JPH05232120A - タンパク質結合化のための接着剤配合物 - Google Patents

タンパク質結合化のための接着剤配合物

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JPH05232120A
JPH05232120A JP4199935A JP19993592A JPH05232120A JP H05232120 A JPH05232120 A JP H05232120A JP 4199935 A JP4199935 A JP 4199935A JP 19993592 A JP19993592 A JP 19993592A JP H05232120 A JPH05232120 A JP H05232120A
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protein
substrate
adhesive formulation
hydroxyl group
composition
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John L Seed
ジョン・エル・シード
Brian Seed
ブライアン・シード
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Advanced Genetic Technologies Corp
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明の組成物及び方法は、生物学的に活性
なタンパク質およびタンパク質を含む組成物を、基質に
対して接着ならびに結合するために提供される。 【構成】 ９以下のｐＫ値を持つ、少なくともひとつの
水酸基で置換された芳香族部分を含むモノマー単位の、
非タンパク性ポリマーからなる接着剤配合物が、基質に
適用され、続いてタンパク質と接触せられる。９以下の
ｐＫ値を持つ、少なくともひとつの水酸基で置換された
芳香族部分を含むモノマー単位の、非タンパク性ポリマ
ーからなるビーズもまた提供され；このビーズはタンパ
ク質で被覆される。 【効果】 接着剤配合物ならびにビーズが適用される基
質は、基質への細胞および組織の接着、細胞型の整列、
イムノアッセイの実施、クロマトグラフィーの実施、お
よび試料からのタンパク質の除去に用いることができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、タンパク質に対する接
着剤および結合剤の分野に関するものである。より詳細
には、接着剤配合物の形状あるいはビーズの形状で、タ
ンパク質に対し高い親和性を持つポリマー物質の利用に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】タンパク性ポリマー接着物質および結合剤 タンパク質を含む生物標本への接着のための種々の異な
るポリマー配合物は、当業界で公知のものである。これ
らは、しばしば傷の治療、移植された細胞、臓器、人工
器官、歯の移植などの医学上の応用があると教示されて
いる。
【０００３】エルハンは、米国特許第４，８２２，８６
７号明細書において、タンパク質の骨格上に合成部分を
持つ組織移植用コポリマーの利用が、人工皮膚及び傷の
被覆に有用であると教示する。シュワルツは、米国特許
第４，４１４，９７６号明細書において、フィブリノー
ゲン、第XIII因子、アルブミンおよびプラスミンあるい
はプラスミノーゲン活性化因子阻害物質からなる、組織
接着剤配合物の利用を開示している。ライヒは、米国特
許第４，９７３，４６６号明細書において、綿状のフィ
ブロネクチンからなる傷治療用包帯剤について開示して
いる。ヤングは、米国特許第５，０２４，９３号明細書
において、核酸のハイブリダイゼーションを行うことが
できる、組織及び細胞用接着物質としてムラサキガイ由
来のタンパク質標品の利用を教示している。ベネディク
トは、米国特許第５，０１５，６７７号明細書におい
て、架橋剤に加え、ムラサキガイのポリフェノールタン
パク質のデカペプチド部材を含む組成物を開示してい
る。本組成物は、骨の修復、眼科手術、歯科用材、植物
の接ぎ木、手術の際の縫合ならびに電流が通過する２種
の電導物質を接着するために用いることができる。しか
し、出発材料としてタンパク質を必要とする調製法は、
通常合成ポリマーを純粋に用いる方法よりも、調製なら
びに取扱いに関して、より困難でかつ高価である。
【０００４】ノヴィンスキーは、米国特許第４，７５
２，６３８号明細書において、溶液から相補的に結合し
て対をなす部材を選択的に除去するために、ポリマーの
特異的結合対部材を利用することを教示する。この特異
的結合対部材は、モノマー単位に結合せられ、つづいて
重合される。特異的結合対部材はふつう、それ自体、抗
体、抗原、抗体受容体、ホルモン受容体、薬剤受容体及
び輸送タンパク質などのタンパク質であり、このため、
合成ポリマーよりもより困難で高価である。
【０００５】生物試料からのタンパク質の抽出と分離 フェノールは、それに続く分析あるいはＤＮＡ操作を妨
害するかも知れないタンパク質や他の物質を抽出するた
めにしばしば用いられる（カービー、Ｐｒｏｇｒ． Ｎ
ｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．
ｖｏｌ．３、ｐ．１、 １９６４）。しかし、フェノ
ールにはいくつかの安全上及び健康上の危険があり、そ
のため作業の安全性には好ましくない。クロロホルム
も、普通フェノールと組み合わせてＤＮＡおよびＲＮＡ
の単離によく用いられる（マニアティスら、モレキュラ
ー クローニング． ア ラボラトリー マニュアル、
コールド スプリング ハーバー ラボラトリー、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８
２、ｐｐ．４５８−４６０）。クロロホルムは発ガン物
質であるため、クロロホルムも作業場から除去されるべ
きである。マコーマックは、米国特許第４，９２３，９
７８号明細書において、核酸からタンパク質の分離に、
ケイソウ土などの大きな表面積を持つ固形材及び高濃度
の穏やかな酸性ヒドロキシルの利用を教えている。スヴ
ェックは、米国特許第４，８８９，６３２号明細書およ
び米国特許第４，９２３，６１０号明細書において、ビ
ニルモノマー（これは、他のビニルの内の、ヒドリキシ
スチレンであるかもしれない）と、ジビニルモノマーの
コポリマーからなる、巨大孔ポリマー膜の利用を教示す
る。これらは、タンパク質の分離に有用性を持つことが
示されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、物質
へタンパク質あるいはタンパク質を含む組成物を接着す
る方法を提供することである。
【０００７】本発明の別の目的は、組成物からタンパク
質を除く方法を提供することである。
【０００８】本発明の更に別の目的は、固形基質におい
て細胞あるいは組織を培養状態で生育させる方法を提供
することである。
【０００９】本発明のまた更に別の目的は、生物試料か
らウイルス、細胞もしくは生物を精製する方法を提供す
ることである。
