”中，1989, Skjak-Braek, Anthonsen和 Sanford, eds. Elsevier科學出版公司，pp. 37-43)。圖14细胞在p-GlcNAc膜之存在或不存在下生長之细胞生存能力研究。賁心圓（·）：在P-GlcNAc基質上生長之细胞 ;空心圃（。）：在無基質存在下生長之细胞。圖15較形小鼠纖維母细胞在p-GIcNAc膜上生長之SEM顯微照Η。放大：上圖，ΙΟΟΟχ;下圃，3000χ。 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2tOX297公釐） ----------‘裝------訂------線 (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) 458987 經濟部中央標隼局貝工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（7 ) 圖16A根撺在Μ下13.1節中所述之方法製備之僅有驂原蛋白之控制姐物質之掃描霉子顯微照片（SEM)。放大 1 0 0 X ° 圖16Β根據在以下13.1節中所述之方法製備之膠原蛋白 /p-GUHAc混成物質之掃描電子顙微照H(SEM)。膠原蛋白懸浮液：p-G1cN Ac懸浮液之比值等於3:1 *而具75毫克 /毫升膠原和0.07毫克/奄升P-G丨cN Ac之最终濃度。放大 1 0 0 X 〇豳16C根據在Μ下13.1節中所述之方法製備之膠原蛋白 /p-GUNAc混成物質之掃描電子顯微照片（SEM)。膠原蛋白懸浮液：p-G IcN Ac懸浮液之比值等於1 : 1 ，而具50毫克 /毫升瞎原和0.12毫克/毫升P-GlcNAc之最終溏度。放大 1 0 0 X 〇圖16D根據在Μ下13.1節中所述之方法製備之膠原蛋白 /p-GUNAc混成物質之掃描電子顯微照H (SEH)。膠原蛋白懸浮液：p-G1cNAc懸浮液之比值等於2:2 ，而具1〇.〇毫克/奄升穋原和0.25毫克/毫升p-GIcNAc之最終澹度。放大 1 0 0 X 〇圈16E根據在Μ下13.1節中所述之方法製備之膠原蛋白 /p-GUNAc混成物質之掃描電子顯微照H (SEM) 。_原蛋白懸浮液：p-GlcN Ac懸浮液之比值等於1:3 ，而具2.5毫克/奄升膠原和0.25毫克/毫升p-GIcHAc之最終濃度。放大 10 0 X。圈17A在以上圖16A之僅有膠原蛋白之控制姐物質中培 -1 0 - 本紙張度適用中國國家榡率（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------^------ΐτ------^ I i (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 458987 A7 B7 五、發明説明（8 ) 養之小® 3T3纖維母佃豳之SEM 。放大ΙΟΟχ。圖17B在V上圈I16B之穋原蛋白/ p-G1cNAc物質中培驀之小鼠3T3嫌維母细胞之SEH 。放大100X。圖17C在以上晒16C之膠原蛋白/ p-G丨cNAc物質中培養之小鼠3T3纖維母细胞之SEM 。放大ΙΟΟχ。圖17D在Μ上晒16D之膠原蛋白/ p-G丨cNAc物質中掊養之小鼠3T3纖維母细胞之SEM 。放大ΙΟΟχ。 5,益明之詳捆說明 Μ下所呈現者首先係本發明之丨cHAc類、p-GlcM Ac衍生物和其再調配物之物理特性描述。接著，描述自微薄•較佳地矽薄起始源純化本發明之Ρ-G丨cH Ac之方法。第三，呈規P-G丨cKAc之衍生物和再調配物及產生如此衍生物和再調配物之方法。最後，圼琨本發明之P-G丨cNAc、 p-GlcNAc衍生物和/或p-G1cNAc再調S物之用途。 5.1p-G1κ N A c 經濟部中夬標隼局貝工消費合作社印裝 (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之9-0丨〇^<虹多_類係自約800,000道耳吞至約3 千萬道耳吞之平均重曇範圍之高分子量之聚合物，根據膠 «滲透層析法之測定。如此之分子量範圍代表p-GIcNAc具約4,000至約1 50.000届M/3-1— 4構肜連结之N-乙醯基葡萄糖胺單黼，而W約4,000至約15.000涸N-乙醯基葡萄糖胺單釀係較佳者（BU。本發明之P-GlcNAc之雯異.性低及其純度很高，其兩者皆由化學和物理櫟準証明。其中係化學姐成和非多Μ污染物。首先，p-GlcNAc使用阐種不同純化方法，其兩者皆在 -11- 本紙張尺度遑用中國國家梯隼（CNS ) A4优格（210X297公釐） 45 898 7 A7 B7 i、發明説明（9 ) 經濟部中央橾牟局員工消費合作社印製以下5.3節中描述’所得之化學姐成數據係在以下表I中 _示。如可見地，由兩種方法所得之P_GlcNAc之化學姐成在寘驗僑差界限内係與P-G丨cHAc之式姐成栢同。第二，亦顯示在表I中者係所產生之p-GUAc不含可檢出之蛋白質污染物、完全不含其他有櫬污染物如游離胺基酸及完全不含無機污染物如及分和金臛離子（本發明之P-G1CNAC可含多至約0.05«之微量金觸再者，本發明之P_G1CNA(^ 琨較低之结合水。表 I 化璺分析Bf埔（亩1X1— _ d-ΠΙπΝΑρ之理論值一^ 碳- 47.29 氫- 6.40 氮- 6.89 氧- 39.41 蛋白質- 0.00 存D-GlcHAt>確结上之窗驗數據： (每種硬结型態之實驗批數係大於30次> 機械方法 fb mjMM- 常態化1 s；偏差常態化 TUi 娘氫氮氧 47.21±〇.〇8 -0.17 47.31± 0 6.45 ± 0.08 +0.78 6.34 ± 0 6. 97±0.1δ +0.87 6. 94士0 39 . 55 ± 0.36 +0.36 39 . 41 ± 0 12 本紙浪尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------,神衣------1T-------旅 (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 方法_

S1偏差 08 16 1〇 + 0.04 -0. 94 + 0.73 0,00 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 4 b B y b 7 A7 ______B7_ 五、發明説明（10 ) 平均值 _平均值蛋白質 0.00 0.〇〇灰分 1.30 0.98 水分 2.0 1 . 2 1原分析數據經常態化以計算樣品之灰分和水分含量。本發明之純p-GIcNAc展現完全輿在圖2中所示者相同之醣類分析縱切面。本發明純p-GlcNAc之基本單釀係N_乙雜基葡萄糖胺。再者，本發明之純p-G1cNAc並不含單_葡萄糖胺。本發明之p-GlcNAc之循環兩向色性（CD)和尖銳紅外線光 _( I R)係分別顯示在圖3 A及ffl 4 A和4 D中，其代表使用在>乂下5.3節中所述之方法所得物質之分析。如此物理數據確証本發明之p-GIcH Ac係高純度及结晶性。用Μ獲得CD和 IR數據之方法係在以下第6節中之工作霣施例中描述。本發明之純p-GIcNAc之NMR分析展現與在園5A和5B中所見完全相同之型態。如此型態指出不僅與本發明 P-G丨cNAc-·致地為全乙醯化聚合物，而且在P-GlcNAc内展琨缺乏污染之有機物。本發明p-GUNAc之雷子顗微照相结構，如使用在Μ下 5.3節中所述之方法產生者及在以下第8和9節中所示之工作實施例中所展現者*係在圈6至國9Ε中描逑。本發明之P-GlcN Ac展規高度之生物相容性。生物相容性 -13- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS > A4現格（210X297公釐） ----------^------tr------ ^ (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 45 B9S 7 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 _B7_五、發明説明（11 ) 可由多種技術決定，包括但不限於如此之程序如溶析試驗、肌肉内移植或皮内或系统注射至動物倨體内。簡言之· 溶析試驗（美 Η P h a「a m c 〇 p e i a X X I I , 1 9 9 0 , p p . 1 4 1 5- l 4 9 7 ; 美國 P h a r a n c 〇 p e i a X X I I , 1 9 9 1 , 補充 5 , p p . 2 7 0 2- 270 3)係設計M評估測試物體萃取物之生物相容性及分析培赛之哺乳妞胞線之生物反應性*其對測試物賴反應而對可萃取细胞毐性钧膀（例如L929细胞線）敏感。在以下第 10節所示之工作實施例展規本發明之p-GlcNAc之高生物相容性。 5 _ ?畜牛d-GIpNAh淋aiiS之方法 5.2.1 D-filnHAp 之激皤葙本發明之P-GlcNAc係由及可自微薄，較佳地矽阑產生及純化。一些《和在如此屬中之許多種之矽涵可作為 ρ-GlcNAc起始源。各矽藻產生由p-GlcHAc姐成之嫌維，其自其妞胞體外延。見圄12之如此矽藻之相Η。可用為產生本發明之p-G1cN Ac之起始源矽薄包栝，但不限於 CoscinodiscusB、Cy c 1。t e ί i a 鼷和 Thai lass i_osi B 之成員，但以ThallassiosiraM為較佳。在CoscinodiscusB中》可用以產生本發明之P-GlcHAc之矽蛹種包括，但不限於c 〇 n c LiLruLa.和c ajLLa_Lu_£L種。在Cvclotel IaB中，可用之矽藻包括但不限於cajs^l^， c r V p t i i! a和醒eneqhiniaina播。可用為產生本發明 p-GlcNAc之起始物之Thalassiosira砂薄包括，但不限於 nitzschoicles. a pa t i v a 1 i s . a n t a r c t i c a_, decioherts. -14- ---------ά------ir------旅 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X297公麈） 4b 8^8 7 A7 B7 五、發明説明（12 ) in n -- - ί I- 1^1 In . 1^1 (請先聞讀背面之注意事項再填鸡本萸) eccentrica. f 1 o r i d a n a . fluviatilis. gravida. ku i 1 l.ard i.丄,h ya 1 i na . i n i aa，ilordens.k-i.Qld-LL, 〇 c e a η ί π a . do I vrhorda. pseudonanq . 「o t ii 1 a · t u b i f e r a . t u m i d a f D weissfiotti ilt * 且 M fluviatil ip 军 n w e i s s f 1 o g i >棰為較佳。如上述之矽薄可例如自畢格洛（Bigelow)海洋科學菌棰收集中心、海洋浮游植物收集中心（Mckown Point.西攤灣港（West Boothbay Harbo「，緬因州 04575)獲得。 5.2. 2牛再砍蘧夕方法 4 經濟部中央標準局負工消費合作社印製

