TWI653993B - 血管取代物 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種血管取代物，包含一管狀的主體及一位於該主體表面的改質層，該主體具有連通的孔隙及表面負電性，該改質層具有親水性及負電性，且該血管取代物之內徑為0.5mm以上。該血管取代物即便具有小口徑，其在活體內具有長期暢通性且會隨時間明顯降解，因此適合用於暫時性取代活體之動脈、靜脈、小動脈、及小靜脈。

Description

血管取代物

本發明係關於一種用於活體內管狀結構的植入裝置，特別係關於一種具有長期暢通性的血管取代物。

人體血管可能因為創傷或病變而受損，為永久性或暫時性地取代受損血管的功能，醫學界提出人工血管移植物之使用，例如用於動脈粥狀硬化、血管老化之血管移植手術，或作為洗腎病人進行血液透析所需之靜脈移植廔管(Graft fistula)。一般外科手術上常用的血管移植物可為生物型(biological vascular graft)或合成型(synthetic vascular graft)。

生物型人工血管包括自體移植血管與異體移植血管。自體移植血管的常見來源為腿隱靜脈(saphenous vein)或胸內乳動脈(internal mammary artery)，雖然是較理想的材料，但其來源有限；異體移植血管通常是將取自動物體的血管進行化學處理，雖然來源較豐富，但植入人體後易引起免疫反應而造成排斥現象，並導致血栓形成。

合成型人工血管的發展始於1952年Voorhees首次研發成功之氯乙烯-丙烯腈共聚纖維(Vinyon N)人工血管，其經證實可應用於臨床。合成型人工血管依照材料不同又可細分為生物不可降解型人工血管及生物可降解型人工血管。相對於生物型人工血管，合成型人工血管較不易引發排斥或血栓、鈣化，但仍存在長期暢通性不佳的問題。

人工血管按照口徑大小可分為大口徑(大於8mm)人工血管、中口徑人工血管(6~8mm)及小口徑(小於6mm)人工血管(或稱人工小血管)。口徑小於6mm的人工小血管可應用於小動脈以及冠狀動脈或腹股溝動脈等血液流速較慢 的血管，但目前以人工小血管替代人體小動脈或小靜脈等仍未獲得滿意成果，因為人工小血管的長期暢通率不盡理想，例如口徑為4mm之人工小血管的一年暢通率小於40%。故目前市面上無口徑小於4mm之產品。鑑於人工小血管存在因凝血反應或新生內膜增厚而狹窄或阻塞的問題，發展一種適合替代人體小動脈或小靜脈的人工小血管，使其具有與人體動、靜脈相似的生理化學性質，以及良好的生物相容性與長期暢通率，為現今人工血管組織工程之一重要課題。

緣此，本發明之一目的在提供一種生物可降解的血管取代物，包含一管狀的主體及一位於主體表面的改質層，該主體具有連通的孔隙及表面負電性，該改質層具有親水性及負電性，且該血管取代物之內徑為0.5mm以上。

在本發明之一實施例中，該主體由聚胺酯(polyurethane)製成，該聚胺酯包含一硬鏈段與一軟鏈段，該硬鏈段係由二異氰酸酯(diisocyanate)與一鏈延長劑(chain extender)反應形成，該軟鏈段係選自於由聚己內酯二元醇(polycaprolactone diol，PCL二元醇)、聚己二酸乙二醇丁二醇酯二元醇(polyethylene butylene adipate diol，PEBA二元醇)及其組合所組成的群組；該二異氰酸酯可為異佛爾酮二異氰酸酯(isophorone diisocyanate，IPDI)，該鏈延長劑可為二羥甲基丙酸(dimethylolpropionic acid，DMPA)及乙二胺(ethylenediamine，EDA)，且該異佛爾酮二異氰酸酯與二羥甲基丙酸之化學劑量比為3.57：0.7~1.3。

在本發明之一實施例中，該主體之孔隙率(porosity)為50~99%，較佳為70~90%；該主體之界達電位為-20~-80mV，較佳為-40~-80mV；該主體之水滴接觸角為68~73°；且該主體在十二週的降解率為6%以上。

在本發明之一實施例中，該主體係以冷凍乾燥法或靜電紡絲法製得；該改質層係選自由磺酸化幾丁聚醣(sulfonated chitosan，SCS)、肝素(heparin)、及精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸胜肽(簡稱RGD胜肽)所組成的群組；該磺酸化幾丁聚醣可接枝至經電漿活化的該主體表面。

本發明之血管取代物即便內徑減低至約0.5mm，其在植入活體12週後仍保有80%以上暢通率而不易引發免疫反應、血栓、及血管內膜過度增生，且隨時間明顯降解，因此適合用於暫時性取代活體之動脈、靜脈、小動脈、及小靜脈，或作為洗腎用動靜脈廔管，亦可用作篩選藥物之平台。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

