BRPI0014652B1 - fabricação de conjugados de agente terapêutico-poliglutamato - Google Patents
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Abstract
"fabricação de conjugados de agente terapêutico-poliglutamato". a invenção provê novos processos para preparação de conjugados de agente terapêutico e ácido poliglutâmico para desenvolvimento clínico e uso farmacêutico e conjugados de agente terapêutico-ácido poliglutâmico preparados de acordo com estes processos.
Description
FABRICAÇÃO DE CONJUGADOS DE AGENTE TERAPÊUTICO- POLIGLUTAMATO
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se a um processo para fabricação, de forma escalonada, de conjugados de agente terapêutico-poliglutamato para desenvolvimento clínico.
HISTÓRICO DA INVENÇÃO O respectivo agente paclitaxel antitumor mostra eficácia aumentada e toxicidade diminuída, quando administrado aos hospedeiros portando tumor como um conjugado de ácido poli-glutâmico em comparação com a relativa forma não conjugada do medicamento (Patente US Número 5.977.163; Li e outros, Câncer Res., 58:2404, 1998). O respectivo conjugado de ácido- paclitaxel poliglutâmico mostra uma solubilidade em água aumentada, uma liberação mais lenta do corpo e um acúmulo aumentado no tumor. É esperado que os conjugados de ácido poliglutâmico e vários outros agentes terapêuticos forneçam alternativas clinicamente úteis às formulações presentemente disponíveis.
Para propósitos de pesquisa, os conjugados de agente 1 terapêutico-ácido poliglutâmico podem ser produzidos pelo processo revelado em Li e outros, ibid. Naquele processo, o conjugado é preparado como um sal de sódio, dializado para remoção de contaminantes de baixo peso molecular e sal em excesso e então liofilizado. Contudo, o processo não é bem adequado para a fabricação em grande escala de quantidades de conjugados para o desenvolvimento clínico e o emprego. Em particular, o emprego de diálise para remover impurezas consome tempo e abaixa o rendimento do produto final. Além disso, embora muitas substâncias farmacêuticas possuam propriedades mais favoráveis quando preparadas como sais (por exemplo, solubilidade aperfeiçoada, armazenamento e manuseio) , isto não é verdadeiro para os conjugados de agente terapêutico-poliglutamato da presente invenção. As formas de sal dos conjugados são sólidos eletrostáticos, não são sais de escoamento livre. Eles são mais difíceis de serem empacotados, mais suscetíveis à contaminação por poeira e mais prováveis de contaminarem o local de trabalho com agentes citotóxicos do que os pós de escoamento livre. Portanto, existe a necessidade de um processo aperfeiçoado de fabricação de conjugados de agente terapêutico-ácido poliglutâmico que possam ser usados para produzir quantidades de 1 grama a centena de gramas destes conjugados com alto rendimento e em um modo que forneça manuseio e empacotamento de material aperfeiçoado.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção satisfaz a necessidade de fornecimento de um processo aperfeiçoado para preparação de conjugado de agente terapêutico-ácido poliglutâmico que seja capaz de prover quantidades de grama a quilograma de conjugado de classificação farmacêutica, com rendimentos entre 85% e 98% ou entre 85% a cerca de 98%.
Em uma concretização, o processo compreende: (a) provisão da forma protonada de um polímero de ácido poliglutâmico e um agente terapêutico para conjugação do mesmo; (b) ligação covalente do agente ao polímero de ácido poliglutâmico em um solvente orgânico em inerte para formar um conjugado de agente terapêutico e ácido poliglutâmico; (c) precipitação do conjugado de agente terapêutico e ácido poliglutâmico da solução, por adição de um volume em excesso de solução de salmoura aquosa; e (d) coleta do conjugado como um sólido protonado. A remoção adição dos contaminantes de peso molecular baixo residuais pode ser realizada entre as etapas (c) e (d) ou após a etapa (d).
Em outra concretização que é presentemente mais preferida, a geração in si tu de um agente terapêutico-ácido poliglutâmico é realizada por um processo que compreende: (a) suspensão de um sal do polímero de ácido poliglutâmico em um solvente orgânico inerte; (b) protonação do polímero por adição de um ácido anidro à suspensão, para formar um sal solúvel da base conj ugada ; (c) provisão de um agente terapêutico e ligação covalente do agente ao polímero de ácido poliglutâmico para formar um conjugado de agente terapêutico e ácido poliglutâmico; (d) precipitação do conjugado de agente terapêutico e ácido poliglutâmico da solução por adição de um volume em excesso de solução de sal aquosa; e (e) coleta do conjugado como um sólido protonado.
Em outra concretização, o processo para fabricação em larga escala de conjugado de ácido poliglutâmico-2'-paclitaxel compreende: (a) provisão de uma solução aquosa do sal de sódio de ácido poli-L-glutâmico; (b) acidificação da solução, para um pH de cerca de 2 a 4, desta forma convertendo o sal de sódio de ácido poli-L-glutâmico na forma protonada e precipitando a mesma da solução; (c) coleta do precipitado de ácido poli-L-glutâmico e lavagem do precipitado com água; (d) secagem do ácido poli-L-glutâmico para um teor de água entre cerca de 2% a cerca de 7%, preferivelmente entre cerca de 7% e 21% e, mais preferivelmente, entre cerca de 7% a cerca de 21% em peso; (e) contato do ácido poli-L-glutâmico com paclitaxel sob condições de acoplamento padrão, por tempo suficiente para conjugar o paclitaxel ao polímero de ácido poliglutâmico, através de uma ligação de éster formada entre o grupo 2'-OH de paclitaxel e um grupo carbõxi de ácido poli-L-glutâmico,- (f) resfriamento da mistura de reação entre 0°C a 10°C, ou entre 0°C a 10 °C, enquanto adicionando lentamente solução de sal aquosa à mistura de reação; (h) acidificação da suspensão resultante; (i) coleta do conjugado como um sólido protonado; e (j) extração das impurezas do sólido protonado. É mais preferido para uma fabricação em larga escala de conjugado de ácido poliglutâmico-21-paclitaxel substituir pelas etapas (a)-(d) acima, etapas (a') e (b'): (a1) provisão de uma suspensão de sal de sódio de ácido poli-L-glutâmico, ou um sal de ácido poli-L-glutâmico de lítio, potássio ou amônio quaternário em um solvente orgânico inerte; e (b' ) adição de cerca de 0,95 equivalente de ácido trifluoracético ou ácido metanosulfônico, desta maneira formando uma solução compreendendo trifluoracetato de sódio de ácido poli-L-glutâmico ou metanosulfonato de sódio de ácido poliglutâmico e realizando as etapas (e)-(j) conforme descrito acima.
Qualquer conjugado de agente terapêutico-ácido poliglutâmico pode ser preparado pelos processos descritos aqui. Em uma concretização, os agentes terapêuticos são agentes antitumor, por exemplo, paclitaxel, docetaxel, etoposido, teniposido, epotilonas, tais como, epotilona A, epotilona B, epotilona C, epotilona, epotilona F e 12,13-disoxiepotilona F; gencitabina, 20 (S) (+)camptotecina, 9- aminocamptotecina, 9-nitrocampotecina, 7-etil-10- hidroxicamptotecina, 9-dimetilaminometil-10 - hidroxicamptotecina, 10,11-metilenodioxicamptotecina, 7- metilpiperi zonometil-10,11-etilenodioxicamptotecina, flavopiridol, geldanamicina, 17 -(alilamino)-17- dimetoxigeldanamicina, ecteinascidina 743, pftalascidina, CT-2584 (1-(11-dodecilamino)-10-hidroxiundecil)-3,7- dimetilxantina, CT-4582 (1 - (11-(N-metil N-dodecil amino)- 10-hidroxiundecil)-3,7-dimetilxantina) , doxorubicina, adriamicinona; melfalana; fludarabina; daunomicina; verapamil; 5-flúoracila; floxuridina (FUDR), ciclosporina, ácidos retinóicos; 7-dimetil-tert-butilsilióxi)-10-hidróxi camptotecina e outros.
DESCRIÇÃO DETALHADA DOS DESENHOS
Figura 1 - exemplos de conjugados.
Figura 2 - Esquema de Fabricação para conjugado de ácido poli-L-glutâmico-paclitaxel.
Figura 3 - Varredura de NMR de próton de conjugado de ácido poli-L-glutâmico-paclitaxel.
Figura 4 - Preparação de ácido poli-L-glutâmico- glicil-20 (S) -camptotecina.