【００１０】本発明の別の目的は、試料中の分子、ウイ
ルス、細胞もしくは生物の濃度または存在を決定する方
法を提供することである。
【００１１】本発明の更に別の態様は、クロマトグラフ
ィーによるタンパク質の分離を行う方法を提供すること
である。
【００１２】本発明の更に別の態様は、結合分子、ウイ
ルス、細胞もしくは生物に関する組成物を提供すること
である。
【００１３】本発明のこれら及び別の目的は、下記のひ
とつあるいはそれ以上の態様によって提供される。本発
明のひとつの態様において、タンパク質受容性基質を形
成するために基質に適用し、該接着剤配合物は９以下の
ｐＫａを有する、少なくともひとつの水酸基で置換され
た芳香族部分を含むモノマー単位の、非タンパク性ポリ
マーから成り；そして該タンパク質受容性基質とタンパ
ク質を含む生物活性組成物とを接触させることからな
る、タンパク質あるいはタンパク質を含む組成物を基質
へ接着する方法が提供される。
【００１４】本発明の別の態様において、タンパク質が
結合した基質と組成物が接触する、組成物からタンパク
質を除く方法が提供される。接着剤配合物は、基質のタ
ンパク質結合能を増幅するために適用されている。接着
剤配合物は、９以下のｐＫ値を持つ、少なくともひとつ
の水酸基で置換された芳香族部分からなるモノマー単位
の、非タンパク性ポリマーを含む。本発明の別の態様に
おいて、ビーズが基質として用いられる。このビーズ
は、９以下のｐＫ値を持つ、少なくともひとつの水酸基
で置換された芳香族部分からなるモノマー単位の、非タ
ンパク質ポリマーを含む。
【００１５】本発明の別の態様において、固形基質上で
細胞あるいは組織を培養状態で生育させる方法が提供さ
れる。接着剤配合物は、細胞または組織が接着する基質
に適用されている。この接着剤配合物は、９以下のｐＫ
値を持つ、少なくともひとつの水酸基で置換された芳香
族部分からなるモノマー単位の、非タンパク性ポリマー
を含む。別の態様において、ビーズが固形基質として用
いられる。このビーズは、９以下のｐＫ値を持つ、少な
くともひとつの水酸基で置換された芳香族部分からなる
モノマー単位の、非タンパク性ポリマーを含む。
【００１６】本発明の別の態様において、生物試料から
ウイルス、細胞または生物を、固形担体上で精製する方
法が提供される。ウイルス、細胞または生物に特異的な
タンパク質が、生物試料と接触させられる。このタンパ
ク質は、接着剤配合物を介して固形担体に固定される。
この接着剤配合物は、９以下のｐＫ値を持つ、少なくと
もひとつの水酸基で置換された芳香族部分からなるモノ
マー単位の、非タンパク性ポリマーを含む。別の態様に
おいて、ビーズが固形基質として用いられる。このビー
ズは、９以下のｐＫ値を持つ、少なくともひとつの水酸
基で置換された芳香族部分からなるモノマー単位の、非
タンパク性ポリマーを含む。ウイルス、細胞または生物
に特異的なタンパク質がこのビーズに固定される。
【００１７】本発明の更に別の態様において、試料中の
分子、ウイルス、細胞あるいは生物の濃度または存在を
決定する方法が提供され、該方法では、タンパク質を含
む第１反応物質が基質に固定され、また該第１反応物質
および第２反応物質を互いに結合するために、第２反応
物質が第１反応物質と接触させられる。第１反応物質
は、接着剤配合物によって、基質に固定される。この接
着剤配合物は、９以下のｐＫ値を持つ、少なくともひと
つの水酸基で置換された芳香族部分からなるモノマー単
位の、非タンパク性ポリマーを含む。本発明の別の態様
では、ビーズが基質として用いられる。このビーズは、
９以下のｐＫ値を持つ、少なくともひとつの水酸基で置
換された芳香族部分からなるモノマー単位の、非タンパ
ク性ポリマーを含む。
【００１８】本発明の更に別の態様では、タンパク質の
大部分を含む組成物がクロマトグラフィー担体と接触せ
られ、タンパク質はクロマトグラフィー担体へのそのこ
となる結合能に基づいて分離される。タンパク質のクロ
マトグラフィーによる分離法が提供されたものは；
（１）９以下のｐＫ値を持つ、少なくともひとつの水酸
基で置換された芳香族部分からなるモノマー単位の、非
タンパク性ポリマーを含む接着剤配合物、及び（２）タ
ンパク質である。別の態様では、ビーズがクロマトグラ
フィー担体として用いられる。ビーズは、９以下のｐＫ
値を持つ、少なくともひとつの水酸基で置換された芳香
族部分からなるモノマー単位の、非タンパク性ポリマー
を含む。ビーズはそれ自体に固定されたタンパク質を有
している。
【００１９】本発明の別の態様において、結合分子、ウ
イルス、細胞あるいは生物用組成物が提供される。この
組成物は、９以下のｐＫ値を持つ、少なくともひとつの
水酸基で置換された芳香族部分からなるモノマー単位
の、非タンパク性ポリマーを含む接着剤配合物で被覆さ
れた基質；ならびに接着剤配合物に固定された生物学的
に活性なタンパク質を含む。別の態様において、本組成
物は９以下のｐＫ値を持つ、少なくともひとつの水酸基
で置換された芳香族部分を含むモノマー単位の、非タン
パク性ポリマー製のビーズからなる。このビーズはタン
パク質で被覆されている。
【００２０】以下でより詳細に説明されるであろうこれ
ら及び別の態様は、それら自体及び他の物質に対して、
タンパク質あるいは混成物を含むタンパク質を接着また
は結合する、迅速かつ安価な方法を持つ技術を提供す
る。これはまた、より効果的な診断法及び調製法のため
の装置を提供する。
【００２１】
【課題を解決するための手段】固形あるいは半固形状態
で、タンパク質に特異的に結合する非タンパク性ポリマ
ーは、本発明の発見である。該ポリマーは芳香族部分に
おいて、少なくとも１つの水酸基によって置換されてい
る好ましい比率の芳香族モノマー単位を含んでいる。こ
の水酸基のｐＫは９以下である。タンパク質結合化のた
めの該固形または半固形物の発見は、分子、ウイルス、
細胞あるいは生きている生物の濃度または存在を決定す
るアッセイ関する応用、タンパク質除去、固定されたタ
ンパク質を含むビーズ上でのクロマトグラフィー、細胞
培養、組織培養、人工組織、血管、移植片または移植組
織の二次加工または移植、破壊された組織の被覆または
修復、医学的手術あるいは獣医学における装置、および
分子、化合物、ウイルス、細胞あるいは生物の検出のた
めの電気装置の操作への操作に関する応用を有してい
る。これらのポリマーのタンパク質結合能は、たとえば
人体において、タンパク質及びタンパク質を含む混成物
の放出を調節、あるいは一時的に遅らせるためにも利用
できる。
【００２２】本発明の芳香族モノマー単位は、共鳴安定
化され、縮重された環状系を有する化学構造物である。
これらには炭化水素、有機または無機の複素環および元
素的に純粋な無機化合物がある。共鳴安定化され、縮重
された環状系を有する化学構造物は、好ましいプラナー
（planar）である。上述の如く、環状構造物は９以下の
ｐＫをもつ、少なくとも１つの水酸基を有している。本
環状系あるいは本ポリマー骨格上の別の置換を用いるこ
とができる。そのいくつかは、タンパク質に対するポリ
マーの親和性を修飾することができる。そのいくつかは
重合体架橋を可能にできる。別の置換はタンパク質への
不可逆的な化学結合に用いられることができる。