圖1係為本發明一實施例之PU-C聚胺酯及比較例之PU-N聚胺酯之合成示意圖。

圖2係為PU-C薄膜在磺酸化幾丁聚醣表面改質前後的衰減全反射傅立葉紅外光譜儀(ATR-FTIR)，圖中PUm表示以電漿接枝磺酸化幾丁聚醣之PU-C薄膜、PUs表示表面直接塗覆磺酸化幾丁聚醣之PU-C薄膜、PU表示未進行表面改質之PU-C薄膜、SCS表示磺酸化幾丁聚醣。

圖3係為PU-C支架及PU-C血管取代物之內、外表面與橫截面之掃描式電子顯微鏡影像；比例尺表示40μm。

圖4係為PU-C血管取代物或市售聚胺酯(Pellethane)所製成之支架植入大鼠左後腿股動脈4-12週後，植入處之血管超音波檢查結果。

圖5顯示PU-C血管取代物或Pellethane支架植入大鼠左後腿股動脈12週後之暢通率；*表示p<0.05。

圖6a-6d係為PU-C血管取代物或Pellethane支架植入大鼠左後腿股動脈的照片；其中，圖6a係為PU-C血管取代物植入大鼠左後腿股動脈0天的照片；圖6b係為Pellethane支架植入大鼠左後腿股動脈0天的照片；圖6c係為PU-C血管取代物植入大鼠左後腿股動脈12週後的照片；圖6d係為Pellethane支架植入大鼠左後腿股動脈12週後的照片；比例尺表示5mm，箭頭指示PU-C血管取代物或Pellethane支架的位置。

圖7a-7d顯示PU-C血管取代物之冷凍切片顯微鏡影像及免疫染色的結果；其中，圖7a及7c係為PU-C血管取代物之冷凍切片顯微鏡影像；圖7b係以抗CD86抗體對圖7a之冷凍切片進行免疫染色的結果；圖7d係以抗CD163抗體對圖7c之冷凍切片進行免疫染色的結果；比例尺表示100μm。

圖8a-8c顯示PU-N薄膜或PU-C薄膜相比Pellethane薄膜或組織培養專用聚苯乙烯(TCPS)對衍生自THP-1細胞之巨噬細胞分化的影響；其中，圖8a係為M0及M1巨噬細胞的顯微鏡影像，圖8b及圖8c係以M1及M2巨噬細胞的細胞激素分泌量表現各種薄膜上M1及M2巨噬細胞的分化程度；圖8a中比例尺表示50μm；實驗數據係三次獨立實驗結果的平均值±標準偏差，*表示p<0.05，***表示p<0.01，ns表示無統計上顯著差異。

圖9顯示衍生自THP-1細胞之M1巨噬細胞以PU-C或PU-C’奈米粒子處理後，其細胞激素IL-1β及IL-6之訊息核糖核酸(mRNA)相對表現量；實驗數據係三次獨立實驗結果的平均值±標準偏差，*表示p<0.05，ns表示無統計上顯著差異。

圖10a-10b顯示衍生自外周血單核細胞(PBMC)之M1及M2巨噬細胞以PU-N或PU-C奈米粒子處理後，其細胞激素TNF-α、IL-1β、IL-10及TNF-β的分泌量；實驗數據係三次獨立實驗結果的平均值±標準偏差，**表示p<0.01，***表示p<0.001，ns表示無統計上顯著差異。

圖11a-11d顯示PU-N薄膜、PU-C薄膜、及聚乳酸(PLA)薄膜連同周圍組織切片的的蘇木素-伊紅染色(H&E染色)結果、纖維囊厚度估算值以及巨噬細胞活化狀況；其中，圖11a-11b係為PU-N薄膜、PU-C薄膜、及PLA薄膜連同周圍組織切片的H&E染色結果及纖維囊厚度估算值；圖11a中比例尺表示100μm，箭頭指示纖維囊的位置；圖11c-11d係為前述切片的M1、M2巨噬細胞螢光染色結果及M1、M2巨噬細胞平均數目與M2/M1比例；圖11c中比例尺表示10μm；實驗結果表示為平均值±標準偏差，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

本發明提供一種具有長期暢通性且生物可降解的血管取代物，包含一管狀的主體及一位於該主體表面的改質層，該主體具有連通的孔隙及表面負電性，該改質層具有親水性及負電性，且該血管取代物之內徑為0.5mm以上。以下實施例以生物可降解的聚胺酯所製成的薄膜及支架，以及經過表面改質的聚胺酯薄膜及支架，舉例說明本發明之血管取代物的特性，包含親水性、負電性、近似血管構成細胞大小之孔隙直徑及高孔隙率、強化的機械性質、低發炎刺激性或免疫刺激性、可隨時間而降解等。