Figuras 5-7 - Esquemas de Reação I-III.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições Conforme usado aqui, um "ácido poliglutâmico" ou "polímero de ácido poliglutâmico" inclui poli(l-ácido glutâmico), poli(d-ácido glutâmico) e poli(dl-ácido glutâmico). Preferivelmente, o polímero de ácido poliglutâmico compreende, pelo menos 50% de seus resíduos de aminoácido como ácido glutâmico e, mais preferivelmente 100%. O polímero de ácido poliglutâmico pode ser substituído até 50% por aminoácidos modificados quimicamente, ocorrendo naturalmente, preferivelmente aminoácido hidrófilos, contanto que, quando conjugado para um agente terapêutico, o polímero de ácido poliglutâmico substituído tenha solubilidade aquosa aperfeiçoada e/ou eficácia aperfeiçoada em relação ao agente terapêutico não conjugado, e seja preferivelmente não imunogênico. O peso molecular do polímero de ácido poliglutâmico usado na preparação do conjugado pelos processos descritos aqui é tipicamente maior do que 5.000 daltons, preferivelmente de 15 kd a 80 kd, mais preferivelmente de 20 kd a 80 kd, mesmo mais preferivelmente de 20 kg a 60 kd e, mais preferivelmente de 30 kd a 60 kd (conforme determinado pela viscosidade) . Na extremidade inferior do peso molecular, os polímeros de ácido poliglutâmico desta invenção possuem um peso molecular de cerca de 10.000, cerca de 11.000, cerca de 12.000, cerca de 13.000, cerca de 14.000, cerca de 15.000, cerca de 16.000, cerca de 17.000, cerca de 18.000, cerca de 19.000, cerca de 20.000, cerca de 21.000, cerca de 22.000, cerca de 23.000, cerca de 24.000, cerca de 25.000, cerca de 26.000, cerca de 27.000, cerca de 28.000, cerca de 29.000, a cerca de 30.000 daltons. Ao final da extremidade maior, os polímeros de ácido poliglutâmico, desta invenção, possuem um peso molecular de cerca de 31.000, cerca de 32.000, cerca de 33.000, cerca de 34.000, cerca de 35.000, cerca de 36.000, cerca de 37.000, cerca de 38.000, cerca de 39.000, cerca de 40.000, cerca de 41.000, cerca de 42.000, cerca de 43.000, cerca de 44.000, cerca de 45.000, cerca de 46.000, cerca de 47.000, cerca de 48.000, cerca de 49.000, cerca de 50.000, cerca de 51.000, cerca de 52.000, cerca de 53.000, cerca de 54.000, cerca de 55.000, cerca de 56.000, cerca de 57.000, cerca de 58.000, cerca de 59.000, cerca de 60.000, cerca de 61.000, cerca de 62.000, cerca de 63.000, cerca de 64.000, cerca de 65.000, cerca de 66.000, cerca de 67.000, cerca de 68.000, cerca de 69.000, cerca de 70.000, cerca de 71.000, cerca de 72.000, cerca de 73.000, cerca de 74.000, cerca de 75.000, cerca de 76.000, cerca de 77.000, cerca de 78.000, cerca de 79.000, a cerca de 80.000 daltons. Os versados na técnica apreciarão que os valores de peso molecular podem ser diferentes, quando medidos por outros processos. Estes outros processos incluem, por exemplo, permeação a gel, difusão de luz em ângulo baixo, difusão de luz de laser em ângulo múltiplo, índice de refração e combinações dos mesmos.
Conforme usado aqui, um "conjugado de agente terapêutico-ãcido poliglutâmico" se refere ao polímero de ácido poliglutâmico que é covalentemente ligado ao agente terapêutico por uma ligação direta entre um resíduo de ácido carboxílico do ácido poliglutâmico e um grupo funcional do agente terapêutico ou por uma ligação indireta através de um ou mais ligantes bifuncionais. Ligantes preferidos são aqueles que são relativamente estáveis â hidrólise na circulação, são biodegradáveis e são não-tóxicos quando clivados do conjugado. Naturalmente, é entendido que ligantes apropriados não interferirão com a eficácia de antitumor dos conjugados. Ligantes exemplares incluem aminoácidos (por exemplo, glicina, alanina, leucina, isoleucina), hidroxiácidos (por exemplo, ácido γ-hidroxibutírico), dióis, aminotióis, hidroxitióis, aminoálcoois e combinações destes. Um agente terapêutico pode ser ligado ao polímero ou ligante por qualquer processo de ligação que resulte em uma ligação fisiologicamente clivável (isto é, uma ligação que é clivável por mecanismos enzimáticos ou não enzimáticos que se refere as condições em um organismo animal vivo). Exemplos de ligações preferidas incluem éster, amida, carbamato, carbonato, aciloxialquiléter, aciloxialquiltioéter, aciloxialquiléster, aciloxialquilamida, aciloxialcoxicarbonila, aciloxialquilamina, aciloxialquilamida, aciloxialquilcarbamato, aciloxialquilsulfonamida, cetal, acetal, dissulfeto, tioéster, N-acilamida, alcoxicarboniloxialquila, uréia e N-sulfonilimidato.
Os processos para formação destas ligações são bem conhecidos dos versados na química orgânica sintética e podem ser encontrados por exemplo, em textos padrão, tais como, J. March, Advanced Organic Chemistry, Wiley Interscience, 4a Edição. O grau de carga do agente bioativo, terapêutico ou de diagnóstico no polímero (isto é, a "densidade de carga") pode ser expresso como o número de moléculas ou número médio de moléculas por cadeia de polímero de ácido poliglutâmico ou preferivelmente como um percentual (%) do peso total do conjugado ("% em carga"). Uma porcentagem de carregamento desejada pode ser obtida por ajuste das razões do agente terapêutico e polímero e otimização de outros reagentes, caso necessário. A densidade de carga ótima para um dado conjugado e dado uso é determinada empiricamente com base nas propriedades desejadas do conjugado (por exemplo, solubilidade em água, eficácia terapêutica, propriedades farmacocinéticas, toxicidade e requisitos de dosagem). A densidade de carga varia entre 1% a cerca de 60% ou de cerca de 1% a cerca de 60%, preferivelmente de 5% a 55% ou cerca de 5% a cerca de 55% e mais preferivelmente, de cerca de 10% a 45% ou cerca de 10% a cerca de 45% para os conjugados que são especificamente descritos aqui. A porcentagem de carga é tipicamente determinada por quatro processos: (1) % em peso calculada (2) espectrofotometria, preferivelmente espectrofotometria UV; (3) processo de razão de NMR; e (4) processo de hidrólise. (1) A porcentagem em peso calculada baseia-se no peso conhecido do material de partida de ácido poliglutâmico e o peso do agente terapêutico. Para todos os conjugados, a conversão para forma de conjugado é 100% completa, quando determinada por TLC sobre sílica. (2) O processo de espectrofotometria, preferivelmente espectrofotometria UV baseia-se na porcentagem em peso do agente terapêutico quando medida por absorvência em um comprimento de onda apropriado (por exemplo, absorvência UV) ou fluorescência, conforme exemplificado para um conjugado de ácido poliglutâmico-paclitaxel. O conjugado é dissolvido em água deionizada (2,5 ou 5 mg/ml) , centrifugado a 500 g por 15 minutos para remover matéria em partículas, caso presentes, e a solução límpida é diluída lOOx a 200x com água deionizada. A absorvência é lida contra o diluente em um comprimento de onda especificado, por exemplo, absorção de UV é lida contra o diluente em 228 nm ou 2 60 nm. Uma solução do mesmo lote de ácido poliglutâmico usada para preparar o conjugado é dissolvida na mesma concentração nominal que o conjugado e sua absorvência é lida contra o diluente, por exemplo, a 228 nm ou 2 60 nm. Uma curva de calibração linear é preparada por medição da absorvência, por exemplo, a 228 nm ou 260 nm das soluções de concentrações conhecidas do paclitaxel dissolvido em metanol. Para calcular a porcentagem de carga, a absorvência da solução de ácido poliglutâmico (corrigida para contabilizar a carga teórica de ácido poliglutâmico na solução de ácido poliglutâmico-paclitaxel) é subtraída da absorvência de ácido poliglutâmico-paclitaxel. Esta absorvência corrigida é comparada à curva padrão de paclitaxel para obter a concentração de paclitaxel (w/v) na solução conjugada. O percentual de carga é a razão da concentração de paclitaxel para concentração de conjugado de ácido poliglutâmico-paclitaxel vezes 100. (3) O processo de razão de NMR baseia-se na porcentagem em peso do agente terapêutico conforme medida pela razão das máximas nos espectros resultando do polímero com relação as máximas do agente terapêutico. Isto é ilustrado abaixo para o conjugado de ácido poliglutâmico-paclitaxel. A área entre cerca de 4,5 ppm a cerca de 6,5 ppm, preferivelmente 4,5 ppm e 6,5 ppm é totalizada e dividida pelo número de prótons (7). Este número é então comparado à área entre cerca de 3,8 ppm a cerca de 4,4 ppm, preferivelmente 3,8 ppm a 4,4 ppm para a estrutura de polímero e é corrigida para 2 prótons a partir do paclitaxel que se sobrepõe. As duas áreas por próton são comparadas, levando-se em consideração os pesos moleculares de paclitaxel e o polímero. A = área por próton para polímero dividido pela área por próton para paclitaxel = 21,36/1,98 = 10,79.