任何在5.2.1節中所述之矽薄可由例如利用本節所迷2 方法生長。新矽薄培養物在無菌狀態下以一部分成热培赛矽薄接種至營養培赛基開始。營餐培養基必須不含所有其他微生物，因此所有物質，包括在製備營養培養基中所用之水、有機姐成和無桷姐成必須是無菌的。此外，強制志，在此搡作中涉及之所有程序在K格無菌吠態下進行· gP 所有容器，自一容器至另一容器之所有轉移物質等必須在無菌之瑁境中進行。一次製備之營養培養基量應不超過必須開始新培養物之量。例如，佔有約1平方英呎表面之 Fernbachm瓶可作為矽薄培着物之容器及如此之容器裔要 1升營養培養基作為矽薄生物之最理生長。營養培養基之製備渉及以下之操作： a)海水之獲取和處理 1)>蒸讅和去離子水之製備 c)初级營養母液之製備 -1 5 _ 本紙張尺度通用中國两家標丰（CNS ) A4规格（210X297公釐） M濟部中央標準局員工消費合作社印製 45 898 7 A7 B7 五、發明説明（13 ) d)營養工作母液之製備 e>終營養培養基之製備過®之海水可例如自海洋生物實驗室（Woods Ho le , Μ 卅）獲得。海水容器應貯於51C。當需要時，所霈之水量可自Buchne「過濾單元*使用具0.45微米孔大小之硝基纖維素濾瞑（Mill ipore公司）過》。海水然後由高壓滅菌，例如在121C下每升殺菌15分。在殺菌過程完成時•較佳地*由較移至能允許溶液到達約5C之溫度之冷室中|迅速地冷卻加蓋容器。當其在使用時，溶液允許到逹室溫。自來水使用標準設備及程序蒸餾及去離子化，和收集及貯存無菌、安全蓋緊，較佳地玻璃容器中。 Μ下所列係可依循以製備營養培養基製備所需之母液之配方。當然地•雖然如此配方係用為指引*有意地，如此配方之例行赛異•其»因於製備能維持微蒲矽薄生長 > 足夠上述p-GlcN Ac製備過程之營養培養基，亦在本發明之範疇。 I .徹量金腸初鈒母液（THPS) a. 39奄莫耳濾度CuS〇4* 5H2〇(碲酸飼[II]五水和物 > (9.8克硫酸飼[II]/升） 1>,7.5毫莫耳濃度2以〇4.71120(碕酸鋅七水和物）（22 克硫酸鋅/升> c, 42毫舆耳濃度CoCU. 6H20(氯化鈷[ΙΠ六水和物 )(1 0克氛化鈷[I I ] /升） d. 91奄莫耳濃度MnCU.4H2〇(氯化錳[II]四水和物 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2I0X 297公釐） ---------d------ir------.^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4b 8bB 7 A7 B7 五、發明説明（14 ) Μ 18克氯化錳[I]/升） e. 26奄莫耳濃度NaMo〇4‘ 2H2〇(鉬酸納二水和物） 6.3克鉬酸納/升） €.153.5毫莫耳濃度（1256〇3(亞硒酸）（12.9克亞硒酸/ 升）。各營養物Μ不大於0.2毫米孔大小之滹紙無菌過®。 11 _維牛表初纽扭液（VPS) a, 1毫克/毫升維生素Β12 b. 0.1毫克/毫升生物素兩母液Μ不大於0.2毫米孔大小之®紙無菌過濾。 Ε .納H Τ作扭液（SSWS > a. 硝酸納工作母液：0.88莫耳灃度（75克NaN03/升）。 b. 磷酸納單馥單水和物工作母液：36. 2毫舆耳濃度 NaH3P〇4 · H2〇 (5 克 NaH2P(U · H20/升） c. 偏矽酸納九水和物工作母液：0.11莫耳濃度NaSi03· 9H2〇 (30克 NaS i03 · 9H20/升）各SSWSM不大於0.2毫米孔大小之滤紙無菌過濾。 IV .徹罱金臑丁作B液（TMWS > 11.7毫奠耳濃度^2£0下6(伸乙二胺四乙酸，二納鹽二水和物）（4.36克/升） 11.7毫舆耳澹度FeCU· 6H2〇(氯化锇[m ]六水和物） (3 · 15克 /升）上列之6棰初级微量金屬母液各1毫升/升。 Μ不大於0.2毫米孔大小之滤紙無菌過滤。注記微量金 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X 297公釐） --------扣衣------.1Τ------^ (讀先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 45 898 7 A7 _^B7_ 五、發明説明（15 ) 鼷工作母液必須每次新鮮製備以裝配新營養培養基 V.维生素工作母液（vvs) l.o微克/毫升生物素（I*0毫升初级生物素母液^100 毫升） 1,0微克/¾升維生素B12 (0.1毫升維生素B12初級母液/ 100奄升） 20微克唾胺HC1 (噻胺氫氯鹽/100毫升）。 Μ不大於0.2毫米孔大小之滅紙無菌過濾°注記新維生素工作母液應每次新鲜製備以裝配新營養培養基。以下所述係可依循以製備營養培養基和矽藻培養之技術。當然地，除此些技術外’在此所述之配方和/或程序中之任何例變異，其導致營養培養基和程序能维持砂蒲生長足Κ供在此所述之製備過程’係有意地在本發明之範嘀。營養培養基可例如製備如下：在各升過濾和殺菌之海水中，可加人1毫升NaN〇3工作母液、1毫升NaH2P〇4 · H20工作母液、1毫升微量金屬工作母液和1毫升 Ha2Si〇3· 9H20工作母液。同時加人Na2Si03· 9H20 ，可加人2毫升1當量濃度HC1及溶液可振盪混合。接著•可加入1.5毫升1當量濃度Na〇H及溶液可再振盪混合。最後，可加入0.5毫升維生素工作母液。為生長新矽藻培養物，7毫升成熟培養液（具約1 X 10s涸细胞/毫升）之细胞密度）可移轉至含100毫升無菌營養培騫基之無菌容器，其可根據上述之方法製備。接種之培養液然後可在Μ下之條件下培餐8天： -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -----------.¾------1T------^ (#先閱讀背面之注意事項再填寫本页) 經濟部中央標準局員工消費合作社印褽 45 898 7 A7 B7 五、發明説明（l6) 溫度：20¾ 持嫌照明。播動：每早及每晩溫和渦漩一次2或3秒。在8天培赛後，30毫升之此培養液可在無菌條件下移轉至1000毫升營養培養基，其可例如内含於2.8升 Fernbach燒瓶中，由妙布覆蓋之棉花塞保護。如此之培養液可允許培養及生長至所要之细胞密度或*可替代地可用以接種新矽藻培養液。一旦培養液到達所要之妞胞密度，培養液之p-GlcNAc纖維可Μ採收及本發明之p-GlcNAc可使用如該等在Μ下5.3節中所述之方法純化。 C02可溶於培養溶液中，Μ維持約7至8之培養液pH，且以約7.4為較佳。如此中性pH環境之维持大大地增加 p-GlcHAc產量*其可自各矽蒱培養液獲得。 5.3分雔、純化和滴縮p-G IcHAc潘維之方法在本節中所陳述者係可用以自矽_培養液如該等在以上 5.2節中所述者製備p-GlcNAc纖維之方法。當下述各自矽藻，較佳地矽浠起始原純化p-GIcNAc之方法產生非常純、不摻雜、结晶之p-GIcNAc，>各方法產生具特定特性和有利特微之P-GIcNAc。例如，本發明之口-0丨〇^(：經在以下5.3.1節所述之機械力方法純化產生 p-GtcNAc硬結•其對细胞與p-GIcNAc之連結提供優良之受質。在Μ下5.3.2節中所述之第二個方法，化學/生物方法較由機械力方法所產生之平均P-GIcNAc產量產生更高之平均產量。此外，描述為以下5.3.2節之化學/生物方法 -1 9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -----------裝------11------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中失標準局員工消費合作社印製 45 898 7 A7 B7 五、發明説明（17 ) 之部分之酸處理/中和化變法產生極長之p-GlcNAc纖維* 其一些纖维超過1〇〇微米及具非常高之分子量*高至so-so百萬道耳吞。 5.3.1製備純p-GIcNAc之欏械力方法 p-GUNAc纖維可自矽薄钿胞體由將培驀液之内容物接受合逋之機械力分開。如此之機械力可包括·但不限於由例如膠磨機、超音機裝置或氣泡發生器產生之剪力*或由例如瓦林攪碎機產生之切力。矽藻细胞和p-GlcNAc潘維之生成懋浮液然後分離。例如，懸浮液可接受一系列自细胞體分離P-G丨cNAc纖维之離心步驟•產生澄清之上清液，若有的活展現少許可見之絮凝物質。定角轉子和約ίου之溫度對離子步驟較佳。所裔之速度、持續時間和離心步驟之總數可因例如所用之特定離心轉子而定|但如此肋變數之數值決定則對热諸此技藝者很清楚。在上清液中之p-GIcNAc然後可使用對熟諸此技藝者所熟知之技術澹縮。如此之技術包括•怛不限於抽氣及過濾裝置。最後 > 濃縮之P - G 1 c N A c纖維以例如蒸豳-去離子水、H C 1 和乙醇或其他合遇之溶劑清洗•較佳地溶劑如醇，其中有機和無機物質兩者皆溶。在Μ下第7節中所述之工作實施例示範本方法以純 pUcNAc之用途。 5.3.2純仆D-GIcNAf之仆璺/牛物方法本纸張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） ---------^------11------戎 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中夬標準局員工消費合作杜印装 A7 B7___ 五、發明説明（l8 ) 在本方法中· P-G丨cNAc自砂藻细胞館由將其接受如下更詳述之化學和/或生物劑分開。矽瀦培養液可以能減弱矽藻细胞壁之化學品處理’其専致p-GlcH Ac纖維之釋出而不改變其结構。如此之化學品可包括，但不限於氫氟酸（H F )。可替代地’成熟之矽藻培養液可以能改生物過程之生物劑處理，其可用以抑制P-GlcNAc纖維合成*因而釋出已存在之纖維°例如，如此之劑可包括，但不限於多氧菌素-D，酵素N -乙醯基葡萄楗胺基-P-轉移_之抑制劑。矽藻培養液之细胞賴和含p-GlcHAc娥雄Μ多教之上述化學或生物劑處理然後分開。例如，處理之矽藻培養液之内容物可允許沉降，以使培養液之内容物允許形成兩届明顯液層。上層將主要含p-G丨cNAc_維，而下層將含細胞體。上面含p-GUNAc纖維之液層可虹吸掉，留下下層之沉降細胞物質。虹吸之含p-GIcNAc纖維液看然後可進一步鈍化，由& + 傷害P-GlcNAc纖維之清潔劑處理除去蛋白筲和其他不之物質》如此之清潔劑可包括，但不限於十二基硫 (SDS丨。當使用酸處如HF處理自矽涵细胞體分開p-GUNAeai$ 時，可包括分散缴維之步驟。如此之步驟可包括，但於使用機械力Μ分散纖維，如纖維接受瓦林捥碎機分散之步嫌。可替代地，酸處理懸浮液可在一個視情況之步驟中，在 -21 - 本纸張尺度逍用中國國家標準（CNS )八4現格（2ΙΟΧ297公釐） ---------^------1Τ------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 45 by8 7 _ B7_____ 五、發明説明（19) 由清潔劑處理進一步純化前中和化。如此之中和通常將改變懋浮液之pH自約1.8至7.0及可由例如添加合適虽之1 Μ耳濃度Tris(PH 8.0>或添加合適量之氫氧化納（Na0f°達成。中和通常產生較在此所討論之其他純化方法實質上更長之純P-G IcNAc纖維。纯化之p-GIcN Ac嫌維然後可使用在技蓊中热知之技術澹縮，如由利用抽氣及過濾装置。最後.P-G丨cN Ac潘維在一糸列步驟中Μ蒸器[-去離子水、HC1及乙酵或其他合適之溶劑清洗*較佳地溶劑如醇，其中有機和有機物質皆可溶〇在Μ下第8節所述之工作實施例展現如此純化方法之成功利用。 5 . 4 ρ - G 1 c K A c ^ ΐΗ Φ <V, 本發明之純、全乙豳化P-G lcN Ac可由利用多棰控制之條件和程序衍生化成大範圍之不同化合物。見圖13中描述一些此類化合物之圖式。如此衍生化之化合物可包括，但不限於部分或全去乙醯化ρ-GlcHAc，其如下進一步詳述地經化學和/或醇素性方法修飾。此外，P-G lcN Ac或其去乙藤化衍生物可由碕酸化、磷酸化和/或豳酸化而衍生化。再者，如下詳述地，0 -磺醯基、N -醯基、〇 -烷基、H -烷基、去氧鹵素及N -亞烷基和H -亞芳基及其他衍生物可自本發明之p-GIcNAc或去乙醯化p~GlcNAc製備。本發明之去乙醯化 p-GIcKAc亦可用Μ製備多種有楣鹽和/或金臑螯合物。再者，本發明之p-GlctJ Ac或其衍生物可共價地抑或非共價地 - 2 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210Χ2ί>7公釐） ----------^------1T------^ (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央樣準局貝工消費合作杜印製 45 898 7 A7 _B7_五、發明説明（20 ) 連结任何多棰之分子。再進一步地，本發明之p-GlcNAc或其衍生物可接受控制之水解條件*其產生具均一或分開分子屋特性之分子群。本發明之P-GlcNAc之一或多偁單釀單元可去乙醯化，以形成多-/9-1—4-»(-葡萄糖胺，具約640,000道耳吞至 2400萬道耳呑之分子量，而W約640,000道耳呑至240萬道耳呑為較佳。具如此分子fi範圍之種類代表具約4000至約150,000個葡萄糖胺單_之種類，其係以；3 -134構形埋結*而以約4,000至約15,000個葡萄糖胺為較佳。本發明之P-GlcHAc可由處理以阑去乙醯化產生具游皤胺基之葡萄糖胺。此水解過程可Μ澹氫氧化納或氫氧化鉀之溶液在升高之溫度下進行。為精確控制去乙醯化之程度和為防止多醣之主要_鐽之崩解，然而，較佳地使用採用幾丁質去乙醢_酵素之酵素程序以去乙海[化P-GIcHAc。如此之去乙睡_酵素程序對熟諸此技藝者係熟知的及可如在（美國專利第5,219,749號）中進行，其在此以其全體併人供參考。本發明之p-GIcN Ac之一或多涠單醣軍元可衍生化，以具至少一個碕酸根，或可替代可磷酸彳或硝酸化，如下描述 ---------^------#------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾準局員工消費合作社印裝

nhr2 -23- 本紙張火度適用中國國家標準（CNS 規格（210X297公釐） 458987 Α7 Β7 經濟部中央榡隼局員工消費合作杜印製五、發明説明（21 ) 其中代替氫之R和/或h，和/或代替-COCH3之可為硫酸根（-SH03)、磷酸根（-p(〇H)2>或硝酸根（-N〇2)基團。以下描述係可藉以製備如此P-GIcNAc衍生物之方法。在進行如該等在本節中所述之方法前.有利地先將p-G丨cNAc起始物冷凍乾埭、在液箱中冷凍及粉碎化。硫酸化P-GlcN Ac衍生物可由例如兩步《加工產生。在第 -步驟中，0-羧基甲基p-G1cHAc可自本發明之p-GlcNAc和 /或P-GIcNAc衍生物由例如利用如該等由Tokura等人（ Tokura, S.等人，1983, Polyra. J. L5_:485)描述之技術製備。第二，硫酸化步驟可以例如Ν,Ν -二甲基甲醯胺-三氧化硫根據熟諸此技藝者所热知之技術如由SchweUe「 (Schweiger, R, 1972, Carbohydrate Res, 21 : 219)所述者進行。生成之產物可以納醣分離。本發明之磷酸化p-Glcfl Ac衍生物可例如由利用热諸此技 @者所热知之技術如由Nishi等人（Hishi等人，1986在，，自然界中之幾丁質及技術”，Muzzare丨！ ί等人，eds. Plenum Press，紐約，pp. 297-299)所述者製備。簡言之 • PllcNAc /甲磺酸混合物可以五氧化磷（以約0.5至4.0莫耳當星）在約01C至約51C之溫度下攪拌處理。處理可進行約2小時。生成之產物然後可沉豭及使用熟諂此技藝者所熟知之標準程序清洗。例如，樣品可以溶劑如乙醚沉澱、離心、Μ溶劑如乙醚、丙酮或甲酵清洗及脫水。 -24- 本紙張尺度適用中軸家料（CNS > A4^ (21Gx297公褒） --------，装------訂------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 45 898 7 A7 B7 绍濟部中央標隼局I工消費合作社印农五、發明説明（22 硝酸化p-GlcN Ac衍生物可由利用熟諸此技藝者可热知之技術製備，如該等由 Schorigin 和 Halt (Scliorigin, (Ϊ, 和 Halt, Ε·, 1934. Che·. Ber. Qi:1712> 所述者。簡言之* p-GlcNAc和/或p-GlcNAc衍生物可M濃硝酸處理，以形成棰定之硝化產物。本發明之p-GlcH Ac之一串多®軍釀軍元可含硫醣基，如下描述： CH2〇^^2^3

NHCOCH3 其中1可為烷基、芳基、烯基或炔基部分。如此衍生物可由熟知之方法產生•如在Kurita等人中所述之方法（ Kurita等人，1990, Polym· P「ep [Am. Chem. Soc.，〇卜‘卩〇1?11|.(：116!11.]2丄：624-625】。簡言之，水性碱性 p-GlcN/\c溶液可以甲笨磺醢氯之氮仿溶液反應及該反應然後允許在室溫下緩慢進行。本發明之P-GlcNAc或其去醚化衍生物之一或多個單_可含一或多画〇-醢基•如下描述： -25 本紙張尺度適财關雜_ ( CNS > A4· ( 21Q>< 297公餐 --------Λ------ΐτ------^ (請先聞讀背面之注意事¾再填寫本頁) 4 b B 9 B 7 A7 B7五、發明説明（25 ) CH2〇COft4

Η ΝΗ2 or ί NHCRfi I 6 ο Ο 其中代替氫之（?4和/或Re可為烷基、烯基或炔基部分，及可為烷基、烯基或炔基部分。如此衍生物之實例可由热知之方法產生，如該等由Koraai (Kamai. Τ.等人> 1986, 在”自然界中之幾丁質及技術”，Muzzare丨丨i等人，eds., Plenum Press,紐約，pp. 497-506> 所述者。簡言之， p-GlcNAc可Μ任何之多數合適之醯基氯在甲磺酸中反應，生成P-G lcN Ac衍生物，其包括，但不限於己醯基、辛醯基、月桂醯基或苄醯基衍生物。本發明之去乙醯化p-GlcNAc之一或多涸單釀可含N -醏基，如下描述： ch2oh M·濟部中央標华局員工消费合作社印製