定義

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。

本文中「支架」一詞，除非特別指定，係指由合成材料製成之血管取代物之主體，其未經過表面改質，亦不含改質層。

材料及方法 聚胺酯之合成

本發明之血管取代物之主體較佳為由生物可降解的聚胺酯製成。該生物可降解的聚胺酯具有一主鏈，該主鏈包含一硬鏈段與一軟鏈段。該硬鏈段係由二異氰酸酯與一鏈延長劑反應形成，該二異氰酸酯可為異佛爾酮二異氰酸酯(IPDI)；該鏈延長劑包含一離子性鏈延長劑及一第二鏈延長劑，該離子性鏈延長劑可為二羥甲基丙酸(DMPA)。在本發明之一較佳實施例中，IPDI與DMPA之化學劑量比為3.57：0.7~1.3。該第二鏈延長劑之一例為短鏈且反應性較高的乙二胺(EDA)。該軟鏈段係為聚己內酯二元醇(PCL二元醇)或者由PCL二元醇與聚己二酸乙二醇丁二醇酯二元醇(PEBA二元醇)反應形成。以下實施例中使用四種例示性聚胺酯材料，分別名為PU-C、PU-C’、PCL40EB60、及PU-N，其組成及化學劑量比如表1所示。該PU-N係作為比較例，其係以N-甲基二乙醇胺(N-methyldiethanol-amine，N-MDEA；購自Acros)為離子性鏈延長劑。

前述聚胺酯之合成採用水性製程，其中，PU-C及PU-N聚胺酯之合成示意圖參見圖1，其步驟簡述如下。將PCL二元醇(分子量約為2kDa；購自Sigma)加入四頸反應瓶，在75-80℃的預合(mixing)溫度下，以轉速180rpm之機 械攪拌方式使二元醇混合均勻，並於全程填充氮氣以避免副反應發生。30分鐘後，於四頸反應瓶中添加催化劑二辛酸亞錫(tin(II)2-ethylhexanoate，T-9；購自Alfa Aesar)及IPDI，在75℃的預聚合(prepolymerization)溫度下，以轉速180rpm進行反應3小時。其次，將DMPA(購自Sigma-Aldrich)或N-MDEA與作為溶劑之丁酮(methyl ethyl ketone，MEK；購自J.T.Baker)加入四頸反應瓶，維持溫度於75℃攪拌反應1小時，降溫至45-50℃後再加入三乙基胺(triethylamine，TEA；購自R.D.H.)或醋酸(acetic acid)以中和反應。該中和反應產物在轉速1100rpm下分散於去離子水，再將二次水稀釋的乙二胺(購自Tedia)分兩次加入，每次間隔為15分鐘，即可獲得生物可降解聚胺酯乳液(固含量約30wt%)。

聚胺酯薄膜之製備

將生物可降解聚胺酯乳液以水稀釋為5~30wt%，較佳為15wt%。將該稀釋液注入鐵氟龍盤，在-20℃下冷凍24小時，隨後以冷凍乾燥機(freeze dryer，FDU-1200，Eyela，日本)進行冷凍乾燥24小時，可製得厚度約為0.5~1mm的生物可降解聚氨酯薄膜。生物可降解聚氨酯薄膜亦可利用靜電紡絲法製得。

聚胺酯支架之製備

將生物可降解聚胺酯乳液以水稀釋為5~30wt%，較佳為15wt%。取1mL該稀釋液注入內徑分別為0.5~0.7cm及1.0cm的鐵氟龍雙層管模，在-20℃下冷凍24小時，隨後以冷凍乾燥機進行冷凍乾燥24小時，可製得內徑約為0.7mm、壁厚度約為0.3mm、及孔隙率約為50~99%的生物可降解聚氨酯支架。該支架亦可利用靜電紡絲法製得。

聚胺酯薄膜及支架之表面改質

利用大氣電漿(atmospheric-pressure plasma，三方機械，Model Type：FH3001+HTR1001+RD1004)對冷凍乾燥製得的聚胺酯薄膜或聚胺酯支架進行表面改質。使用20%氧氣及80%氮氣的混合氣體，進氣壓力2.5kg/cm²，電漿功率設定為1000W。電漿處理時，固定噴嘴高度為20mm、平台移動速度為30m/min；電漿處理後將聚胺酯薄膜及聚胺酯支架迅速浸入1%幾丁聚醣衍生物溶液，於37℃下反應30分鐘以接枝磺酸化幾丁聚醣(分子量約為140kDa，去乙醯度95%，磺酸化99%)，再以二次蒸餾水清洗及風乾。

材料特性分析

為分析表面性質，將表面改質前後之聚胺酯薄膜裁剪成適當大小，置放於夾具上，以衰減全反射傅立葉紅外光譜儀(attenuated total reflection fourier transform infrared spectrometry，ATR-FTIR，spectrum 100 model；Perkin Elmer)分析官能基，掃描次數3次，解析度為0.5cm^-1，掃描範圍為500~4000cm^-1。此外，依據液滴接觸角法(sessile drop technique)，使用接觸角儀(FTA-1000B，First Ten Angstrom Company，美國)在室溫下分析聚胺酯支架的水滴接觸角，各種聚胺酯材料的測量值為3次測量的平均值。

