SE530716C2 - Molekylärt aggregat på ett substrat - Google Patents

Description

25 30 35 40 45 530 715 2 framställa en icke-trombogen heparinyta, så som visats i '224 diskuterat ovan, har biotinbindningsställena på avidin visat sig att inte fullständigt blockeras-av heparinet. Således finns där fortfarande tillgängliga bindningsställen för biotin på avidinmolekylerna som kan användas för att addera biotinylerade biologiska prober. Dessa prober, lämpligen biomolekyler, kommer således att ”förankras” 1 heparinlagret genom bindningen av biotinrester till avidin, och kommer att u sticka ut från heparinytan där de kommer att vara användbara som prober for de önskade interaktioner/ reaktioner som skall studeras. Heparinlagret kommer att bilda ett i huvudsak ”inert” lager med hänsyn till de reaktioner som detßar av intresse att studera. De biologiska proberna eller biomolekylerna kan ocksa användas som mälorienterade prober för terapeutiska ändamål.

De biotinylerade proberna eller biomolekylerna väljs företrädesvis från gruppen bestående av antikroppar, fragment av antikroppar, tillväxtfaktorer, regulatorer for komplementfaktorer, regulatorer för koagulation, antiinflarnmatoríska medel, extracellulära matrisproteiner.

Den föreliggande uppfinningen hänför sig därför i en första aspekt till ett _ molekylärt aggregat på ett substrat innefattande en i huvudsak biologiskt inert yta med biologiska prober förankrade däri, så som definierats 1 krav 1.

I en ytterligare aspekt hänför sig uppfinningen till en metod innefattande en stegvis procedur för att uppnå ett hepaiinlager på en yta där tillsats av biotinylerade biologiska prober eller biomolekyler till ytan är möjlig genom förankring i heparinlagret.

Kort beskrivning av ritningarna Figur la visar schematiskt ett aggregat enligt det kända dokumentet PCT sE2oo6/o5o224.

Figur lb visar schematiskt ett aggregat enligt uppfinningen.

Figur 2 visar en anordning som implementerar uppfinningen.

Figur 3a visar en HOECHST fluorescensbild av en kanal på en anordning som implementerar uppfinningen.

Figur 3b Visar en CD3-FITC fluorescensbild av en kanal på en anordning som implementerar uppfinningen.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen För syftet med föreliggande ansökan ges följande definitioner givna.

Med ”biotinylerade biomolekyler” menas molekyler och/ eller celler som är ytmodiferade med biotin. Termen ”substrat” betyder en yta eller material som är lämpligt för att binda avidin. Termen ”prob” betyder en kemisk struktur som 10 15 20 25 30 35 40 45 530 ?'ll5 3 känner av, undersöker eller testar. Den har någon slags reaktivt ställe, kapabelt att interagera med andra specier, företrädesvis i lösning.

”I huvudsak biologiskt inert” skall förstås att betyda att det i huvudsak inte kommer att föreligga några störande / blockerande interaktioner, såsom t.ex. blodkoagulation eller cellavlagringar, mellan en yta som har täckts med ett aggregat enligt uppfinningen, och vätskan mot vilken en sådan yta exponeras, så att interaktioner mellan biomolekyler förankrade i nämnda yta och specierna av intresse i vätskan kan förekomma med den önskade noggrannheten, och utan störningar.

Ett ”heparinlager” skall förstås att betyda ett lager innefattande heparin.

Således kommer ett heparinkonjugat som bildar ett lager att omfattas av denna definition.

En känd metod för att täcka vävnad och andra substrat med heparin visas i PCT/ SE2006 / 050224, som omnåmnts i bakgrundsdelen. Metoden innefattar att fästa ett heparinkonjugat till substratet genom en avidínkoppling.

Den föreliggande uppfinningen baseras på den överraskande upptäckten att avidinenheter inom sådana ytor som är täckta med heparinkonjugat enligt nämnda kända teknik, trots att de tillhandahåller adekvat skydd mot oönskade reaktioner såsom trombos, fortfarande är tillgängliga för bindning via en biotinenhet närvarande på en biologisk prob. Substratet får således ett ytterligare särdrag av riktad infångningsreaktion med en utvald biomolekyl (se exemplen).