Peso molecular de paclitaxel = 837; peso molecular de monômero de ácido poliglutâmico é de 129. % de carga = (837/(10,79 x 129) + 837) x 100 = 37,6%.
Os processos descritos aqui são geralmente úteis para preparação de conjugados de ácido poliglutâmico com qualquer agente bioativo, terapêutico ou de diagnóstico que é apropriadamente funcionalizado por ligação ao ácido poliglutâmico, conforme descrito aqui. Os conjugados que são exemplificados aqui destinam-se a ilustrar e não limitar o escopo da invenção.
Em uma concretização preferida, os agentes terapêuticos compreendem medicamentos que são eficazes no tratamento das condições cancerígenas que espera-se sejam beneficiadas de propriedades farmacocinéticas únicas destes conjugados (por exemplo, permeabilidade e retenção melhoradas no tecido de tumor, liberação controlada do agente ativo, meia vida biológica longa com agente não conjugado e outros). Agentes presentemente preferidos incluem, como exemplo, taxanos (por exemplo, paclitaxel, docetaxel); etoposideo; teniposido, epotilonas, tais como, epotilona A, epotilona B, epotilona C, epotilona D, epotilona F e 12,13-disoxiepotilona F; gencitabina, 20(S)(+)camptotecina, 9-aminocamptotecina, 9-nitrocampotecina, 7-etil-10-hidroxicamptotecina, 9-dimetilaminometil-10-hidroxicamptotecina, 10,lime ti lenodioxicamptotecina , 7-metilpiperi zonomet il-10,11-etilenodioxicamptotecina, flavopiridol, geldanamicina, 17-(alilamino)-17-dimetoxigeldanamicina, ecteinascidina 743, pftalascidina, CT-2584 (1-(11-dodecilamino)-10-hidroxiundecil)-3,7-dimetilxantina, CT-4582 (1-(11-(N-metil N-dodecil amino)-10-hidroxiundecil)-3,7-dimetilxantina), doxorubicina, adriamicinona; melfalana; fludarabina; daunomicina; verapamil; 5-flúoracila; floxuridina (FUDR), ciclosporina, ácidos retinóicos; 7-dimetil-tert-butilsilióxi-10-hidróxi captotecina e outros. O agente terapêutico deve ser capaz de anexação ao polímero por meio de um grupo funcional que já está presente na molécula nativa ou de outra forma pode ser introduzida por procedimentos bem conhecidos na química orgânica sintética, sem alteração da atividade do agente. Nos exemplos dados aqui, o agente é relativamente insolúvel em água na forma não conjugada e mostra solubilidade muito aperfeiçoada após conjugação. Contudo, espera-se que os medicamentos solúveis em água mostrem vantagens seguindo sua conjugação em ácido poliglutâmico (por exemplo, farmacocinética aperfeiçoada e retenção no local de ação, em comparação ao agente não conjugado).
As reações realizadas sob "condições de acoplamento padrão" são realizadas em um solvente inerte (por exemplo, DMF, DMSO, N-metilpirrolidona) em uma temperatura de -20°C a 150°C ou cerca de -20°C a cerca de 150°C, preferivelmente de 0°C a 70 ° C ou cerca de 0°C a cerca de 70°C, mais preferivelmente de 5°C a 30°C ou cerca de 5°C a cerca de 3 0 °C, em presença de um reagente de acoplamento e um catalisador. Naturalmente, a temperatura usada dependerá de fatores, tais como, a estabilidade do agente terapêutico, e a reatividade do grupo de anexação. Reagentes de acoplamento apropriados são bem conhecidos na química orgânica sintética e incluem, porém não estão limitados, as carbodiimidas, cloroformato de alquila e trietilamina, sais de piridinio-tributila amina, diclorofosfato de fenila, 2-cloro-1,3,5-tinitrobenzeno e piridina, di-2 piridil carbonato, poliestiril difenilfosfina (trimetilsilil) etoxiacetileno, 1, 1'-carbonilbis(3-metillimidazolio) triflate, dietilazodicarboxilato e trifenil fosfina, N, N' carbonildiimidazola, cloreto de metanosulfonil, cloreto de pivaloil, ácido bis(2-oxo-3-oxazolidinil) fosfinico ("BOP-CL"), 2 iodeto de 2-clorometilpiridinio ("CMPI") e semelhantes. Catalisadores apropriados para acoplamento de álcool incluem bases orgânicas, por exemplo, 4-N,N-dimetilaminopiridina e 4-pirrolidinopiridina.
Conforme usado aqui, o termo "solvente inerte" significa um solvente inerte sob condições de reação sendo descrito em conjunto com os mesmos [incluindo, por exemplo, benzeno, tolueno, acetonitrila, teetraidrofurano ("THF"), dimetilformamida ("DMF"), clorofórmio ("CHC13"), cloreto de metileno (ou diclorometano ou "CH2C12"), éter dietila, acetato de etila, acetona, metiletil cetona, dioxano, piridina, dimetoxietano, éter t-butil metila e semelhantes]. A menos que de outra forma especificado, os solventes usados nas reações da presente invenção são solventes inertes.
Se os grupos múltiplos funcionais estão presentes no agente terapêutico, anexação seletiva de um grupo específico do agente para o polímero de ácido glutâmico precisará usar um grupo de proteção apropriado. O termo "grupo de proteção" ou "grupo de bloqueio" se refere a qualquer grupo que, quando ligado a um ou mais hidroxila, tiol, amino ou carboxila dos compostos, impede que as reações destes grupos ocorram e onde o grupo de proteção pode ser removido por química convencional ou etapas enzimáticas para restabelecer o grupo hidroxila, tiol, amino ou carboxila. Vide, de modo geral, T.W. Greene & P.G.M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 3a edição, 1999, John Wiley and Sons, N.Y. O grupo de bloqueio removível específico não é importante e grupos de bloqueio hidroxila removíveis preferidos incluem substitutos convencionais, tais como, alila, benzilo, acetila, cloroacetila, tiobenzilo, benzolidina, fenacila, t-butil-difenilsilila, t-butildimetilsilila, trietilsilila, MOM (metoximetila), MEM (2-metoxietoximetila), t-BOC (tert-butiloxicarbonila), CBZ (benziloxicarbonila) e qualquer outro grupo que possa ser introduzido quimicamente em uma funcionalidade hidroxila e mais tarde seletivamente removido tanto por processos químicos quanto enzimáticos em condições brandas compatíveis com a natureza do produto.
Grupos de bloqueio amino removíveis preferidos incluem substitutos convencionais, tais como, t-butiloxicarbonila (t-BOC), benziloxicarbonila (CBZ), fluorenilmetoxicarbonila (FMOC), aliloxicarbonila (ALOC) e semelhantes, que podem ser removidos por condições convencionais compatíveis com a natureza do produto.
Em outra concretização, os grupos de bloqueio amino derivados de piro tais como, ácido piroglutâmico, podem ser usados. Em uma concretização específica, o ácido piroglutâmico pode ou não ser removido.
Grupos de proteção carboxila preferidos incluem ésteres, preferivelmente ésteres contendo grupos alquilas, tais como, metila, etila, propila, t-butila, etc., que podem ser removidos por condições de hidrólise branda, compatíveis com a natureza do produto.
Nomenclatura Conjugados exemplares preparados de acordo com as concretizações da invenção descritos aqui são mostrados na figura 1. Os conjugados nos Exemplos abaixo são denominados do mesmo modo que os conjugados da figura 1.