為分析機械性質，將表面改質前後之聚胺酯支架的兩端夾緊於夾具上，利用萬能拉力機(HT-8504，弘達，臺灣)以等拉伸速率100mm/min進行抗拉試驗，由應力-應變圖獲得楊氏係數(Young’s modulus)、抗拉強度(tensile strength)、及拉伸率(elongation at break)，各種聚胺酯材料製得之支架的測量值為3次測量的平均值。

為分析孔隙結構，以10mA電流在表面改質前後之聚胺酯支架上鍍白金40秒，再以場發射掃描式電子顯微鏡(field emission scanning electron microscope，FE-SEM，JEOL-JSM-7600)於電壓5kV下觀察支架內、外表面。聚胺酯支架的橫截面結構係以液態氮折斷支架後再依前述步驟觀察。

血管取代物之植入

以下實施例中由聚胺酯支架製得之血管取代物之尺寸為內徑0.5~0.7mm、壁厚度0.3mm、及長度12mm。血管取代物植入過程中，以異氟醚(isoflurane)對體重約300-350g的成年SD大鼠(Sprague-Dawley rat)進行氣體麻醉，將其左後腿股動脈部分切除，切除長度約10mm，其後植入血管取代物以替代原本的股動脈，再以10-0尼龍線縫合股動脈與聚胺酯支架的接合處。大鼠飼養環境控制在室溫25℃、濕度45%及光週期12小時。

冷凍切片

將血管取代物自大鼠體內取出，在-20℃下急速冷凍，並使用切片機將其製備為厚度約為9μm的標本，以利後續進行免疫染色。

細胞分化

為進行巨噬細胞(microphage)分化試驗，將人類單核細胞THP-1(human monocytic THP-1)培養於添加10%熱滅活胎牛血清(fetal bovine serum)及1%青黴素-鏈黴素-兩性黴素溶液之RPMI-1640培養基(Gibco)。該細胞每週繼代培 養二次，培養條件為37℃、含有5%二氧化碳之濕潤空氣。其次，為誘導THP-1細胞形成M0巨噬細胞，將THP-1細胞接種於6孔培養盤並以200ng/mL佛波醇-12-十四乙醯-13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)處理細胞24小時。若欲誘導THP-1細胞進一步分化為M1巨噬細胞，以200ng/mL PMA處理THP-1細胞24小時，再添加100ng/mL脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)及20ng/mL干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)培養細胞24小時。另一方面，若欲誘導THP-1細胞進一步分化為M2巨噬細胞，以200ng/mL PMA處理THP-1細胞24小時，再添加20ng/mL介白素-4(interleukin-4，IL-4)及20ng/mL介白素-13(interleukin-4，IL-13)培養細胞24小時。細胞形態以倒立式顯微鏡(Leica，DMIRB)觀察。

外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)係利用密度梯度離心法自人類新鮮血液的白血球細胞層(buffy coat)分離而得。該細胞以50ng/mL顆粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)或20ng/mL巨噬細胞群落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)於37℃培養6天可形成M1或M2巨噬細胞的前驅細胞，本文中亦稱PBMC的衍生細胞。若欲誘導該前驅細胞進一步分化為M1巨噬細胞，以200ng/mL LPS及20ng/mL IFN-γ培養細胞24小時。另一方面，若欲誘導該前驅細胞進一步分化為M2巨噬細胞，以20ng/mLIL-4培養細胞24小時。

酵素連結免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

M0巨噬細胞分化為M1或M2巨噬細胞的過程中所分泌的細胞激素(cytokine)係依據廠商說明書使用ELISA套組(R&D system，美國)進行定量。該細胞激素包含促發炎細胞激素(proinflammatory cytokines)，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及介白素-1β(interleukin-1β，IL-1β)，以及免疫抑制細胞激素(immunosuppressive cytokines)，如腫瘤壞死因子-β(tumor necrosis factor-β，TNF-β)及介白素-10(interleukin-10，IL-10)。

基因表現分析

利用定量即時聚合酶鏈鎖反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)測定M1巨噬細胞中IL-1β及介白素-6(interleukin-6，IL-6)等標記蛋白之基因表現，其步驟簡述如下。依據廠商說明書，利用Trizol試劑(Invitrogen)自細胞分離出總RNA，再於37℃下以互補去氧核醣核酸(cDNA)合成套組(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit；MBI Ferments，德國)將RNA反 轉錄為cDNA。其後，利用qPCR套組(DyNAmo Flash SYBR Green qPCR kit；Finnzymes Oy，芬蘭)及IL-1β、IL-6、及甘油醛3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因之引子對(表2)在PCR熱循環儀(StepOnePlus thermo cycler；Applied Biosystems，美國)進行qRT-PCR。各基因的表現量以GAPDH的基因表現量標準化。實驗結果所示mRNA相對表現量係相對於空白對照組的基因表現量的比值。