Fig. la visar schematiskt ett substrat täckt med heparin enligt '224, vari ett heparínkonjugat HC är kopplat till substratet S via avidin A. HC visas i sin helhet i den ovan citerade EP 0658 1 12, och kan beskrivas som ett makromolekylärt konjugat bestående av en bärarkedj a (PAV; en polymer amin) till vilket ungefär 70 heparinmolelyler är kovalent bundna.

Fig. lb visar likaledes schematiskt den generella principen för föreliggande uppfinning, där avidlnets (A) tillgänglighet ”inuti heparinkonjugat-(HQ-ytan utnyttjas för att binda en biomolekyl (BM) med en biotin (B)-enhet fäst därtill.

Således är biomolekylen ”förankrad” till avidinet under HC-ytan, via avidin- biotinkopplingen, och sticker ut från HC-ytan för att stå till förfogande för vilken som helst reaktion av interesse.

Det är möjligt att tillhandahålla modifieringar av strukturen som visas i ñg. B.

Till exempel är det tänkt att mer än en sorts biomolekyl år förankrad till ytan genom metoden enligt uppfinningen. I tillägg till cellinfångningsfunktionalitet kan t.ex. en tillväxtstimulerande funktionalitet läggas till.

Således tillhandahåller uppfinningen i sin generella form ett aggregat som är användbart i flera olika applikationer, så som antytts ovan. Aggregatet innefattar ett substrat vars yta har ett avidinlager, och kopplat till avidinlagret ett heparinlager. Heparinet är fäst till specifika heparinbindningsställen på 10 15 20 25 30 35 40 45 530 715 4 avidinet. I heparinlagret är de bíotinylerade biologiska proberna förankrade till avidinmolekylerna via specifika biotinbindningsställen. Biomolekylerna har företrädesvis ställen (sites) som är reaktivai någon mening, dvs. har egenskapen att kunna interagera, binda till eller reagera med någon annan molekyl eller annan specie, såsom hela celler. Sådan interaktion kan sedan monitoreras med passande analytiska eller andra tekniker, för bestämning av närvaro och / eller koncentration av specíer, eller i avsikt att studera _ reaktionskinetik, etc. De bíotinylerade biomolekylerna eller proberna kan väljas bland en stor mängd av olika typer. Lämpligen väljs de från gruppen bestående av antikroppar, fragment av antikroppar, tillväxtfaktorer, regulatorer för komplementfaktorer, regulatorer för koagulation, antiinflammatoriska medel, extracellulära matrisproteiner.

Lagret av immobiliserat avidin på en ytan kan användas på olika sätt. Om ytan redan har passande funktionella grupper som kan reagera med avidin, kan avidin fästas direkt därtill.

I andra fall där inga sådana funktionaliteter föreligger, kan ytan modifieras genom passiv täckning med t.ex. olika proteiner såsom albumin, adhesiva föreningar innehållande primära eller sekundära arninogruper, tiol eller karboxylgrupper till vilka biotin kan bindas kovalent. Avidin kan därefter binda till biotinet som fästs till ytan.

I en annan utföringsform skulle det vara möjligt att använda en löslig, adhesiv substans till vilken biotin är bundet. Denna bíotinylerade substans kan användas för en enstegstäckningsprocedur för att introducera biotin fäst till ytan. Således kan avidin sedan binda till det till ytan fästa biotinet.

I en vidare utföringsform kan avidin bindas kovalent till ytan som modiferats med en polymer substans som bår primära aminogrupper, genom användning av tvärbindningsmetoder som är väl kända för fackmannen. Uppfinningen tillhandahåller också en metod för att göra ett aggregat såsom definieras ovan.