H NHCR, f 7 Ο 〇其中R7可為烷基、烯基或炔基部分。如此衍生化可由利用熟諸此技铥者所熟知之技術獲得，如在Hira no等人（ -2 6 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I------- i------ΐτ-----線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 458987 A7 B7 _________五、發明説明（24 ) Hirano，S.等人，1 976. Carbohydrate Research 3 1 5-320)中所述之技術。去乙醯化p-GicNAc係溶於多數之水性有機酸溶液。選定之羧酸酐添加至含如此p-GIcN Ac之溶液於水性甲酵性乙酸中，導致N-醯基p-GlcNAc衍生物之形成。本發明之去乙«化ρ-GlcNAc或其去乙醯化衍生物之一或多倨單釀可含0-烷基，如下描述： CH2ORe

Η ΝΗ2 or I nhcoch3 Ο 經濟部中央標擎局工消費合作杜印製其中1^可為烷基、烯基或炔基部分。如此衍生化可由熟諸此技蕤者所熟知之技術獲得。例如，由Maresh等人（ M a r e s h , G .等人，在h幾丁質和幾丁聚糖”，S k j a k _ Braelc, G.等人，eds, 1989, Elsevier 出版公司，pp, 389-395)描述之程序。簡言之，去乙醯化p-CilcHAc可二甲氧基乙烷（DME )中分散及以《屋環氧丙烷反應。反應期間可為24小時，及反應在殺菌釜中在40至90tT下進行°混合液然後可以水稀釋及過濾。DME可由蒸豳除去。最後’終 -27- I I i n * 装------訂----I ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家樣牟（CNS ) A4規格（210X297公釐） 458987 A7 B7 五、發明説明（25) 產物可經冷凍乾烽分離。本發明之P-G1cN Ac之一或多個單醣單元可為碱性衍生物，如下描述：如此衍生物可由使用热諸此技藝者所熟知之技術獲得。例如，如由 Noguchi 等人（Noguchi, J.等人，1969, Kogyo Kagaku Zasshi 796-799)所述之方法可以利用。簡言之，p-GIcNAc可在真空下浸在NaOH(43S；，較佳地）中*在約 Ot：下約2小時之時段。過量之NaOH然後可由例如在藍式離心機離心及由機械壓滤除去。本發明之p-GlcNAc之去乙醯化衍生物之一或多個單餓單元可含烷基•如下描述： ch2oh 、裝------訂-----線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印黎

H CH^CHg Rs 其中％可為烷基、烯基或炔基部分。如此衍生化可由利用 -28 -

本紙張尺及適用中國國家標牟（CNS ) A4規格（210X297公釐> 經濟郎中央標隼局員工消費合作社印製 458987 A7 B7 五、發明説明（26 ) 例如上述為產生〇-烷基p-GlcNAc衍生物之Maresh等人（ Haresh, G,等人，在”幾丁質和幾丁聚糖”，Skjak-Brack, G_等人，eds. 1989， Elsevier出版公司 * pp. 389-395)之程序獏得。本發明之p-GlcNAc之去乙醸化衍生物之一或多假單_單元可含至少一種去氧鹵素衍生物•如下描述：

其中（?1〇可為F、Cl、Br或I’而Ml為較佳。如此衍生物可由使用熟諸此技藝者所热知之技術獲得。例如’可利用如由 KurUa 等人（Kurita, K.等人，1990，Polym.

Prep. [An. Chem. Soc. Div. Poly». Chen.] 2_L· 624-625)所述之程序。簡言之，製成之甲笨確藤化 p-GlcNAc與鹵化納在二甲基亞砸中反應，產生去氧由素衍生物。p-GIcNAc甲笨磺醯化可由將碱性P-GlcNAc水溶液與甲笨磺_氣之氨仿溶液反應進行。如此反應可在低溫下緩和進行。本發明之P-G1cNAc之去乙醯化衍生物之一或多假單_單元可形成鹽，如下描述：本紙張尺渡適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） ------- 、裝------訂-----線 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 458987 A7 B7 五、發明説明（27 ch2oh

其中可為烷基、烯基或炔基部分。如此衍用熟諸此技藝者所热知之技術獲得。例如，可 Austin 和 Senriett( Austin, P.R.和 Sennett, 然界中之幾丁質及技術”· 1986, Muzzarelli, 人，e d s . P I e n u m P r e s s , p p . 2 7 9 - 2 8 6 > 所述言之*去乙醯化P-G丨cNAc可懸浮於有機溶媒如異丙醇*在其中可加入合適之有機酸例如甲酸乙酸或乳酸。混合液可允許靜置一段時間（例 )。反應和乾燥之溫度可自約12°至約35C不 20°至251C為較佳。鹽然後可由過濾分開，Μ 洗及蒸發殘留之溶媒。本發明之P-GIcN Ac之去乙醯化衍生物之一或多個單18單元可形成金画蝥合物，如下描述：生化可由使利用如由 S .，在”自 R . A . A .等之程序。簡乙酸乙酯或、乙酸、羥如1至3小時同•而Μ 新鲜溶媒清丨、裝------訂-----線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印裝 ch2oh

30- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4現格（210 X 297公釐）經濟部中央標隼局員工消f合作祍印製其中R i 3可為烷基、烯基、炔基或芳基部分。如此衍生物可由使用熟諸此技S者所熟知之技術獲得。例如*如由 Hirano 等人（Hirano, S.等人，1981，J. Bioiaed. Mat. Res. li: 903-911)所述之程序可K利用。簡言之，去乙藤化p-GIcNAc之取代反應可以羧酸酐和/或芳基醛進行| 生成醯基和/或亞芳基衍生物。再者，本發明之P-GlcNAc或其去乙醯化衍生物可接受控制之水解條件，其產生具均一、不連_分子量及其他物理持性之分子群。如此水解條件可包括，例如K酵素，溶菌酶處理。P-GlcNAc可暴露至溶菌酶下不同時段，以期控制水解之程度。此外，水解率可Μ程度之函數控制，在其中由溶菌梅處理之P-GlcNAc己去乙醯化。去乙醯化條件可如在本節中前述者。P_GlcH/\C分子更經全去乙醯化 > 分子則 -3 1 - 458987 A7 B7 五、發明説明（28 ) 其中可為金圏離子，特刖地一棰過渡金靨，及X係由在去乙醯化P-G丨cNAc中存在之胺基和取代之胺基中存在之氮電子所建立之與格鍵。本發明之p-GlcNAc之去乙醯化衍生物之一或多涸單醣單元可含有N-亞烷基或H-亞芳基*如下描述： ch2oh

H NHCR13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---- I Η ϊρ^— I - - - ^^^1 1 - 一iJ1 - - - i ! (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟郎中央標隼局員工消費合作杜印聚 45 898 7 A7 B7 五、發明説明（29 ) 更全水解。除降低分子量外’在物理特性之改變係由水解和/或去乙醚化處理引出。過度之水解導致P_WcliAc之液化。水解/去乙醯化程序之结果係在从下第9節之工作實施例中如下所述。再者，熱變性可作用以修飾P-GIcNAc之结晶结構。如此 p-GIcNAc產物结晶結構之修飾可有利地影響，例如P-GlcNAc之反應性。再者，多種分子可共價地或非共價地與本發明p-GlcHAc之去乙醣化衍生物官能連结。如此分子可包括，但不限於如生長因子之多肽、如神經生長因子、激素或肽雜別序列如R G D序列、潘維網蛋白識別序列、積層素 (laminin)、整合素（integrins)、细胞附著分子及其類似物。分子與去乙醢化P-GlcNAc之暴K初級胺之共價連結可由例如利用雙官能交聯劑之化學連結完成•其作為特定長度化學間隔基。如此技術係熟猪此技蕤者所熟知的及可相似於例如 Davis 和 Preston (Davis, M.和Preston, J. F. 1981, Anal. Biochem. 116:404-407)和 Staros 等人（Staros, J.V.等人，1986, Anal. Biochem, 156: 220-222)之方法。簡言之，在呔上與本發明之去乙醯化或部分去乙醯化P-GlcNAc連結之羧酸殘基可Μ活化及然後與 p-GlcNAc交聯。活化可例如由添加如羰二亞胺EDC (卜乙基- 3- (3 -二甲基胺基丙基）羰二亞胺）之溶液至肽於磷酸緩衝液之溶液完成。較佳地，此溶液附加地可含如磺酸基 -NHS(N -羥基磺酸基琥珀亞g胺）之劑以增強偶合。活化之 -32- 本紙張尺渡適用中圃國家標率（CNS)A4現格{ 2丨0X297公釐） ------- 、裝------訂----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 458987 經濟郎中央標隼局員工消費合作杜印装 A 7 B7 五、發明説明（5〇 ) 肽可與去乙醯化p-GlcNAc由在高pH緩衝液，如磺酸明媛街液（pH 9.0-9.2)中混合交梅。可替代地，如該等上述之如此分子可與去乙醢化 ρ-GlcNAc使用热諸此技藝者所热知之技術非共價地連結。例如選定之分子或分子群可與去乙醯化p-GIcN Ac溶液在冷凍乾堍前混合。可替代地，可形成包括p-GlcNAc和/或P-GlcNAc衍生物之混成物。如此混成物可含任何多捶天然和/或合成物質，而除P-GlcNAc和/或p-G IcN Ac衍生物之外。例如，混成物可由p-GIcKAc和/或p-G丨cNAc衍生物加一或多種细胞外基質（ECM)成分姐成。如此ECM成分可包括，但不限於膠原蛋白、織維網蛋白、胺_聚_和/或呔聚醣。混成物亦可由P-GlcNAc和/或p-GlcNAc衍生物加一或多棰合成物質例如聚乙烯姐成。如此P-G丨cNAc/聚乙烯或P-GlcNAc衍生物/聚乙烯琨成物可由熱連結混成物成分經例如高壓殺菌製成。在膠原蛋白/ p- GlcNAc混成物之例中，簡言之’ p-GUN Ac懋浮液和膠原蛋白懸浮液可混合及冷凍乾燥和交聯，較佳地熱脫水交聯。如此混成物之瞎原蛋白類可為天然或合成的，及可為人或非人本源如牛。原蛋白和/或p-G lcNAc衍生物/膠原蛋白棍成物質展規均― 特性及形成多孔基質’其可例如作為细胞連结及生長之有效三級基質°在以下第13節中所述之工作實施例展規如此 p-GUNAc /膠原蛋白混成物之形成、特性及有用性。 -33- -------- ’參------訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 45 898 7 A7 B7 經濟部中夹標隼局員工消費合作社印製五、發明説明（51 ) 5.5再綢ffi _ 本發明之p-GlcN Ac及其去醯化衍生物和/或其衍生物如在Μ上5_4節中所述者，可溶解及其後再調配成多種形狀和組態。本發明之p-GlcHAc溶液可由以二甲基乙醣胺（DMA) /氯化經處理達成。P-G丨cNAc可輕易在含5X LiCl(DMA之重量）之DMA溶液中播拌溶解。水溶性p_GlcNAc衍生物如 P-G丨cHAc鹽可溶於水。至少約755|；去乙醯化之p_(ncNAc可放人例如溫和酸性之溶液，如1Χ乙酸之溶液。水不溶性之 p-GlcNAc可放人有機溶劑之溶液。本發明之p-GlcNAc、其去乙醯化衍生物和/或其衍生物在溶液中然後可沉澱及再調配成形狀，其包括，但不限於硬结、皞、繩、微球、微珠、_、嫌維、粉末及海綿。再者，超薄（即少於約1微米厚 > 均一膜可Μ調配成。如此調配物可由例如藉纯p-GlcNAc係不溶於如水和酵，較佳地乙酵之溶液之有利事實達成。由一般方法如注射導人例如含p-G丨cNAc之DMA/LiC丨琨合液至如水或酵，較佳地乙醇之溶液將導致再沉澱.及因此再調K溶解之p-G丨cNAc。如此純p-GlcNAc係在Μ下在第 11節中所述之工作實腌例中展現。在水溶性p-G1cNAc衍生物之例中，再調配物可由在如此有機溶劑如乙酸乙酯或_ 丙酵中再沉35達成。P-GlcNAc之再調配物，其為至少約 75S；去乙醯化，可由在緘性溶液中再沉狠達成。水不溶性 P-GlcNAc衍生物可由在水溶液如水中再沉載再調配。 I -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