Descrição das Concretizações Preferidas Em geral, o processo de fabricação de conjugados de agente terapêutico-poliglutamato em uma classificação que é apropriada para o desenvolvimento clínico e uso farmacêutico compreende as etapas de: (a) provisão da forma protonada de um polímero de ácido poliglutâmico e um agente terapêutico para conjugação do mesmo; (b) ligação covalente do agente ao polímero de ácido poliglutâmico em um solvente orgânico em inerte para formar um conjugado de agente terapêutico e ácido poliglutâmico; (c) precipitação do conjugado de agente terapêutico e ácido poliglutâmico da solução, por adição de um volume em excesso de solução de salmoura aquosa; e (d) coleta do conjugado como um sólido protonado. A forma protonada do polímero de ácido poliglutâmico na etapa (a) é obtida por acidificação de uma solução contendo o sal de ácido poliglutâmico a ser usada como um material de partida e conversão do sal nesta forma de ácido. Após separação do sólido por centrifugação, o sólido é lavado com água. (Quando dimetilaminopiridina ("DMAP") é usado na etapa (b), é preferido lavar o sólido, até a fase aquosa possuir pH 3 ou maior). O ácido poliglutâmico é então seco, preferivelmente por liofilização e preferivelmente a um peso constante compreendendo entre cerca de 2% a cerca de 21% de água, preferivelmente entre cerca de 7% a cerca de 21% de água, mais preferivelmente entre 7% e 21% de água, antes da conjugação a um agente terapêutico desejado (etapa (b)). O agente terapêutico da etapa (b) pode precisar de modificação antes da conjugação, por exemplo, a introdução de um novo grupo funcional, a modificação de um grupo funcional preexistente ou a anexação de uma molécula espaçadora. Tais modificações podem precisar utilizar os grupos de proteção, que são descritos acima.
Os esquemas de reação I-III ilustram processos que foram usados para ligação de vários agentes terapêuticos exemplares para ácido poli-L-glutâmico (PG) , tanto direta quanto através das moléculas espaçadores de glicina. As condições mostradas nestes esquemas e descritas nos Exemplos podem variar, conforme será prontamente apreciado pelos versados na química orgânica sintética. As condições exatas que são usadas para conjugar um agente terapêutico específico em ácido poliglutâmico podem ser com base na estabilidade do agente terapêutico em relação as condições de reação, a reatividade dos grupos de ligação, outros fatores pertinentes ao processo de fabricação (por exemplo, questões de segurança ou regulamentares) e semelhantes. Conforme descrito acima, vários tipos de ligações podem ser usados na preparação em conjugados, dependendo dos grupos funcionais disponíveis no agente terapêutico e a molécula de ligante, se um ligante for usado. Assim, o agente terapêutico pode ser conjugado no ácido poliglutâmico e/ou moléculas de ligante por ligação a outro que não o éster e ligações amida. Os ligantes que não glicina e reagentes de acoplamento que não aqueles exemplificados aqui podem também ser usados. As condições exatas usadas para preparação dos conjugados que ilustram a prática das concretizações da presente invenção são descritas abaixo nos Exemplos.
Na etapa (c), uma solução de sal aquosa é adicionada à mistura de reação para precipitar o conjugado de agente terapêutico-ácido poliglutâmico da solução. Qualquer sal inorgânico solúvel em água pode ser usado para este fim, tais como os sais de sódio, potássio e amônio, bem como sais de haleto e sulfato (por exemplo, NaCl, KC1, NH4C1, sulfato de sódio, sulfato de amônio, etc.). Preferivelmente, solução de sal 10-15% é usada em volume de lx-4x. Em uma concretização preferida, um volume de 2,5x de NaCl a 10% é usado. A solução de sal é adicionada lentamente à mistura de reação, que é resfriada durante a adição. Para rendimento ótimo do conjugado, a temperatura é mantida entre cerca de 0°C a cerca de 10°C, preferivelmente 0°C e 10°C. A etapa de precipitação separa o conjugado de agente terapêutico-ãcido poliglutâmico dos materiais de partida e os subprodutos de reação que são total ou parcialmente solúveis sob as condições usadas para precipitação do conjugado.
Na etapa (d) , o conjugado é coletado como sólido protonado. A suspensão obtida na etapa (c) é preferivelmente acidifiçada. Dependendo da estabilidade da molécula de medicamento em condições ácidas, um pH na faixa de cerca de pH 1 a cerca de pH 4, preferivelmente pH 1-4, pode ser usado. Para preparação de conjugados de ácido poliglutâmico-paclitaxel, contudo, acidificação abaixo de pH 2 resulta na decomposição de paclitaxel, e acidificação é tipicamente realizada em pH de cerca de 2,5. Preferivelmente, para remoção da base, tal como DMAP, um ácido, tal como ácido clorídrico (HCl) é usado na etapa (d) . A suspensão pode ser filtrada ou centrifugada, preferivelmente filtrada para coletar o conjugado.
Materiais de partida não reagidos, subprodutos e outras impurezas podem ser removidos antes ou após acidificação para render o conjugado protonado final (ilustrado nos Exemplos 2 e 3 abaixo e figuras 2 e 4). Por exemplo, após adição da solução de sal, o sólido pode ser coletado e resolubilizado, então tanto filtrado ou extraído com um solvente apropriado, onde os contaminantes são solúveis, porém o conjugado não é solúvel (por exemplo, acetato de etila, cloreto de metileno, clorofórmio, hexanos, heptano, éter dietila e dioxano). A solução é então acidifiçada e a forma protonada do conjugado é coletada conforme descrito acima.
Alternativamente, o sólido pode ser liofilizado, então transformado em pasta com um solvente apropriado ou misturas dos mesmos, por exemplo, acetonitrila (MeCN), éteres, tais como, éter dietila, dioxano, tetraidrofurano, solventes halogenados, tais como, clorofórmio, cloreto de metileno, cetonas, tais como, acetona e metiletil cetona (MEK) ; ãlcoois Ci a Ci0 , tais como, álcool tert-butila, álcool isopropilico, álcool etílico ou metanol; para remover impurezas do produto conjugado protonado final.
Em uma concretização preferida alternada, a etapa (c) acima é substituída pela etapa (c1) que compreende: (c1) separação do conjugado de agente terapêutico-ácido poliglutâmico dos materiais de partida não reagidos e subprodutos e precipitação do conjugado de agente terapêutico-ácido poliglutâmico da solução por adição de um solvente orgânico no qual os materiais de partida não reagidos e os subprodutos são solúveis.
Além do acetato de etila e acetonitrila, exemplos de outros solventes que podem ser usados para purificar o conjugado incluem clorofórmio, tetraidrofurano, dioxano, tolueno, éter 2-butilmetila e semelhantes.
Um procedimento alternativo é presentemente o mais preferido, onde a geração in si tu de um conjugado de agente terapêutico-ácido poliglutâmico é realizado pelo processo que compreende: (a) suspensão de um sal do polímero de ácido poliglutâmico em um solvente orgânico inerte; (b) protonação do polímero por adição de um ácido anidro à suspensão, para formar um sal solúvel da base conj ugada; (c) provisão de um agente terapêutico e ligação covalente do agente ao polímero de ácido poliglutâmico para formar um conjugado de agente terapêutico e ácido poliglutâmico; (d) precipitação do conjugado de agente terapêutico e ácido poliglutâmico da solução por adição de um volume em excesso de solução de sal aquosa; e (e) coleta do conjugado como um sólido protonado. O procedimento in situ elimina as múltiplas etapas na preparação do polímero PG protonado e reduz o tempo de processo total até uma semana. Além disto, o produto parece dissolver nas soluções aquosas, mais rapidamente do que quando produzido pelo processo in situ em comparação com outros processos revelados aqui.
Neste procedimento, qualquer ácido anidro pode ser usado na etapa (b) acima, contanto que o sal da base conjugada seja solúvel no solvente orgânico selecionado para uso no procedimento. Exemplos de ácidos apropriados incluem ácido trifluoracético, ácido cloroacético, ácido bromobenzóico, ácido clorobenzóico, ácido clorofenoxiacético, ácido clorofenilacético, ácido cianoacético, ácido cianobutírico, ácido cianofenoxiacético, ácido cianopropiônico, ácido dicloroacético, ácido acetoacético, ácido fumárico, ácido hipúrico, ácido iodoacético, ácido láctico, ácido malônico, ácido mesacônico, ácido naftóico, ácido nitrobenzóico, ácido ftálico, ácido metano sulfônico, HBr, HC1 e HI.
As etapas (c) , (d) e (e) são realizadas conforme descrito acima para os procedimentos gerais. A tabela 1 mostra uma análise representativa para conjugado de ácido L-glutâmico-paclitaxel preparado conforme descrito no Exemplo 3 abaixo. A tabela 2 mostra uma análise representativa para conjugado de ácido poli-L-glutâmico-paclitaxel preparado in si tu conforme descrito no Exemplo 7 abaixo. TABELA 1 - Dados Analíticos a % de rendimento; b gramas de conjugado; c gramas de paclitaxel/gramas de conjugado determinadas por processo UV; ã gramas de paclitaxel/gramas de conjugado determinadas por processo NMR; e % em peso de paclitaxel livre em relação ao conjugado; f % em peso de acetonitrila residual em relação ao conjugado; 9 % em peso residual de dimetilformamida em relação ao conjugado; h % em peso de diisopropiluréia em relação ao conjugado; 1 % em peso do resíduo quando da ignição.