Denna metod är i huvudsak en trestegsprocedur som i huvudsak innefattar stegen att täcka ett utvalt substrat med avidin, och därefter tillhandahålla ett lager heparinkonjugat genom bindning till avidinet, följt av bíndningen av en biotinylerad biomolekyl till avidin inom ytlagret, så att biomolekylen sticker ut från heparinytan. _ Infångriing av biotinmärkta molekyler eller celler kan också uppnås genom exponering av avidin/heparinytan till blod eller andra kroppsvätskor till vilka biotinmärkta molekyler eller celler har adderats. Låt oss t.ex. anta att det är önskat att studera en specifik cellsort genom att fånga in den på en chip-yta för fluorescensanalys. Då kan en antikropp riktad mot cellen i fråga biotinyleras och adderas till blodprovet. Antikroppen kommer att riktas mot cellen och bindas därtill, och när den är i kontakt med chip-ytan kommer de märkta cellerna att binda till chip-ytan via avidin-biotin-länken.

En annan möjlighet är att applicera aggregatet enligt uppfinningen på ytan av en stent för att underlätta snabb endotelisering efter implantering i en patient. 10 15 20 25 30 35 40 45 5313 715 5 Ett biotinylerat reagens som är lämpligt för att fånga in endotela stamceller (EPC) i blodet hos en patient kan injiceras i patienten där det binder till EPC, och därefter kommer EPC att fästas till stenten där de kommer att stimulera snabb växt av ett lager av endotelceller.

Föreliggande uppfinning kan tillämpas på en mängd ytor, båda biologiska och artificiella, t.ex. polymerer, metaller, glas och keramer.

I en utföringsform är det första steget i prepareringen av den heparintäckta ytan att exponera en biotinylerad yta som skall täckas för en utspädd vattenhaltig _ lösning med avidin, typiskt inom koncentratíonsområdet 0,01 till l mg/ ml, mer föredraget 0,01 till 0,05 mg/ ml, i ungefär 5 minuter eller mera vid rumstemperatur. Efter tvätt med vatten exponeras ytan för en lösning av heparinkonjugat enligt europeiskt patent EP 0658112. Heparinlösningen är typiskt inom koncentrationsområdet 0,01 till 1 mg / ml, mer föredraget 0,01 till 0,05 mg / ml, i 0,15 M NaCL, och exponeringstiden är åtminstone 30 minuter vid rumstemperatur. Ytan tvättas därefter försiktigt med rent vatten och ytan som visar strukturen visad i ñg la är klar för vidare användning.

I en annan utföringsform, vari substratet inte är passande för direkt bindning av avidin, t.ex. där substratet är av biologiskt urspring eller ett syntetisk material med låg afñnitet för avidin, appliceras ett lager av biotin till ytan som skall täckas före täckning med avidin. Detta kan enkelt göras genom kovalent bidning av t.ex. NHS-Biotin (Pierce, Sverige) till primära aminogrupper eller genom användning av kemiskt modifierade biotiner för att binda till andra funktionella grupper såsom tioler eller karboxylgrupper såsom beskrivits i PCT/ SE2006 / 050224. Den biotinylerade ytan är därefter exponerad för en förtunnad lösning av avidin (typiskt inom koncentrationsintervallet 0,01 till 1 mg/ ml). Efter tvätt med vatten exponeras ytan mot en heparinlösning enligt EP0658l 12 (typiskt inom ett koncentrationsintervall om 0,01 till 1 mg / ml i 0,15 M NaCl) i åtminstone 30 minuter vid rumstemperatur. Ytan tvättas därefter försiktigt med rent vatten och heparinytan som visar strukturen i fig. lb är klar för vidare användning.

I en vidare utföringsform kan vilken som helst heparintäckt yta användas för att utföra metoden enligt uppfinningen, för att tillhandahålla ett aggregat enligt uppfinningen.

Om ytan är katjonisk kan ett första lager av heparin (anjoniskt) enkelt etableras genom att doppa ytan i en utspädd vattenhaltig lösning av heparinkonjugatet. A andra sidan, om ytan är anjonisk eller oladdad, kan en katjonisk yta enkelt etableras genom att doppa ytan i en utspädd vattenhaltig lösning av en lämplig polymer aminförening följt av att doppa ytan i en utspädd vattenhaltig lösning av heparinkonjugatet.

