CN101141976A - 用释放bmp或pth的基质局部治疗骨缺损 - Google Patents
用释放bmp或pth的基质局部治疗骨缺损 Download PDFInfo
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Abstract
一种局部治疗特定骨缺损如骨质疏松或骨囊肿的方法，所述方法包括局部施用一种制剂的步骤，所述制剂含融合肽和适于形成生物可降解基质的材料，所述融合肽含第一个结构域和第二个结构域，所述第一个结构域含PTH或BMP 2或BMP 7，所述第二个结构域含可共价交联的底物结构域；所述生物可降解基质适于细胞生长或内生，其中所述融合肽共价连接所述基质。在一个实施方案中，所述基质包含一种或多种造影剂，优选在没有生长因子的情况下形成。所述基质可用于治疗充液性囊肿，例如Tarlov囊肿、卵巢囊肿、蛛网膜囊肿、动脉瘤样骨囊肿或肝囊肿。
Description
发明领域
本发明涉及骨囊肿的局部治疗方法和不健康骨中受骨质疏松侵袭区域的预防性局部治疗。
发明背景
骨质疏松
骨丢失是衰老的天然组成部分，男性和女性平均在40-50岁开始每年以0.6-1.2％的速率丢失骨量。在妇女绝经后，骨丢失每年加速至2-3％。但是，尤其是在绝经后妇女中，骨丢失速率可急剧增加。该病症叫做骨质疏松。骨质疏松具有重要的世界性意义，侵袭近2亿人。目前，在美国有1千万人罹患骨质疏松，还有一千八百万人患有骨质减少，这使他们处于发生骨质疏松的风险当中。此有风险人群的80％是女性。骨质疏松是系统性骨骼疾病，一般侵袭整个骨骼，其中总骨量下降且骨结构退化，这增加了骨空隙率。骨量和结构的这些变化降低了骨总体强度，使骨易于骨折。
骨质疏松是系统激素和局部因子之间的一种复杂相互作用，骨质疏松的确切细胞机制仍有待阐明。因此，目前的治疗没有直接抓住疾病病因。例如，最常用治疗剂双膦酸盐的衍生物在减少骨折发病率方面充其量仅50％有效。目前被批准使用的双膦酸盐包括阿仑膦酸盐(FOSAMAX)、依替膦酸盐(DIDROCAL)和利塞膦酸盐(ACTONEL)。已知为片剂形式或静脉内注射的双膦酸盐是一类通过包被骨并防止破骨细胞活性而用于预防和治疗骨质疏松的药物。
骨囊肿
骨囊肿是通常在长骨近端中的良性单腔溶解性区域，具有界限分明和狭窄的骨内边缘。单腔骨囊肿，或者称为单纯性骨囊肿，是骨中的充液性腔，衬有压缩的纤维组织。其经常出现在发育中儿童的长骨中，尤其是肱骨的上部(50-60％的机会)或股骨的上部(25-30％的机会)。但是，其它骨也可受侵袭。这些囊肿通常侵袭主要在5-15岁之间的儿童，但也可侵袭较年长儿童和成人。在较年长儿童和成人中，它们往往出现在扁骨(例如骨盆、颌、头颅或肋骨护架)或大跟骨(跟骨)中。
单腔骨囊肿被看作是良性的。它们没有转移(扩散)出骨外。有一些自发痊愈，但另一些扩大。更具侵袭性的囊肿可生长至填满骨干骺端的大部分(骨轴连接骨末端的过渡区域)，引起所谓的病理性骨折。更具侵袭性的囊肿还可破坏骨生长板，导致骨缩短。这些囊肿有时被分类为“活动性的”或“潜伏的”。活动性囊肿邻近生长板，趋向于扩大，引起上述问题。潜伏囊肿是更易于用治疗治愈的囊肿，因为生长板已迁离囊肿。
现时治疗的主要目标在于预防复发性骨折。目前应用以下的手术方法：刮除术/骨移植术(用称为刮匙的特定仪器手术刮除囊肿，所述刮匙具有匙杓、在其尖端的环或圈)、类固醇注射或骨髓注射。
关节周软骨下骨囊肿也称为软骨下囊肿病灶(SCL)，可出现在青年马中，是与人中的单腔骨囊肿相似的临床实体。它们通常被看作是经常在青年马中致跛的病理实体。最常遭受SCL的部位处于后膝关节(等同于人膝关节)。具体地说，骨囊肿存在于后膝关节的主承重面(股骨内髁)，很少在关节内的其它位置(近胫骨外侧和股骨外侧髁)。SCL是射线可透过的骨区域，根据SCL的发展阶段，所述区域通过硬化边缘与周围组织完全分开，一般充满纤维结缔组织和类似于滑液的浆液。在马中，至上覆的关节软骨表面的关节连接可存在于1/3的病例中。股骨内侧囊肿大小的变化范围为由浅拱形缺损(约8mm×3mm)至40mm×30mm的大卵形囊肿。
对致跛的SCL的治疗选择包括长期休息、抗关节炎和关节内皮质类固醇治疗和手术。保守治疗可能需要9-12个月的围场休息，与跛行的消退相关。不幸的是，用兽医文献中业已评价的保守治疗管理的马的数量非常有限，但成功率接近50％。
已使用众多手术技术治疗马骨囊肿。目前推荐的治疗包括关节镜去除(刮除)囊肿内容物、囊肿内衬和上覆无支持软骨。在增强愈合和改善结果的尝试中使用的其它技术包括骨钻孔和移植，这两种现在都被认为无益处。此外，骨囊肿可继续扩展，最终在马关节中导致继发性骨关节炎。
在过去的20年中，已研究了几种生物活性因子影响骨组织再生的能力。甲状旁腺激素(PTH)是一种84个氨基酸的肽，由甲状旁腺产生和分泌。该激素通过其对包括骨在内的各种组织的作用在血钙水平控制中起主要作用。用各种形式的甲状旁腺激素在人中进行的研究证明了其在系统施用时对骨的同化作用。这使人关注甲状旁腺激素对系统治疗骨质疏松和相关骨病的应用(Chorev等的美国专利第5,747,456号和Eli Lilly&Co.的WO 00/10596)。甲状旁腺激素通过结合细胞表面受体作用于细胞。该受体已知存在于成骨细胞上，成骨细胞是负责形成新骨的细胞。
业已报道，人甲状旁腺激素N-末端34个氨基酸的结构域在生物学上等同于全长甲状旁腺激素。甲状旁腺激素1-34及其作用模式首先报告于美国专利第4,086,196号。已对甲状旁腺激素1-34和其它截短形式的天然人甲状旁腺激素形式(例如1-25、1-31和1-38)进行了研究(参见例如Rixon RH等，J Bone Miner.Res.，9(8)：1179-89(1994年8月))。
PTH影响骨重建的机制是复杂的，已产生相矛盾的结果，随后引起针对所涉及的确切机制的大量研究。业已表明，如果PTH以连续方式系统施用，则骨密度将下降。相反，业已报道，如果以脉动方式系统施用相同分子，则骨密度将增加(参见例如Eli Lilly&Co.的WO 99/31137)。这种明显的矛盾可由这样的机制解释：其中，PTH调节骨重建，并在此后调节可观测的骨密度参数。在成熟骨中，已表明PTH受体仅存在于成骨细胞谱系细胞的表面，但不存在于破骨细胞上。PTH在骨重建中所起的作用针对与破骨细胞相反的成骨细胞。但是，当处于成骨细胞谱系不同时期的细胞结合甲状旁腺激素时，它们的响应不同。因此，当使用不同方法给予PTH时观察到的显著差异可通过理解相同分子对成骨细胞谱系中不同细胞所具有的不同作用而得到解释。
当PTH结合间充质干细胞时，该细胞被诱导分化为前成骨细胞。因此，通过将PTH加入至系统，前成骨细胞群有增加。但是，这些前成骨细胞同样具有PTH受体，PTH随后与这些细胞上的受体结合导致不同响应。当PTH结合前成骨细胞时，产生导致骨吸收的两个独立结果。首先，其抑制前成骨细胞进一步分化为成骨细胞。其次，其增加前成骨细胞的白介素6(IL-6)分泌。IL-6既抑制前成骨细胞分化，又增加前成骨细胞向破骨细胞的分化。成骨细胞谱系中细胞的这种双重反应在骨重建和PTH接触之间提供了复杂反应。如果PTH在短时间内定期给药，则诱导间充质干细胞分化为成骨细胞。短给药期因而防止新形成的前成骨细胞产生IL-6，防止破骨细胞活化。因此，在给药间隙当中，这些新形成的前成骨细胞可进一步分化为成骨细胞，导致骨形成。但是，如果施加恒定剂量的PTH，则前成骨细胞将有机会开始生产IL-6，因此活化破骨细胞，并抑制自身，导致相反的作用：骨吸收。