TABELA 2 - DADOS ANALÍTICOS a % de rendimento; b gramas de conjugado; d gramas de paclitaxel/gramas de conjugado determinadas por processo NMR;f % em peso de acetonitrila residual em relação ao conjugado; 9 % em peso residual de dimetilf ormamida em relação ao conjugado; h % em peso de diisopropiluréia em relação ao conjugado. A invenção é ilustrada pelos exemplos que se seguem que não seriam considerados como limitando o escopo da invenção, de que forma for.
EXEMPLOS
Nos exemplos que se seguem, os intermediários na produção dos conjugados foram caracterizados por 1H NMR. Os pesos moleculares do ácido poliglutâmico (sal Na) usados para preparar os conjugados exemplificados abaixo variam de 20 kd a 50 kd, conforme especificado pelo fornecedor (Sigma Chemical Co., Milwaukee, WI) com base nas medições de viscosidade. A densidade de carga média dos conjugados foi de 37%.
Exemplo 1. Preparação de ácido poli-L-glutâmico Sal de sódio de ácido poli-L-glutâmico (85,9 g) (Sigma Chemical Co., 37kd peso molecular determinado por medição de viscosidade) foi dissolvido em água purificada USP (534 ml; 6,2 ml/g) , e a solução foi resfriada para entre 0°C -5°C. Solução de ácido clorídrico diluída (1M) foi adicionada gota a gota, com agitação vigorosa, mantendo a temperatura a <10 °C até o pH estar entre pH 2 a 2,5.
Durante a adição, o ácido poli-L-glutâmico separou-se da solução. A mistura de reação foi aquecida a temperatura ambiente e agitada por 1 hora. A suspensão foi centrifugada a 2700 x g por 10 minutos. A camada aquosa superior foi removida e o sólido foi resuspenso em 56 0 ml de água purificada USP e recentrifugada por 10 minutos. A camada aquosa superior foi removida e o pH foi medido. A lavagem continuou, se necessário, até o pH da camada aquosa ser maior ou igual a 3,0. O sólido úmido foi liofilizado em um sistema de secagem por congelamento LABCONCO™ até um peso constante ser obtido. A porcentagem em peso de sódio não foi maior do que 7.000 ppm conforme determinado por ICP.
Exemplo 2 . Preparação de conjugado de ácido poli-L-glutâmico-2'-paclitaxel Ácido poli-L-glutâmico (16,82 g) , preparado conforme descrito no Exemplo 1 acima, foi suspenso em N,N-dimetilformamida anidro (180 ml), paclitaxel (9,923 g, 11,6 mmol) e N, N-dimetilaminopiridina (283 mg, 2,32 mmol) . A mistura de reação foi agitada por 30 minutos. Uma solução de N,N-diisopropilcarbodiimida (1,903 g, 15,08 mmol) em N, N-dimetilformamida (50 ml) foi adicionada por um período de 3 horas usando uma bomba de seringa. Após a adição, a reação foi agitada até estar completa (cerca de 4 horas a temperatura ambiente). A reação foi resfriada para 5°C-10°C e solução de cloreto de sódio a 10% (345 ml) foi adicionada lentamente para precipitar o conjugado de ácido poli-L-glutâmico-paclitaxel. O precipitado foi separado por transferência da mistura para um frasco de centrífuga e centrifugando o mesmo a 1500 g. O sólido úmido foi resuspenso em água (150 ml) e 1M solução de bicarbonato de sódio (120 ml) foi adicionada lentamente com agitação vigorosa para trazer o pH da solução para pH 7 . A reação foi agitada por uma hora e filtrada através de um filtro de O, 2 micron para remover impurezas. O filtrado foi resfriado para 0°C-5°C e HC1 (IN) foi adicionado lentamente com agitação vigorosa até o pH da solução ser trazido para pH 3. A agitação continuou por 30 minutos. O sólido precipitado foi centrifugado a 1500 g e o sólido úmido foi lavado duas vezes por suspensão em água (150 ml) e centrifugação. O produto foi liofilizado para render 24 g de conjugado de ácido poli-L-glutâmico-paclitaxel (90% de rendimento).
No procedimento acima, a etapa de filtração pode ser omitida por lavagem da solução com acetato de etila (250 ml, 2x) para remover impurezas. A figura 3 mostra uma varredura NMR de próton representativa para conjugado de ácido poli-L-glutâmico -2'-paclitaxel preparado pelo mesmo procedimento conforme descrito acima, porém possuindo uma carga de paclitaxel maior (isto é, 55%).
Exemplo 3 . Preparação de conjugado de ácido poli-L-glutâmico^1-paclitaxel (processo de fabricação) Ácido poli-L-glutâmico (42 g), preparado conforme descrito no Exemplo 1 acima, foi adicionado a um frasco de fundo redondo de três litros e três gargalos equipado com um agitador mecânico, funil de adição e sonda térmica. N,N-dimetilformamida (350 ml) foi adicionada e agitada por 10 minutos. Paclitaxel (24,66 g) e N,N-dimetilaminopiridina (0,70 g) foi adicionada e agitada por 10 minutos. Uma solução de N,N-dilsopropilcarbodiimida (4,73 g) em N,N-dimetilformamida (143 ml) foi adicionada a temperatura ambiente por um período de 1 hora, usando um funil de adição e foi agitada por quatro horas. A mistura de reação foi resfriada para 5°C-10°C e uma solução resfriada de cloreto de sódio a 10% (1,2 1) foi adicionada gota a gota usando um funil de adição e mantendo a temperatura a 5°C- 10°C por resfriamento do frasco em uma mistura de gelo-sal. Após a adição da solução de cloreto de sódio, em solução IN de ácido clorídrico (35 ml) foi adicionada gota a gota até o pH da reação alcançar 2,5. A mistura de reação foi agitada por 30 minutos a 5°C-10°C e o conjugado de poli-L-glutâmico-paclitaxel precipitado foi coletado por filtração.
Os sólidos foram lavados três vezes com água e secos por congelamento em um liofilizador por 24 horas. O sólido seco foi energizado em um pó fino usando um pilão e soquete. O conjugado de ácido poli-L-glutâmico foi suspenso em acetonitrila (1.000 ml) e agitada por 2 horas, então filtrada e o sólido foi lavado com 2 x 2 00 ml de acetonitrila. O sólido foi seco sob vácuo por 24 horas para fornecer conjugado de ácido poli-L-glutâmico-paclitaxel (60 g) . Rendimento (90%) .
Exemplo 4. Preparação de conjugado de ácido poli-L-glutâmico-glicina-paclitaxel (Esquema de Reação II) As etapas 1 e 2 abaixo foram realizadas essencialmente conforme descrito em Mathew e outros (Mathew, A.E., Mejillano, M.R., Nath, J.P. Hímes, R.H., e Stella, V.J., J. Med. Chem., 35:145-151, 1992).
Etapa 1. Preparação de 21 -(N-t-BOC-glicil)paclitaxel A uma solução de N-t-BOC-L-glicina (131 mg, 0,75 mmol) e paclitaxel (640 mg, 0,75 mmol) em diclorometano (20 ml) foi adicionada 1,3-diisopropilcarbodiimida (124 mg, 0,98 mmol) seguido por N,N-dimetilaminopiridina (27 mg, 0,23 mmol). Após agitação a temperatura ambiente por 4 horas, a mistura foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia de cintilação de sílica gel eluindo com 1:1 (v/v) acetato de etila/hexano para render 2 ' - (N-t-BOC-glicil) paclitaxel (720 mg, 95% de rendimento) como um pó branco.
Etapa 2. Preparação de 21 -(glicil)paclitaxel Uma solução de 2'-(N-t-BOC-glicil)paclitaxel (245 mg, 0,242 mmol) em ácido fórmico (2 ml) foi agitada por 3 0 minutos. Após concentração sob pressão reduzida, o resíduo foi suspenso em água (15 ml) . Solução de bicarbonato de sódio fria 0,05M (45 ml) foi adicionada e a solução (pH 8,0) foi extraída com diclorometano (2 x 40 ml) . Os extratos de diclorometano combinados foram secos sobre sulfato de sódio anidro e concentrados sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia de cintilação de sílica gel eluindo com 4% metanol/diclorometano para render 2(glicil)paclitaxel (161 mg, 73 % de rendimento) como um pó branco.