【００２３】また、ポリマーはランダムなコポリマー、
ブロックコポリマー、あるいはグラフトコポリマーであ
ることもできる。芳香族部分は、フェニル基であること
が好ましい。ポリマー形成に適した芳香族モノマー単位
は、水酸化フェニルエチルを含む基、特にパラ−水酸化
フェニルエチル基を含む。環状系あるいはポリマー骨格
は別の置換体を含むことができる。ポリマーは非タンパ
ク性、つまり天然に存在しないものであり、半合成もし
くは合成タンパク質である。ポリマーの骨格はペプチド
結合で形成されていない。代表的な場合、芳香族モノマ
ー単位はアミノ酸ではないだろう。
【００２４】芳香族モノマー単位の種々の置換体、およ
び比率、ならびに共鳴安定化した、縮重した環状系は、
それらを含む配合物と表面を接触させ、もし必要なら余
剰の配合物を除き、表面をタンパク質溶液、懸濁液、粉
末あるいはエアゾルと接触させ、もし必要なら余剰のタ
ンパク質を除き、表面に結合したタンパク質あるいは溶
液、懸濁液などから除かれたタンパク質量を測定するこ
とによって、本発明における使用の可否を容易に試験す
ることができる。このような測定は、色素の結合、分光
器、放射性ラベルされたタンパク質の場合はシンチレー
ション計測、酵素活性、抗体の結合あるいは処理された
表面の、所望の応用における実行能を直接測定すること
によって行うことができる。
【００２５】本発明のポリマーは、接着性物質として配
合され得るか、あるいはビーズ状などの固形として用い
ることができる。本発明の接着剤配合物は、その活性内
容物として上述の芳香族水酸化ポリマーを含む。これは
また、１種もしくは２種の希釈物質、賦厚剤、分散剤、
色素あるいは表面処理剤を含むことができる。代表的な
接着剤配合物は、水溶液もしくは極性有機溶媒中で調製
されるだろう。これに適した溶媒は、エタノール、ジエ
チレングリコール二酢酸、酢酸エチル、アセトンおよび
ジメチルスルホキシドを含む。ビーズは、蛍光色素また
は吸光性色素あるいは磁性もしくは常磁性粒子を取り込
むこともできる。
【００２６】本発明のタンパク質もしくはタンパク質を
含む組成物は、ウイルス、細胞及び組織と同様に細胞溶
解物のような、タンパク質の精製標品及び粗標品を含
む。典型的なものは、タンパク質が生物学的に活性であ
ろうし、また本発明の接着剤配合物およびビーズに結合
された際にも、生物学的活性を維持するであろう。生物
学的活性は、酵素活性、抗体の結合、抗体あるいは受容
体によって認識され、また結合される能力および生存率
を含む。このタンパク質は、抗体、抗原、ホルモン、受
容体分子などであり得る。タンパク質を含む組成物は、
ウイルス、細胞、組織及び生物であり得る。
【００２７】本発明の接着剤配合物で被覆され得る基質
は、プラスチック、天然もしくは合成繊維、膜もしくは
紙、金属、ガラス、セラミック、半導体、細胞、組織及
び他のタンパク質を含む混成物を含む。適当なプラスチ
ックは、置換ポリエチレン、ポリアミド、ポリエステ
ル、ポリエーテル、ポリスルホン、フェノール樹脂、エ
ポキシ樹脂および置換セルロースを含む。これらは、ス
プレー、浸液、塗布、スタンプ、型押しあるいは散布を
含む、当業者に公知のいずれかの方法によって被覆もし
くは部分的に被覆され得る。
【００２８】本発明の被覆された基質は、多くの形状を
とることができる。これらは、ビーズ、細片、マルチウ
エルプレートのウエル、細片あるいは個々の単位、細
管、網、開放した小孔をもつ泡状体、膜、紙、針、手術
用縫い糸、手術用閉じ金、顕微鏡スライド、ナイフおよ
びメスなどの手術用器具、フラスコおよび培養皿と云っ
た細胞培養容器を含む。
【００２９】本発明の方法に従い、接着剤配合物が基質
に適用された後、タンパク質を含む組成物は、基質と接
触せられる。このタンパク質は、タンパク質に非共有結
合力によって接着されるか、別の場合では、このタンパ
ク質は共有結合相互作用によって接着剤配合物に対して
架橋されることができる。これは、更に好ましくは、ク
ロマトグラフィーあるいは調製用の除去といった応用に
所望されるかもしれない、ここでは進んだ過程が必要と
されるか、あるいは基質が再使用されるであろう。
【００３０】本発明の接着剤で被覆された基質及びポリ
マービーズを用いることが可能な、特定の使用法が多数
ある。それらは、試料を脱タンパク質するために、細胞
溶解液などの試料からタンパク質を除くために用いるこ
とができる。それらは、固形基質への細胞または組織の
接着を増強することにより、培養中の細胞あるいは組織
の生育に用いることができる。それらは、生物試料か
ら、たとえば接着物質で被覆した基質、またはポリマー
ビーズと、ウイルス、細胞あるいは生物に特異的結合能
を有するタンパク質とをはじめに接触することによっ
て、ウイルス、細胞または生物を精製するために用いる
ことができる。それらはまた、分子、ウイルス、細胞あ
るいは生物に特異的なタンパク質からなる反応物質を、
基質またはビーズに結合することによって、試料中の分
子、ウイルス、細胞あるいは生物の濃度、もしくは存在
を測定するためのアッセイにおいても用いることができ
る。それらはまた、たとえば抗体もしくは抗原を基質あ
るいはビーズに結合することによって、タンパク質のク
ロマトグラフィーによる分離にも用いることができる。
抗体または抗原は、その分離が所望されるタンパク質に
特異的である。
【００３１】本発明の接着剤により被覆された基質及び
ポリマービーズが適用され得る別の利用法は、生物適応
性表面の作製、組織混成体を含むタンパク質を有する混
成物の二次加工、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞及び組織の生
育を支持する表面、及び人工もしくは修復された組織、
血管、移植片あるいは移植組織を含む。それに加え、電
導性接着剤配合物は、細胞を含む、タンパク質あるいは
タンパク質を有する混成物によって仲介される、実時間
的電気的計測の目的に用いる、固相状態センサーへタン
パク質を接着するために用いることができる。このよう
な組成物において、該組成物を電導性ならしめるため
に、微量の添加物がよく使用されてきた。この微量添加
物は、しばしばガリウムヒ素および塩化銀などの金属で
ある。
【００３２】
【実施例】
【００３３】
【実施例１】本実施例は、ポリ（ｐ−ヒドロキシ−スチ
レン）適用後の、基質への免疫グリブリン−酵素複合体
の、結合増幅を示している。
【００３４】９６穴のポリ（塩化ビニル）製およびポリ
（スチレン）製マイクロプレートを、２０ｍｇ／ｍｌの
ＰＨＳエタノール溶液で満たすことによって、ポリ（ｐ
−ヒドロキシスチレン）（ＰＨＳ；ＭＷ６１００）で被
覆した。対照プレートは、エタノールのみで処理され
た。この溶液を直ちにデカントし、余剰のＰＨＳ溶液を
除き、コーティングを乾燥するためにこのプレートを６
０’Ｃで５分間インキュベーションした。リン酸緩衝生
理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）で１：１，０００から
１：１２８，０００に希釈されたヒツジ抗ウサギＩｇＧ
のＩｇＧ−ペルオキシダーゼ複合体を、ウエルあたり１
００ｕｌとなるようにウエルに添加した。時間を変えて
（１５、３０、４５、６０分）インキュベーションした