聚胺酯薄膜之皮下植入

在麻醉後的成年SD大鼠(每組3隻)背部皮膚切割出10mm×10mm之開口，將裁切成正方形之聚胺酯薄膜(尺寸為10mm×10mm，厚度為0.2mm)或聚乳酸(polylactic acid，PLA)薄膜植入該開口位置的皮下組織。皮下植入4週後，將前述薄膜取出並以磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS溶液)清洗，該薄膜連同周圍組織以甲醛固定，經過石蠟包埋、切片、及蘇木素-伊紅染色(haematoxylin and eosin stain，H&E染色)，以軟體分析其顯微鏡影像中纖維囊(fibrous capsule)最薄處的厚度。

免疫染色及影像分析

為偵測M1巨噬細胞，將血管取代物的冷凍切片或經甲醛固定的皮下植入薄膜樣品切片以抗CD86小鼠單株抗體MCA2874GA(AbD serotec)培養一段時間。為偵測M2巨噬細胞，將前述切片以抗CD163小鼠單株抗體MCA342GA(AbD serotec)培養一段時間。其次，以標記螢光染劑Alexa Flour 594及Alexa Flour 488之抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)抗體(Biolegend)作為CD86及CD163的二級抗體，與前述切片培養一段時間。利用螢光顯微鏡觀察巨噬細胞並取得高解析度影像，再由單一切片的三幅影像計算陽性染色的巨噬細胞的平均 數目。聚胺酯薄膜之皮下植入實驗中，M2/M1比例定義為各組中M2巨噬細胞數目除以M1巨噬細胞數目所得比值，再進一步以PLA組的M2/M1比值進行標準化。統計上的顯著差異以單變量變異數分析(one way ANOVA)判斷。

實施例1 聚胺酯薄膜及支架之親水性

為檢測聚胺酯支架的表面改質，利用衰減全反射傅立葉紅外光譜儀獲取PU-C薄膜在磺酸化幾丁聚醣表面改質前後的ATR-FTIR光譜，結果如圖2所示。圖2包含4種樣品的光譜，由上而下分別為表面以電漿接枝磺酸化幾丁聚醣之PU-C薄膜(標記為PUm)、表面直接塗覆磺酸化幾丁聚醣之PU-C薄膜(標記為PUs)、未進行表面改質之PU-C薄膜(標記為PU)、以及磺酸化幾丁聚醣(標記為SCS)。依據圖2，PU的吸收峰位於3370cm^-1(代表N-H鍵伸縮震動)、2954cm^-1(代表C-H鍵伸縮震動)、1735cm^-1(代表酯類及胺基甲酸乙酯之C=O鍵)、1532cm^-1(代表N-H鍵彎曲震動)、及1240cm^-1(代表胺基甲酸乙酯之C-O鍵伸縮震動)，其中，1735cm^-1位置出現尖挺吸收峰，而1532cm^-1位置出現較小吸收峰。相比未進行表面改質之PU-C薄膜，磺酸化幾丁聚醣表面改質後的PU-C薄膜在代表C-O-S伸縮震動之810cm^-1位置及代表亞碸(sulfoxide)之1020cm^-1位置有吸收峰增強趨勢，並且在代表磺酸(sulfonic acid)之1240cm^-1位置有明顯的吸收峰增強，證明本發明聚胺酯薄膜及支架能成功接枝磺酸化幾丁聚醣。

此外，水滴接觸角檢測結果顯示PU-C及PCL40EB60支架的接觸角分別為102.9°及106.1°，但磺酸化幾丁聚醣表面改質後的PU-C及PCL40EB60支架均有大幅減少的接觸角，分別為72.5°及68.9°，此親水性提高的現象再次證明本發明聚胺酯支架能成功接枝磺酸化幾丁聚醣。對照市售聚胺酯(Pellethane 2363-80A，簡稱Pellethane，Upjohn)的水滴接觸角為71.6°，本發明聚胺酯支架透過磺酸化幾丁聚醣表面改質可達到與其近似的親水性。

實施例2 聚胺酯支架及血管取代物之孔隙 2.1孔隙

將PU-C聚胺酯乳液的固含量調整為15wt%，可以冷凍乾燥法製得PU-C支架。其後，利用大氣電漿對該支架的內、外表面進行改質，如接枝磺 酸化幾丁聚醣，以獲得PU-C血管取代物。該PU-C血管取代物的外表面可進一步塗佈30wt%PU-C聚胺酯乳液以形成一層PU-C緻密膜，因此使外表面幾乎無孔隙。圖3係為PU-C支架及PU-C血管取代物之內、外表面與橫截面之掃描式電子顯微鏡影像。由圖3可測量PU-C支架及PU-C血管取代物之內、外表面與橫截面之孔隙平均大小，如表3所列；由圖3可測量得PU-C支架的孔隙率約為50~99%。

依據表3，PU-C支架在表面改質前的內表面孔隙直徑為9.5μm，但接枝磺酸化幾丁聚醣後，PU-C血管取代物的內表面孔隙直徑降低至小於6μm。PU-C支架在表面改質前的外表面相比內表面有較大孔隙，其直徑約為29.9μm。相對地，PU-C血管取代物因外表面塗覆一厚度約30μm的PU-C緻密膜，其外表面孔隙直徑降低為6.4μm。此外，PU-C血管取代物的內、外表面及截面結構顯示上述孔隙間彼此連通。