已研究的另一种生物活性因子是一类骨形态发生蛋白(BMP)和转化生长因子(TGFβ)。有至少20种结构和功能上相关的BMP和几种为TGFβ超家族成员的TGFβ。BMP最初被鉴别为软骨和骨形成的蛋白调节物。它们还参与不同组织和器官的胚胎发生和形态发生。BMP调节包括间充质细胞、上皮细胞、造血细胞和神经元细胞在内的不同细胞类型的生长、分化、趋化和凋亡。与其它TGF-β家族蛋白类似，BMP在动物种间是高度保守的。
骨形态发生蛋白2和7(BMP 2和7)在骨或软骨形成应用方面特别令人关注。BMP 2诱导软骨和骨这二者的形成。该蛋白作为前原肽合成。全长人前原肽BMP 2是一种具有396个氨基酸的序列的糖基化多肽，由19个氨基酸的信号序列、263个氨基酸的原区(pro region)和114个氨基酸的成熟区段组成。原区的切割发生在聚集之前。成熟形式具有7个半胱氨酸的部分和1个N-联糖基化位点。功能形式的蛋白由两条二硫键连接的成熟链组成。业已发现，仅由BMP 2的一部分成熟氨基酸序列(例如氨基酸283-396)组成的BMP 2变体也表现出生物活性。
人BMP 7或成骨蛋白-1(Op-1)是一种49kDa、431个氨基酸的前原蛋白，其类似于BMP 2，被裂解为一个292个氨基酸的前原区和一个139个氨基酸的成熟区段。所述成熟区段含3个潜在的N-联糖基化位点加7个半胱氨酸残基。
为修复或再生组织，细胞必须迁移入伤口床中、增殖、表达基质组分或形成胞外基质并形成最终的组织形状。多个细胞群经常参与该形态发生反应，常常包括血管细胞和神经细胞。其中掺有生物活性因子的基质对于此形态发生反应的发生已表现出极大增强，在某些情况下已发现对于此形态发生反应发生是必需的。已实施了由天然或合成来源或这二者的混合物开发基质的方法。天然细胞内生(in-growth)基质通过全部基于蛋白水解的细胞效应进行重建，例如通过纤溶酶(降解纤维蛋白)和基质金属蛋白酶(降解胶原蛋白、弹性蛋白等)进行重建。此降解是高度区域性的，仅发生在与迁移细胞直接接触时。另外，紧密调控特定细胞发信号蛋白如生长因子的传递。在天然模型中，不使用大孔细胞内生基质，而使用形成在细胞迁移入基质中时细胞可局部地按照要求降解的微孔基质。由于对免疫原性、生产昂贵、利用度有限、批料变异和纯化的顾虑，已开发了基于合成前体分子的基质，如修饰的聚乙二醇，用于机体中和/或机体上的组织再生。
尽管如上所述已做了许多工作研究PTH的系统作用，但研究很少考察PTH的区域性或局部施用。在WO 03/052091中描述了一种局部施用PTH的方法。WO 03/052091描述了共价连接至合成和天然基质的甲状旁腺激素，所述基质具体地说为纤维蛋白和聚乙二醇基质。以该方法甲状旁腺激素可局部施用，并以受控方式释放在需要的部位。在WO 03/052091中已表明该系统在健康骨中触发骨组织形成。
本发明的目标是提供一种局部治疗不健康骨中的区域的方法，所述不健康骨即受骨质疏松侵袭的骨，或即受骨囊肿和骨肿瘤侵袭的骨。
发明概述
已令人惊奇地发现，不健康骨的区域，例如受骨质疏松或骨囊肿或骨肿瘤侵袭和弱化的骨或特定骨区域，可通过局部施用生物活性因子有效治疗。
因此，本发明涉及一种制剂用于生产局部治疗不健康骨区域的药物的用途，所述制剂包含生物活性因子和能够在骨中需要治疗的部位形成基质的组合物，所述生物活性因子选自PTH和BMP或一种融合肽，所述融合肽在第一个结构域中含PTH或BMP，而在第二个结构域中含可共价交联的底物结构域。
本文描述了含生物活性因子的基质(本文也称为“补充基质”)以及制备和使用该基质的方法，所述含生物活性因子的基质适用于局部再生不健康骨区域，或局部增加不健康骨区域中的骨密度。在一个优选实施方案中，生物活性因子可释放性地掺入到基质中。基质可在不健康骨区域的部位原位形成，或根据适应症在体外形成，并通过手术以预成形形式应用于机体。生物活性因子由基质释放，并局部触发骨组织再生。合适的生物活性因子包括具有触发骨组织再生能力的分子、肽和蛋白。生物活性因子优选为PTH或BMP。甲状旁腺激素可为PTH1-84(天然的)、PTH1-38、PTH1-34、PTH1-31、PTH1-28或PTH1-25，或具有触发骨组织再生能力的任意修饰或等位基因形式的PTH，或BMP2或BMP7。最优选的生物活性因子是PTH1-34或BMP2。在一个实施方案中，所述生物活性因子处于融合肽中。所述融合肽包含第一个结构域和第二个结构域，第一个结构域包含生物活性因子，优选为PTH或BMP，第二个结构域包含可交联底物结构域。
在进一步优选的实施方案中，所述生物活性因子构成了前体组合物的一部分，所述前体组合物适于在受侵袭骨中的需要部位形成补充基质。形成补充基质的组合物优选是可注射的，由液体(于25℃)前体组分形成。一种将补充基质施用于不健康骨区域和/或施用到不健康骨区域中的方法需要至少一种能够于生理温度形成基质的液体前体组分和生物活性因子，并将前体组分和生物活性因子施用于不健康骨区域和/或施用到不健康骨区域中。骨缺损，即不健康骨区域，一般是受骨质疏松、骨囊肿或骨肿瘤侵袭的骨区域。对于骨质疏松性骨来说，治疗导致骨(可以是例如股骨颈或椎骨)的骨质疏松部分中的骨密度局部增加(并因此降低骨或骨的部分的骨折率)。在该意义上，如本申请所述用补充基质治疗骨的不健康区域的方法是预防性治疗，特别是用于预防骨折。在其中补充基质施用到骨囊肿的已清洁腔中或在骨囊肿的已清洁腔中形成或去除骨肿瘤后施用或形成的情况下，补充基质在腔中诱导骨形成，用于在功能上以及结构上恢复骨的完整性。
优选地，所述基质是纤维蛋白基质或基于聚乙二醇的基质。
还可在基质植入前或植入时乃至植入后将细胞加入基质，或者在聚合物交联形成基质时或之后将细胞加入基质。这可作为对交联基质的附加或替代，以产生设计用于促进细胞增殖或内生的胞间隙。
在一个实施方案中，所述基质包含一种或多种造影剂，还可在没有生长因子的情况下形成。一般来说，所述造影剂能够在注射和胶凝过程中使制剂的分布成像并定位制剂。如果在没有生物活性因子的情况下使用制剂，则基质优选可用于治疗充液性囊肿，例如Tarlov囊肿、卵巢肿瘤、蛛网膜肿瘤、动脉瘤骨囊肿或肝囊肿。
因此，本发明还涉及一种制剂，其包含：
i)能够在生理条件下形成基质的组合物；
ii)PTH、BMP或含至少两个结构域的融合肽，其中第一个结构域包含PTH或BMP，第二个结构域包含可交联底物结构域；和
iii)造影剂。
本发明还涉及一种补充基质，其包含天然或合成基质材料、选自PTH和BMP的生物活性因子以及造影剂。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含纤维蛋白原、凝血酶、钙源、选自PTH和BMP的生物活性因子以及造影剂。
附图简述
图1显示了PTH变体的生物活性。用等量的PTH1-34、TG-pl-PTH1-34(后文描述)或国际84氨基酸标准品处理连接至用PTH受体启动子的报告基因转染的细胞。检测萤光素酶报告基因表达的抑制，并与未接触溶液中的PTH的转染细胞(对照)对比。