後、ウエルをＰＢＳで洗浄し、２、２’アジノ−ビス
（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（Ａ
ＢＳＴ〜）を用いて、ペルオキシダーゼについてアッセ
イした。そして、吸光度はＥＬＩＳＡプレートリーダー
を用いて定量された。ＰＨＳ被覆したプレートのウエル
は、ポリ（塩化ビニル）プレートよりも４倍高いペルオ
キシダーゼ活性を示し、ポリ（スチレン）プレートより
も８倍高い活性を示した。試験したいずれの場合も、Ｐ
ＨＳ被覆したウエルに、より高い活性が結合し、また、
被覆したウエルと被覆していないウエルの相対的相違
は、試験したいずれの時点でも同様であった。ＰＨＳ被
覆したポリ（塩化ビニル）プレート及びポリ（スチレ
ン）プレートの間では、有意な相違はみられなかった。
【００３５】
【実施例２】この実施例は、ＰＨＳとスチレンのコポリ
マーによって提供される、タンパク質の結合増強を示し
ている。
【００３６】９６穴のポリ（塩化ビニル）製プレート
は、実施例１の如く、７０％のＰＨＳコポリマーおよび
スチレン（ＭＷ−３０，０００）で被覆された。実施例
１に記載されるように、ＰＨＳ−被覆したウエルと被覆
しないウエルに、ヒツジ抗ウサギＩｇＧのＩｇＧ−ペル
オキシダーゼが添加された。３０分間のインキュベーシ
ョン後、ウエルを水で洗い、ＡＢＴＳを用いてペルオキ
シダーゼ活性をアッセイした。コポリマーで被覆したウ
エルから得られるペルオキシダーゼ活性は、ＰＨＳ単独
で得られる活性の８０％であった。
【００３７】
【実施例３】本実施例は、ＰＨＳによって提供される、
細胞のスライドへの結合増幅を示している。
【００３８】透明な、指向性ポリスチレン製の細片は、
２０ｍｇ／ｍｌのＰＨＳ（６１００ＭＷ）エタノール溶
液で被覆され、６０’Ｃで乾燥せられた。対照の細片は
エタノールのみで処理された。懸濁培養で成長したマウ
スＰ３ＸＮＳ１ＡＧ４ミエローマ細胞は、リン酸緩衝生
理食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）で洗われ、ＰＨＳ−被覆
したスライドと、被覆していないスライドをおいたＰＢ
Ｓを含む皿に添加された。室温からの、３０分間のイン
キュベーション後、スライドは除かれ、ＰＢＳで洗浄し
てカバーガラスで覆われた。顕微鏡による試験は、ＰＨ
Ｓ−被覆したスライド表面に、視野１ｍｍ2あたり３
３．９細胞が接着し、一方被覆しないスライドは、視野
１ｍｍ2あたり１２．２細胞を含むことを示した。
【００３９】
【実施例４】本実施例は、ＰＨＳ−被覆したビーズによ
る、タンパク質の結合増幅を示している。
【００４０】１インチ以下のポリスチレン、ナイロン、
ポリカーボネート、酢酸及びデルリン（Ｄｅｌｒｉｎ）
〜は、２０ｍｇ／ｍｌのＰＨＳ（６１００もしくは９８
７００ＭＷ）エタノール溶液で被覆され、室温で乾燥せ
られた。対照のビーズは、エタノールのみで処理され
た。このビーズは、ビーズを収容するに充分な大きさの
セルをもつ、９６穴のポリスチレン製プレートにおか
れ、ＰＢＳで１：１０，０００に希釈された、２００ｕ
ｌのヒツジ抗ウサギＩｇＧのＩｇＧ−ペルオキシダーゼ
複合体とともに、室温で３０分間インキュベーションさ
れた。このビーズは、水で洗浄され、ＡＢＴＳを用いて
ペルオキシダーゼ活性についてアッセイされた。ＰＨＳ
で被覆したビーズは、被覆しないビーズよりも２倍から
１０倍量の、結合したペルオキシダーゼを有していた。
【００４１】
【実施例５】本実施例は、ＰＨＳによる管内壁の被覆
と、そのタンパク質の結合増幅を示したものである。
【００４２】ポリエチレン製細管（すなわちＺ １ｍ
ｍ）内壁は、４０ｍｇ／ｍｌもしくは２０ｍｇ／ｍｌの
ＰＨＳ（６１００ＭＷ）エタノール溶液を細管に流し、
また細管に空気を通気するために、吸引ポンプを用いて
空気乾燥することによってＰＨＳで被覆された。この細
管は、１２チャンネルのピペッターの２００ｕｌ容ピペ
ットチップに連結された。細管を満たすのに充分量（２
５ｕｌ）の、ヒツジ抗ウサギＩｇＧのＩｇＧ−ペルオキ
シダーゼ複合体希釈液を細管に流し込み、室温で５分間
インキュベーションし、新たな溶液で合計５回、放出と
再充填した。この細管は、同様にして水で洗浄され、次
にＡＢＴＳアッセイ溶液で満たされ、室温で２分間イン
キュベーションし、プレートリーダーによる定量のた
め、マイクロタイタープレートに放出された。このアッ
セイ手順は４回行われ、１００ｕｌの最終的な着色産物
についてのアッセイ容量が得られた。ＰＨＳで被覆した
細管についての両方の濃度は飽和した応答を与え、一
方、ＰＨＳで被覆されていないポリエチレン製細管の壁
に対するタンパク質の接着は検出されなかった。
【００４３】
【実施例６】本実施例は、生物試料からタンパク質を抽
出するための、架橋されたＰＨＳ粒子の利用を示してい
る。
【００４４】０．５％ジビニルベンゼン（平均直径＝６
０ミクロン）で架橋されたＰＨＳは、核酸を含む溶液を
含む水溶液から、ウシ血清アルブミンあるいはウシＩｇ
Ｇを抽出するために用いられた。ＰＨＳ懸濁液（ＰＢＳ
中５％）を、２０ｕｌの１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ溶液あるい
はＩｇＧのＰＢＳ溶液と等量混合し、穏やかにボルテッ
クスし、ＰＨＳを沈澱するために微量遠心機において、
最高速で１分間遠心し、そしてブラッドフォードアッセ
イを用いて、上清についてタンパク質の存在を調べた。
１ｍｇの架橋されたＰＨＳによって抽出されたタンパク
量は、ＢＳＡについては２．５ｍｇ、ＩｇＧについては
１６ｍｇであった。
【００４５】
【実施例７】本実施例は、半導体チップへの、酵素の結
合を示すものである。
【００４６】半導体チップは、２０ｍｇ／ｍｌのＰＨＳ
（６１００ＭＷ）エタノール溶液で被覆され、風乾され
た。次に、この被覆されたチップの一部を、室温で３０
分間、１Ｕ／ｍｌのアルカリホスファターゼを含む０．
３ｕｌの水溶液に接触させた。次に、このチップを洗浄
し、ビス−クロロインドールフェノールニトロブルーテ
トラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を用いて酵素活性を
アッセイした。酵素にさらしていない部分のチップは、
ほとんど検出不能な酵素活性を有し（チップ表面に現れ
る不溶性の青色の沈澱によって示される）、一方酵素に
さらされた部分は検出可能な活性を有していた。
【００４７】
【実施例８】本実施例は、２つの混合繊維を接着するた
めの、ＰＨＳの利用を示すものである。
【００４８】綿／ポリエステル繊維の２つの細片を、約
１ｃｍ2あたり１ｇｍ／ｍｌのＰＨＳ（３００００Ｍ
Ｗ）エタノール溶液を適用し、この細片を圧縮し、一夜
乾燥させることによって接着した。次に、接着された繊
維は剪断試験にかけられた。結合強度は１６０ｇ／ｃｍ
2であった。
【００４９】
【実施例９】本実施例は、酵素−抗体複合体を注射針に
接着するためのＰＨＳの利用を示すものである。
【００５０】２１ゲージの注射針は、その針に２０ｍｇ
／ｍｌのＰＨＳ（６１００ＭＷ）エタノール溶液を通
し、窒素を通気する事によって被覆された注射針を乾燥
することによって内部被覆された。この注射針は８チャ