2.2機械性質

前述PU-C支架在表面改質前後的楊氏係數(Young's modulus)、100%模數(100%modulus)、抗拉強度(tensile strength)、及拉伸率(elongation at break)如表4所示。磺酸化幾丁聚醣的接枝提升PU-C支架的機械性質，尤其是拉伸率可由242.0%提高至510.2%。作為對照組的Pellethane薄膜與未經表面改質之PU-C支架有相似的機械性質，其楊氏係數、100%模數、抗拉強度、及拉伸率分別為3.4±0.2Mpa、1.6±0.3Mpa、2.0±0.4Mpa、及301.1±65.8%。

為探討本發明血管取代物在生理環境下的機械性質變化，將PU-C血管取代物持續放置於37℃的去離子水或鹽類溶液(PBS溶液)中2、4、6週，並測量其機械性質。依據表4，經過2週後，PU-C血管取代物的機械性質皆下降，但拉伸率仍可維持約200%，須注意測試狀態會影響測量值，溼式測試較乾式測試的測量值低，但水或PBS溶液的不同環境未使PU-C血管取代物的機械性質有明顯差別。經過4週後，PU-C血管取代物在水或PBS溶液的不同環境下表現出不 同的抗拉強度，依乾式測試結果，PU-C血管取代物置於PBS溶液中較置於水中有較低的抗拉強度，分別為1.9±0.6Mpa與3.5±0.3Mpa。經過6週後，溼式測試的測量值在PBS溶液與水的環境下皆低於乾式測試的測量值。

實施例3 血管取代物之活體應用 3.1血流暢通性

將本發明一實施例之PU-C血管取代物植入SD大鼠經切除的左後腿股動脈後，以雷射都卜勒微流儀(MoorVMS-LDF2；Moor Instruments，英國)分析該植入處及大鼠正常右後腿的血流量(flux)、血流速度(speed)、及血流濃度變化。依據表5，相比正常右後腿，PU-C血管取代物植入左後腿12週後的血流量、血流速度、及血流濃度略為下降；相對地，Pellethane支架植入大鼠左後腿12週後的血流量及血流速度下降為正常右後腿的一半。

此外，依據圖5之血管超音波檢查結果，PU-C血管取代物植入大鼠左後腿10週後可測得4個血流訊號；Pellethane支架植入10週後可測得2個血流訊號，僅為在大鼠正常右後腿所測得之4個血流訊號的一半。

圖5係利用血管超音波評估而得PU-C血管取代物或Pellethane支架植入大鼠左後腿12週後的暢通率(patency rate)，其計算公式如下：血管取代物植入後的股動脈血流速度/未植入血管取代物的股動脈血流速度×100%。依據圖5，PU-C血管取代物的暢通率可達80%以上，明顯高於Pellethane支架的暢通率。該些結果說明本發明血管取代物能維持正常血流暢通性明顯較長時間。

3.2血管取代物之降解

圖6a-6d顯示PU-C血管取代物(圖6a及6c)或Pellethane支架(圖6b及6d)植入大鼠左後腿股動脈0天及12週後的降解狀況。依據圖6c，PU-C血管取代物植入12週後有明顯的降解情形，且其沾黏現象相比植入12週的Pellethane支架(圖6d)更輕微。此外，依據膠體滲透層析儀(gel permeation chromatography，GPC)的分析結果(表6)，PU-C血管取代物主體之PU-C支架在12週內的降解率約為6.51%，而Pellethane支架在12週內的降解率約為10.48%。

Mw：重量平均分子量；Mn：數目平均分子量；Mw/Mn：分子量分布指數。

3.3血管取代物之低發炎刺激性

由於外來物植入動物體內通常會引發巨噬細胞參與的免疫反應，導致包括CD86⁺ M1巨噬細胞之發炎性細胞的聚集，本實施例將植入大鼠左後腿股動脈12週的PU-C血管取代物自大鼠體內取出及冷凍切片，再以巨噬細胞特異性抗體對該切片進行免疫染色，以檢測其發炎刺激性。依據圖7b，當以抗CD86抗體進行免疫染色時，PU-C血管取代物僅有少部分呈現M1巨噬細胞陽性染色，約佔切片整體的20%。此結果顯示本發明血管取代物不易引起發炎反應，亦暗示本發明血管取代物不易引發血管內膜過度增生。

由於巨噬細胞具有異質性，除了促進發炎的M1巨噬細胞外尚有其他可被活化的替代細胞系，如CD163⁺M2巨噬細胞，故PU-C血管取代物之切片亦以抗CD163抗體進行免疫染色。由圖7d可觀察到CD163⁺陽性染色約佔切片整體的25%，故推測PU-C血管取代物中有M2巨噬細胞存在。因為M2巨噬細胞普遍被認為與抗發炎及促進組織結構重組相關，此結果說明本發明血管取代物具有抗發炎的效果。