Så snart ett första lager av heparin har etablerats, doppas ytan i en utspädd vattenhaltig lösning av avidin (typiskt inom koncentrationsintervallet 0,01 till 1 mg/ ml) följt av nästa steg i proceduren, som är att doppa ytan i en utspädd vattenhaltig lösning av heparinkonjugatet. 10 15 20 25 30 35 40 45 530 715 Som kan ses i den schematiska ritningen i fig. lb finns det tillräckligt med _ _ utrymme mellan heparinkonjugaten HC i heparinytlagret för att exponera avidin tillräckligt för att det skall vara tillgängligt för bindningen av biotinenheter som föreligger på biotinylerade biomolekyler. Avidin är en relativt stor molekyl°(60- 70000) och således kommer de biotinreaktiva ställena som är distinkta fran HC- bindningsställena att vara enkelt tillgängliga. Tillgängligheten kan (sannolikt) tillskrivas den mycket starka interaktionen mellan avidin och biotin, som är en av de starkaste protein-ligandinteraktioner som har identifierats. Sådan tillsats eller bindning av biotinylerade biomolekyler till den heparintäckta ytan kan utföras på olika sätt. Ett enkelt sätt är att exponera heparinytan för en utspädd lösning av biomolekylen modifierad med biotin (biotinylerad), varvid biotinenheten kommer att binda till avidin på grund av den starka affiniteten av avidin-biotinparet. Ett annat alternativ är att exponera avidin/heparinytan för blod eller andra kroppsvätskor till vilka biotin-märkta molekyler, som kan interagera med specifika specier i blodet, såsom t.ex. celler som uttrycker specifika receptorer, har adderats. Den biotinylerade delen av de märkta specierna i blodet kommer då att binda till heparinytan och bilda ett aggregat enligt uppfinningen.

Så som visats i patentansökan PCT/ SE2006/ 050224 kan ytor av biologiskt ursprung enkelt biotinyleras. Biotinyleringen möjliggörs genom det faktum att proteiner som exponeras på dessa ytor tillhandahåller reaktiva grupper lämpliga för kovalent bindning av biotin. Det följer att tidigare visade metoder också kan användas på biologisk vävnad. ~ Varierande olika applikationer av uppfinningen är möjliga, varav några exempel nämns nedan.

Komponenter av medicinsk apparatur kan tillhandahållas med ytor täckta med aggregatet enligt uppfinningen, för att framvisa en specifik biologisk funktionalitet, såsom enzymatisk aktivitet, medan den samtidigt förhindrar oönskade sidoreaktioner, såsom trombos. infångning av celler genom att fästa antikroppar med metoden enligt uppfinningen till en heparintäckt yta är mycket effektiv.

Tillväxt av tex. endotelceller kan stimuleras genom förankring av biotinylerad tillväxtfaktor i ett aggregat enligt uppfinningen. Detta år särskilt användbart för implantat av olika slag, både baserat på levande celler, såsom de som visas i den tidigare nämnda internationella patentansökningen PCT/ SE2006/ 050224.

Dock kan andra implantat baserade på andra material såsom metaller, polymerer etc. också förses med en täckt yta baserad på ett aggregat enligt uppfinningen.

En särskild tillämpning av föreliggande uppfinning är att inkludera ett aggregat enligt uppfinningen på en Point of Care-anordning för diagnostiska syften. En sådan anordning visas i fig. 2. Den innefattar en mikrokanal som är 200 pm bred, 25 um djup och omkring 2 cm lång, och har en total volym om 0,1 pl. 10 15 20 25 30 35 40 45 530 715 7 Mikrokanalytan är täckt med ett aggregat enligt uppfinníngen vari den biologiska proben t.ex. skulle kunna vara en biotin-CDfil-antikropp.

Vid användning dras ett blodprov in i kanalen genom kapillärkrafter. Om CD4- celler föreligger i blodet skulle de binda till ytan i kanalen, och skulle enkelt kunna detekteras genom passande metoder såsom konfokal mikroskopi.

Följande exempel är ägnade att visa användningen av uppfinningen, men skall inte tolkas att vara begränsade för omfånget av kraven.