图2显示了纤维蛋白基质的PTH释放测定的结果。
发明详述
本文描述了一种在不健康骨(总称为不健康骨区域)中局部治疗骨缺损和结构的方法。优选治疗骨质疏松骨和/或骨囊肿和/或骨肿瘤中的区域。所述方法使用其中可释放地掺有生物活性因子(特别是PTH或BMP)的天然和合成基质。补充基质是可注射的、生物可相容的和生物可降解的，并可在植入时在体外或体内形成。所述生物活性因子可掺入到基质中，并保有其完整的生物活性。可使用对PTH或BMP如何释放和何时释放和释放到什么程度进行控制的技术，使特别优选的生物活性因子PTH1-34、BMP 2或BMP 7通过与基质的共价或非共价相互作用可释放地掺入，以便可使用补充基质作为受控的释放载体，将补充基质直接或间接地用于组织修复。
定义
本文通常使用的“粘附位点或细胞附着位点”指分子(例如细胞表面的促粘附受体)结合的肽序列。粘附位点的实例包括但不限于纤连蛋白的RGD序列和层粘蛋白的YIGSR(SEQ ID NO：1)序列。粘附位点可通过包含可与纤维蛋白基质交联的底物结构域可选地掺入到基质中。
本文通常使用的“生物活性”指由目标蛋白介导的功能事件。在某些实施方案中，其包括通过测量多肽与另一多肽的相互作用测定的事件。其还包括测定目标蛋白对细胞生长、分化、死亡、迁移、粘附、与其它蛋白的相互作用、酶活性、蛋白磷酸化或脱磷酸化、转录或翻译所具有的作用。
本文通常使用的“共轭不饱和(congujated unsaturated)键”指碳-碳、碳-杂原子或杂原子-杂原子多键与单键的交替，或官能团与大分子(例如合成聚合物或蛋白)的连接。这样的键可经历加成反应。
本文通常使用的“共轭不饱和基团”指分子或分子的区域，其包含碳-碳、碳-杂原子或杂原子-杂原子多键与单键的交替，具有可经历加成反应的多键。共轭不饱和基团的实例包括但不限于乙烯砜、丙烯酸酯、丙烯酰胺、醌和乙烯吡啶，例如2-或4-乙烯基吡啶和衣康酸酯。
本文通常使用的“造影剂”指用于增加影像对比度的分子或物质，其能够监测机体中的所述物质或分子。
本文通常使用的“交联”指形成共价键。
本文通常使用的“交联密度”指相应分子的两个交联(Mc)之间的平均分子量。
本文通常使用的“平衡状态”是其中水凝胶在水中于恒定条件下储存时未经历质量增加或损失的状态。
本文通常使用的“当量”指mmol官能团/g物质。
本文通常使用的“纤维蛋白基质”指一种过程的产物，在该过程中，在钙源和XIIIa因子存在下，基本全部的前体组分纤维蛋白原和凝血酶都交联，形成三维网络。术语基质、凝胶和三维网络或聚合网络同义使用。
本文通常使用的“官能化”指以导致官能团或部分连接的方式修饰分子。例如，一种分子可通过引入使其成为强亲核试剂或共轭不饱和分子的分子而被官能化。优选地，将例如PEG的分子官能化，成为硫醇、胺、丙烯酸酯或醌。具体地说，还可通过将二硫键部分或完全还原以产生游离巯基而使蛋白有效官能化。
本文通常使用的“官能度”指分子上的反应性位点数。
本文通常使用的“分支点的官能度”指分子中由一点延伸的臂的数量。
本文一般使用的“融合肽或蛋白”指至少含第一个和第二个结构域的肽或蛋白。一个结构域包含生物活性因子，优选PTH 1-34、BMP2或BMP 7，另一个结构域含可在基质形成期间和形成后交联至该基质的底物结构域。酶降解位点或水解降解位点也可存在于第一个结构域和第二个结构域之间。
本文一般使用的“基质”指这样的物质：其用来与生物系统接合，以基于所述基质持久地或暂时地处理、增大或替换任意组织或组织功能。所述基质可用作用于将生物活性因子掺入其中的传递装置，和/或用作细胞内生基质。本文描述的基质由液体前体组分形成，所述液体前体组分能够在机体中需要的部位形成支架。术语“基质”和“凝胶”在本文同义使用。术语“基质”和“凝胶”指在前体组分混合在一起后形成的组合物。因此，术语“基质”和“凝胶”包含部分或全部交联的聚合网络。它们可为液体、半固体如糊浆或固体形式。根据前体材料的类型，基质可用水溶胀，但不溶解在水中，即形成在一定时间段内停留在体内的水凝胶。
本文一般使用的“多功能”指每个分子(即单体、寡聚物和聚合物)有不止一个亲电子和/或亲核官能团。
本文一般使用的“天然前体组分或聚合物”指可在自然界中发现的分子。
本文一般使用的“不健康骨或不健康骨区域”指骨或骨的部分，其具有由骨质疏松引起的结构或遗传退化、如在骨囊肿中一样的局部炎症或如在癌症中一样的肿瘤生长引起的疾病，即指处于疾病状态的骨结构，与疾病种类无关。就本发明意义而言，设想骨质疏松性骨中的骨折为骨缺损。
本文一般使用的“骨质疏松”指系统性的骨骼疾病，其特征在于低骨量和骨组织的结构退化，其增加了骨多孔性和对骨折的易受性。骨丢失是无症状的，某些人可能没有意识到他们患有骨质疏松，直至他们遭受骨折。已知两种主要类型的骨质疏松：原发性骨质疏松和继发性骨质疏松。原发性骨质疏松再分为I型骨质疏松和II型骨质疏松，I型骨质疏松侵袭绝经初起已引起加速骨丢失的妇女；II型骨质疏松侵袭衰老过程已导致骨密度下降的人员。继发性骨质疏松出现在其它疾病之后经历骨丢失的人员中，或出现在使用某些类型药物的人员中。主要是手腕、脊椎和髋部易受骨质疏松相关骨折。优选治疗I型骨质疏松。
本文一般使用的“聚乙二醇基质”指一种过程的产物，在该过程中，至少两种具有官能团的前体聚乙二醇组分彼此自选择性地交联，形成三维交联网络。这些系统是已知的，描述于例如WO 03/052091。
本文使用的“PTH”包括PTH1-84的人序列和所有表现出骨形成特性的截短、修饰和等位基因形式的PTH，特别是在掺入时优选共价结合至纤维蛋白基质的上述PTH。优选的截短形式的PTH是PTH1-38、PTH1-34、PTH1-31或PTH1-25。最优选的是PTH1-34。优选地，PTH是人PTH，但其它来源的PTH如牛PTH可能是适合的。
本文使用的“骨膜”指形成致密的纤维层的骨外层，形成关节结构的那些部分除外，该外层覆盖完整骨结构，含有滋养外部骨组织的血管系统。
本文一般使用的“生理的”指可在活脊椎动物中存在的条件。具体地说，生理条件指人体中诸如温度和pH的条件。生理温度具体地指35℃-42℃的温度范围，优选约37℃。
本文一般使用的“聚合网络”指一种过程的产物，在该过程中，基本全部的单体、寡聚物或多聚物都通过经由其可用的官能团的分子间共价键结合，以产生一个巨大分子。
本文一般使用的“强亲核试剂”指能够在极性键形成反应中贡献电子对给亲电子试剂的分子。优选地，所述强亲核试剂在生理pH比水更具亲核性。强亲核试剂的实例是硫醇和胺。
本文一般使用的“合成前体分子”指自然界中不存在的分子。
本文一般使用的“自选择反应”指组合物的第一种前体组分与组合物的第二种前体组分的反应或反过来的反应远比与存在于混合物中或反应部位的其它化合物的反应快速。本文使用的亲核试剂优先结合亲电子试剂，而亲电子试剂优先结合强亲核试剂，而不是结合其它生物化合物。
本文一般使用的“溶胀”指通过基质吸收水而使体积和质量增加。术语“水吸收”和“溶胀”在整个本说明书中同义使用。
本文一般使用的“补充基质”指生物活性因子(任选地为融合肽)可释放地掺入其中的基质。生物活性因子通过共价或非共价相互作用掺入。
I.补充基质
A.基质材料