比較例1 聚胺酯材料之免疫刺激性因表面電性而異

為評估表面電性對聚胺酯材料之免疫刺激性的影響，首先，以具有胺基的N-MDEA為鏈延長劑製備PU-N聚胺酯，以具有羧基的DMPA為鏈延長劑製備羧基含量較高的PU-C聚胺酯及羧基含量較低的PU-C’聚胺酯，並分析該三種聚胺酯乳液中聚胺酯奈米粒子的粒徑及界達電位。依據表7，PU-N聚胺酯具有表面正電性，PU-C’及PU-C聚胺酯皆具有表面負電性，但以PU-C聚胺酯帶有較多表面負電荷且粒徑較小。

為比較前述二種聚胺酯對巨噬細胞分化的抑制作用，將PU-N及PU-C聚胺酯乳液(10wt%，300μL)於室溫下分別注入24孔細胞培養盤以製成 PU-N及PU-C薄膜，並將人類單核細胞THP-1置於PU-N或PU-C薄膜上進行巨噬細胞分化培養24小時，其後，以顯微鏡觀察巨噬細胞形態及以ELISA分析細胞激素之分泌。作為對照，將細胞依同上步驟培養於Pellethane薄膜或組織培養專用聚苯乙烯(tissue culture polystyrene，TCPS)製成之24孔細胞培養盤。

圖8a顯示各組被誘導而形成的M0巨噬細胞皆呈圓形，但相對於TCPS培養盤或Pellethane薄膜，PU-N及PU-C薄膜上有較少的M0巨噬細胞貼附。此外，相對於TCPS培養皿及Pellethane薄膜上因LPS/IFN-γ誘導而形成的M1巨噬細胞呈紡錘形，PU-N及PU-C薄膜上的M1巨噬細胞偏圓形且有些微聚集現象。依據圖8b，相對於TCPS培養盤及Pellethane薄膜上的M1巨噬細胞，PU-N及PU-C薄膜上的M1巨噬細胞分泌顯著較少的促發炎細胞激素，包括TNF-α及IL-1β，且以PU-C薄膜使M1巨噬細胞分泌最少的TNF-α及IL-1β。然而，依據圖8c，TCPS培養盤、Pellethane薄膜、PU-N薄膜、及PU-C薄膜上的M2巨噬細胞所分泌的免疫抑制細胞激素在數量上並無顯著差異，包括TNF-β及IL-10。該些結果證明如PU-N及PU-C之生物可降解的聚胺酯能抑制M1巨噬細胞的分化，且以具有表面負電性的聚胺酯較果最佳。

圖9顯示以LPS/IFN-γ誘導24小時而形成的M1巨噬細胞以100μg/mLPU-C或PU-C’奈米粒子處理30分鐘後，其細胞內IL-1β及IL-6等標記蛋白的mRNA相對表現量。依據圖9，相較於未以聚胺酯奈米粒子處理的空白對照組，PU-C及PU-C’奈米粒子皆會抑制IL-1β及IL-6的基因表現，但以羧基含量較低及表面負電荷較少的PU-C’奈米粒子相比PU-C奈米粒子表現出較差的免疫抑制效果。

為驗證前述聚胺酯材料對巨噬細胞分化的抑制作用亦可見於人類初代單核細胞(primary human monocytes)，以PU-N或PU-C奈米粒子處理外周血單核細胞(PBMC)衍生細胞30分鐘後再以LPS/IFN-γ或IL-4/IL-13處理該細胞24小時。依據圖10a，相較於未以聚胺酯奈米粒子處理的空白對照組，PU-N及PU-C奈米粒子皆會抑制衍生自PBMC之M1巨噬細胞分泌TNF-α及IL-1β，且以PU-C奈米粒子對TNF-α分泌的抑制力最強，此結果與THP-1細胞的實驗結果相符。依據圖10b，PU-N及PU-C奈米粒子皆會促進衍生自PBMC之M2巨噬細胞分泌IL-10及TNF-β，此結果有別於前述THP-1細胞的實驗結果。

比較例2 聚胺酯薄膜引起的異物反應(foreign body reaetions，FBR)因表面電性而異

人造植入物在活體內容易被緻密的膠原蛋白包覆而形成纖維囊，同時刺激巨噬細胞累積而引起異物反應。為比較不同表面電性的聚胺酯薄膜植入活體後所引起的異物反應，將PU-N或PU-C薄膜植入SD大鼠背部的皮下組織4週，估算其所造成纖維囊的厚度，以評量引起異物反應的程度。作為對照，以習知聚乳酸(PLA)薄膜進行皮下植入。