ンネルのピペッターに直接連結された。注射針をちょう
ど満たす量（２５ｕｌ）のヒツジ抗ウサギＩｇＧのＩｇ
Ｇ−アルカリホスファターゼ複合体希釈液（１：１０，
０００）をこの細管に流入させ、５分間室温でインキュ
ベーションし、合計５回新鮮溶液再流入と放出を繰り返
した。この細管を同様にして水で洗浄し、次にｐ−ニト
ロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）アッセイ溶液で満
たし、室温で２分間インキュベーションし、プレートリ
ーダーによる定量のために、マイクロタイタープレート
に放出した。このアッセイ手順は４回行われ、１００ｕ
ｌの最終的な着色産物についてのアッセイ容量が得られ
た。ＰＨＳで被覆した注射針は飽和応答を与えたが、一
方ＰＨＳで被覆していない注射針は検出不能の応答を与
えた。
【００５１】
【実施例１０】本実施例は、酵素連結免疫吸収物質アッ
セイに用いるマルチウエルプレートへの、タンパク質の
結合の増幅を示したものである。
【００５２】ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、９６ウエル
のポリスチレン製プレートに、ＢＳＡが、１ｕｇから
０．５ｐｇ／ウエルの濃度の、１００ｕｌのＰＢＳ ｐ
Ｈ７．４溶液によって、室温で３０分間被覆された。こ
のプレートを洗浄し、ウエルに対して、ＰＢＳで１：
１，０００から１：１２８，０００に希釈した１００ｕ
ｌのウサギ抗ＢＳＡ抗体を添加した。室温で３０分間イ
ンキュベーションした後、ウサギ抗体を除き、ＰＢＳで
１：１，０００に希釈したヒツジ−抗ウサギＩｇＧ−ペ
ルオキシダーゼ複合体を添加した。最終段階の後、この
複合体は洗浄によって除かれ、ＡＢＴＳ基質が添加され
た。ＰＨＳで被覆したプレートは、被覆していないプレ
ートが１６−３２倍低い応答しか与えない濃度と同等の
の応答を与えた。
【００５３】
【実施例１１】本実施例は、ＰＨＳによって仲介され
る、金属へのタンパク質の接着を示すものである。
【００５４】ＰＨＳ（６１００ＭＷ）は、エタノール、
エチレングリコール二酢酸、酢酸エチル、アセトンある
いはジメチルスルフォキシドのいずれか中に、２０ｍｇ
／ｍｌとなるように溶解された。それぞれのＰＨＳ溶液
を、電解薄膜を施したアルミニウムプレートの表面に一
滴落とし、６０’Ｃで乾燥した。次に、このプレートを
０．０１Ｕ／ｍｌの濃度のアルカリホスファターゼを含
むＰＢＳに浸した。室温で３０分間インキュベーション
した後、結合しなかった酵素を除くためにこのプレート
をＰＢＳで洗浄し、酵素の存在を検出するためにＢＣＩ
Ｐ／ＮＥＴ基質に浸した。ＰＨＳで被覆された領域のそ
れぞれは、アルカリホスファターゼの存在を示す発色を
生じた。被覆されていない領域は、検出可能な発色を生
じなかった。異なるＰＨＳ溶液で被覆された領域の間
で、発色の程度に有意な相違は観察されなかった。
【００５５】
【実施例１２】本実施例は、ＰＨＳで被覆されたビーズ
を充填したクロマトグラフィーカラムへの、タンパク質
の結合を示したものである。
【００５６】巨大網状構造を持つ樹脂（ＸＡＤ−８；１
６０ｍ２／ｇｍ、孔サイズ＝２２５オングストローム）
はエタノール中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解されたＰ
ＨＳ（９８，７００ＭＷ）で被覆され、真空状態で乾燥
された。対照のビーズはエタノールのみで処理され、乾
燥された。再び水を含ませた後、２．５ｕｇのＢＳＡを
含む溶液を、０．５ｍｌの樹脂に通過させた。ＰＨＳ処
理したカラムの溶出液中に、有意な量のタンパク質が検
出されなかったことは、タンパク質の完全な吸着を示し
ている。一方、対照のカラムには検出可能な量のタンパ
ク質は結合しなかった。
【００５７】
【実施例１３】本実施例は、ＰＨＳ被覆したナイロン膜
への酵素の結合を示したものである。ナイロン膜（ＭＡ
ＧＮＡナイロン；ＭＳＩ）は、３ｃｍ ｘ １２ｃｍの
細片に切断された。それぞれの細片の半分を２０ｍｇ／
ｍｌのＰＨＳ（６１００ＭＷ）エタノール溶液で被覆
し、６０’Ｃで乾燥した。次にこの細片をわずかの間、
０．１Ｎの水酸化ナトリウムに浸し、ＰＢＳで洗浄して
２ｕｌ ｘ １３ウエルのスロット−ブロット装置にお
いた。アルカリホスファターゼあるいはヒツジ抗ウサギ
ＩｇＧ−ペルオキシダーゼ複合体いずれかの試料１００
ｕｌをスロットに添加し、膜を通過させた。最初のスロ
ットに添加したタンパク量は、アルカリホスファターゼ
については１Ｕ、ヒツジ抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダ
ーゼについては、１：６００００のＥＬＩＳＡタイター
を持つ複合体の１：１０００希釈であった。その後のそ
れぞれのスロットは、合計１１スロットにわたって、タ
ンパク質の１：１希釈が加えられ、最終的な希釈率は、
開始量に対して１：１０００を与えた。次にこのブロッ
トを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ緩
衝液 ｐＨ８で洗浄し、装置からはずし、アルカリホス
ファターゼに関してはＢＣＩＰ／ＮＥＴ基質を含む緩衝
液に、またはペルオキシダーゼに関しては４−クロロナ
フトール基質を含む緩衝液に浸した。検出される酵素活
性量は、それぞれの膜のヒドロキシスチレンで被覆した
側で４−１０倍高かった。ＢＣＩＰ／ＮＥＴ基質の濃度
が１０の比率で減少されるとき、その相違はヒドロキシ
スチレンで被覆したナイロンに結合したアルカリホスフ
ァターゼの活性については、全く検出し得る損失はみら
れず、被覆していないナイロンでは、ほとんど完全な活
性損失がみられるという、よりいっそう顕著なものであ
った。
【００５８】
【実施例１４】本実施例は、マルチウエルプレートを被
覆するための、ハロゲン化されたＰＨＳの利用を示した
ものである。
【００５９】９６ウエルのポル（塩化ビニル）製プレー
トを臭化ＰＨＳで被覆し、３０分間のインキュベーショ
ン時間を用いて、実施例１に記載の如く、ＰＨＳについ
てタンパク質の結合を調べた。臭化ＰＨＳで被覆したプ
レートのウエルに結合したタンパク量は、非置換型ＰＨ
Ｓで被覆したプレートのウエルに結合した量よりも３０
−３５％少なかったが、被覆していないプレートのウエ
ルに結合した量よりも４倍多かった。
【００６０】
【実施例１５】本実施例は、セラミックに対するタンパ
ク質の結合のためのＰＨＳの利用を示したものである。
【００６１】セラミックプレートは、２０ｍｇ／ｍｌの
ＰＨＳ（６１００ＭＷ）エタノール溶液で被覆され、風
乾された。１Ｕのアルカリホスファターゼを含むＰＢＳ
のアリコート２０ｕｌを、セラミック材料のＰＨＳ被覆
した領域と、被覆していない領域に滴下し、溶液の蒸発
を防ぐために高湿度状態で３０分間インキュベーション
した。この酵素はプレートから洗浄され、ＢＣＩＰ／Ｎ
ＥＴ基質が添加された。セラミックプレートのＰＨＳ被
覆した領域で検出されるアルカリホスファターゼの量
は、被覆していない領域で見られる量よりも、実質的に