通过离子地、共价地或其组合地交联前体分子与聚合网络形成基质，和/或通过溶胀一种或多种聚合材料即基质来形成基质，以形成具有足够聚合物间间隙的聚合网络，允许细胞内生或迁移入基质中。在一个实施方案中，所述基质由蛋白、优选天然存在于所述基质要植入其中的患者中的蛋白形成。特别优选的基质蛋白是纤维蛋白，但也可使用由其它蛋白如胶原蛋白和明胶制备的基质。多糖和糖蛋白也可用于形成基质。还有可能使用可通过离子或共价结合交联的合成聚合物。
纤维蛋白基质
纤维蛋白是一种天然材料，已报道了其几种生物药物用。纤维蛋白在Hubbell等的美国专利第6,331,422号中已描述为用于细胞内生基质的材料。纤维蛋白凝胶因为其结合许多组织的能力及其在伤口愈合中的天然作用而业已用作密封剂。某些特定应用包括用作血管移植附着、心脏瓣附着、骨折中的骨定位和腱修复的密封剂。另外，这些凝胶已用作药物传递装置和用于神经原再生。尽管纤维蛋白提供了用于组织再生和细胞内生的固体支持体，但在单体中有少量直接增强这些过程的活性序列。
纤维蛋白原聚合为纤维蛋白的过程也已被表征。首先，蛋白酶在两个对称位点切割二聚纤维蛋白原分子。有几种可能的蛋白酶可切割纤维蛋白原，包括凝血酶、肽酶和蛋白酶III，每一种都于不同的位点切断所述蛋白。一旦裂解了纤维蛋白原，就进行自聚合步骤，其中纤维蛋白原单体聚集在一起，形成非共价交联的聚合凝胶。这种自组装的发生是因为在发生蛋白酶裂解后结合位点变成暴露的。它们一暴露出来，在分子中心的这些结合位点就可结合纤维蛋白原链上存在于肽链末端的其它位点。以此方式形成聚合物网络。然后，通过凝血酶蛋白水解由XIII因子经谷氨酰胺转移酶活化的XIIIa因子可共价交联聚合物网络。存在其它谷氨酰胺转移酶，它们也可参与同纤维蛋白网络的共价交联和移植。
一形成交联的纤维蛋白凝胶，就紧密控制随后的降解。控制纤维蛋白降解的其中一种关键分子是α2-纤溶酶抑制剂。该分子通过经XIIIa因子作用交联至纤维蛋白的α链而起作用。通过自身连接至凝胶，高浓度抑制剂可定位至凝胶。然后抑制剂通过防止纤溶酶原与纤维蛋白结合并失活纤溶酶而起作用。α2-纤溶酶抑制剂包含谷氨酰胺底物。确切的序列鉴别为NQEQVSPL(SEQ ID NO：2)，第一个谷氨酰胺是用于交联的活性氨基酸。
业已表明，含XIIIa因子底物序列和生物活性肽序列的双结构域肽可交联入纤维蛋白基质中，该生物活性肽保留其体外细胞活性。
根据适应症和混合入纤维蛋白中的物质，凝血酶的浓度可有所改变。在一个优选实施方案中，纤维蛋白基质含有的纤维蛋白原在5-65mg/ml纤维蛋白基质的范围内，更优选15-60mg/ml纤维蛋白基质，再更优选25-55mg/ml纤维蛋白基质，最优选30-45mg/ml纤维蛋白基质。凝血酶以0.5-5I.U./ml纤维蛋白基质的范围存在，更优选以1.25-3.25I.U./ml纤维蛋白基质的范围存在，最优选以1.5-2.5I.U./ml纤维蛋白基质的范围存在。另外，钙离子源有助于形成纤维蛋白基质。钙离子源优选为0.5-5mg/ml纤维蛋白基质浓度的CaCl2*2H2O，浓度再更优选为2-3.5mg/ml纤维蛋白基质，最优选为2.5-3mg/ml纤维蛋白基质。I.U.代表凝血酶的一种国际单位，定义为0.0853mg人凝血酶第一次国际标准品(First international standard)所包含的活性。由以这些浓度范围存在的材料形成的补充纤维蛋白基质优选用于所有不需要加入造影剂的适应症，如骨囊肿和骨肿瘤。
当基质中存在一种或多种造影剂时，纤维蛋白基质中的凝血酶量一般大于无造影剂时相同纤维蛋白基质中的凝血酶量。当补充基质作为预防性治疗用于在骨质疏松性骨中防止骨折时，优选加入造影剂，即注射入脊椎或股骨颈中。在这些情况下，纤维蛋白基质典型地含7.5-125I.U.凝血酶/ml纤维蛋白基质浓度范围的凝血酶，浓度优选在25-50I.U.凝血酶/ml纤维蛋白基质的范围内，最优选在35-40I.U.凝血酶/ml纤维蛋白基质的范围内。
形成纤维蛋白基质的前体溶液
优选用两种前体溶液形成纤维蛋白基质。第一种前体溶液包含纤维蛋白原，优选10-130mg纤维蛋白原/ml前体溶液，更优选30-120mg纤维蛋白原/ml前体溶液，再更优选50-110mg纤维蛋白原/ml前体溶液，最优选60-90mg纤维蛋白原/ml前体溶液。如果必须加入凝血酶来形成基质以及在那些其中适应症需要一种或多种造影剂的情况下，第二种前体溶液包含凝血酶，优选15-250I.U.凝血酶/ml前体溶液，更优选50-100I.U.凝血酶/ml前体溶液，最优选70-80I.U.凝血酶/ml前体溶液。另外，在至少一种前体溶液中可存在钙离子源。钙离子源优选为CaCl2*2H2O，浓度优选为1-10mg/ml前体溶液，再更优选为4-7mg/ml前体溶液，最优选为5-6mg/ml前体溶液。可选地，将能够催化基质形成的酶如XIIIa因子加入至少一种前体溶液。优选地，XIIIa因子以0.5-100I.U./ml前体溶液的浓度存在，更优选以1-60I.U./ml前体溶液的浓度存在，最优选以1-10I.U./ml前体溶液的浓度存在。
在不需要存在造影剂的情况下，纤维蛋白基质优选由优选的两种前体溶液形成。第一种前体溶液典型地含纤维蛋白原，浓度范围优选为10-130mg纤维蛋白原/ml前体溶液，更优选30-120mg纤维蛋白原/ml前体溶液，再更优选50-110mg纤维蛋白原/ml前体溶液，最优选60-90mg纤维蛋白原/ml前体溶液。如果必须加入凝血酶来形成基质，则第二种前体溶液包含凝血酶，浓度范围优选为1-10I.U.凝血酶/ml前体溶液，更优选2.5-6.5I.U.凝血酶/ml前体溶液，最优选3-5I.U.凝血酶/ml前体溶液。另外，钙离子源存在于其中一种前体溶液中。钙离子源优选为CaCl2*2H2O，浓度范围为1-10mg/ml前体溶液，再更优选为4-7mg/ml前体溶液，最优选为5-6mg/ml前体溶液。可选地，将能够催化基质形成的酶如XIIIa因子加入前体溶液。优选地，XIIIa因子以0.5-100I.U./ml前体溶液的浓度范围存在，更优选以1-60I.U./ml前体溶液的浓度范围存在，最优选以1-10I.U./ml前体溶液的浓度范围存在。
合成基质和前体溶液
形成应用于机体的合成基质的交联反应包括：(i)在含不饱和双键的两种或更多种前体之间的自由基聚合，如Hern等，J.Biomed.Mater.Res.39：266-276(1998)所述；(ii)亲核置换反应，例如含胺基的前体和含琥珀酰亚胺基的前体之间的亲核置换反应，如Rhee等的美国专利第5,874,500号所公开；(iii)缩合和加成反应；和(iv)在强亲核试剂和共轭不饱和基团或键(为强亲电子试剂)之间的迈克尔加成反应。特别优选具有巯基或胺基为亲核基团的前体分子与含丙烯酸酯或乙烯砜基团作为亲电子基团的前体分子之间的反应。最优选的亲核基团是巯基。迈克尔加成(Michael addition)反应描述于Hubbell等的WO 00/44808。迈克尔加成反应允许在生理条件下以自选择方式原位交联至少第一种和第二种前体组分，即便存在敏感性生物材料也是如此。当其中一种前体组分具有至少2的官能度以及其它前体组分中的至少一种具有大于2的官能度时，系统将自选择地反应，形成交联的三维基质。