Etapa 3. Preparação de conjugado de ácido poli-L-glutâmico-2(glicil) paclitaxel A uma solução agitada de agitada ácido poli-L-glutâmico (275 mg, 1,87 mmol) em dimetilformamida anidra (6 ml) foi adicionado 2(glicil)paclitaxel (161 mg, 0,177 mmol). Uma solução de 1,3-diisopropilcarbodimida (29 mg, 0,23 mmol) em dimetilformamida (1,4 ml) foi adicionada a suspensão agitada por um período de 30 minutos. Após agitação a temperatura ambiente por 3 horas, a mistura foi resfriada em um banho de gelo para trazer a temperatura do banho para 0°C-5°C e então a solução de cloreto de sódio aquosa a 10% (7 ml) foi adicionada por um período de 30 minutos para precipitar o conjugado de ácido poli-L-glutâmico-2(glicil)paclitaxel. A suspensão branca resultante foi centrifugada a 1.500 g, 15 minutos. Após filtração, o sólido foi lavado duas vezes por suspensão em água (10 ml) e centrifugação. O produto bruto foi suspenso em água (6 ml) e uma solução de bicarbonato de sódio 1M aquosa (2,3 ml) foi adicionada lentamente com agitação para trazer o conteúdo do frasco para pH 7,6. Após agitação por um adicional de 2 horas, a camada aquosa foi lavada com acetato de etila (3x6 ml) e então acidificada por adição de ácido clorídrico IN para pH 2,8. O sólido precipitado foi separado por centrifugação e lavado com água (2x6 ml). O sólido úmido foi liofilizado para fornecer conjugado de ácido poli-L-glutâmico-21 -(glicil)paclitaxel (315 mg, 72 % de rendimento) como um pó branco.
Usando procedimento semelhante, o conjugado acima pode ser substituído por outros aminoácidos que não seje glicina.
Exemplo 5. Preparação de conjugado de ácido poli-L-glutâmico-2 1-docetaxel (Esquema de Reação III) Etapa 1. Preparação de 10-deacetilpaclitaxel 10-Deacetilpaclitaxel foi preparado essencialmente conforme descrito em Zheng, Q.Y., Darbie, L.G., Chen, X., Murray, C.K., Tetrahedron Letters., 36:2001-2004, 1995 e Patente US número 5.629.433. A uma solução de paclitaxel (l,0g, 1,17 mmol) em tetraidrofurano (20 ml) foi adicionado peróxido de hidrogênio (30%, 20 ml) seguido por bicarbonato de sódio (1,92 g, 22,85 mmol). Após agitação a temperatura ambiente por 18 horas, a mistura foi tratada com diclorometano/água (1:1 (v/v) , 100 ml) . A fase orgânica foi lavada com água (2x 3 0 ml) , seca sobre sulfato de magnésio anidro, e concentrada sob vácuo. O residuo foi purificado por cromatografia de cintilação de sílica gel eluindo com 3% metanol/diclorometano (v/v) para render 10-deacetilpaclitaxel (890 mg, 93% de rendimento) como um pó branco.
Etapa 2. Preparação de 2 ' , 7 -bis(trietilsilil)-10-deacetilpaclitaxei 21.7- Bis(trietilsilil)-10-deacetilpaclitaxel foi preparado conforme descrito na Patente US número 5. 629.433 . A uma solução de 10-deacetilpaclitaxel (850 mg, 1,05 mmol) em piridina anidra (20 ml) foi adicionado clorotrietilsilano (2,72 ml, 20,1 mmol) a temperatura ambiente por um período de 30 minutos sob uma atmosfera de argônio. Após agitação por 17 horas, a mistura foi tratada com diclorometano (75 ml), lavada com água (3 x 30 ml), com solução de sulfato de cobre aquoso a 10% (4 x 35 ml) , com água (3 0 ml) e com solução aquosa saturada (3 0 ml) . A camada orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada sob pressão reduzida para prover 2',7-bis(trietilsilil)-10-deacetilpaclitaxel (980 mg, 90% de rendimento) como um pó.
Etapa 3. Preparação de 21,7-bis(trietilsilil)-10-deacetilpaclitaxel imina 21.7- Bis (trietilsilil)-10-deacetilpaclitaxelimina foi preparada conforme descrito na Patente US número 5 . 629.433. A uma solução de 2',7-bis(trietilsilil)-10-deacetilpaclitaxel (730 mg, 0,70 mmol) em tetraidrofurano (7,3 ml) foi adicionado cloreto de zirconoceno (543 mg, 2,11 mmol). Após agitação a temperatura ambiente sob uma atmosfera de argônio por 15 horas, a mistura foi derramada em hexanos frios (75 ml) . Os complexos de zircônio precipitados foram removidos por filtração (75 ml) . Os complexos de zircônio precipitados foram removidos por filtração. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para fornecer 2',7-bis(trietilsilil)-10-deacetilpaclitaxelimina (636 mg, 92% de rendimento) como um pó branco.
Etapa 4. Preparação de asiina primária de 10-deacetilpactitaxei Amina primária de 10-Deacetilpaclitaxel foi preparada de acordo com a Patente US número 5.629.433.
Uma solução de 2',7-bis(trietilsilil)-10-deacetilpaclitaxel imina (636 mg, 0,621 mmol) em ácido clorídrico concentrado a 1% (peso/peso)/etanol a 95% (25 ml) foi agitada por 15 horas, tratada com água (65 ml) e lavada com hexanos (2 x 30 ml). A camada aquosa foi neutralizada (pH 7) por adição de uma solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada e extraída com diclorometano (2 x 40 ml). Os extratos combinados foram secos sobre sulfato de magnésio anidro e concentrados sob pressão reduzida para render o produto de amina primária bruto (405 mg, 92% de rendimento) como um pó branco. Este produto foi empregado para a próxima etapa, sem purificação adicional.
Etapa 5. Preparação de docetaxel Docetaxel foi preparado de acordo com a Patente US número 5.629.433. A uma solução de amina primária 10-deacetilpaclitaxel (405 mg, 0,57 mmol) em acetato de etila (40 ml) foi adicionada solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (40 ml) . A esta mistura bifásica foi adicionado di-tert-butildicarbonato (225 mg, 1,03 mmol). Após agitação a temperatura ambiente por 15 horas, acetato de etila (75 ml) foi adicionado. A fase orgânica foi lavada com água (2 x 3 0 ml) , seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de cintilação de sílica gel eluindo com 4% metanol/diclorometano para prover docetaxel (351 mg, 76 % de rendimento) como um pó branco.
Etapa 6. Preparação de conjugado de ácido poli-L-glutâmico-2'-docetaxel A uma suspensão de ácido poli-L-glutâmico (658 mg, 4,47 mmol) em dimetilformamida anidra (10 ml) foi adicionado docetaxel (385 mg, 0,48 mmol) e N,N-dimetilaminopiridina (12 mg, 0,096 mmol). A esta suspensão agitada foi adicionada uma solução de 1,3-diisopropilcarbodiimida (78,8 mg, 0,624 mmol) dimet ilf ormamida (3 ml) gota a gota por 20 minutos. Após agitação por 15 horas, a mistura foi resfriada para um banho de gelo e solução aquosa de cloreto de sódio a 10% (20 ml) foi adicionada por 30 minutos. Após agitação por um adicional de 1 hora, o sólido foi filtrado e o bolo filtrado foi lavado com água (4 x 50 ml) . O sólido foi liofilizado para um peso constante e então triturado com acetonitrila (4 x 50 ml) . Secagem sob vácuo alto por 15 horas forneceu conjugado de ácido poli-L- glutâmico-2 ' -docetaxel (890 mg, 87% de rendimento) como um pó branco. ΧΗ NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 12,10 (s, -COOH), 7,05-8,20 (m, prótons aromáticos), 4,80-6,05 (m) , 3,80-4,50 (m) , 5,0-5,6 (m, 5-H2. 7-H2), 3,70-4,35 (m) , 1,20-2,80 (m) , 1,00(s) .
Exemplo 6. Preparação de poli-l-ácido glutâmico -glicil-20(S) camptotecina (Esquema de Reação I) As etapas 1 e 2 abaixo foram realizadas conforme descrito por Greenwald, R.B., Pendri, A., Conover, C.D., Lee, C., Choe, Y.H., Gilbert, C., Martinez, A., Xia, J., Wu, D., e Hsue, M., Bioorg. & Med. Chem., 6:5 51-5 62, 1998 .