.1T 银本紙張尺度適用中國國家標芈（CNS ) A4規格（210X297公釐） 45 898 7 A7 B7 M濟部中央標隼局員工消費合作杜印裝五、發明説明（52 )5.6甩兔本發明之p-GIcN Ac以及其去乙醯化衍生物和其衍生物， I 如該等在Μ上5.4節中所述者及再調配物，如該等在Μ上 5.5節中所述者具多種用途。例如，除P-GlcN Ac和其衍生物之在文内所述之有利性質外，本發明分子之非毒性、非發熱性、生物可崩解及生物相容性使其在如此多樣領域如雇業、化粧品、生物»學工業、動物營養和健康及食品、化學、投影及«藥工樂上之應用。生物K學用途可包括例如酶和/或藥物固定化/傳遞方法。例如，本發明之P-GlcN Ac或其衍生物可具與其共價連結之所要肽（例如生長因子），如在Μ上5.4節中所述。含呔之P-GlcN Ac可使用热諳此技藝者所热知之標準程序施至病人，其程序包括*但不限於注射、移植、關節鏡、膝蓋鏡或相似之方法。在含肽之ρ-GlcNAc導入至病人時，本發明之P-G丨cN Ac生物崩解，使得連結之肽逐漸地釋於至病人之血流中，如此提供控制藥物傳遞之方法。一般而言•去乙醯化之百分率愈高，刖生物崩解性之速率愈快。此外，本發明之分子可作為媛慢釋放藥物傳遞載體其中所要之藥物由p-GUHAc或其衍生物膠囊化。藥物/ p- GIcNAc膠囊化反應可例如由接著在以上5.3.2節中所述之化學/生物純化方法之酸處理/中和化變法之修飾產生。與其提高 P-G丨cNAc溶液之pH至約中性pH範圍（即7.4 )·吾人不如可創造碱性pH環境，在p-GlcNAc纯化完成後提高pH至約9.0 。在更《性PH下，本發明ρ-GlcNAc之结構或其衍生物假定 -35- 、裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中圉國家標準（CNS ) A4規格< 210X29：?公釐} άο 898 7 A7 B7 經濟部中央標準局員工消f合作杜印聚五、發明説明（55) 更三級或”開"之姐態。當pH降低時•分子姐態回復至更緊湊* ”接近”之姐態。因此，所要之藥物可在高pH下加至 p-GlcNAc，然後可降低p-GIcNAc/藥物懋浮液之pH，因而 ”圈住”或膠囊化所要之槩物在p-GIcNAc基質中。如此 P-GUN Ac膠嚢化物可使用热語此技藝者所熟知之標準程序施至病人，Μ致在施用時，嘐囊化藥物當膠囊化物之 p-GIcNAc崩解時緩慢地釋至病人之系統中。同樣地， P-GIcN Ac膠囊化之钿胞可經熟諸此技藝者所熟知之標準技術施至病人及用以治療疾病，其可包括•但不限於巴金生氏疾病、糖尿病及骨關節炎。去乙链化或部份去乙醯化p-GIcN Ac類可產生具可預測之生物崩解性速率。例如，去乙醯化之百分率影W p-GlcNAc類崩解之速率。其他生物路學用途亦可包括|例如细胞培養受質。例如，如在以下第12節中所述之工作實腌例中所示，本發明之 p-GIcNAc作為對哺乳细胞在培養液中生長之非常有效受質。再者，p-GIcNAc之三鈒驵態可作為培養基成分，其允許三级细胞培養生長。本發明p-GIcNAc之细胞受質可容性亦可在體内利用。在此，本發明之p - G 1 c N Ac或其衍生物*如在此所述地*可作用Μ促進姐織再生（例如渾蓋接近牙齦線之牙之结締姐織、血管移植、韌帶、肌腱《捲筒、骨、皮虜、神經姐織）。本發明之p-GIcNAc或其衍生物之進一步生物酱學應用，如在此所述地*可涉及在傷口塗抹、傷口癒合_眘及外科缝合線、海綿及其類似物中之分子用途 -36- 、裝------訂-----.線 <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格{ 210 X 297公釐）經濟部中史標隼局员工消費合作杜印聚 4b 898 7 A7 _B7____ 五、發明説明（3〇。此外，p-GlcHAc瞑可用以提供生物可崩解、生物相容之機械陣壁，Μ防止手術後之粘著。再進一步地，如此分子可用於例如骨闞節炎之治療、血清膜固酵量之降低，作為抗病毒劑，作為抗菌劑•作為免疫調節劑*作為抗凝固劑，作透析及超過濾膜及作為抗腫瘤劑。本發明之p-GIcN Ac或其衍生物之某些衍生化物對特定應用可為較佳的（衍生化物係在Μ上5.4節中描述）。例如，碗酸化、磷酸化和/或硝酸化p-G lcN Ac衍生物可較佳地作為抗凝固劑或作為脂蛋白肪脂_活化劑。N-醸基 p-GlcN Ac衍生物亦可較佳地作為抗凝固劑，此外，較佳地，例如用於人造血管之產生、抗病毒化合物、抗腫瘤（特別地*癌细胞凝集化合物）、透析及超過濾膜、和控制釋放藥物傅遞系统之產生。〇-烷基P-G丨cN Ac和其去乙醢化衍生物亦可較佳地產生控制釋放藥物傳遞系统。N -烷基 P-G IcN Ac衍生物可較佳地作為抗菌劑。氧化去胺化衍生物可較佳地作為抗癌劑，特別地其與免疫療法聯结對抗癌细胞。去乙醯化p-GIcHAc衍生物可較佳地作為傷口癒合劑。 N -亞烷基及N -亞芳基衍生物可較佳地作為酶固定化應用。本發明之p - G 1 c N A c或其衍生物亦可用於多種農業麽用。如此應用包括，但不限於殺蟲m、殺真菌劑、殺菌劑及殺線蟲劑應用。N -烷基p-GIcKAc衍生物可較佳地作為殺真菌劑應用。此外，本發明之分子可用於多棰土壤處理應用，包括|但不限於肥料姐成。再者，雇業化學物之控制釋放可由經固定化、膠囊化及在此節中所述之其他方法圈入如 -37- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4現格（210X297公釐） ------- i------if-----k (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 5 8 9 B. 7 經鴻部中央標隼局負工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（55 ) 此化學物達成。此外，例如根瘤菌（Rh izob ium)瘤化因子和/或固氮誘等劑之類似物可固定至，或經由本發明之 P-GIcNAc和/或p-G丨cNAc衍生物腌用。本發明之p-GlcNAc和其衍生物*如在此所述地*附加地具在動物和人營養領域中之應用。例如•本發明分子可用為飼枓姐分技術•如該等在以上本節中所述者•可用於產生在動物糸統中之控制釋放產物。此外|上述之生物輅學應用可在動物糸統中由併入熟諸此技铥者所熟知之例行修飾利用。本發明之P~GlcNAc之化杻品應用可包括，但不限於產生頭髮及皮（t保養之產品。皮濟保養產品可包括例如利用去乙醯化p-G1cNAc鹽之化杻品、含梭基甲基p-G!cNAc之產品及含去乙醢化p-GlcHAc之化杻包和如此衍生物如羥基丙基 -H -琥珀醯基及四鈒p-GlcNAc衍生物。頭髮產品可包括，例如含羧基甲基P-GlcHAc之產品及膜肜成p-GlcNAc衍生物〇本發明之p - G 1 c N A C及其衍生物具可用於化學工程工業之多種應用。例如，P - G 1 c H A c可用為耦合劑Μ粘著金圖至聚合物上、由乙二醇p-GIcNAc形成而可用於脫鹽應用之瞑及由其他P -G 1 c N Ac衍生物形成而可用於榆送鹵離子之膜。其他應用可包括火焰延遲劑之產生和金_蝥合化合物及可自液體除去微量及重金屬以及水溶性I業污染物如PCB之化含物之製造。p-G1cNAc和/^p-GlcM Ac衍生物可用於照相應用。例如，P-G丨cNAc和/或p-GIcNAc衍生物蝥合金覊如 _ 3 8 - 、裝------訂-----0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格{ 210X297公釐）經濟部中央樣率局員工消费合作社印裝 ^58987 A7 B7____ 立、發明説明（36 ) 鹵化銀之能力可由將照相液與再》硬结如P-GlcNAc和/或 p-GIcNAc衍生物之薄膜接觸利用。本發明之P-G丨cNAc和其衍生物之食品工業應用*如在此所述地，可包括，但不限於抗|g固酵（即低血膽固酵化合物）、脂肪結合化合物、乳化劑、載體、防腐劑、調味劑及食品質地劑，除水果塗布劑外，及食品包裝產物。 6 . g施例：轴播物夕物揮恃袢在此實腌例中所示者係p-GUNAc和去乙88化P-GlcNAc膜之循環雙向色性（CD)及紅外嫁光譜（IR)分析。 6. 1材料與方法 p-GlcNAdn商桊”讲丁留，，脚描物：在（：1)研究中所用之？-(]丨(^/^丨系使用在以上5.3.1節中所述之櫬械力純化方法製備。商業”幾丁質”係自NovaChem公司，P.O. Box 1030 Armdale. Halifax, Nova Scotia,加拿大 B3L 4K9 購買 Ο 在11?研究中所用之[>-〇1(；^(：膜係由在以上5.3.1節中所述之機械力純化方法或由以上5, 3.2節中所述之化學/生物純化方法如所示地製備。商業” p-GIcNAc”製備物由溶於含5¾氯化鋰之二甲基乙醯胺溶液及在蒸皤、去離子水中成層直至瞑沉降而鐮成膜。 P.-G丨cHAr衍牛物及醴埋：在CD和IR研究中所用之去乙醯化p-GlcNAc係由 P_GlcNAcM50X NaOH在60C下處理2小時製備。在IR研究 -39- 本紙張尺度逍用中國國家橾隼< CNS > A4«t格（210X297公釐） (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝.