优选地，共轭不饱和基团或共轭不饱和键是丙烯酸酯、乙烯砜、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯腈、乙烯砜、2-或4-乙烯基吡啶、马来酰亚胺或醌。
亲核基团优选为巯基、氨基或羟基。巯基实质上比未质子化胺基更具反应性。pH的重要性在于这样的考虑因素：去质子化的巯基实质上比质子化的巯基更具反应性。因此，涉及共轭不饱和物质如丙烯酸酯或醌与巯基的加成反应将两种前体组分转变为基质，该加成反应通常最好在约8的pH最快速地和自选择地进行。在约8的pH，大部分目标巯基是去质子化的(并因此更具反应性)，而大部分目标胺仍是质子化的(并因此反应性差)。当巯基用作第一种前体分子时，非常期望其对巯基的反应性相对于对胺的反应性是选择性的共轭结构。
适宜的第一种和第二种前体分子包括蛋白、肽、聚氧化烯、聚(乙烯醇)、(乙烯-乙烯醇)共聚物、聚(丙烯酸)、(乙烯-丙烯酸)共聚物、聚(乙基唑啉)，、聚(乙烯吡咯烷酮)、(乙烯-乙烯吡咯烷酮)共聚物、聚(马来酸)、(乙烯-马来酸)共聚物、聚丙烯酰胺和聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物。特别优选的前体分子是聚乙二醇。
聚乙二醇(PEG)提供了一种便利的构造单元。人们可容易地购买或合成线性PEG(意味着具有两个末端)或分支PEG(意味着具有不止两个末端)，然后使PEG末端基团官能化，以引入强亲核试剂如硫醇，或引入共轭结构，如丙烯酸酯或乙烯砜。当这些组分彼此混合时或与略碱性环境中的对应组分混合时，基质通过第一种和第二种前体组分之间的反应形成。PEG组分可与非PEG组分反应，任一种组分的分子量或亲水性都可被控制，以操控所获基质的机械特征、透过性和水含量。
在形成基质时，尤其是在形成期望在体内降解的基质时，肽提供了一种非常便利的构造单元。直接合成含两个或多个半胱氨酸残基的肽，然后该组分可容易地用作具有亲核基团的第一种前体组分。例如，具有两个游离半胱氨酸残基的肽于生理pH或稍高的pH(例如8-9)与PEG三乙烯砜(具有3个臂的PEG，其每个臂都有乙烯砜)混合时，容易形成基质。胶凝还可在甚至更高的pH充分进行，但潜在地损害了自选择性。当两种液体前体组分混合在一起时，它们在几分钟的时间段内反应形成弹性凝胶，该弹性凝胶由PEG链网络组成，带有网络节点，肽为连接物。可选择作为蛋白酶底物的肽，以便使所述网络能够被细胞浸润和降解，在基于蛋白的网络中(如在纤维蛋白基质中)就是这样做的。优选地，结构域中的序列是参与细胞迁移的酶的底物(例如，胶原酶、纤溶酶、金属蛋白酶(MMP)或弹性蛋白酶之类的酶的底物)，但合适的结构域不限于这些序列。一个特别有用的序列是酶纤溶酶底物。凝胶的降解特性可通过改变用作交联节点的肽的细部来操控。人们可制备可被胶原酶降解而不被纤溶酶降解的凝胶，或者可制备可被纤溶酶降解而不被胶原酶降解的凝胶。而且，仅仅通过改变氨基酸序列，以便改变酶反应的Km或kcat或这二者，就有可能使凝胶响应于该酶而更快或更慢降解。因此，人们可制备作为生物模拟物的基质，因为其能够通过细胞的正常重建特征而被重塑。例如，该研究表明了用于重要的蛋白酶纤溶酶的底物位点。PEG与肽的胶凝是自选择性的。
可选地，可将生物功能剂掺入基质中，以提供与其它物质(例如组织表面)的化学键合。在由PEG乙烯砜形成基质时已将蛋白酶底物掺入基质中是重要的。除了由PEG丙烯酸酯和PEG硫醇反应形成的基质以外，由PEG乙烯砜和PEG硫醇反应形成的基质不含水解可降解键。因此，蛋白酶底物的掺入允许基质在机体中降解。
合成基质在操作上易于形成。混合两种液体前体，一种前体含具有亲核基团的前体分子，另一种前体分子含亲电子基团。生理盐水可用作溶剂。反应产生最小热量。因此，胶凝可在体内或在体外直接接触组织进行，而无不利的毒性。因此，可使用PEG之外的聚合物，这些聚合物或者是遥爪修饰的，或者对其侧基修饰。
对于大部分治愈的适应症，细胞内生或细胞迁移入基质中的速率与适合的基质降解速率组合对整体治愈反应是关键。水解不可降解基质被细胞侵入的潜力主要随网络密度而变。如果在分支点或节点之间的现有间隙相对于细胞的大小太小，或者如果导致在基质内建立更大间隙的基质降解速率太慢，则将观察到非常有限的愈合反应。作为响应于机体中损伤而形成的天然存在的愈合基质，如纤维蛋白基质，已知由非常松散的网络组成，所述网络可非常容易地被细胞侵入。浸润由细胞粘附的配体促进，所述配体是纤维蛋白网络的集成部分。
同聚乙二醇一样，由合成亲水前体分子制备的基质在形成聚合网络后于水性环境中溶胀。为了在机体中原位形成基质期间获得足够短的胶凝时间(在pH为7-8、温度范围为36-38℃的情况下为3-10分钟)和定量反应，前体分子的起始浓度必须足够高。在这些条件下，网络形成后的溶胀应不会发生，并且当基质于水性环境中不可降解时，必需的起始浓度会导致基质对细胞浸润而言太密。因此，聚合网络的溶胀对扩大和加宽分支点之间的间隙很重要。
由相同的合成前体分子(例如4个臂的PEG乙烯砜和具有SH基的肽)制备的水凝胶，在平衡态溶胀至相同水含量，而与前体分子的起始浓度无关。这意味着前体分子的起始浓度越高，水凝胶在达到其平衡状态时的终体积就越高。如果机体中的可用间隙太小，不允许足够的溶胀，特别是如果由前体组分形成的连接不是水解可降解的，则细胞浸润速率和愈合反应将下降。因此，必须寻找应用于机体中的两种相反需求之间的最佳状态。用由具有分子量基本相似的至少3个臂的三官能分支聚合物和至少为双功能分子的第二种前体分子的反应形成的三维聚合网络，已经观察到良好的细胞浸润和随后的愈合反应。第一种和第二种前体分子的官能团的当量比率在0.9-1.1之间。选择第一种前体分子的臂的分子量、第二种前体分子的分子量和分支点的官能度，以使所获聚合网络的水含量在平衡重量％和完全吸水后聚合网络总重的92％(重量)之间。优选地，水含量处于完全吸水后聚合网络和水的总重的93-93％(重量)之间。完全吸水可在达到平衡浓度时或在基质中可用间隙不允许进一步增加体积时实现。因此，优选选择尽可能低的前体分子起始浓度。这对所有可溶胀基质都适用，但对那些经历细胞介导的降解和在聚合网络中不含水解可降解键的基质特别适用。
胶凝时间和低起始浓度之间的平衡应基于前体分子的结构进行优化，特别是对于水解不可降解的凝胶而言。具体地说，必须相应地调整第一种前体分子的臂的分子量、第二种前体分子的分子量和分支度，即分支点的官能度。实际反应机制对该相互作用的影响微小。
如果第一种前体分子是3个或4个臂的聚合物，在每个臂的末端都具有官能团，而第二种前体分子是线性双功能分子，优选为含至少两个半胱氨酸基团的肽，则优选选择第一种前体分子的臂的分子量和第二种前体分子的分子量，使得形成网络后分支点之间的连接具有的分子量在10-13kDa范围内(在连接为线性、不分支的条件下)，优选在11-12kDa之间。这使第一种和第二种前体分子总和的起始浓度在溶液中第一种和第二种前体分子的总重(在形成网络之前)的8-12％(重量)的范围内，优选在9-10％(重量)之间。对于第一种前体组分的分支度增加至8而第二种前体分子仍为线性双功能分子的情况，分支点之间连接的分子量优选增加至18-24kDa之间的分子量。当第二种前体分子的分支度由线性增加至3个或4个臂的前体组分时，分子量(即连接的长度)相应增加。在一个优选实施方案中，选择组合物，其包含作为第一种前体分子的三官能3臂15kD聚合物，即各个臂都具有5kD的分子量，以及包含作为第二种前体分子的双功能线性分子，其分子量在0.5-1.5kD之间的范围，再更优选约为1kD。优选地，所述第一种和第二种前体组分为聚乙二醇。