Etapa 1. Preparação de 20-(N-t-BOC-glicil)-20(S)camptotecina A uma solução de N-t-BOC-glicina (530 mg, 3,0 mmol) em diclorometano anidro (240 ml) foi adicionada 1,3-diisopropilcarbodiimida (379 mg, 3,0 mmol), N,N-dimetilaminopiridina (244 mg, 2 mmol), e 20 (S) camptotecina (348 mg, 1,0 mmol) a 0°C. A mistura de reação foi deixada aquecer a temperatura ambiente. Após agitação por 18 horas, a mistura foi lavada seqüencialmente com solução de ácido clorídrico aquosa 0, IN (2 x 50 ml) , com água (2 x 50 ml) , com solução de bicarbonato de sódio aquosa 0,1M (2 x 2 5 ml) , e com água (2 x 5 0 ml) . A fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi cristalizado de metanol (7 ml) para prover 20-(N-t-BOC-glicil)-20(S)camptotecina (424 mg, 84% de rendimento) como um pó amarelo. 1H NMR (3 00 MHz, CDC13) : δ 8,35 (s, 1H) , 8,22 (d, J = 8,38 Hz 1H) , 7,91(d, J = 8,07, 1H) , 7,76-7,85 (m, 1H) , 7,65 (t, J = 7,4 Hz, 1H) , 7,26 (s, 1H) , 5,70 (d, J = 17,25 Hz, 1H) , 5,40 (d, J = 17,25 Hz, 1Η) , 5,25 (s, 2H) , 4,95 (br s, 1H) , 3,98-4,25 (m, 2H) , 2,18-2,26 (m, 2H), 1,38 (s, 9H), 0,95 (t, J = 7,47 Hz, 3H).
Etapa 2. Preparação de sal de ácido trifluoracético de 20-Glicil-20(S)camptotecina Uma solução de 20-(N-t-BOC-glicil)-20(S)camptotecina (424 mg, 0,84 mmol) em uma mistura 1:1 (v/v) de diclorometano/ácido trifluoracético (21 ml) foi agitada a temperatura ambiente por 1 hora. Os solventes foram evaporados sob pressão reduzida. O sólido amarelo foi cristalizado de diclorometano/éter dietila (3:7 (v/v), 50 m) para prover sal de ácido trifluoracético de 20-glicil-20(S)camptotecina (361 mg, 83 % de rendimento) como um pó amarelo. 1H NMR (3 00 MHz, DMSO-d6) : δ 8,7 8 (s, 1H) , 8,45 (br s, 2H) , 8,20 (d, J = 8,2 Hz 1H) , 7,70-7,95 (m, 2H), 7,30 (s, 1H), 5,55 (s, 2H), 5,30 (s, 2H), 4,35 (d, J = 17,9 Hz, 1H) , 4,15 (d, J = 17,9 Hz, 1H) , 2,10-2,30 (m, 2H), 1,00 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
Etapa 3. Preparação de conjugado de ácido poli-L-glutâmico-20-glicil-20(S)camptotecina A uma suspensão agitada de sal de ácido trifluoracético de 20-glicil-20(S)camptotecina (351 mg, 0,68 mmol), ácido poli-L-glutâmico (465 mg, 3,16 mmol), e N,N-dimetilaminopiridina (249 mg, 2,04 mmol) em dimetilformamida anidra (13 ml) foi adicionada uma solução de 1,3-diisopropilcarbodiimida (111,6 mg, 0,88 mmol) em dimet ilformamida (2 ml) por 20 minutos. Após agitação sob uma atmosfera de argônio por 2 dias, a mistura foi resfriada em um banho de gelo e solução de cloreto de sódio aquosa a 10% (35 ml) foi adicionada por 3 0 minutos. Após agitação por um adicional de 1 hora, a suspensão foi acidif içada para pH 2,5 por adição de solução de ácido clorídrico aquoso a IN. O precipitado amarelo foi coletado por filtração, lavado com água (5 x 2 5 ml) , seco sob vácuo por toda a noite e triturado com acetonitrila (100 ml) . Após secagem sob vácuo alto por 24 horas, conjugado de ácido poli-L-glutâmico-20-glicil-20(S)camptotecina (703 mg, 95% de rendimento) foi obtido como um pó amarelo. 1H NMR (300 MHz, DMSO-dg) : δ 12,10 (s, -COOH) , 7,05-8,74 (m, 7,9,10,11,12, e 14 CH) , 5,0-5,6 (m, 5-CH2, 7-CH2), 3,70-4,35 (m, -Gly-CH2, PG-N-CH-), 1,42-2,62 (m, 18-CH2, PG-ÔCH2, ôCH2), 0,90 (br s, 19-CH3). ΧΗ NMR indicou uma carga de paclitaxel de 34%.
Exemplo 7. Processo In si tu para Geração de Ácido Glutâmico-Paclitaxel Um frasco de fundo redondo de 100 ml foi carregado com uma barra de agitação, sal de sódio de ácido poli-(L-glutâmico) , (340 mg, 2,25 mmol, 11,3 eq) , e 7 ml de dimetilformamida seca. A suspensão foi agitada e ácido trifluoracético (156 μΐ, 2,03 mmol, 10,2 eq) foi adicionado puro através de seringa. O sólido suspenso dissolveu em cerca de 5 minutos. Paclitaxel (170 mg, 0,199 mol, 1,0 eq) foi adicionado como um sólido, seguido por 4-(N,N- dimetilamino)piridina (10 mg, 0,082 mmol, 0,4 eq.) e diisopropilcarbodiimida (40 μΐ, 0,259 mmol, 1,3 eq.). A solução foi agitada a temperatura ambiente por 18 horas e foi então resfriada para 0°C com um banho de gelo. Uma solução de cloreto de sódio aquosa a 10% foi adicionada lentamente com agitação vigorosa, resultando na precipitação de um sólido branco pino. O pH foi ajustado para 2,5 com ácido hidroclorídrico diluído e a suspensão transferida para um tube centrifugo à 50 ml. O sólido foi girado, o sobrenadante foi decantado e o material resultante foi suspenso em 3 5 ml de água. A suspensão foi novamente girada, decantada e resuspensa em 35 ml de água. Após este enxágue final, o material restante foi liofilizado para obter um pó seco. O pó foi enxaguado com 3 x 15 ml de acetonitrila e então o solvente remanescente foi removido sob vácuo alto, fornecendo 485 mg de um pó branco. 1H NMR (d6 DMSO) indicou uma carga de paclitaxei de 38% em peso.
Exemplo 8. Ensaio Biológico A atividade antitumor foi analisada em camundongos implantados subcutaneamente com células de carcinoma de pulmão Lewis (LL/2) . Os tumores foram produzidos no músculo da região interescapular direita por injeção subcutânea 2,5 x 105 de células de carcinoma de pulmão de Lewis de murinos (LL/2) (ATTC CRL-1642) em um volume de 0,25 ml de PBS + 2% FBS. Os compostos e controle de veículo foram injetados i.p. 7 dias após implantação da célula de tumor quando os tumores tinham crescido para 20 mais ou menos 20 mm3 (média de 230 tumores) . Uma dose simples de conjugado de agente terapêutico-ácido poliglutâmico em 0, IN Na2HP04 foi administrado em uma dose equivalente tolerada máxima de lx-4x do agente não conjugado, que foi tipicamente administrado em cremofore 8,3% EL/8,3% de etanol em 0,75% de salmoura. Cada grupo de tratamento consistia de 10 camundongos aleatoriamente alocados a cada grupo. Inicialmente, o crescimento do tumor foi controlado a cada 3 a 4 dias. Quando os tamanhos de tumor aproximaram-se do estabelecido arbitrariamente como limite superior de 2.500 mm3, os tamanhos de tumor foram determinados diariamente. O volume de tumor foi calculado de acordo com a fórmula (comprimento x largura x altura)/2. Os camundongos com tumores iguais ou maiores do que 2.500 mm3 foram eutanizados por deslocamento cervical. A eficácia dos vários tratamentos foi expressa em termos de dias para tumor alcançar um volume de 2.500 mm3 (isto é, TGD, "tumor growth delay" retardo do crescimento do tumor), em comparação à dose tolerada máxima do agente terapêutico não conjugado.
Os conjugados de agente terapêutico-PG descritos nos Exemplos 2, 3, 5 e 6 acima foram testados e verificou-se serem ativos neste ensaio.
Exemplo 9. Preparação de ácido poli-L-glutâmico-CT 2584 Ácido poli-L-glutâmico (4,95 g) foi suspenso em Ν,Ν-dimetil formamida anidra (120 ml) e CT 2584 (0,873g, 1,634 mmol) foi adicionado. A mistura de reação foi aquecida com agitação a 50°C, até a solução limpida ser formada. A mistura de reação foi resfriada novamente para a temperatura ambiente e uma solução de N,N-dilsopropilcarbodiimida (0,247 g, 1,96 mmol) em N,N-dimetilformamida (5 ml) foi adicionada por um período de 30 minutos usando um funil de gotas. Após a adição, a reação foi agitada por 4 horas a temperatura ambiente. A reação foi resfriada para 5°C-10°C e 10% solução de cloreto de sódio (200 ml) foi adicionada lentamente para precipitar o conjugado de ácido poli-L-glutâmico CT 2584. O precipitado foi coletado por centrifugação a 1500 x g. O sólido úmido foi lavado duas vezes por suspensão em água (150 ml) e centrif ugação. O produto foi seco por congelamento para fornecer 5,16 gramas de conjugado de ácido poli-L-glutâmico CT2584. Rendimento = 88,6%. O produto foi caracterizado por ‘‘H NMR, que mostrou um simples em 3,9 ppm e 3,4 ppm correspondendo ao grupo metila em N3 e N7 e um simples amplo em 1,24 ppm correspondendo aos prótons alquila e uma máxima ampla em 0,85 ppm para grupo metila termina de CT 2584. Além disto, NMR mostrou múltiplos entre 1,5 ppm - 3,0 ppm e 3,5 ppm - 4,5 ppm correspondendo â estrutura de ácido poli-L-glutâmico.