多かった。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１０月２６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】本発明のこれら及び別の目的は、下記のひ
とつあるいはそれ以上の態様によって提供される。本発
明のひとつの態様において、タンパク質受容性基質を形
成するために基質に適用し、該接着剤配合物は、少なく
ともひとつの水酸基で置換された芳香族部分を含むモノ
マー単位の、非タンパク性ポリマーから成り；そして該
タンパク質受容性基質とタンパク質を含む生物活性組成
物とを接触させることからなる、タンパク質あるいはタ
ンパク質を含む組成物を基質へ接着する方法が提供され
る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】本発明の別の態様において、タンパク質が
結合した基質と組成物が接触する、組成物からタンパク
質を除く方法が提供される。接着剤配合物は、基質のタ
ンパク質結合能を増幅するために適用されている。接着
剤配合物は、少なくともひとつの水酸基で置換された芳
香族部分からなるモノマー単位の、非タンパク性ポリマ
ーを含む。本発明の別の態様において、ビーズが基質と
して用いられる。このビーズは、少なくともひとつの水
酸基で置換された芳香族部分からなるモノマー単位の、
非タンパク質ポリマーを含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】本発明の別の態様において、固形基質上で
細胞あるいは組織を培養状態で生育させる方法が提供さ
れる。接着剤配合物は、細胞または組織が接着する基質
に適用されている。この接着剤配合物は、少なくともひ
とつの水酸基で置換された芳香族部分からなるモノマー
単位の、非タンパク性ポリマーを含む。別の態様におい
て、ビーズが固形基質として用いられる。このビーズ
は、少なくともひとつの水酸基で置換された芳香族部分
からなるモノマー単位の、非タンパク性ポリマーを含
む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】本発明の別の態様において、生物試料から
ウィルス、細胞または生物を、固形担体上で精製する方
法が提供される。ウィルス、細胞または生物に特異的な
タンパク質が、生物試料と接触させられる。このタンパ
ク質は、接着剤配合物を介して固形担体に固定される。
この接着剤配合物は、少なくともひとつの水酸基で置換
された芳香族部分からなるモノマー単位の、非タンパク
性ポリマーを含む。別の態様において、ビーズが固形基
質として用いられる。このビーズは、少なくともひとつ
の水酸基で置換された芳香族部分からなるモノマー単位
の、非タンパク性ポリマーを含む。ウィルス、細胞また
は生物に特異的なタンパク質がこのビーズに固定され
る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】本発明の更に別の態様において、試料中の
分子、ウィルス、細胞あるいは生物の濃度または存在を
決定する方法が提供され、該方法では、タンパク質を含
む第１反応物質が基質に固定され、また該第１反応物質
および第２反応物質を互いに結合するために、第２反応
物質が第１反応物質と接触させられる。第１反応物質
は、接着剤配合物によって、基質に固定される。この接
着剤配合物は、少なくともひとつの水酸基で置換された
芳香族部分からなるモノマー単位の、非タンパク性ポリ
マーを含む。本発明の別の態様では、ビーズが基質とし
て用いられる。このビーズは、少なくともひとつの水酸
基で置換された芳香族部分からなるモノマー単位の、非
タンパク性ポリマーを含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】本発明の更に別の態様では、タンパク質の
大部分を含む組成物がクロマトグラフィー担体と接触せ
られ、タンパク質はクロマトグラフィー担体へのそのこ
となる結合能に基づいて分離される。タンパク質のクロ
マトグラフィーによる分離法が提供されたものは；
（１）少なくともひとつの水酸基で置換された芳香族部
分からなるモノマー単位の、非タンパク性ポリマーを含
む接着剤配合物、及び（２）タンパク質である。別の態
様では、ビーズがクロマトグラフィー担体として用いら
れる。ビーズは、少なくともひとつの水酸基で置換され
た芳香族部分からなるモノマー単位の、非タンパク性ポ
リマーを含む。ビーズはそれ自体に固定されたタンパク
質を有している。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】本発明の別の態様において、結合分子、ウ
ィルス、細胞あるいは生物用組成物が提供される。この
組成物は、少なくともひとつの水酸基で置換された芳香
族部分からなるモノマー単位の、非タンパク性ポリマー
を含む接着剤配合物で被覆された基質；ならびに接着剤
配合物に固定された生物学的に活性なタンパク質を含
む。別の態様において、本組成物は少なくともひとつの
水酸基で置換された芳香族部分を含むモノマー単位の、
非タンパク性ポリマー製のビーズからなる。このビーズ
はタンパク質で被覆されている。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】
【課題を解決するための手段】固形あるいは半固形状態
で、タンパク質に特異的に結合する非タンパク性ポリマ
ーは、本発明の発見である。該ポリマーは芳香族部分に
おいて、少なくとも１つの水酸基によって置換されてい
る好ましい比率の芳香族モノマー単位を含んでいる。タ
ンパク質結合化のための該固形または半固形物の発見
は、分子、ウィルス、細胞あるいは生きている生物の濃
度または存在を決定するアッセイに関する応用、タンパ
ク質除去、固定されたタンパク質を含むビーズ上でのク
ロマトグラフィー、細胞培養、組織培養、人工組織、血
管、移植片または移植組織の二次加工または移植、破壊
された組織の被覆または修復、医学的手術あるいは獣医
学における装置、および分子、化合物、ウィルス、細胞
あるいは生物の検出のための電気装置の操作への操作に
関する応用を有している。これらのポリマーのタンパク
質結合能は、たとえば人体において、タンパク質及びタ
ンパク質を含む混成物の放出を調節、あるいは一時的に
遅らせるためにも利用できる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】本発明の芳香族モノマー単位は、共鳴安定
化され、縮重された環状系を有する化学構造物である。
これらには炭化水素、有機または無機の複素環および元
素的に純粋な無機化合物がある。共鳴安定化され、縮重
された環状系を有する化学構造物は、好ましいプラナー
（ｐｌａｎａｒ）である。上述の如く、環状構造物は少
なくとも１つの水酸基を有している。本環状系あるいは
本ポリマー骨格上の別の置換を用いることができる。そ
のいくつかは、タンパク質に対するポリマーの親和性を
修飾することができる。そのいくつかは重合体架橋を可
能にできる。別の置換はタンパク質への不可逆的な化学
結合に用いられることができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３４】９６穴のポリ（塩化ビニル）製およびポリ