*1T 4b 898 Μ濟部中央樣牟局R工消費合作枉印裝 A7 B7 五、發明説明（w) 中所用之熱變性P-GlcHAc_係由在0.2奄舆耳濃度EDTA中沸騰3分修飾。高壓蒸氣處理之P-GlcNAc經高壓蒸氣或在 122Ϊ：下30分。CD技術：固態CD技術基本上根據Doraard (Domard, A., 1986, Int. J. Macromol. S_： 243-246) 〇 6 . 2结果 6.2. 1CJ)_分析- 在自未處理p-G1cNAc所得之CD光譜（圖3A)中，觀察到所預期之m，和π - π β1光學活性電子轉移（220-185毫微米 )，係因為在P-G丨cNAc之乙酷基部中羰基之存在。如此峰完全不存在於自去乙醣化p-G1cNAc產物所得之CD光譜，如圖3B中所示。 6.2. Μ I；光遒分析在此研究中所得之IR光譜與ρ-GlcHAc之化學结構一致。此外，各IR峰之尖銳界定係指出在p-GlcNAc缩維中有規則及正常（即假性结晶 > 结構之存在。見圖4A中p-GlcNAc經機械力純化方法之IR光譜及圖4D中p-GlcHAc經化學/生物方法之IR光譜。在比較下’見圖4B，其展現商業”幾丁質" 製備物之IR光譜。自髙壓蒸氣處理p-GlcNAc物質所得之IR光譜（圖4E)在目視上與在匯4A中所見之IR光譜並無不同。此數據指出 p-GlcNAc物質可由高壓蒸氣處理殺菌而不損失其聚合物結構。 7 .當腌例：d-G1cNAo使用棟械力純化方法夕純化在本節中，？-01(：1^(；使用在以上5.3.1節中所述之機械 -40- 本紙張尺度適用中國圉家標準（CNS > Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 458987 A7 B7 五、發明説明（58 ) 力技術純化。 7 . 1材料甜方法/结粜 W 逋掊着疲條件：矽藻種（Thai lasiosira f luv iat ϊ 1 is ) 在培養液中根據在M上5.丨和5.2節中所述之程序生長。 S E H稈序：在此所用之SEM技術係該等在Μ下12.1節中所述者0 持濟部中央標隼局員工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} d-GIcNAc純化稈序：p-G】cNAc自矽藻培養液由利用在以上 5.3.1節中所述之機械力技術純化。特別地，口_01(^^嫌維自矽薄细胞艏由將掊養液内容物在瓦林攪碎機中接受3 次短促之髙速琨合播動分開。3次短促之迪時間約1秒。生成之嫌浮液在Sorva丨1 GS-4固定角轉子中在3500 rpm 下在約1 0勺下離心2 0分。上清液經傾倒及再離心，此時在 Sorvall GS-4固定角轉子中在4000 rpn下在約10C下20分。再一次，上清液經傾倒及在4000 rp*下在1〇1〇下離心。第3次離心之終上清液為澄清，若有的話·在液體中具少量漂游之絮凝物。澄清之上清液傾倒入裝置具0.S微孔大小硝基纖維素之布赫納過《單元•然後施用抽氣及液體自纖維懸浮液中過嫌，允許纖維在膜上收集。收集之纖維以 1升之蒸皤、去離在7〇υ下ίί洗。當差不多所有水滴乾時，纖維Ml升之1當量湄HC1至70Ρ下抽氣清洗。當大部酸液滴乾時，缴維以1升之蒸餾、去離子H20在 70T：下使用抽氣清洗。當大部分清洗水滴乾時•嫌維以1 升95S；乙酵在室溫下及施用真空下清洗。白色嫌維結收集在其上之濾膜然後自過濾單元取出及硬结和膜撐體在乾煉 -4 1 - 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > A4規格（210X297公釐） 4 b 898 7 A7 B7 五、發明説明（59 ) 烘箱中在58t下乾煉20分，之後硬结及其撐體置於乾煉器中16小時。依循此純化程序，ρ-G丨cN Ac自〗000毫升培養液之產量為每升矽藻培養液（3.85毫克。由？~0丨〇^<;嫌維經本技術收集所得之膜之SEM照Η於圖6中顧示。 8 .當·施例：ρ - G丨ο Ν Α ^栩用牛物/化舉鋪化方法之純化在本節中，^〇1(；}^(；使用在以上5.3.2節中所述之兩種化學/生物技術純化。藺言之，在第一例中，p-GlcNAc經 HF處理纯化，及在第二例中，經酸處理/中和化作用純化 Ο 8 . 1材料與方法/鹄里砂邊培驀液條件：的潘種（Thai lasiosira fiuviafi I is)根據在M上5.1和5.2節中所述之程序在培養液中生長。 S Ε Η程序：在本研究中所利用之技術係在以下1 2 . 1節中描述 C，純」hi序：首先，p-G1cNAc由HF處理純化，其結果如圖7 所示。特別地，在抽氣室中，在每1 0 0 0奄升原始细胞培養液之體積7 &室溫下加人2 .42毫升49¾ (29當量濃度> 經濟部中*標苹局員工消费合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) HF溶液至培養液之矽涵内容中，生^0.07莫耳灌度之HP溶液。混合液然後剷烈振鹽約30秒•導致殘存之泡沫在液面上出現。容器允許靜置5-6小時，以允許重粒子沉降。在靜置之最後，形成一層泡沫，而同時液層本身分成兩層：苜先狹 '極暗綠色層，靜止在容器底層，在上第二個較亮之灰綠及稼臁層，其代表大約85-90¾缌量之液體。泡沫磨 -42- 本紙張尺度適用中國@家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐} A7 B7 五、發明説明（40 ) 使用毛细管玻璃及真空抽氣小心地虹吸掉。然後在小心不攪動主要含沉降细胞體之暗底層下|虹吸掉灰箱之上清液及轉人分開之塑膠容器中。灰锈之上清液允許睜置再16小時。剛開始液層差不多無色，淡灰色*但不透明。在16小時靜置時間後*少量泡沫係在主要液體之上面及少虽錄色物質已沉降至容器之底部。液體發得更亮但仍不透明。在液體上面之泡沫如前虹吸〇主要液曆然後小心虹吸掉，留下少量沉降之綠色物質在容器之底部。如此分離之液體含大部分P〜GlcH/ic纖維及一些不純物。 Μ濟部中央標隼局貫工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本I) 為除去由矽藻在自含纖維液體程序之前述步驟期間釋出之蛋白質和其他不想要之物質*纖維和细胞殘屑之懸浮液 Μ十二基硫酸納（S D S >清洗。特別地，2 0 $ S D S溶液所需之體積加至使液體之終濃度為0.5¾體積之SDS 。装有液體之容器經密閉、安置在振盪機器之水平位置上及在每分約1 0 0下振盪下振動2 4小時。在振盪開始後不久，大絮凝之白色p-GlcNAc纖維在懸浮液中出現，但相當量之泡沫蓄集在容器之上部。在SDS清洗最後 > 容器之内容物轉至裝置具0.8微米（Super Filter, Gelman)iS_之布赫納過嫌裝置。液體Μ抽氣過濾及在液體中之p - G 1 c H A c收集在濟膜上。在滤膜上收集之p - G 1 c H A c _維然後再清洗。首先，纖維以熱（70 TM蒸餾、去離子H20使用3倍於原懸浮液之體積清洗。W使用蒸豳、去離子H20之水柱，在布赫納漏4之逋膜上收集之白色纖維1轉至瓦林掮碎機*坆纖維蕞以約 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐> 4b 898 7 經濟部中夬標隼局員工消費合作杜印裝 A7 B7五、發明説明（U ) 10次之短促混合分解。分離嫌維之恝浮液轉至如上述地裝置具硝基纖維素滹瞑之布赫納濾器漏斗，及液層在抽氣下除去。收集之纖維以1000毫升熱（？〇υ) 1當量濃度HC1溶液清洗及其後再Μ1000毫升熱（7〇υ)蒸餾、去離子[^0清洗。最後，纖維Μ 1000毫升95¾乙酵在室溫下清洗及過嫌至乾涸。纖維结及支撐孅維结之滅瞋然在乾堍烘箱中在 58¾下乾燥20分。硬结及_撐艚然後置於乾烽器中16小時。硬结然後小心地自濾膜脫離。第二| p-GIcH Ac由使用在以上5,3.2節中所述之酸處理 /中和化方法純化。特別地，p-G1cNAc如在本節中前述地進行，直至SDS清洗步驟前 > 在其點溶液由添加2.9莫耳濃度Tr丨s溶液中和至約7.0之pH。自本純化程序之口-014力[：產量為毎升矽阑培養液20.20毫克。在本鈍化程序期間形成膜之SEM相Η如圖9和9A-9E所示。 9 .窗确例：D-GlpNAn去乙醏化反瞧 P - α 1 c H A C硬结懸浮於含5 0 SS N a 0 Η之溶液。懸浮液在8 0 t 下加熱2小時。生成之去乙醯化硬结經乾燥及由掃描電子顯微镜研究，如圖U所示。 10.苜瓶例：D-(]UHAn牛物相客件 . 在本宵施例中*其展規本發明之P - G 1 c Ν Λ c顯示無可檢測之生物反應性，如由溶析試驗、在兔中之肌肉内移植、在兔中之皮下注射及在小鼠中之系統注射分析。 10. 1材料_方法 10.1. 1溶析試驗 -4 4 - 、裝------11-----奴 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 45 8^8 7 A7 B7 五、發明説明（42 ) 溶析試驗之條件依循在美國PharBacopeia XXII, 1990，ρρ· 1415-1497 和在美國 Pharciac〇peia mi ,補充5, 1991, pp. 2702-2703中所述之規格。细胞培養液=利用小鼠嫌維母细胞L929细胞線（美國型菌種收集中心，石村（Rockv i Ile > , MD; ATCC No. CCL1, NCTC選殖929)。L929细胞之24小時融合軍層在完全最小必需培養基（MEM >中繁殖。 p-G IcHAc ： p-G lcNAc之固態，其已根據以上5.3.1節中所述之機械力方法之鈍化製備，在20毫升血清補充之MEM中如每美fflPharacopeia XXII ( 1 990 )需求霣地萃取。持制姐：天然橡皮用為正控制姐•及矽膠用為負控制姐。控制姐Μ相同方式如測試物體，ρ-GlcNAc地拥I試。翠取物：萃取物在37C下在含5¾二氛化碳之加濕氣壓下製備。萃取物評估其pH之改變及調整使其pH在原培養基之 + /- 0.2 pH單位間。調整MHC降低萃取物pH或以NaHC〇3升高萃取物pH達成。萃取物由通過0.22微米濾細’在施用细胞單層前無菌過濾。劑鼍施用：3毫升p-GlcNAc或控制姐萃取物用以代替细胞培養液之維持培養基。所有萃取物經二電薄郝1試° 評估標準：细胞單層之反應目視或在顧微鏡卜一评估°生物反應生，即细睢變質和/或異常形成以0至4之尺度評定’ 如下所示。本測試糸統係合適地，當負控制姐物體記載無细胞反應性信號（0級）及正控制驵物體顯示大於®和反應、性（2級）。測試物體（即p-GlcNAc)達到生物相容性’若無本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ------- i------ΐτ-----0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 458987 A7 B7 五、發明説明（45 ) Μ測試物體處理之培養液顯示大於溫和反應性 Q 級反應性反應性區域之描述 1 輕微地不大於 20% 之细胞為圓鬆散連結及無细胞質内粒子 » 偶而存在分解之细胞 2 溫和不大於 50¾ 之细胞為圓及缺乏畑胞質内粒子廣泛细胞分析及细胞間之空白區域 3 中度不大於 70¾ 之细胞層含圓细胞和 / 或為分解的 4 嚴重近乎完全破 m 之细胞層 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) *裝- 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印裝 10,1. 2ΒΠ.肉内稔榷動物：使用健康之紐西蘭白兔，雄和雔（東部兔奇種實驗室，Taunton, MA)。兔使懸空之不绣網龍子g別棲養。在接受時，動物置於檢疫所8天，如在真實測試之相同條件。硬板 H (Sani_chipsTM, J.P. Murphy 森林產物， Mont va le, KJ)則在龍中作為無接觸床墊。動物設備維持在68s +/_ 3下之溫度，且相對湄度在30-70¾，每小時最小量之1 0 - 1 3次完全空氣交換及使¥全光譜螢光之1 2小時白天/黑暗循環。動物在控制條件下供應商業飼料（ Agway Prolab，Waverly, NY)及都市自來水，無限畐地。無已知污染物•其會預期地干擾測試結果*存在於阏料、床墊或水中。動物自一大群動物選定為研究用。兔子稱至最小1 0克，及個別Μ耳刺紋鑑別。 -46 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（210 X 297公釐} 45 898 7 A7 B7 p- '* * —IM - 五、發明説明（4〇 p-G I cHAc ：所用之p-G IcHAc如在M上10· 1 . 1節中所述。接^ 植試驗：各移植試驗使用兩隻兔子。在潮試當天，在脊椎柱之兩側上之動物皮肅剪去皮毛。各動物經麻醉Μ防止肌肉運動。使用無菌皮下計及探針，4條測試p-GlcNAcU 毫米X 1毫米 X 10毫米）植入兩雙兔子之一之脊椎一側之脊椎旁肌肉（自中皞與脊椎柱平行之2.5至5匣米及約自各自約2.5厘米）。在相同情形下，兩條USP負控制姐塱膠RS( 1毫米X 1奄米X 10毫米）植人各動物之相對肌肉中。動物維持在7天之時段裡。在觀察時段之最後，動物經稱重及由可注射之巴比妥酸篇，安逸死一5 (E u th a m a s ί a - 5 )(獸轚實驗室公司，L e n e X a , K S )而安逸死。允許足夠時間以切下組嫌而無流血。各移植條中心部位周圍之姐織面積使用放大鏡目視檢査。出血、壊死、變色及感染皆使用Μ下之尺度計分：0 =正常、1=溫和、2 =中度及3 =嚴重。若存在有膠囊化則先測定膠囊之寬度（即自移植之外緣至膠囊之外緣之距離）而捨人至最近之毫米。膠囊化則計分如下： ------- ά------ίτ-----k (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 度寬囊一膠一數分經濟邹中夹標隼扃員工消f合作杜印製至無多於大米米米米毫奄毫奄 0 12 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中失橾苹局員工消費合作社印黎 45 898 7 A7 B7 ----------- ' 玉、發明説明（45) 計算Ρ-G丨cNAc和正控制姐物體之平均分數間之差_。若在各兔中，各姐生物反應之P-CHcHAc和正控制姐塑膠移植部位之平均分数間差異並不超過1.0;或若所有組之生物反應之各p-GlcNAc之平均分數和所有姐之所有正控制姐塑膝移植部位之平均分數間之差異在不超過4 p-GIcN Ac條之一下並不超過1.0 ，則此試驗係認定為負值。 10.1 . 3皮1注射動物：使用妞西蘭白兔及如在以上10.1.2節中所述地维持 Ο p-CIcNAc：根據在以上5.3.1節中所述之機械力純化方法製備之P-GlcNAc固结置於萃取燒瓶中*在其中加入20毫升合適之培養基。萃取由加熱至70°進行24小時。在此程序後*萃取物冷至室溫。各萃取瓶在豳用前阚烈振盪。

皮下試驗：在試驗當天|動物剪去背俩之皮毛。各 P-GlcNAc萃取液之0.2毫升體積皮下注射在兩隻兔子之一之一側5個部位。各兔子使用多於一捶P-G丨cNAc萃取液。在各兔另一側之5涸部位上，注射0.2毫升之相對應控制姐。注射部位在注射後24、4δ和72小時観察紅斑、浮睡及壊死之信息。観察值根據皮膚反應計分之Draize尺度計分 (USP Pharmacopeia XXII, 1990, 1497-1500； USP

Pharmacopeia XXII:補充 5, 1991, 2703-2705)，如在 Μ 下表II中所示。 -48- 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) Α4規格（210X297公釐> -------- 、裝------訂-----.沐 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 45 898 7 A7 B7 五、發明説明（46 ) 表 I 皮虜反應計分之D r a i Z e尺度無紅斑........................................〇極輕微紅斑（約可看出）..........................1 明確之紅斑....................................2 中度至嚴重紅斑................................3 嚴重紅斑（甜菜紅）至輕微碗形成..................4 總可能紅斑分散 =4 择蘼形式無浮腫........................................〇極輕微浮腫（約可看出）..........................1 輕微浮腫（邊緣由界定升起而明確）................2 中度浮腫（升起約1毫米及延展超出暴露之面積）.....3 嚴重浮腫（升起大於1毫米及延展超出暴露之面積）..4 结！可能浮腫分數=4 ------- A------ΐτ----- 热. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝在2 4、4 8和7 2小時之所有紅斑及浮腫分數分別缌計及除 M12(即2隻動物 X 3計分時段 X 2計分组），以決定 p-GlcNAc對相對應之總平均分數。動物在觀察時段之最後稱重及由巴比妥酸鹽，安逸死_5(獸K賁驗室公司， Lenexa, K>之注射而安逸死。試驗之结果在若p-GlcHAc和控制姐平均反應分數（紅斑/浮腫）之差異係1.0或更小時 _ 4 9 _ 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS > Α4規格U〖0X297公釐） 45 898 7 A7 ____ B7五、發明説明（47 ) •則達成所求。 10.1. 4集統汴射動物：使用雔性白子瑞士小鼠BUSCU 1 ilsJ (査爾斯何育棰實驗室，威明頓（Wilmington, MA)每群5隻小鼠在裝有不绣網蓋子之聚丙烯雜子中棲養。硬板Η ( Sanί-chipsTM, J.P. Murphy 森林產物 ’ Montvale, NJ) 則在簏中作為接觸床墊。動物設備維持在限制接近之區域。動物室維持在68 +/- 3T下·且相對濕度在30- 70» ’ 每小時最小量10-13次完全空氣交換及使用全光譜螢光之 12小時白天/黑暗循環。小鼠無限量地供應商業飼料及都市自來水。無已知污染物，其會預期地干搛測試结果’存在於飼料、床墊或水中。動物自一大群中選定為研究用。小鼠至最少0 . 1克及個別由耳打洞鑑定。 p-G lcN Ar ：所用之樣品係如在以上10.1.1節中所述μ萃取物根據在Κ上10. 1.3節中所述之程序製備。条统沣射試餘：苗姐7Γ侓小鼠M p-G lcNAc萃取物或相對應之控制姐物體，以相同虽及由相同途徑注射如F銳明：表-- (洗先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) Λ 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Μ規格（2〖0Χ297公釐） 458987 A7 B7 五、發明説明（48 ) 測試物體或控制組物體萃取物劑量施用途徑劑量/公斤注射率〇. 9 3；氛化納注射液，USP (0 . 9¾ NaC 1 ) 靜哌内 50毫升 0 . 1毫升/秒 5¾乙醇於0.9¾ 氯化納注射液 U S P ( E t 0 Η ·· NaC 1 ) 靜脈内 50毫升 0, 1毫升/秒聚乙二醇4 0 0 (PEG 400) 腹瞋内 10克 - - 棉籽油 (CS0 ) 腹膜内 50毫升 - — p-G!cNAcM PEG 400及相對應控制姐製餚之萃取物以 0,9¾ KaC 1 稀釋，以獲得每毫升200毫克PEG 400 。為皮下、裝------訂----- 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟郎中央橾隼局員工消費合作社印聚注射，PEG 400 MO.9¾ NaCI稀釋，Μ獲得每毫升120毫克 PEG 400 。動物在注射後立即，在注射後2 4小時、4 8小時及7 2小時觀察。動物在覼察時段之最後稱重及暴露至二氧化碳氣下安逸死。若無M P-GUN Ac處理之動物顯示較K控制组物體處理之動物更大之生物反應性時，則達成本試驗之需求。 -51- 本紙張尺度適用中國國家標準{ CNS ) A4規格{ 2!〇X297公釐）經濟部中夾標卒局員工消費合作社印聚本發明之P-GlcHAc因此通過生物相容性之溶析試驗之需求*及因而為非細胞毒性的。 10.2.2航肉内柊榷測試之兩隻兔子（A和B )增加體重及展示無毒性之徵候。見表IV之數據。此外，在各動物中並無明顯之毒性徵候。测試和控制組物體移植部位之目視評估顯示無發炎、膠囊化、出血、壞死或變色。見表IV之結果。試驗因此展現所分析p-GlcNAc顯示無生物反應性，其中在各兔中*所有生 4 b 8 ^ ϋ , Α7 Β7 五、發明説明（朽） 10 ‘ 2结果 10.2. 1溶析試驗细胞單層對P-G丨cKAc測試物體之反應目視及在顯微鏡下評估。無细胞化學染色用於本評估。由暴露至負控制姐物體或至P-G丨cNAc後48小時所觀察得無细胞生物反應性之激候（0级）。嚴重反應生（4級）刖注記在正控制姐物體上* 如在Μ下表m中所示：表ill 反應性成績時間 p-G丨cNAc 控制姐物體負正

A B A B A B 0小時 0 0 0000 24 小時 0 0 0 0 4 4 48 小時 0 0 00 44 本紙張尺度適用中國®家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） --------ά------ίτ----- m (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁j 5 b9B 7 A7 B7 五、發明説明（50 ) 物反應姐之所有p-(HcHAc移植部位之平均分數與所有姐之所有控制姐移植部之平均分數間之差異並不超過1.0 。 I------- 装------1T------- ^ (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 458987 A7 B7 五、發明説明（51 )

表IV 移植試驗 (目視觀察)

测試物9i:p-GlcNAc 動物棰類：兔子動物#:A 姐嫌部位： T1 T2 T3 T4 試驗 C1 C2控制姐平均 F 均發炎 0 0 0 0 0 0 0 0 膠囊化 0 0 0 0 0 0 0 0 出血 0 0 0 0 0 0 0 0 壊死 0 0 0 0 0 0 0 0 變色〇 0 0 0 0 0 0 1 0 總計 0 0 0 0 0 平均分數： 0 0 0 岂殳 0^ (缌數/5) 平均控制姐值 ---------¾.------IT------ ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐} 45 Qb8 7 A7 B7 五、發明説明（52 ) 表IV (績)