Exemplo 10« Preparação de ãcido poli-L-glutâmico-camptotecina Uma mistura de 20(S)-camptotecina (64 mg, 0,184 mmol), poli-(ácido L-glutâmico) (256 mg, 49,8 kD) foi seca sob vácuo por 6 horas, então dissolvida em dimetilformamida anidra (15 ml) . A solução foi resfriada para -5°C em um banho de gelo/sal. A isto foi adicionado, sob argônio, iodeto de 2-clorometilpiridinio (85 mg, 0,33 mmol) e N, N-dimet ilaminopiridina (81 mg, 0,66 mmol) . A mistura de reação foi deixada aquecer para temperatura ambiente por toda a noite. Após 4 dias, o frasco de reação foi novamente resfriado para 0°C e 10% solução de cloreto de sódio (35 ml) foi lentamente adicionada durante 25 minutos. Esta mistura foi acidif içada para pH 2,5 usando 0,5N HCl (3,5 ml) e então agitada a temperatura ambiente por uma hora a mais. O precipitado amarelo que se formou foi filtrado, lavado com água (4 x 3 0 ml) , então seco sob vácuo por 12 horas. O bolo seco amarelo obtido foi moido a um pó fino, resuspenso em 2% MeOH/CH2Cl2 (10 ml) e agitado por 3 horas. O sólido foi separado por centrifugação. Este processo foi repetido quatro vezes para remover qualquer camptotecina não reagida. O sólido resultante foi seco sob vácuo por dois dias, para render PG-20(S)-camptotecina (295 mg, 97% de rendimento, determinado por equilíbrio de peso em relação a base de camptotecina recuperada (13 mg)) . 1H NMR (300 MHz em DMS0-d6) : δ 12,10 (s, -COOH) , 6,90-8,80 (m) , 5,15-5,8 (m) , 3,10-4,35 (m) , 1,42-2,62 (m) , 0,90 (br s, 19-CH3) . A porcentagem de carga de paclitaxel foi de 16% em peso.
Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência às concretizações especificas da mesma, deve ser entendido pelos versados na técnica que muitas alterações podem ser feitas e os equivalentes podem ser substituídos, sem com isto fugir do espírito e escopo da invenção. Além disto, muitas modificações podem ser feitas para adaptarem-se à situação específica, material, composição da matéria, processo, etapa de processo ou etapas, em relação ao espírito e escopo da presente invenção. Todas as modificações encontram-se dentro do escopo das reivindicações apensas.
Todas as publicações, pedidos de patente e patentes citadas aqui neste pedido são incorporadas como referência em sua totalidade, como se cada publicação, pedido de patente ou patente individual tivesse sido especificamente indicado para ser incorporado aqui como referência em sua totalidade.
REIVINDICAÇÕES
Claims (16)
1. Processo para preparação de um conjugado de ácido poli-L-glutâmico e um agente terapêutico de taxano selecionado de paclitaxel e docetaxel caracterizado por compreender: (a) fornecimento da forma protonada de um polímero de ácido poli-L-glutâmico e o agente terapêutico de taxano para conjugação do mesmo; (b) ligação covalente do agente de taxano ao polímero de ácido poli-L-glutâmico em um solvente orgânico inerte para formar um conjugado de agente terapêutico de taxano-ácido poli-L-glutâmico-2' , em que o agente é ligado ao ácido poli-L-glutâmico por um ligante de glicina; (c) precipitação do conjugado de agente terapêutico de taxano-ácido poli-L-glutâmico-2' da solução, através da adição de um volume em excesso de solução salina aquosa; e (d) coleta do conjugado como um sólido.protonado.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende ainda: (a.l) fornecimento de uma solução aquosa do sal de sódio de ácido poli-L-glutâmico; (a.2) acidificação da solução, desta forma convertendo o sal de sódio de ácido poli-L-glutâmico na forma protonada e precipitando a mesma da solução; e (a.3) coleta do precipitado de ácido poli-L-glutâmico e lavagem do precipitado com água.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) o ácido poli-L-glutâmico possui um peso molecular de 20 kd a 80 kd, conforme determinado por viscosidade.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (b) , o agente de taxano é ligado diretamente a um grupo carbóxi do ácido poli-L-glutâmico através de uma ligação fisiologicamente clivável.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a ligação é uma ligação de éster ou uma ligação de amida.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a ligação é uma ligação de éster.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (b) , o agente de taxano é ligado indiretamente a um grupo carbóxi do ácido poli-L-glutâmico através do ligante, onde o ligante é anexado ao ácido poli-L-glutâmico e ao agente de taxano através de ligações fisiologicamente cliváveis.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (b), o conjugado de agente terapêutico de taxano-ácido poli-L-glutâmico-2' compreende cerca de 5-55% em peso de um agente terapêutico.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende cerca de 10% a 45% em peso do agente terapêutico de taxano.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (c) , a solução salina aquosa compreende cloreto de sódio.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a solução salina aquosa é adicionada em l,5x - 4x o volume do solvente da mistura de reação.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende ainda a etapa de acidificar a mistura de reação.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda a ação de remover as impurezas de peso molecular inferior do conjugado, onde a remoção pode ser realizada entre as etapas (c) e (d) ou após a etapa (d).
14. Processo para preparação de um conjugado de ácido poli-L-glutâmico e um agente terapêutico de taxano selecionado de paclitaxel e docetaxel caracterizado por compreender: (a) suspensão de um sal de um polímero de ácido poli-L-glutâmico em um solvente orgânico inerte; (b) protonação do polímero por adição de um ácido anidro à suspensão, para formar um sal solúvel da base conjugada; (c) fornecimento do agente terapêutico de taxano selecionado de paclitaxel e docetaxel e ligação covalente do agente de taxano ao polímero de ácido poli-L-glutâmico para formar um conjugado de agente terapêutico de taxano-ácido poli-L-glutâmico-2' , em que o agente é ligado ao ácido poli-L-glutâmico por um ligante de glicina; (d) precipitação do conjugado de agente terapêutico de taxano-ácido poli-L-glutâmico-2' da solução por adição de um volume em excesso de solução de sal aquosa; e (e) coleta do conjugado como um sólido protonado.
15. Processo para preparação de um conjugado de ácido poli-L-glutâmico-2'-paclitaxel do sal de sódio de ácido poli-L-glutâmico e paclitaxel caracterizado por compreender as etapas de: (a) provisão de uma solução aquosa do sal de sódio de ácido poli-L-glutâmico; (b) acidificação da solução para um pH de cerca de 2 a 4, desta forma convertendo o sal de sódio de ácido poli-L-glutâmico para a forma protonada e precipitando o mesmo da solução; (c) coleta do precipitado de ácido poli-L-glutâmico e lavagem com água; (d) secagem do ácido poli-L-glutâmico a um teor de água entre 7% e 21% em peso; (e) contato do ácido poli-L-glutâmico com paclitaxel sob condições de acoplamento padrão por tempo suficiente para conjugar o paclitaxel ao polímero de ácido poliglutâmico por um ligante de glicina, através de uma ligação de éster formada entre o grupo 2'-OH de paclitaxel e um grupo carbóxi de ácido poli-L-glutâmico; (f) resfriamento da mistura de reação entre 0°C a 10°C, enquanto adicionando lentamente solução de sal aquosa à mistura de reação; (h) acidificação da suspensão resultante; (i) coleta do conjugado como um sólido protonado; e (j) extração das impurezas do sólido protonado.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato das etapas (a)-(d) serem substituídas por etapas (a') e (b'): (a' ) fornecimento de uma suspensão de sal de sódio de ácido poli-L-glutâmico em um solvente orgânico inerte; e (b') adição de cerca de 0,95 equivalente de ácido trifluoracético ou ácido metanosulfônico, desta maneira formando uma solução compreendendo trifluoracetato de sódio de ácido poli-L-glutâmico ou metanosulfonato de sódio de ácido poliglutâmico e realizando as etapas (e)-(j) conforme descrito na reivindicação 15.
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