Exempel Exempel 1. Addition av biotinylerat pepparrotsperoxidas (HRP) Följande exempel utformades för att visa den bevarade enzymaktiviteten för HRP efter biotinylering och bindning till avidin.

Slangar av PVC täcks med heparin enligt en välkänd metod (EP0658112).

Slangarna delas in i två grupper, en första grupp av ej behandlade slangar, och en andra grupp av slangar ínkuberade med 0, 15 M N aCl innehållande avidin (0,1 mg/ ml) i 15 minuter vid rumstemperatur. Efter tvätt med renat vatten inkuberades slangarna med 0,15 M NaCl innehållande heparinkonjugat (0,05 mg/ ml).

Båda grupperna av slangar inkuberas med en utspädd buffertlösning innehållande biotinylerad HRP i 15 minuter vid rumstemperatur. Den enzymatiska aktiviteten i den andra gruppen registreras som sju gånger högre än för den första gruppen.

Exempel 2: Infångning av CD34-positiva stamceller till en heparinyta i kontakt med blod tillsatt med en biotinylerad antikropp mot CD34 Perifert blod innehåller hematopoetiska (hematopoetic) stamceller uttryckande CD34 vid en koncentration av 0,05 - O,2%. Ett prov av perifert blod som försatts med citrat, kompletterat med en biotinylerad antikropp mot CD34 bereds. Ett mikroskopobjektglas prepareras med en heparinyta enligt grupp (a) i Exempel 1 och en annan enligt grupp (b) i Exempel 1. Båda objektglasen inkuberas med blodprovet vid rumstemperatur i 60 minuter. Efter försiktig tvätt inkuberas objektglasen med en fluorescerande antikropp mot CD 133 och undersöks genom konfokal mikroskopi. Objektglas (b) kommer att visa ett antal positiva celler men inga positiva celler kommer att detekteras på objektglas (a).

Exempel 3: Förbättrad tillväxt av endotelceller på en heparinyta kompletterad med biotinylerad tillväxtfaktor (VEGF) Cellodlingsbrunnar modifieras med en heparinyta enligt grupp (b) i Exempel 1.

En rad av brunnar lämnas utan vidare behandling och nästa rad inkuberas med en buffertlösning innehållande biotinylerad VEGF i femton minuter vid rumstemperatur och tvättas sedan försiktigt med saltlösning. De tvä raderna 10 15 20 25 30 530 715 8 inkuberas sedan med odlingsmedium innehållande endotelceller. Undersökning med konfokal mikroskopi avslöjar förbättrad utvåxt av endotelceller 1 brunnarna som hade kompletterats med biotinylerad VEGF.

Exempel 4: Mindre komplementaktivering inducerad genom Langerhanska öar modifierade med en ytbeläggning av heparin kompletterad med biotinylerad Faktor H Isolerade Langerhanska öar modifieras med en heparinbeläggning enligt patentansökan PCT/ SE2006 / 050224, som inkluderar sekvensiell behandling av biotin, avidin och heparinkonjugat enligt europeiskt patent nr EP0658112. En grupp av öar inkuberas vidare med medium innehållande biotinylerad faktor H (ett komplementreglerande protein). Öarna exponeras sedan för helblod genom en testmetod beskriven tidigare (Bennet et al., Diabetes, 1999, 48, 1907-14).

Graden av komplementaktivering är avsevärt lägre i gruppen som kompletterats med komplementfaktor H.

Exempel 5. Cellinfångning med en diagnostisk sensor Ett PDMS-sensorchip, klart för cellinfångning, fig. 2a. Genom att hålla en droppe blod mot änden av kapillåren fylldes den tomma mikrokanalen omedelbart med blod, på grund av sin hydrofila yta, fig. 2b-c.