動物(MB --------- ^------ΪΤ-----Ί (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製姐雜部位： T1 T2 T3 T4 試驗平均 Π C2控制姐平佐1 發炎 0 0 0 0 0 0 0 0 穋*化 0 0 0 0 0 0 0 0 出血 0 0 0 0 0 0 0 0 壊死 0 0 0 0 0 0 0 0 變色 0 0 0 0 0 0 0 0 總計 _0 0 0 0 平均分數： 0 A 0_ 0_ A 0. (Mit/5) 平均控制姐值：j 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4 5 8 9 8 7 A7 B7 五、發明説明（55 ) 10 . 2 . 3皮下沣射所有動物增加體重。見表V之數據。在所観察任何 p-GUHAc或控制組物體部位中並無紅斑或浮腫之徴候。在任何動物中並未觀察到明顯之毒性徵候。因為p-G IcN Ac和控制組物體平均反應分數（紅斑/浮腫）間之差異少於1. 0 ，所以p-GIcNAc達到皮下試驗之需求。見表VI之结果。因此*如由本試驗所分析地，p-GUNAc展規無生物反應性。 I I - I - - - I - - - -- n· -1 - I I _ _ 丁、-·β (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 45 8^ A7 B7 五、發明説明（54) 表V 皮下及移植試驗體重及臨床觀察值測試物體：p-GlcHAc 動物棰類群動物tt 性別體重（公斤）第0天第3天重量改變毒性之徴候 0.9¾ NaCl和CS0 23113 雄 2.51 2.55 0.04 無 0.9¾ NaCl和CS0 23114 雌 2.43 2.46 0.03 無 EtOH:NaCl和 PEG 400 23115 雄 2.47 2.50 0.03 無 EtOH:NaCl和 PEG 400 23116 雌 2.59 2.63 0.04 無第0天第7天植移

A B 雄雔 4 6 7 6 2 2 0 4 8 7 6 8 ο ο ο°· 無無第0天至第7天（移植）和第0天至第3天（皮T)觀察值之簡要。 I--------.裝------訂------旅 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印裂 -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210 X 297公釐） 8 9 8 5 4 五、發明説明（55 ) 表VI 皮下試驗Draize分數測試物體：p-GlcNAc (T=測試* C=控制姐）動物種類：兔子 HaCl萃取物動物部位數計分數（ER/E ») 平均值 ID» 載體 T-1 C-1 T-2 02 T-3 C-3 T-4 C-4 T-5 C-5 時間： T 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 24小時 0/0 0/0 23113 NaCI 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 48小時 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 72小時 0/0 0/0 總數 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 24小時 0/0 0/0 23114 NaCl 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 48小時 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 72小時 0/0 0/0 ! 總數 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 1_1 0/0 0/0 0/0 0/0 . ----------裝------訂------ ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印策本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） 4 5 8 3 8 7 A7 B7 五、發明説明（56 ) 表V[(績） CSO萃取物動物部位數計分數（ER/ED) 平均值 m 載賭 T-1 C-1 T-2 C-2 T-3 C-3 T-4 C-4 T-5 C-5 時間： T C 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 24小時 0/0 0/0 23113 CS0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 48小時 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 72小時 0/0 0/0 雄數 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 24小時 0/0 0/0 23114 CS0 0/0 0/0' 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 48小時 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 7 2小時 0/0 0/0 總數 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 — 0/0 0/0 0/0 -----------装------ΐτ----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製 - 59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） 45898/ A7 B7 五、發明说明（57 ) 表VI (績） HaCl/EtOH萃取物動物部位数計分數（ER/ED) 平均值 IDH 載體 T-l C-l T-2 C-2 Τ-3 C-3 Τ-4 C-4 jT-5 C-5 時間： T C 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 24小時 0/0 0/0 23115 NaCl 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 48小時 0/0 0/0 EtOH 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 72小時 0/0 0/0 總數 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 24小時 0/0 0/0 23116 NaCl 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 48小時 0/0 0/0 EtOH 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 72小時 0/0 0/0 嬷數 0/0 0/0 0/0 — 0/0 — 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 ; 0/0 0/0 0/0 ¾------1T-----Ί (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 -60- 本紙張尺度適用十國國家標準（CNS ) Μ規格（210 X 297公釐） 45 8 ,； A7 B7 五、發明説明（58 ) 表VI (鑛) PEG萃取物動物 IDtt 載體 T-1 gf C-1 i位街 T-2 [計女 C-2 卜数（1 T-3 iR/E[ C-3 )) T-4 C-4 T-5 C-5 1時間：平均 T 值 C — 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 24小時 0/0 0/0 23115 PEG 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 48小時 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 72小時 0/0 0/0 缌數 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 24小時 0/0 0/0 23116 PEG 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 48小時 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0丨0/0 j 72小時 0/0 0/0 總數 0/0 0/0 0/0. 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 __1 0/0 0/0 ---------^------訂-----^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央樣隼局員工消費合作社印製 - 6 1 _ 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） 458^〇 - A7 B7 五、發明説明（Μ ) 1 0 . 2.4糸統試驗加動可動增姐，之皆制此理鼠控因處小或。體之Ac果物理CK结姐處 G 之制體P-VI控物何表 K 姐任見較制在。示控’候顯。或外癥物性物lit性動應取。毒試反萃據之測物 Ac數顯Ac生 CN之明CN之 GiVE到G1大 P-表見P-更 Μ 見無無地有。並出著所重中論顯體物結物 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 4 5 8 J . A7 B7 五 '發明説明（6〇 ) 經濟部中央梂準局貝工消費合作社印製表W _動物重量及臨床觀察值群性刖劑量 (毫升）動物 « 體重（g) 第0天第3天體重改變毒性之癥候s HaCi ：雔 1.03 Ϊ 20.6 22.8 2.2 無 EtOH 雔 1.06 ΙΪ 21.1 23.4 2.2 無試驗雌 1,02 I 20.4 22.6 2.2 無 50毫升/ m 1.11 IV 22.2 24.5 2.2 無公斤雔 1.05 V 21.0 23.2 2.2 無平均 SD */- 21.0 0.7 23.3 0.7 HaCl：雔 1.04 VI 20.7 23.2 2.5 無 EtOH 雌 1*04 W 20.8 23.5 2.7 無控制姐雔 1.02 m 20.3 22.3 2.0 無 50毫升/ 雌 0.91 IX 18.2 20.6 2.4 無公斤雌 0.94 X 18.7 20.9 2.2 無平均 S1W- 19.7 1.2 22.1 1.3 PEG ：雔 1.02 XI 20.3 22.7 2.4 無試驗 m 0.96 X Π 19.2 21.4 2.2 無 10毫升/ 雌 0.95 XBI 18.9 21.6 2.7 無公斤 m 1.05 XIV 20.9 22.7 1.8 無雌 0.94 XV 18.7 21.2 · 2.5 無平均 SD +/- 19.6 1.0 21.9 0.7 PEG ' 雌 1.01 XVI 20.1 22.3 2.2 無控制姐雌 0,99 XVB 19.8 22.0 2.2 無 10克/ 雔 1.10 m 22.0 24.3 2.3 無公斤雔 1.07 XIX 21,4 23.6 2.2 無雌 1.03 XX 20.6 22.4 1.8 無平均 SD V- 20.8 0.9 22.9 1.0 在注射後0、4、24、48和72小時之覼察值之簡要。 ----------^------ir-----J. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 45 8. A7 B7五、發明説明（61 ) 1 1 .當瞄例：D-nirNAr再綑Sfl物在本節中所示之工作實施例中，P-GlcNAc硬結（16.2毫克）溶於1毫升含5S： UC1之二甲基乙醯胺溶液。含 p-GlcNAc之溶液置於注射筒内及擠人至50毫升純水中，Μ 沉澱潘維。生成之纖雄Μ掃描電子顯微鏡研究•如圖10所不。 12,首_例：逛o-GleNAc之湘胞逋結在本工作寅施例中，其示範p-GIcNAc代表對细胞在培_ 液中連結和生長之有效受質。 12.1材料街方法細胞：使用轉化小鼠3T3纖維母细胞及在M10胎兒牛血清 (FBS)補充之DMEM中生長。 p-G I cNAc m ： ?-01(：^(；根據在以上5.3.1和8§[!中所述之方法製備。 p-GIcNAc瞑先使用一滴水钻至<Π( 18毫米）康寧蓋玻片上及由在121亡下高壓蒸氣處理連結。Μ此方式製備之膜然後置於6并培養Η上之焙養井中。 Μ朐計8ί倌：在培養基中之细胞數由Κ血球計數計直接計數潮定及在計數前，先Μ新鲜培養基（Ε) Μ Ε Μ + 1 0 S； F B S )潤洗在基質上之膜，接著Μ胰蛋白酶（10%，在37 t：下5分）處理》 S R H擷作磙件：使用Zeiss 962儀器，其10 kv之加速電壓及15毫米之工作距離。使用如所示之不同放大之拍立得 (Polaroid)型號55 pin (u4> 。樣品被層：碳被層（100 -64- I---------..裝------訂------ ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） 45 898 7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（62 ) 埃）和1 0 0埃a u p d。樣本製備：為初步固定化，培養细胞生長培養基Μ無血清之2¾戊二醛於依哥氏（EaslesIDMEM代替。許多改變羥進行，Μ確定自生長培養基至固定劑之完全轉移。固定化在室溫下進行0.5小時。蓋玻片轉至具2¾戊二醛和0.1 «耳濃度蔗糖之0.1莫耳濃度二甲酸纳* pH 7.2之新鲜小槩瓶中，及在室溫下固定再1 . 5小時。脸水、ΓΡΠ、置时及飛猫绝布：樣品於0.1 «耳澹度二甲酸納· pH 7.2中潤洗及蓋玻Η 轉至CPD保持台。脫水在乙醇系列（30¾、50¾、75¾、85¾ 、953!和3 X 100¾，各5分）中進行及樣品在臨界點脫水。蓋玻片然後置放在A1段、碳塗布、使用真空蒸發器（在 100埃下）及M100埃AuPd飛濺塗布。 12 . 2结果 p-G1cNAc瞑姐測試形成受質之能力，在其中细胞在培養液中生長。小鼠纖維母细胞在井中生長，在有或無 p-GlcNAc瞑之存在，及妞胞數每天讀取Μ分析培養细胞之生存力。一個如此糸列之细胞數結果如圖1 4所示。如所示地*在平板接種第5天後，僅含p-G丨cNAc膜之井眭繼_維持生存细胞，顯示p-G!cHAc_能作為细胞在培養液中持績生畏之有效受質。再者|在圖15中描述之SEM顯微照片顯示健康®胞強烈地與P-G UNAc膜連結。 13.當瓶例/瞪原番白泜成物 -65- 本纸張尺度適用中國國家橾隼（CNS ) A4規格（21〇Χ 297公釐） . 装------訂----- (請先閲讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 45 898 7 A7 B7五、發明説明（65 ) 在本工作實施例中所述者係P-GUN Ac/膠原蛋白混成物之形成及特性化。 13. 1材料與方法材料：牛型工膠原蛋白係用於本研究中所述之混成物之製備。？-0丨(：^(；係根據在以上5.3.2節中所述之機械力方法製備。溫成物製備：膠原蛋白（10毫克/毫升）和P-GlcNAc( 0.25毫克/毫升）懸浮液Μ不同之比值混合、在液 Νζ(-δΟΧ：)下冷凍、在-9C下熱浸漬4小時及冷凍乾燥。材料在真空下（約0.030 Torr)及在601C下熱脫水交聯3天 Ο 细胞掊赛液：小鼠3Τ3纖維母细胞在所產生之膠原蛋白/ P-G丨cK Ac混成物中生長。依循標準培養程序及在培養液中 δ天後獲取SEH顯微照Η。 13.2结果膠原蛋白和Ρ - G 1 c N A c懸浮液以不同之比值（即3 : 1 、 1 :丨、2 : 2和1 ·· 3膠原蛋白：p -G ] c N Ac懋浮液比值）混合、冷凍、冷凍乾燥及交聯。如此程序產生穋原蛋白/ P - G 1 c N A c板。生成物質之S E Μ顯微照Μ如圖1 6 B - E中所示。圖1 6 Α代表僅有膠原蛋白之控制姐物質。注記混成物質之多孔结構。本發明之膠原蛋白/ P-GlcNAc混成物對细胞之連結和生長提供有效之三级结構，如在圖17A-D中之SEM顯微照Η 所示。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 458987 A7 B7 五、發明説明（64 ) 明顯地*本發明之許多修飾和變異·如在此說明地，可給僅例 0 施定實限體所具圍定範特利之專述請上申〇之晡附範所及由旨僅主明其發離本偏及不例而實成為達定 I--------- ^------1T-----A_ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2[〇X 297公釐）