在一个优选实施方案中，第一种前体组分包含为官能团的共轭不饱和基团或键，最优选丙烯酸酯或乙烯砜，第二种前体分子的官能团包括亲核基团，优选巯基或氨基。在本发明的另一个优选实施方案中，第一种前体分子是一种4个臂的15-20kD聚合物，优选15kD聚合物，在各个臂的末端都具有官能团，第二种前体分子为一种双功能线性分子，其分子量在3-4kDa范围内，优选为3.4kDa。优选地，第一种前体分子是具有丙烯酸酯基团的聚乙二醇，第二种前体分子是具有巯基的聚乙二醇。在两个优选实施方案中，第一种和第二种前体分子总和的起始浓度在第一种和第二种前体分子和水的总重(在形成聚合网络之前)的8-11％(重量)的范围内，优选在9-10％(重量)之间，优选在5-8％(重量)之间，以实现胶凝时间低于10分钟。这些组合物在pH 8.0和37℃具有的胶凝时间为混合后约3-10分钟。
当所述基质包含水解可降解的连接时，例如由丙烯酸酯和硫醇之间的优选反应形成的连接，对细胞浸润而言网络密度在开始时特别重要，但在水性环境中，所述连接将被水解，网络将疏松，使得可以进行细胞浸润。随着聚合网络整体分支度的增加，互连的分子量(即连接长度)必须增加。
B.细胞附着位点
细胞通过细胞表面的蛋白-蛋白、蛋白-寡糖和蛋白-多糖相互作用与其环境相互作用。胞外基质蛋白提供宿主的生物活性信号给细胞。需要这种致密的网络支持细胞，基质中的许多蛋白已显示出控制细胞粘附、扩散、迁移和分化。已显示出特别有活性的某些特定蛋白包括层粘连蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原和胶原蛋白。已进行了许多层粘连蛋白的研究，业已表明层粘连蛋白在体内神经和体外神经细胞的发育和再生以及血管生成方面起重大作用。已鉴别出某些直接与细胞受体相互作用并引起粘附、扩散或信号转导的特定序列。
层粘连蛋白是一种多结构域大蛋白，已表明其由具有几个受体结合结构域的3条链组成。这些受体结合结构域包括层粘连蛋白B1链的YIGSR(SEQ ID NO：1)序列、层粘连蛋白A链的LRGDN(SEQ IDNO：3)和层粘连蛋白B1链的PDGSR(SEQ ID NO：4)。已鉴别出细胞的几种其它识别序列。这些序列包括层粘连蛋白A链的IKVAV(SEQID NO：5)和层粘连蛋白B2链的序列RNIAEIIKDI(SEQ ID NO：6)。特别优选的是纤连蛋白的RGD序列。
在一个进一步优选的实施方案中，将用于细胞粘附的肽位点(即结合细胞表面上的促粘附受体)的肽掺入基质中。这样的促粘附肽包括上述那些肽。特别优选的是纤连蛋白的RGD序列、层粘连蛋白的YIGSR(SEQ ID NO：1)序列。掺入细胞附着位点对合成基质是特别优选的。但是，对于某些天然基质，也可包含细胞附着位点。例如可通过将含半胱氨酸的细胞粘附肽与含共轭不饱和基团的前体分子(如PEG丙烯酸酯、PEG丙烯酰胺或PEG乙烯砜)混合来实现掺入。该步骤可在与含亲核基团的其余前体组分(如含巯基的前体组分)混合前不久(例如几分钟)发生。如果细胞粘附位点不含半胱氨酸，则其可化学合成，以包含一个半胱氨酸。在该步骤当中，促粘附肽将被掺入到前体的一个末端，该末端已用共轭不饱和作用多重官能化；当将余下的多巯基加入系统时，将形成交联网络。
共价结合入基质中的粘附位点的浓度可影响细胞浸润速率。例如，对于给定水凝胶，可将一定浓度范围的RGD掺入到基质中，以最佳方式支持细胞内生和细胞迁移。RGD之类的粘附位点的最佳浓度范围为0.04-0.05mM，再更优选为0.05mM，尤其是对于水含量在平衡浓度和水吸收终止后92％(重量)之间的基质而言。
一个优选实施方案是含生物活性因子、4个臂的聚乙二醇和0.050mM RGD的补充基质，所述聚乙二醇具有约20,000Da的分子量，与蛋白酶降解位点GCRPQGIWGQDRC(SEQ ID NO：7)交联；该基质表现出特别好的细胞内生结果和骨缺损愈合。优选地，所述基质含共价结合至所述基质的PTH 1-34。PEG和肽的起始浓度低于所述分子和水(溶胀前)的总重的10％(重量)。凝胶具有可用的一致性，使成骨细胞和前体细胞可容易地浸润基质。
C.生物活性因子
生物活性因子是用于治疗不健康骨如骨质疏松和骨囊肿的特定骨缺损区域的活性成分。已令人惊奇地发现，特定生物活性因子，即PTH和BMP，特别是PTH1-34、BMP2和BMP7，适于局部治疗骨质疏松性骨和骨区域以及骨囊肿和骨肿瘤区域。在过去已研究了这些骨因子的系统治疗。但是，就骨缺损治疗而论，没有提示它们可为局部施用制剂的活性成分。业已发现，当这些生物活性因子掺入到可注射基质制剂中并注射入不健康骨的特定骨缺损区域中时，它们增加该骨区域的骨密度。优选地，生物活性因子共价连接至上述基质，因此确保了生物活性因子的可控释放。生物活性因子可为融合肽的形式，该融合肽在第一个结构域中含所述生物活性因子，并在第二个结构域中含可共价交联的底物结构域。可选地，降解位点位于第一个和第二个结构域之间。
a.PTH
本文使用的术语“PTH”包括PTH1-84的人序列，以及在共价结合至生物可降解的天然或合成基质时表现出骨形成特性的所有截短、修饰和等位基因形式的PTH。优选的截短形式的PTH是PTH1-38、PTH1-34、PTH1-31、PTH1-28或PTH1-25。最优选的是PTH1-34。优选地，PTH是人PTH，但其它来源的PTH如牛PTH可能是适合的。
b.BMP
骨形态发生蛋白可为任意已知的BMP或表现出骨形成特性的任意修饰的或等位基因形式的BMP。特别优选BMP 2和BMP 7。
BMP 2
本文使用的术语“BMP 2”包括BMP 21-396的人序列，以及在共价结合至生物可降解的天然或合成基质时表现出相似生物活性的所有截短、修饰和等位基因形式的BMP 2。优选的截短形式的BMP 2是BMP 2283-396。优选地，BMP 2是人BMP 2，但其它来源的BMP 2可能是合适的，特别是来自小鼠和大鼠的BMP 2，因为人、小鼠或大鼠的BMP 2的氨基酸序列同一性为100％。
BMP 7
本文使用的术语“BMP 7”包括BMP 71-431的人序列，以及在共价结合至生物可降解的天然或合成基质时表现出相似生物活性的所有截短、修饰和等位基因形式的BMP 7。优选的截短形式的BMP 7是BMP 7293-431。优选地，BMP 7是人BMP 7，但其它来源的BMP 7可能是合适的，特别是来自小鼠的BMP 7，因为人和小鼠的BMP 7的氨基酸序列同一性为98％。
c.融合蛋白
可交联的底物结构域
融合肽包含至少两个结构域，其中第一个结构域包含生物活性因子，而第二个结构域包含可在基质形成之前、形成期间或形成之后交联至基质的底物结构域。底物结构域可为用于酶的结构域，优选为谷氨酰胺转移酶的底物结构域(“谷氨酰胺转移酶底物结构域”)，更优选为组织谷氨酰胺转移酶的底物结构域(“组织谷氨酰胺转移酶底物结构域”)，最优选其为XIIIa因子的底物结构域(“XIIIa因子底物结构域”)。