（スチレン）製マイクロプレートを、２０ｍｇ／ｍｌの
ＰＨＳエタノール溶液で満たすことによって、ポリ（ｐ
−ヒドロキシスチレン）（ＰＨＳ；ＭＷ６１００）で被
覆した。対照プレートは、エタノールのみで処理され
た。この溶液を直ちにデカントし、余剰のＰＨＳ溶液を
除き、コーティングを乾燥するためにこのプレートを６
０℃でインキュベーションした。リン酸緩衝生理食塩
水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）で１：１，０００から１：１
２８，０００に希釈されたヒツジ抗ウサギＩｇＧのＩｇ
Ｇ−ペルオキシダーゼ複合体を、ウエルあたり１００μ
ｌとなるようにウエルに添加した。時間を変えて（１
５、３０、４５、６０分）インキュベーションした後、
ウエルをＰＢＳで洗浄し、２，２′アジノ−ビス（３−
エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ
TM）を用いて、ペルオキシダーゼについてアッセイし
た。そして、吸光度はＥＬＩＳＡプレートリーダーを用
いて定量された。ＰＨＳ被覆したプレートのウエルは、
ポリ（塩化ビニル）プレートよりも４倍高いペルオキシ
ダーゼ活性を示し、ポリ（スチレン）プレートよりも８
倍高い活性を示した。試験したいずれの場合も、ＰＨＳ
被覆したウエルに、より高い活性が結合し、また、被覆
したウエルと被覆していないウエルの相対的相違は、試
験したいずれの時点でも同様であった。ＰＨＳ被覆した
ポリ（塩化ビニル）プレート及びポリ（スチレン）プレ
ートの間では、有意な相違はみられなかった。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３８】透明な、指向性ポリスチレン製の細片は、
２０ｍｇ／ｍｌのＰＨＳ（６１００ＭＷ）エタノール溶
液で被覆され、６０℃で乾燥せられた。対照の細片はエ
タノールのみで処理された。懸濁培養で成長したマウス
Ｐ３ＸＮＳ１ＡＧ４ミエローマ細胞は、リン酸緩衝生理
食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）で洗われ、ＰＨＳ−被覆し
たスライドと、被覆していないスライドをおいたＰＢＳ
を含む皿に添加された。室温からの、３０分間のインキ
ュベーション後、スライドは除かれ、ＰＢＳで洗浄して
カバーガラスで覆われた。顕微鏡による試験は、ＰＨＳ
−被覆したスライド表面に、視野１ｍｍ3 あたり３３．
９細胞が接着し、一方被覆しないスライドは、視野１ｍ
ｍ2 あたり１２．２細胞を含むことを示した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】１／４インチ以下のポリスチレン、ナイロ
ン、ポリカーボネート、酢酸及びデルリン（Ｄｅｌｒｉ
ｎTM）は、２０ｍｇ／ｍｌのＰＨＳ（６１００もしくは
９８７００ＭＷ）エタノール溶液で被覆され、室温で乾
燥せられた。対照のビーズは、エタノールのみで処理さ
れた。このビーズは、ビーズを収容するに充分な大きさ
のセルをもつ、９６穴のポリスチレン製プレートにおか
れ、ＰＢＳで１：１０，０００に希釈された、２００μ
ｌのヒツジ抗ウサギＩｇＧのＩｇＧ−ペルオキシダーゼ
複合体とともに、室温で３０分間インキュベーションさ
れた。このビーズは、水で洗浄され、ＡＢＴＳを用いて
ペルオキシダーゼ活性についてアッセイされた。ＰＨＳ
で被覆したビーズは、被覆しないビーズよりも２倍から
１０倍量の、結合したペルオキシダーゼを有していた。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４２】ポリエチレン製細管（すなわち〜１ｍｍ）
内壁は、４０ｍｇ／ｍｌもしくは２０ｍｇ／ｍｌのＰＨ
Ｓ（６１００ＭＷ）エタノール溶液を細管に流し、また
細管に空気を通気するために、吸引ポンプを用いて空気
乾燥することによってＰＨＳで被覆された。この細管
は、１２チャンネルのピペッターの２００μｌ容ピペッ
トチップに連結された。細管を満たすのに充分量（２５
μｌ）の、ヒツジ抗ウサギＩｇＧのＩｇＧ−ペルオキシ
ダーゼ複合体希釈液を細管に流し込み、室温で５分間イ
ンキュベーションし、新たな溶液で合計５回、放出と再
充填した。この細管は、同様にして水で洗浄され、次に
ＡＢＴＳアッセイ溶液で満たされ、室温で２分間インキ
ュベーションし、プレートリーダーによる定量のため、
マイクロタイタープレートに放出された。このアッセイ
手順は４回行われ、１００μｌの最終的な着色産物につ
いてのアッセイ容量が得られた。ＰＨＳで被覆した細管
についての両方の濃度は飽和した応答を与え、一方、Ｐ
ＨＳで被覆されていないポリエチレン製細管の壁に対す
るタンパク質の接着は検出されなかった。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】０．５％ジビニルベンゼン（平均直径＝６
０ミクロン）で架橋されたＰＨＳは、核酸を含む溶液を
含む水溶液から、ウシ血清アルブミンあるいはウシＩｇ
Ｇを抽出するために用いられた。ＰＨＳ懸濁液（ＰＢＳ
中５％）を、２０μｌの１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ溶液あるい
はＩｇＧのＰＢＳ溶液と等量混合し、穏やかにボルテッ
クスし、ＰＢＳを沈澱するために微量遠心機において、
最高速で１分間遠心し、そしてブラッドフォードアッセ
イを用いて、１／２の上清についてタンパク質の存在を
調べた。１ｍｇの架橋されたＰＨＳによって抽出された
タンパク量は、ＢＳＡについては２．５ｍｇ、ＩｇＧに
ついては１６ｍｇであった。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５６】巨大網状構造を持つ樹脂（ＸＡＤ−８；１
６０ｍ２ ／ｇｍ、孔サイズ＝２２５オングストロー
ム）はエタノール中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解され
たＰＨＳ（９８，７００ＭＷ）で被覆され、真空状態で
６０℃にて乾燥された。対照のビーズはエタノールのみ
で処理され、乾燥された。再び水を含ませた後、２．５
ｕｇのＢＳＡを含む溶液を、０．５ｍｌの樹脂に通過さ
せた。ＰＨＳ処理したカラムの溶出液中に、有意な量の
タンパク質が検出されなかったことは、タンパク質の完
全な吸着を示している。一方、対照のカラムには検出可
能な量のタンパク質は結合しなかった。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５７】
【実施例１３】本実施例は、ＰＨＳ被覆したナイロン膜
への酵素の結合を示したものである。ナイロン膜（ＭＡ
ＧＮＡナイロン；ＭＳＩ）は、３ｃｍ×１２ｃｍの細片
に切断された。それぞれの細片の半分を２０ｍｇ／ｍｌ
のＰＨＳ（６１００ＭＷ）エタノール溶液で被覆し、６
０℃で乾燥した。次にこの細片をわずかの間、０．１Ｎ
の水酸化ナトリウムに浸し、ＰＢＳで洗浄して２μｌ×
１３ウエルのスロット−プロット装置においた。アルカ
リホスファターゼあるいはヒツジ抗ウサギＩｇＧ−ペル
オキシダーゼ複合体いずれかの試料１００μｌをスロッ
トに添加し、膜を通過させた。最初のスロットに添加し