Claims

45 898 7 第83U1374號專利申請案部中文申請專利範圍修正本(9〇年5月）给六、申請專利範圍 1. 一種多，冷-1 — 4_N_乙醯基葡萄糖胺，其包含以彡-丨— 4構形共價連結之4,000至i5〇〇〇〇個N-乙醯基葡萄糖胺單醣 '無蛋白質、完全無其他有機污染物、完全無無機污染物，且其具800,000道耳呑至3千萬道耳呑之分子量a 2. 根據申請專利範圍第1項之多-冷4_N -乙酶基葡萄糖胺’其中該種類包含以冷_丨—4構形共價連結之4〇〇〇至15,000個N -乙醯基葡萄糖胺單醣且具8〇〇,〇〇0道耳吞至3百萬道耳吞之分予量。 3. 根據申請專利範圍第1或2項之多_冷_1 — 4-N -乙酿基葡萄糖胺’其中該多·召— 乙醯基葡萄糖胺係細胞培養基質。 4. 根據申請專利範圍第項之多丨―4·ν·乙醯基葡萄糖胺種類，其中該多-冷-1 — 4-Ν -乙醯基葡萄糖胺係硬結、線、繩、微球、微珠 '膜、纖維、粉末或海綿。 5. 根據申請專利範圍第項之多·召-1 — 4_ν -乙醯基經濟部甲央橾準局負工消費合作社印製 I n . n II I 衣 I I I 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 葡萄糖胺，其中該多- — 4-Ν -乙醯基葡萄糖胺係一種三度空間基質配方。 6. 根據申請專利範圍第項之多- /3-1 — 4-N -乙醯基葡萄糖胺，其中至少一個N -乙醯基葡萄糖胺單醣己去乙醯化。 7. 根據申請專利範圍第6項之多- — 4-N -乙醢基葡萄糖胺，其中至少一個胜肽係官能性地連接至去乙醯化單本紙張尺度遑用中围國家橾準（〇那）人4洗格（210><297公釐） 4 5 8 9 8? as B8 C8 D8 —___________________—----—_ _ 六、申請專利範圍醣上。 8 ,根據申請專利範圍第7項之多-冷 '丨—4 - N -乙驢基葡萄糖胺，該胜肽係共價連接至去乙醯化單醣上。 9. 根據申請專利範圍第7項之多- -乙酿基葡萄糖胺，該胜肽係非共價連接至去乙醯化單醣上。 10. 根據申請專利範圍第7項之多— 4-N -乙醯基葡萄糖胺’其中該脸狀係一種生長因子’荷爾蒙，胜肽辨識序列’昆布氣酸，整合素（integrin)，或細胞附著分子。 11. 根據申請專利範圍第5項之多- — 4-N -乙醯基葡萄糖胺’其中該多- /5-1 — 4-N -乙酿基葡萄糖胺之形狀為硬結、線、繩、微球、微珠、膜、纖維、粉末或海綿。 12. 根據申請專利範圍第1或2項之多-冷-1 — 4-N -乙酿基葡萄糖胺，其中至少一個單醣具硫酸基、磺醯基、〇_ 醯基、N -醢基、〇 -烷基、N -烷基、N -亞烷基或ν·亞芳基。 13. 根據申清專利範圍第1或2項之多— 乙酿基經濟部中央揲丰局貝工消費合作社印装 - - I -- -i - ---I— - 1 - - *衣-1 I- I I 1 - (請先閱讀背面之注項再填寫本頁) 葡萄搪胺’其中至少一個單醣係磷酸化衍生物、硝酸化衍生物、鹼衍生物或去氧齒素衍生物。 14. 根據申請專利範圍第1或2項之多-/5 -乙隨基葡萄糖胺’其中至少一個單醣形成鹽或金屬螯合物。 15. 根據申請專利範園第1或2項之多- /S-I — 4-N -乙醯基葡萄糖胺，其中該多-召·丨—in·乙醯基葡萄糖胺係自微讓來源分離。本紙張·尺度適用中國國家梯车（CNS ) A4規格（210χ 297公着） -2 - 4 5 8 9 8 7 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 16‘根據申請專利範圍第丨5項之多-θ_ι—4_Ν-乙醯基葡萄糖胺’其中該微藻來源係矽藻來源， 17. 根據申請專利範圍第16項之多-泠-丨 — 4-N -乙醯基葡萄糖胺’其申該矽藻係Thallasiosirn凰。 18. 根據申請專利範圍第丨7項之多-冷_丨— 4·Ν -乙醯基葡萄糖胺，其中Thallasiosira属之矽藻係Thallasiosira Fluviatilis或 Thallasiosira Weissflogii。 19. 一種多-冷-1 — 4 -葡萄糖胺，其包含以；5_丨—4構形共價連結之4,〇〇〇至150,〇〇〇個葡萄糖胺單醣 '無蛋白質、完全無其他有機污染物、完全無無機污染物，且具 640,000道耳呑至2千4百萬道耳吞之分子量。 20. 根據申請專利範圍第is»項之多- ΐ — ι葡萄糖胺，其 t該多-泠-l — 4-Ν -乙醯基葡萄糖胺包含以泠_丨—4構形共價連結之4,000至15,000個葡萄糖胺單醣，且具 640,000道耳吞至240萬道耳吞之分子量。 21. 根據申請專利範園第〗9至2〇項之多-石-丨—4_葡萄糖胺種類，其中至少一肽係與葡萄糖胺單醣官能地連結。 22. 根據申請專利範圍第21項之多-沒-l — 4 -葡萄糖胺，其 t該肽係與葡萄糖胺單醣共價連結^ 23. 根據申請專利範圍第21項之多-厶-1 — 4-葡萄糖胺，其中該肽係與葡萄糖胺單醣非共價地連結。 24. 根據申請專利範圍第21項之多- — 4 -葡萄糖胺，其中該肽係生長因子' 荷爾蒙、胜狀識別序列、昆布氨酸、整合素（integrin)或細胞附著分子》本紙法尺度遙用中國®家樣準（CNS )八4現格（210X297公釐） ' 〜 In - 1 - - I II— - I m ί - --1 In - -- -(請先閱讀背面之注$項再填寫本頁) 經濟部中央螵隼局貝工消费合作社印氧 -3- 45 898 7 ABCD 經濟部中央榡隼局負4消费合作社印策六、申請專利範圍 25. 根據申請專利範圍第丨9或2〇項之多-冷-1 — 4-葡萄糖胺，其中至少一個葡萄糖胺單醣係經己去醯化。 26. 根據申請專利範圍第25項之多-厶-丨―4·葡萄糖胺，其中至少一胜肽係官能地連結至葡萄糖胺軍醣上。 27. 根據申請專利範圍第26項之多-石-丨—4_葡萄糖胺，其中該胜狀係共價連結至葡萄糖胺單醋上<= 28. 根據申請專利範圍第26項之多- ^-1 — 4-葡萄糖胺，其中該胜狀係非共價地連結至葡萄糖胺單酿上。 29. 根據申請專利範圍第26項之多-冷_ 1 — 4 -葡萄糖胺，其中該胜肽係生長因子、荷爾蒙、胜肽識別序列、昆布胜肽、整合素（integrin)或細胞附著分子。 30. 根據申請專利範圍第丨9或20項之多- /3-1 — 4 -葡萄糖胺’其中至少一個單醣具硫酸基、磺醯基、〇 -醯基、 N -醯基、〇 -烷基、N·烷基、N -亞烷基或N -亞芳基。 31. 根據申請專利範圍第19或20項之多-点-1~^4 -葡萄糖胺，其中至少一個單醣係磷酸化衍生物、硝酸化衍生物、鹼衍生物或去氧鹵素衍生物。 32. 根據申請專利範圍第19或20項之多-jS - 1 — 4 -葡萄糖胺’其中至少一個單醣形成鹽或金屬螯合物a 33. —種多-召-1 — 4 -葡萄糖胺，其包含共價性連結至其 /3 - 1 — 4構造上之4,000至150,〇〇〇個葡萄糖胺單醣，其係無蛋白質、實質無其他有機污染物、實質無其他無機污染物’其中至少一個葡萄糖胺單醣係經去乙醯化。 34. 根據申請專利範圍第33項之多- 召- l 一 4 -葡萄糖胺，其本紙張尺度邊用中國B家揉準（CNS )八4说格（210χ 297公羡） I I ^^1 I..... - I - - -I- I —^1 1^ —1-1 TJ ^ *? (請先Μ讀背面之注_項再填寫本頁) -4- 4 5 8 9 8 ? Α8 BS C8 D8 經濟部中央橾準局負工消费合作社印製六、申請專利範圍中至少25%至75%之葡萄糖胺單醣係經去乙醯化= 35. 根據申請專利範圍第34項之多—4-葡萄糖胺，其中至少30%之葡萄糖胺係經去乙醯化。 36. 根據申請專利範圍第19或33項之多-沒· I — 4-葡萄糖胺’其中該多，召- 丨 — 4- N-乙醯基葡萄糖胺之形狀為硬結、線、繩、微球體、微珠狀、膜、纖維、粉末或海綿。 37·根據申請專利範圍第19或33項之多-冷-1 — 4-葡萄糖胺’其中該多·召_丨_>4·Ν -乙醯基葡萄糖胺係一種三維基質配方。 3 8, 一種多-乙醢基葡萄糖胺衍生物，其包含申請專利範圍第i或2項之多-召_丨—4 _ N ·乙醯基葡萄糖胺’其中至少一種N -乙醯葡萄糖胺單醣係經去乙醯化= 39. 根據申請專利範圍第38項之多-召_ i — iN -乙醯基葡萄糖胺衍生物’其中至少25%至75%之N-乙醯基葡萄糖胺單醣係經去乙醯化。 40. 根據申請專利範圍第38項之多-泠·丨―4^-乙醯基葡萄糖胺衍生物’其中該衍生物之形狀為硬結、線、繩、微球體、微珠狀、膜、纖維、粉末或海棉。 41. 根據申請專利範圍第38項之多- 召- l — 4-N -乙醯基葡萄糖胺衍生物，其中該衍生物係一種三維基質配方。 42. 根據申請專利範圍第39項之多-泠-丨―4·Ν-乙醢基葡萄糖胺衍生物，其中至少70%之Ν -乙醯葡萄糖胺單醣係本纸張尺度逋用中國國家揉準（CNS ) Α4说格（210X297公釐） ~ I -- - - - - - In 1-1 11 - ------I ' _ _ ____ in ^—Ψ (请先聞讀背面之注意事項再填寫本 -5- 45 45 〇 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍經去乙醯化。 - - = I - - ^^1 I - - - n 冬 II. - -I - (請先閲讀背面之注意^項再填寫本頁) 43. —種多-冷-丨―4-N -乙醯基葡萄糖胺衍生物，其包括申請專利範圍第1或2項之多_沒-丨—4·Ν -乙醯基葡萄糖胺’其中至少一種單醣包含硫酸基、颯基、〇 -醯基、 Ν -醯基、〇·烷基、Ν_烷基、ν_亞烷基或Ν_亞芳基。 44. 一種多-冷」—4·Ν_乙醯基葡萄糖胺衍生物，其包括申請專利範圍第1或2項之多-冷_丨—4·Ν -乙醢基葡萄糖胺’其中至少一種單醣為磷酸化衍生物、蛸化衍生物、驗衍生物或去氧齒素衍生物。 45. —種多_冷_〖—4-N -乙酷基葡萄糖胺衍生物，其包括申請專利範圍第1或2項之多- — 4-N -乙醯基葡萄糖胺，其中至少一種單醣形成鹽類或金屬螯合物。 46. —種多-冷-1 — 4 -葡萄糖胺衍生物，其包含申請專利範圍第19或33項之多-/3-1 — 4 -葡萄糖胺，其中至少一個單醣係包含硫酸基、颯基、〇 -醯基、N -醯基、〇_燒基、N-烷基、N -亞烷基或N -亞芳基。經濟部中央樣準局負工消f合作社印策 47. —種多-泠-1 — 4 -葡萄糖胺衍生物，其包含申請專利範圍第丨9或33項之多-石-l — 4-葡萄糖胺，其中至少一個單醣係為磷酸化衍生物、硝化衍生物、鹼衍生物或去氧鹵素衍生物。 48. —種多-冷-l — 4-葡萄糖胺付生物，其包含申請專利範圍第19或33項之多-沒-l — 4 -葡萄糖胺，其中至少一個單號係形成鹽類或金屬螯合物。 49. 一種多-召-丨一4-葡萄糖胺’其包含申請專利範圍第19 本紙張尺度適用中國國家糅舉（CNS > 说格（2丨0 X 297公釐) ' -6 - 45 898 7 經濟部中央梂率扃貞工消费合作杜印製 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍或33項之多- yS-丨 —4 -葡萄糖胺，其中至少一種單醣係含有内酯。 50. —種分離多- — 4-N -乙酿基葡萄糖胺（p_gicnAc)種類之方法，該種類包含以冷-1 — 4構形共價連結之4,000 至150,000個N -乙醯基葡萄糖胺單醣、無蛋白質、完全無其他有機污染物、完全無無機污染物，且具800,000 道耳吞至3千萬道耳呑之分子量，其包括： (a) 將生長於無菌培養之微藻，該微藻細胞體和多-yS-1 — 4-N -乙醯基葡萄糖胺纖維，接受機械力一段足以將細胞體與多-冷-1 — 4-N -乙醯基葡萄糖胺纖維分開之時問； (b) 使多-泠-1 — 4-N -乙醯基葡萄糖胺纖維與細胞體分離；和 (C)自分離之多-召-l — 4-N -乙醯基葡萄糖胺纖維除去所有蛋白質、實質上所有其他有機污染物，及實質上所有之無機污染物，因而分離多- jS-l — 4-N -乙隨基葡萄糖胺。 51. 根據申請專利範圍第50項之方法，其中所分離之多-冷，1 — 4-1^-乙醯基葡萄糖胺包含4,000至15,000個>4-乙醢基葡萄糖胺單醣且具800,000道耳吞至3千萬道耳吞之分子量。 5 2 ·根據申請專利範圍第5 〇項之方法，其中該機械力係剪力或切力。 53.根據申請專利範圍第50項之方法，其中該微藻係矽藻。 - -- an ^i·— I— IP a-I^i i * (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度逋用中國®家#率（CNS ) A4规格（2丨0X297公簸） 45 898 7 經濟部中央標隼局真工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 54. 根據申請專利範圍第53項之方法，其中該矽藻係 Thallasiosira fluviatilis；厲= 55. 根據申請專利範圍第54項之方法，其中Thallasiosira屬之梦薄係 Thallasiosira fluviatilis 或 Thallasiosira Weissflogii ° 56. —種分離多-泠-1 — 4-N -乙醯基葡萄糖胺（p-GlcNAc)種類之方法，該種類包含以召-1 — 4構形共價連結之4,000 至150,000個N -乙醯基葡萄糖胺單醣、無蛋白質、完全無其他有機污染物、完全無無機污染物且具800,000道耳呑至3千萬道耳吞之分子量，包括： (a) 以能弱化微藻細胞壁之化學品，處理包括細胞體和多- — 4-N·乙醯基葡萄糖胺纖維之微藻一段充足之時間’以使多- /5-1 — 4-N -乙醯基葡萄糖胺纖維自完整的細胞體釋出； (b) 使多-/3 · 1 — 4 - N -乙醯基葡萄糖胺纖维與細胞體分離；和 (c) 自分離之多- — 4-N，乙醯基葡萄糖胺纖维除去所有蛋白質、一切所有之其他有機污染物，和一切所有之無機污染物，因而分離多- 石- l — 4-N -乙醯基葡萄糖胺纖維。 57. 根據申請專利範圍第56項之方法，其中所分離之多_点· 1 — 4-N -乙醯基葡萄糖胺包含4,〇〇〇至15,〇〇〇個n _乙醯基葡萄糖胺單醣且具800,000道耳吞至3百萬道耳吞之分子量。