谷氨酰胺转移酶催化结合谷氨酰胺酰基残基的蛋白的γ-氨甲酰基与赖氨酸的ε-氨基之间的酰基转移反应，导致形成N-ε-(γ-谷氨酰胺酰基)赖氨酸异肽侧链桥。融合肽的氨基酸序列可设计为还包含酶切位点或水解切割位点，因此所述生物活性因子可在对一级结构基本没有或没有修饰的情况下被释放。倘若合成分子中存在可用的(pending)伯氨基，谷氨酰胺转移酶底物结构域和特别是XIIIa因子底物结构域，适于连接融合肽至纤维蛋白基质，也适于连接融合肽至合成基质。当与纤维蛋白基质一起使用时，融合肽中的降解位点优选为可酶降解的，使得PTH的释放受控于细胞特异性过程，例如局部蛋白水解。
可交联底物结构域可包括GAKDV(SEQ ID NO：8)、KKKK(SEQID NO：9)、YRGDTIGEGQQHHLGG(SEQ ID NO：10)或NQEQVSPL(SEQ ID NO：2)。
最优选的XIIIa因子底物结构域具有氨基酸序列NQEQVSPL(SEQ ID NO：2)，在本文称为“TG”和TG-PTH。
PTH融合肽可重组产生，或通过化学合成产生。PTH 1-34融合肽优选通过化学合成产生。BMP融合肽优选通过细菌处理重组生产。
为将PTH、BMP 2或BMP 7掺入由合成前体组分形成的基质中，还可在合成时掺入具有至少一个额外的半胱氨酸基团(-SH)的PTH或BMP融合肽或任意其它肽，所述半胱氨酸基团(-SH)优选在作为可交联底物结构域的PTH1-34、BMP 2或BMP 7的N端。半胱氨酸可直接连接至PTH1-34、BMP 2或BMP 7，或通过连接序列连接。连接序列可额外地包含可酶降解或水解降解的氨基酸序列，使得PTH、BMP 2或BMP 7可通过基本天然形式的酶由基质切割下来。在迈克尔加成反应中，游离半胱氨酸基团与前体组分的共轭不饱和基团反应。半胱氨酸的巯基可与在合成聚合物上的共轭不饱和键反应，形成共价键。
这些位点可通过非特异性水解降解(即酯键)，或者它们可为特定酶(蛋白水解降解或多糖降解)降解的底物。降解位点允许在对一级肽序列基本没有或没有修饰的情况下释放PTH、BMP 2或BMP 7，这可产生更高活性的因子。另外，其使因子的释放受控于细胞特异性过程。这使得可根据材料内细胞的位置在相同的材料内以不同的速率释放因子。这还减少了所需的总PTH1-34、BMP 2或BMP 7的量，因为其释放受控于细胞过程。在针对用掺入并优选结合至基质的PTH强愈合上述骨缺损的一种可能的解释中，认为PTH在延长的时间段内(即不仅仅是单次脉冲剂量)但不以连续的方式施用是重要的。这通过利用基质的酶切或水解切割的缓慢降解来实现。随后以此方式通过发生在持续的时间段内的假脉冲作用传递分子。当前成骨细胞浸润基质时，其将遭遇PTH分子，PTH分子诱导前成骨细胞进一步增殖并合成多种对新骨形成关键的生长因子。但是，如果该特定细胞不连续地由基质释放结合的PTH，则其不会开始生产白介素-6，由此避免了对破骨细胞形成的晚期异化作用。然后，最终结果是较高的骨盐密度和最终形成骨基质。最后，肽的治疗性作用被定位于缺损区中，随后被放大。
融合肽的降解位点
酶解或水解降解位点可存在于融合肽的第一个和第二个结构域之间。降解位点可通过特异性酶降解来降解。优选地，降解位点可被选自纤溶酶和基质金属蛋白酶的酶裂解。通过仔细选择该酶降解位点的Km和kcat，可控制降解在基质形成之前或之后发生，和/或通过使用相似或不相似的酶降解基质而发生。这些可降解位点允许对生物活性因子由基质的更特异性释放进行改造。可降解位点可通过由侵入基质的细胞释放的酶切割。可降解位点允许基质内不同位置的传递速率随在该位置和/或基质中的细胞活性而变化。额外的利益包括传递系统内较低的总药物剂量和对释放的空间调节，该空间调节允许在最大细胞活性时释放较大百分率的药物。降解位点在本文被缩写为“pl”。蛋白水解可降解的位点可包括胶原酶、纤溶酶、弹性蛋白酶、溶基质蛋白酶或纤溶酶原激活物的底物。代表性的底物列于以下。N1-N5表示由发生蛋白水解的位点朝向蛋白氨基端的1-5个氨基酸位置。N1′-N4′表示由发生蛋白水解的位点朝向蛋白羧基端的1-4个氨基酸位置。
表1：蛋白酶底物序列的样本
| 蛋白酶 | N5 | N4 | N3 | N2 | N1 | N1′ | N2′ | N3′ | N4′ | SEQID NO |
| 纤溶酶1 | L | I | K | M | K | P | SEQ IDNO： | |||
| 纤溶酶1 | N | F | K | S | Q | L | SEQ IDNO： | |||
| 溶基质蛋白酶2 | Ac | G | P | L | A | L | T | A | L | SEQ IDNO： |
| 溶基质蛋白酶2 | Ac | P | F | E | L | R | A | NH2 | SEQ IDNO： | |
| 弹性蛋白酶3 | Z- | A | A | F | A | NH2 | SEQ IDNO： | |||
| 胶原酶4 | G | P | L | G | I | A | G | P | SEQ IDNO： | |
| t-PA5 | P | H | Y | G | R | S | G | G | SEQ IDNO： | |
| u-PA5 | P | G | S | G | R | S | A | S | G | SEQ IDNO： |
参考文献：
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5.Coombs等，1998.J.Biol.Chem.273：4323-4328
在一个优选实施方案中，序列YKNR(SEQ.NO：11)位于第一个结构域和第二个结构域之间，使连接的纤溶酶可降解。
特别优选的PTH融合肽是TGplPTH：NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF(SEQ ID NO：12)。
可用于蛋白水解降解的酶为数众多。蛋白水解可降解的位点可包括胶原酶、纤溶酶、弹性蛋白酶、溶基质蛋白酶或纤溶酶原激活物的底物。
在另一个优选实施方案中，寡酯结构域可插入第一个和第二个结构域之间。这可使用寡酯如乳酸寡聚物完成。
用于掺入的融合蛋白的设计
优选的融合蛋白包括：
TG-PTH1-34：这是一种修饰形式的PTH，含天然PTH的氨基酸1-34，以及TG(谷氨酰胺转移酶)底物结构域：NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF(SEQ ID NO：13)。
TG-pl-PTH1-34：该形式对应于TG-PTH，只是其在TG序列和PTH1-34之间额外含有纤溶酶可降解序列(pl)：NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF(SEQ ID NO：12)。
TG-BMP 2283-396：这是一种修饰形式的BMP 2，含天然PTH的氨基酸283-396以及TG(谷氨酰胺转移酶)底物结构域：Met-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Pro-Val-Glu-Leu-Pro-Leu-Ile-Lys-Met-Lys-Pro-His-BMP 2283-396(SEQ ID NO：14)。