たタンパク量は、アルカリホスファターゼについては１
Ｕ、ヒツジ抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼについて
は、１：６００００のＥＬＩＳＡタイターを持つ複合体
の１：１０００希釈であった。その後のそれぞれのスロ
ットは、合計１１スロットにわたって、タンパク質の
１：１希釈が加えられ、最終的な希釈率は、開始量に対
して１：１０００を与えた。次にこのプロットを１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ８
で洗浄し、装置からはずし、アルカリホスファターゼに
関してはＢＣＩＰ／ＮＥＴ基質を含む緩衝液に、または
ペルオキシダーゼに関しては４−クロロナフトール基質
を含む緩衝液に浸した。検出される酵素活性量は、それ
ぞれの膜のヒドロキシスチレンで被覆した側で４−１０
倍高かった。ＢＣＩＰ／ＮＥＴ基質の濃度が１０の比率
で減少されるとき、その相違はヒドロキシスチレンで被
覆したナイロンに結合したアルカリホスファターゼの活
性については、全く検出し得る損失はみられず、被覆し
ていないナイロンでは、ほとんど完全な活性損失がみら
れるという、よりいっそう顕著なものであった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｑ 7055−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/00 Ｄ 8413−4Ｃ 39/385 8413−4Ｃ 39/44 8413−4Ｃ Ｃ０９Ｊ 125/06 ＪＣＮ 9166−4Ｊ (72)発明者 ジョン・エル・シード アメリカ合衆国メリーランド州21043，エ リコット・シティー，ハーストン・ロード 3222 (72)発明者 ブライアン・シード アメリカ合衆国マサチューセッツ州02114, ボストン，ジョイ・ストリート 47エイ

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 タンパク質あるいはタンパク質を含む組
    成物を基質に接着する方法であって：タンパク質受容性
    基質を製造するために、基質に接着剤配合物を適用し、
    該接着剤配合物は９以下のｐＫ値を持つ、少なくともひ
    とつの水酸基で置換された芳香族部分を含むモノマー単
    位の、非タンパク性ポリマーから成り；タンパク質を含
    む生物学的に活性な組成物を、該タンパク質受容性基質
    と接触させることからなる方法。
  2. 【請求項２】 組成物からタンパク質を除くための方法
    であって、ここで該組成物はタンパク質が結合する基質
    と接触させられ；タンパク質結合能を増大させるために
    接着剤配合物が適用された基質を使用し、該接着剤配合
    物は９以下のｐＫ値を持つ、少なくともひとつの水酸基
    で置換された芳香族部分を含むモノマー単位の、非タン
    パク性ポリマーから成ることを特徴とする方法。
  3. 【請求項３】 カルチャー中で細胞または組織を成長さ
    せる方法において、ここで固形基質が使用され；接着剤
    配合物が適用されている固形基質を使用し、該接着剤配
    合物は細胞あるいは組織を固形基質に接着させ、該接着
    剤配合物は９以下のｐＫ値を持つ、少なくともひとつの
    水酸基で置換された芳香族部分を含むモノマー単位の、
    非タンパク性ポリマーから成ることを特徴とする方法。
  4. 【請求項４】 固形支持体上で生物試料からのウイル
    ス、細胞あるいは生物を精製する方法であって、ここで
    該ウイルス、細胞あるいは生物に特異的なタンパク質は
    該生物試料と接触しており、該タンパク質が該固形支持
    体上に固定されており；固相支持体として、接着剤配合
    物が適用された基質を用い、該接着剤配合物は、９以下
    のｐＫ値を持つ、少なくともひとつの水酸基で置換され
    た芳香族部分を含むモノマー単位の、非タンパク性ポリ
    マーから成り、ここで該タンパク質が該接着剤配合物を
    介して、該固形支持体に固定されていることを特徴とす
    る方法。
  5. 【請求項５】 試料中の分子、ウイルス、細胞あるいは
    生物の濃度または存在を決定する方法であって、ここで
    タンパク質を含む第１反応物質が基質に固定され、また
    該第１反応物質および第２反応物質を互いに結合するた
    めに、第２反応物質が第１反応物質と接触せられ：該第
    １反応物質は接着剤配合物によって基質に固定され、該
    接着剤配合物は、９以下のｐＫ値を持つ、少なくともひ
    とつの水酸基で置換された芳香族部分からなるモノマー
    単位の、非タンパク性ポリマーを含む事を特徴とする方
    法。
  6. 【請求項６】 タンパク質のクロマトグラフィー的分離
    を行うための方法であって、ここで複数のタンパク質を
    含む組成物はクロマトグラフィー担体と接触させられ、
    ならびにタンパク質はクロマトグラフィー担体への異な
    る結合能に基づいて分離され； （１）９以下のｐＫ値を持つ、少なくともひとつの水酸
    基で置換された芳香族部分からなるモノマー単位の、非
    タンパク性ポリマーを含む接着剤配合物、及び（２）タ
    ンパク質：が適用されたクロマトグラフィー担体を使用
    することを特徴とする方法。
  7. 【請求項７】 タンパク質のクロマトグラフィー的分離
    を行うための方法であって、ここで複数のタンパク質を
    含む組成物はクロマトグラフィー担体と接触させられ、
    ならびにタンパク質はクロマトグラフィー担体への異な
    る結合能に基づいて分離され；クロマトグラフィー担体
    として、９以下のｐＫ値を持つ、少なくともひとつの水
    酸基で置換された芳香族部分からなるモノマー単位の、
    非タンパク性ポリマーで、ここで該ポリマーはそれに結
    合しているタンパク質を有する、を使用することを特徴
    とする方法
  8. 【請求項８】 タンパク質を組成物から除去する方法で
    あって、ここで該組成物はタンパク質が結合する基質と
    接触しており；基質として、９以下のｐＫ値を持つ、少
    なくともひとつの水酸基で置換された芳香族部分からな
    るモノマー単位の、非タンパク性ポリマーを用いること
    を特徴とする方法。
  9. 【請求項９】 結合分子、ウイルス、細胞あるいは生物
    に対する組成物であって：９以下のｐＫ値を持つ、少な
    くともひとつの水酸基で置換された芳香族部分からなる
    モノマー単位の、非タンパク性ポリマーを含む接着剤配
    合物で被覆された基質；及び該接着剤配合物に固定され
    たタンパク質を含む、生物学的に活性な組成物を含む組
    成物。
JP4199935A 1991-07-25 1992-07-27 タンパク質結合化のための接着剤配合物 Pending JPH05232120A (ja)

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