圖11a及圖11b係為PU-N薄膜、PU-C薄膜、及PLA薄膜連同周圍組織切片的H&E染色結果及纖維囊厚度估算值，其顯示相較於源自PLA薄膜的纖維囊，PU-N及PU-C薄膜會造成厚度較薄的纖維囊。圖11c及圖11d係前述切片的M1、M2巨噬細胞螢光染色結果及M1、M2巨噬細胞平均數目與M2/M1比例，該二圖顯示PU-N及PU-C薄膜相比PLA薄膜會聚集較少的M1巨噬細胞及較多的M2巨噬細胞。該些結果說明如PU-N及PU-C之生物可降解的聚胺酯會引起較輕微的異物反應，相較習知的聚乳酸材料表現出更好的生物相容性，特別是具有表面負電性的聚胺酯最不易引起異物反應。

綜上所述，本發明之血管取代物透過諸如磺酸化幾丁聚醣之表面改質而具有較高的親水性，有利於血管新生過程中內皮細胞及平滑肌細胞貼附其上。同時，因為帶負電的磺酸基間彼此排斥而增加聚胺酯主鏈的移動，磺酸化幾丁聚醣表面改質可減少血液中蛋白質及血小板吸附本發明之血管取代物，進而降低血栓形成。本發明之血管取代物植入體內一段時間後，因為改質層之磺酸化幾丁聚醣在生物體內分解快速，作為主體的聚胺酯支架會與細胞直接接觸，該支架內表面孔隙直徑(約9.5μm)與細胞大小相當，因此能協助細胞(如動脈平滑肌細胞)更有效地貼附支架及組織管胺構造，並藉由限制細胞滲透(cell penetration)而促進細胞間接觸及細胞自組裝(self-assembly)。

此外，考慮到如PU-C聚胺酯的羧基在生物體內與磷酸基團作用而造成支架澎潤，且聚胺酯的降解特性亦會降低支架的機械性質，本發明血管取代物藉由內、外表面改質增加機械性質至高於正常血管之機械性質(如2~14日齡小牛主動脈(內徑4mm)之抗拉強度為0.9±0.1MPa、犬下胺靜脈之抗拉強度為2.2MPa、大鼠腹主動脈(內徑0.7mm)之楊氏係數為0.4±0.2MPa、犬下胺靜脈之拉伸率為220%)，因此有利於抵抗動脈血壓。僅管本發明之血管取代物隨時間 而降解，平滑肌細胞浸潤至多孔支架內部及新生血管組織將使降解中的血管取代物維持特定機械性質，例如前述表4之結果即顯示PU-C血管取代物浸泡於PBS溶液2週後的抗拉強度與拉伸率下降至原先的一半，尤其是濕式測試的機械性質更接近天然血管，有利於與宿主組織整合，因為符合動脈機械性質而可能促進血管細胞分化及避免應力遮蔽效應(stress shielding)。雖然表4之結果顯示PU-C血管取代物浸泡於PBS溶液4週後的拉伸率下降約43%，但宿主細胞重建之新生血管將逐漸取代人工血管，再次增加其機械性質。

<110> 國立臺灣大學

<120> 血管取代物

<130> 106B0141-I1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子

<400> 1

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> PCR引子

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> PCR引子

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子

<400> 5

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子

<400> 6

Claims (11)

1. 一種生物可降解的血管取代物，包含一管狀的主體及一位於該主體表面的改質層，該主體具有連通的孔隙及表面負電性，該改質層具有親水性及負電性，且該血管取代物之內徑為0.5mm以上，其中該主體由聚胺酯製成，該聚胺酯包含一硬鏈段與一軟鏈段，該硬鏈段係由二異氰酸酯與一鏈延長劑反應形成，該鏈延長劑包含二羥甲基丙酸，該二異氰酸酯與該二羥甲基丙酸之化學劑量比為3.5~3.6：0.5~1.5。
2. 如申請專利範圍第1項所述之血管取代物，其中該軟鏈段係選自於由聚己內酯二元醇、聚己二酸乙二醇丁二醇酯二元醇及其組合所組成的群組。
3. 如申請專利範圍第1項所述之血管取代物，其中該二異氰酸酯為異佛爾酮二異氰酸酯。
4. 如申請專利範圍第3項所述之血管取代物，其中該鏈延長劑為二羥甲基丙酸及乙二胺，且該異佛爾酮二異氰酸酯與二羥甲基丙酸之化學劑量比為3.57：0.7~1.3。
5. 如申請專利範圍第1項所述之血管取代物，其中該主體之孔隙率為50~99%。
6. 如申請專利範圍第1項所述之血管取代物，其中該主體之界達電位為-20~-80mV。
7. 如申請專利範圍第1項所述之血管取代物，其中該主體之水滴接觸角為68~73°。
8. 如申請專利範圍第1項所述之血管取代物，其中該主體在十二週內的降解率為6%以上。
9. 如申請專利範圍第1項所述之血管取代物，其中該主體係以冷凍乾燥法或靜電紡絲法製得。
10. 如申請專利範圍第1項所述之血管取代物，其中該改質層係選自由磺酸化幾丁聚醣、肝素、及精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸胜肽所組成的群組。
11. 如申請專利範圍第10項所述之血管取代物，其中該磺酸化幾丁聚醣係接枝至經電漿活化的該主體表面。