本紙張尺度適用t國國家揉準（CNS 说格（210X297公釐） ---- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,1T -8, 45 898 7 A8 B8 C8 D8 經濟部中央橾隼局負工消費合作杜印装六、申請專利範圍 58_根據申請專利範圍第56項之方法，其中能弱化微藻細胞壁之化學品係氫氟酸。 59. 根據申請專利範圍第56項之方法’其中該微藻係矽藻。 60. 根據申請專利範園第59項之方法，其中該矽藻係 Thallasi nsira 辱。 6 1.根據申請專利範圍第6〇項之方法，其中Thallasiosira屬之珍藻係 Thallasiosira fluviatilis L· Thallasiosira Weissflogii » 62.根據申請專利範圍第56項之方法’進一步包含在步騾 (c) 前中和該經分離之多-冷，丨―4_n -乙醯基葡萄糖胺纖維。 63 .根據申請專利範圍第62項之方法，在步驟（c )之後，進一步包含： (d) 將分離出之多-彡-1 —4-N -乙醢基葡萄糖胺種類置於鹼性pH之環境中。 64. 根據申請專利範圍第63項之方法，進一步包含. (e) 添加一種藥物於多·冷d — iN -乙醯基葡萄糖胺’以使該藥及多-冷-1 — 4- N-乙醯基葡萄糖胺皆存在於鹼性pH值環境中，以及 (f) 降低該驗性pΗ環境之pH值*以使藥物封裳於續多· — 4，N -乙隨基葡萄糖胺中。 65. 根據申請專利範圍第5 0項之方法，其包括： (a)於中性之經減菌的培養液中，培養包含細胞體及多-/5 - 1 — 4 - N -乙醯基葡萄糖胺纖維之微藻；本紙浪尺度逋用令明困家樣準（<^5以4说格（2丨0父297公釐） ---- In —^ϋ I - - -I - - - - - -I I n n^i ^^^1 ^^^1 ^^^1 ^^1^ai (请先閲讀背面之注項再填寫本頁) 45 898 7 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍以將細 4，Ν -乙醯基葡萄糖胺纖維中分出 (b)每8至12小時攪拌步驟（a)中之培養液—次_ (C)對該微藻施以機械性外力一段足夠之時間，胞體自多-召μ 來； ⑷將I田胞體與多n —4|己醯基葡萄糖胺纖維分離； (e)以有機溶劑或清潔劑處理該多_点·丨〜一、、 1N ·乙酶基匍萄糖胺纖維，因此所有蛋白質、一切所有之其他有機污染物，和—切所有之無機污染物，皆自該分離之多_ -1 —4-N_乙醯基葡萄糖胺纖維中移除，而多卢-乙醯基葡萄糖胺亦經分離。 66_根據申請專利範園第65項之方法，其中該分離出之多_ 万-1 — 4-Ν -乙醯基葡萄糖胺包含4〇〇〇至15〇,〇〇〇之Ν· 乙酸葡萄糖單醣，且具8〇〇,〇〇〇道耳吞至3百萬道耳呑之分子量。 67. 根據申請專利範圍第65項之方法’其中該機械外力係剪力或切力。 68. 根據申請專利範圍第65項之方法，其中該微藻係為碎藥。 69. 根據申請專利範圍第68項之方法，其中該>5夕漢係為 Thallasiosira/1 ° 70. 根據申請專利範圍第69項之方法，其中該Thallasiosira 屬之碎条係 Thallasiosira fluviatilis 成 Thaliasiostra Weissfloeit - 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS > A4規格（21〇X297公釐） (請先閲讀背面之注項再填寫本頁) 訂經濟部卡央揉隼局貝工消费合作社印製 -10 - 經濟部中央橾準局負工消費合作社印*. 4 5 898 7 as f C8 _ D8 六、申請專利範圍 71. 根據申請專利範圍第65項之方法’其中該絰減菌之培養中間質之pH值係7.0至7.4。 72. 根據申請專利範圍第71項之方法，其中該經滅菌之培養 t間質之PH值係以溶於該滅菌培養液中之二氧化破纖維。 73. 根據申請專利範圍第65項之方法，其中該多-冷_丨—4_ N -乙醯基葡萄糖胺纖維係藉由固定角度離心機自細胞趙分離。 74. 根據申請專利範圍第71項之方法，其中該有機溶劑係乙醇。 76.根據申請專利範圍第56項之方法，其中步驟（a)包括以可抑制多- /S-1 — 4-N -乙醯基葡萄糖胺纖維合成之生物劑處理包括細胞體和多- /S-l — 4-N-C酿基葡萄糖胺纖维之微漢一段足以使多-卢-1 — 4 - N -乙酷基葡萄糖胺纖維自細胞體釋出之時間。 7入根據申請專利範圍第76項之方法，其中所分離之多_石_ 1 — 4- N-乙酷基葡萄糖胺包含4,000至15, 〇〇〇個N -乙酿基葡萄糖胺單醣且具800,000道耳呑至3百萬道耳吞之分子量》 7 8.根據申請專利範圍第7 6項之方法，其中該生物劑係多氧菌素-D。 79. 根據申請專利範圍第76項之方法，其中該微蕩係碎蓬。 80. 根據申請專利範圍第79項之方法，其中該5夕蓬係 Thallasiosira屬。本纸張尺度逋用中國國家搞準（CNS } A4規格(210X297公釐） ~ --- <請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 訂 -11 - 4 5 7 as C8 D8 1 |__ --- - . 六、申請專利範圍 8 1.根據_ ^專利圍第80項之方法，其中Thallasiosira屬之碎漢係 Thallasiosira flaviatilis 或 Thallasiosira Weissflogii。 82. —種由根據申請專利範圍第50，5 1，53，56，57，65，76 或77項之方法分離之多，泠_i_>4-N -乙醯基葡萄糖胺。 83. —種分離多-召-l —4-N -乙醯基葡萄糖胺之方法，該其多-泠-1 — 4-N-乙醯基葡萄糖胺包含以召·ι — 4構形共價連結之4,000至15〇,〇〇〇個Ν -乙醯基葡萄糖胺單醣、無蛋白質、完全無其他有機污染物、完全無無機污染物且具800,000道耳吞至3百萬道耳吞之分子量，包括： (a) 以能合成多-/3-1 — 4-Ν -乙醯基葡萄糖胺織維之生物劑處理包括細胞體和多-冷-1 — 4-N<乙醯基葡萄糖胺纖維之微藻一段足以使多-泠-1—4-N -乙醯基葡萄糖胺纖維自細胞體釋出之時間； (b) 使多-泠-1 — 4-N -乙醢基葡萄糖胺纖維與細胞體分離；及經濟部中央標窣局男工消費合作社印策 l^n ^^^1 HI n 1 - I - —I- I— in nnr {請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) (c) 自分離之多-泠-1 — 4-N -乙醯基葡萄糖胺纖維除去所有蛋白質、一切所有之其他有機污染物，和一切所有之無機污染物，因而分離多-沒-1 — 4-N·乙醯基葡萄糖胺。 84. 根據申請專利範圍第82或83項之多· /5 - 1 —4-Ν·乙醯基葡萄糖胺，其中該多- 沒- l — 4-Ν -乙醯基葡萄糖胺具有不包含1740(:111-1尖峰之IR光譜° 85. —種由根據中請專利範圍第64項之方法製成之藥物/ -12- 45 898 7 經_部t央揉率局負工消费合作社印裝 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍 " ~ 多，沒_1—4·Ν-乙醯基葡萄糖胺膠囊化物。 80‘一種藥物/多-沒-l —4-Ν-乙醯基葡萄糖胺組合物，以沒-丨—4構形共價連結之4,000至15〇〇〇〇個Ν -乙醯基葡萄糖胺單醣、無蛋白質、完全無其他有機污染物、完全無無機污染物且具800,000道耳呑至3千萬道耳呑之分子量’其中藥物係封裝於其中。 87. 根據申請專利範圍第86項之藥物/多-冷-乙睡基葡萄糖胺組合物’其中至少一種Ν -乙酿葡萄..糖單驢係經乙醯化。 88. 根據申請專利範圍第86或8：7項之藥物/多·沒丨—仁心乙醯基葡萄糖胺組合物，其中該封裝之藥物係為抗生物性、抗發炎剤、抗真菌劑、抗原生動物劑或除精劑β 89. —種藥物/多-沒-1 — 4-葡萄糖胺組合物，以構形共價連結之4,000至150,000個Ν-乙醯基葡萄糖胺單醣 '無蛋白質、芫全無其他有機污染物、完全無無機污染物且具640,000道耳吞至2千4佰萬道耳呑之分子量，其中藥物係封裝於其中。 90. 根據申請專利範圍第89項之藥物/多-冷_丨—4·葡萄糖胺組合物，其中該封裝之藥物係為抗生物性、抗發炎劑、抗真菌劑 '抗原生動物劑或除精劑。 91. 一種藥物/多-彡-1 — 4- N-乙醯基葡萄糖胺组合物，以 /3 - 1 — 4構形共價連結之4,000至150,000個N -乙酿基葡萄糖胺單醣、無蛋白質、完全無其他有機污染物、完全無無機污染物且具800,000道耳吞至3千萬道耳吞之分子 (請先闉讀背面之注意事項再填寫本寅) 本紙張尺度逋用中國國家搮率（CNS )八4規_格（210X297公釐） 4b 898 7 A8 B8 C8 D8 經濟部中央椹準局貝工消费合作社印策六、申請專利範圍〜量，其中至少一種^-乙醯葡萄糖胺單醣係經乙醯化，且其中至少一種胜肽係官能性連結至該多-冷—1 — 4 · N _ 乙醯基葡萄糖胺之經乙醯化的單醣上， 92. 根據申請專利範圍第91項之藥物/多-石·丨—4 _ n _乙酿基葡萄糖胺組合物，其中該胜肽係共價連結至去乙酿單醣上。 93. 根據申請專利範圍第91項之藥物/多·冷M〜4_N.乙随基葡萄糖胺組合物，其中該胜肽係非共價連結至去乙酶單醣上。 94. 根據申請專利範圍第91項之藥物/多-^ — 4_N_乙睹基葡萄糖胺組合物’其中該胜肽係一種生長因子，荷爾蒙’胜肽辨識序列’昆布氨酸’整合素（integrin)，或細胞附著分子。 95. —種藥物/多- —4_葡萄糖胺，其包含多-召-丨― 葡萄糖胺’其包含/S-1 — 4構形上共價键結了自4,000個至150,000個葡萄糖胺單醣、無蛋白質、完全無其他有機污染物 '完全無其他無機污染物，且具有640,000至2 千4百萬道耳吞之分子量，其中至少一個多- — 葡萄糖胺之葡萄糖胺單醣包含一共價鍵結於其上之胜肽。 96. 根據申請專利範圍第95項之藥物/多-召-1 一 4-葡萄糖胺，其中該胜肽係共價鍵結於葡萄糖胺單醣上。 97. 根據申請專利範圍第95項之藥物/多- 冷- l — 4 -葡萄糖胺，其中該胜肽係非共價键結於葡萄糖胺單醣上。本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4洗格（210X 297公釐） I ^^1 I - - ^—^1 - - i ――I I - - . - --11 III -- - (請先閎讀背面之注意Ϋ項再填寫本I } -14 - a b 898 7 8 8 0〇 8 ABCD 經濟部中央橾準局員工消费合作社印装六、申請專利範圍 98.根據申請專利範圍第95項之藥物/多-卢·丨—扣葡萄糖胺’其中該胜肽係一種生長因子’荷爾蒙，胜狀辨識序列，昆布氨酸，整合素（integrin)，或細胞附著分子。的.一種分離之藥物/多-召d — 4_N_乙醯基葡萄糖胺膠囊化物’包括由根據申請專利範圍第1或2項之多-沒_丨— 4-N -乙醯基葡萄糖胺葡萄糖胺種類膠囊化之藥物。 100. —種分離之昆成物組合物，包括與膠原蛋白種類交聯之根據申請專利範園第1或2項之多-沒-丨―乙醯基葡萄糖胺。 101·根據申請專利範圍第1 0 0項之分離之混成物组合物，其中至少一個N·乙醯基葡萄糖胺單醣己去乙醯化3 102. 根據申请專利範圍第1 〇〇項之分離之混成物组合物，其中至少一個單醣具硫酸基、磺醯基、Ο.醯基、N-醯基、0 -垸基、基、N -亞娱基或N -亞芳基。 103. 根據申請專利範圍第1 〇〇項之分離之混成物组合物，其中至少一個單睹係磷酸化衍生物、确酸化衍生物、驗衍生物或去氧素衍生物。 1〇4.根據申請專利範圍第i 〇〇項之分離之混成物组合物，其中至少一個單醣形成鹽或金屬螯合物。 105•—種分離之混成物組合物，包括與膠原蛋白種類交聯之根據申請專利範圍第19或20項之多- — 4 -葡萄糖胺。 1〇0.根據申請專利範固第1 〇 5項之分離之混成物組合物，其中至少一個葡萄糖胺單醣係經己去醯化。 107‘根據申請專利範圍第105項之分離之混成物組合物，其本纸法ΛΑϋ财縣（CNS)八4胁（2丨Gx297公兼） *—- (請先《讀背面之注意事項再填寫本頁) -15- 經濟部中央樣隼局身工消費合作社印製 4¾ 7 b8 _ D8 六、申請專利範圍中至少一個單醣具硫酸基、磺醯基、0 -醯基、N -聽基、〇·烷基、N-烷基、N-亞烷基或N-亞芳基。 108. 根據申請專利範圍第丨〇5項之分離之混成物組合物，其中至少一個單醣係磷酸化衍生物、硝酸化衍生物、鹼衍生物或去氧自素衍生物》 109. 根據申請專利範圍第1〇5項之分離之混成物組合物，其中至少一個單醣形成鹽或金屬螯合物β 110. —種生物可降解之障壁形成物質，其包含多- — ι N -乙醯基葡萄糖胺’其包含以— 4構形共價連結之 4,000至150,000個N-乙醯基葡萄糖胺單醣 '無蛋白質、冗全無其他有機污染物、冗全無無機；亏染物且具 800,000道耳呑至3千萬道耳吞之分子量。 111. 根據申請專利範圍第110項之生物可降解之障壁形成物質’其中至少一種N，乙酿葡萄糖胺單聽係經乙酿化β 112. 根據申請專利範圍第ui項之生物可降解之障壁形成物質，其中該多-占-1—4-Ν -乙醯基葡萄糖胺具有至少— 個官能性連結至去乙醯單醣上之内酯基囷。 113. —種生物可降解之障壁形成物質，其包含分離之多-点， I — 4 -葡萄糖胺，其包含以卢-1 — 4構形共價連結之 4,000至150,000個葡萄糖胺單醣、無蛋白質、完全無其他有機污染物、完全無無機污染物且具64〇,〇〇〇道耳呑至2千4百萬道耳呑之分子量。 114. 根據申請專利範圍第U3項之生物可降解之障壁形成物質’其中该多-泠-l — 4-¾¾糖胺具有至少一個官能性連結至去乙醯單醣上之内酯基團。本紙張尺度逋用中®國家揉牟（CNS > A4规格（2〖〇 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) *1T -16 -