En biosensorkanal preparerades med avidin följt av heparinkonjugatet. I detta specifika experiment tillsattes biotin-CD4-antikroppar till blod för att riktas mot CD4-positiva celler. Ett blodprov exponerades sedan motsensorkanalen så som visats ovan. Undersökning med fluorescensmikroskopi avslöjade att sex celler infångades av avidin/heparinytan. Figurerna 3a och 3b visar en HOECHST fluorescensbild (a), och en CD3-FITC fluorescensbild (b), av kanalen. Exemplet visar att avidin/heparinytan kan fånga in biotinmårkta celler.

Claims (17)

10 15 20 25 30 35 40 45 5313 716 Patentkrav

1. Ett molekylärt aggregat på ett substrat, innefattande ett substrat med en yta som har förmåga att binda avidin, ett lager av avidin kopplat till substratytan; ett heparinlager kopplat till avidin i avidinlagret, kännetecknat av en eller flera olika typer av biotinylerade biologiska prober förankrade till avidinet, vilka biologiska prober sträcker sig ut från heparinlagret och exponerar ett reaktivt ställe av intresse. i

2. Aggregatet enligt krav l vari substratet innefattar ett reagens kovalent kopplat till substratytan, avidinlagret innefattar avidin kopplat till reagenset, och heparinlagret innefattar heparinreagens kopplat till avidinlagret.

3. Aggregatet enligt kraven l eller 2 vari reagenset som är kovalent kopplat till substratytan väljs från gruppen bestående av biotin, heparin eller en polymer substans som bär primära aminogrupper.

4. Aggregatet enligt något av kraven 1-3 vari de biotinylerade biologiska proberna är biotinylerade biomolekyler.

5. Aggregatet enligt krav 4 vari de biotinylerade biomolekylerna är utvalda från gruppen bestående av antikroppar, fragment av antikroppar, tillväxtfaktorer, regulatorer för komplementfaktorer, regulatorer för koagulation, antiinflammatoriska medel, och extracellulära matrisproteiner.

6. Aggregatet enligt något av de tidigare kraven, vari substratet är av artiflciellt eller biologiskt ursprung.

7. En in vitro-metod för att tillhandahålla ett molekylärt aggregat på ett substrat innefattande följande steg; (a) koppling av avidin till en yta med förmåga att binda avidin, (b) koppling av ett heparinkonjugat till den avidinbehandlade ytan för att bilda ett lager av heparin därpå, och (c) koppling av biotinylerade biologiska prober till avidinet genom lagret av heparin så att proberna sträcker sig ut från ytan.

8. Metoden enligt krav 7 vari substratytan innefattar en yta täckt med specier valda från heparin, biotin eller en polymer substans som bär primära aminogrupper. i

9. Metoden enligt krav 7 eller 8, vari substratet är av artificiellt eller biologiskt ursprung. 10 15 20 25 530 746 10

10. Metoden enligt något av kraven 7-9-, vari avidinkoncentrationen som _ används i avidinbíndningssteget är i intervallet 0,01 - 1 mg/ ml, företradesvls 0,01- 0,05 mg/ml.

11. 1 1. Metoden enligt något av kraven 7-10, vari heparinreagenskoncentationen som används i det heparinbindande steget år i intervallet 0,01 - 1 mg/ ml, företrädesvis 0,01 - 0,05 mg/ ml.

12. Metoden enligt något av kraven 7 -1 1, vari de biotinylerade biologiska proberna är valda från en grupp bestående av antikroppar, fragment av antikroppar, tillväxtfaktorer, komplementreglerare, koagulationsregulrerare, antiinflammatoriska föreningar, extracellulära matrisproteiner.

13. Metoden enligt något av kraven 7-13, vari de biotinylerade biologiska proberna år biotinylerade biomolekyler.

14. Implantatstruktur innefattande ett aggregat enligt något av kraven l-6.

15. En biosensoranordning innefattande ett måtområde vars yta innefattar ett aggregat enligt något av kraven l-6._

16. Biosensorn enligt krav 15, vari mätområdet år en reaktionscell.

17. Ett aggregat innefattande ett substrat med en yta som har förmåga att binda avidin, ett avidinlager och ett heparinlager, med biotinylerade biologiska prober förankrade till avidinet och som sträcker sig ut från heparinlagret och exponerar ett reaktivt ställe av intresse.