基质或前体组分和生物活性因子的组合
在一个优选实施方案中，补充的合成或纤维蛋白基质(相应地其前体溶液)包含基质和PTH或PTH融合肽，浓度范围优选在0.01-2mgPTH或PTH融合肽/ml基质或形成基质的前体组分之间，优选在0.02-1.0mg PTH或PTH融合肽/ml基质或形成基质的前体组分之间，更优选在0.03-0.5mg PTH或PTH融合肽/ml基质或形成基质的前体组分之间，最优选在0.05-0.2mg PTH或PTH融合肽/ml基质或形成基质的前体组分之间的范围内。根据患者年龄，优选一定子范围的PTH浓度或PTH融合肽浓度。如果补充基质应用于治疗儿童骨缺损，则PTH或PTH融合肽的浓度优选在0.01-0.35mg PTH或PTH融合肽/mL基质或形成基质的前体组分的范围内，最优选在0.05-0.15mgPTH或PTH融合肽/mL基质或形成基质的前体组分的浓度范围内。然而，如果制剂应用于在成年人中局部增加骨质疏松性骨的骨密度，则优选的PTH或PTH融合肽的浓度在0.5-2mg PTH或PTH融合肽/mL基质或形成基质的前体组分的范围内，更优选在0.7-1.5mg PTH或PTH融合肽/mL基质或形成基质的前体组分之间，最优选在0.9-1.1mg PTH或PTH融合肽/mL基质或形成基质的前体组分之间。在一个优选实施方案中，所述基质是纤维蛋白基质。
II.掺入和/或释放生物活性因子的方法
在向基质中掺入生物活性因子如PTH或BMP或融合肽的一个优选实施方案中，生物活性因子将在基质胶凝期间物理地或化学地掺入基质中。对于纤维蛋白基质而言，XIIIa因子是在凝结为纤维蛋白的过程中有活性的谷氨酰胺转移酶。该酶如下由XIII因子天然形成：通过凝血酶裂解，或者如果需要更高浓度的话另外加入到纤维蛋白前体溶液中，该酶起作用而经谷氨酰胺侧链和赖氨酸侧链之间形成的酰胺键起将纤维蛋白链彼此连接。该酶还用于在凝结过程中连接其它肽至纤维蛋白。具体地说，已表明序列NQEQVSPL(SEQ IDNO：2)用作XIIIa因子的有效底物。对于合成基质而言，融合肽应为能够与前体组分的官能团反应的官能团，所述前体组分在机体内于生理条件下形成合成基质。例如，如果前体分子含丙烯酸酯基团，则融合肽应含在迈克尔加成反应中与丙烯酸酯基团反应的游离巯基。根据生物活性因子的性质，还有可能混合未修饰的因子，以实现由基质持续释放。
III.应用方法
补充基质可在注射分开的前体组分时于所需部位原位形成，或者可预制，然后植入所需部位。根据适应症，补充基质在不同胶凝阶段施用或注射。如果将基质注射入骨囊肿中，则其优选刚好在前体溶液混合后施用，即以仍为液体的状态施用。如果补充基质注射在受骨质疏松侵袭的不健康骨的区域，则它们优选以预胶凝状态注射。混合前体溶液，在胶凝后(通常在约30秒至2分钟后)将凝胶通过粗针头注射入骨中的受侵袭区域。这样做是为了防止仍为液体的基质渗漏入血液循环中。
对于某些适应症，可能需要观察所述材料在注射过程中于其施用的骨区域中的分布。在一个优选实施方案中，将X射线造影剂，优选可溶于基质材料中的造影剂，加入到基质前体材料中。
一般来说，造影剂被分类为离子型造影剂和非离子型造影剂。优选非离子型造影剂，但也可使用离子型造影剂。优选含碘的X射线造影剂。
优选的非离子型造影剂包括碘克沙醇(iodixanol)、碘海醇(iohexol)、碘异帕(iopamidol)、碘喷托(iopentol)、碘普胺(iopromide)、碘美普尔(iorneprol)、碘西胺(iosimide)、碘酞硫(iotasul)、碘曲仑(iotrolan)、碘佛醇(ioversol)、碘昔兰(ioxilan)和甲泛葡胺(metrizamide)。最优选的非离子型造影剂是碘海醇(CAS No.66108-95-0)。如果加入碘海醇以在荧光镜透视或X射线下显现凝胶，则基质优选含100-600mg碘海醇/ml基质或形成基质的前体溶液，更优选含250-500mg碘海醇/ml基质或形成基质的前体溶液，最优选含300-450mg碘海醇/ml基质或形成基质的前体溶液。
优选的离子型造影剂包括泛影酸(diatrizoate)、碘苯扎酸(iobenzamate)、碘卡酸(iocarmate)、碘西他酸(iocetamate)、碘达胺(iodamide)、胆影酸(iodipamide)、碘沙酸(iodoxamate)、碘格利酸(ioglicate)、碘甘卡酸(ioglycamate)、碘番酸(iopanoate)、碘苯酯(iophendylate)、碘普罗酸(iopronate)、碘丝酸(ioserate)、碘拉他酸(iothalamate)、碘曲西酸(iotroxate)、碘克沙酸(ioxaglate)、碘羟拉酸(ioxithalamate)和甲泛影酸(metrizoate)。
造影剂是商品化的，可容易地合成，这对本领域技术人员来说是众所周知的。
可用本领域一般使用的方法实现对造影剂的监测，例如通过X射线、磁共振成像(MRI)或超声成像。众所周知的是，造影剂的作用是改变它们所分布的机体部位的X射线吸收特征，改变水质子的弛豫时间并因此可通过磁共振成像观察，或改变它们所分布的机体部位中的音速或密度。按照本发明，优选使用可通过X射线成像监测的造影剂。
如本文所述，可以不同胶凝阶段注射入机体中的补充基质制剂可在机体中或机体上原位胶凝。在另一个实施方案中，补充基质可在机体外形成，然后以预制形状施用。不考虑所用前体组分的种类，前体组分应在将混合物施用于机体之前分开，以防止在允许所述组分聚合或胶凝的条件下彼此组合或接触。为防止在施用前接触，可使用将混合物彼此分开的试剂盒。在允许聚合的条件下混合时，组合物形成补充生物活性因子的三维网络。根据前体组分及其浓度，胶凝可在混合后类似即时地发生。
在一个实施方案中，所述基质由纤维蛋白原形成。纤维蛋白原在与凝血酶和钙源于合适的温度和pH接触时通过一连串的不同反应胶凝而形成基质。纤维蛋白原、凝血酶和钙源这3种组分应分别储存。但是，只要3种组分中的至少一种保持独立，另两种组分就可在施用前混合。
在一个实施方案中，纤维蛋白原溶解(其可另外含抑肽酶，以增加稳定性)在生理pH(在pH 6.5-8.0的范围内，优选在pH 7.0-7.5的范围内)的缓冲溶液中，以形成第一种前体溶液，并独立于含凝血酶的氯化钙缓冲液储存(例如40-50mM的浓度范围)。纤维蛋白原的缓冲溶液可为优选浓度为50mM的组氨酸缓冲溶液，额外包含优选浓度为150mM的NaCl，或者可为TRIS缓冲盐水(优选33mM浓度)。
在一个优选实施方案中，试剂盒含融合蛋白、纤维蛋白原、凝血酶和钙源。可选地，所述试剂盒可含交联酶，例如XIIIa因子。融合蛋白含有生物活性因子、交联酶底物结构域，并可选地在底物结构域和生物活性因子之间含降解位点。融合蛋白可存在于纤维蛋白原或凝血酶前体溶液中。在一个优选实施方案中，纤维蛋白原前体溶液含所述融合蛋白。
所述溶液优选通过双路注射器装置混合，在所述双路注射器装置中，通过混合室和/或针和/或静态混合器挤压两个注射器中的内容物发生混合。
在一个优选实施方案中，纤维蛋白原和凝血酶均独立地以冻干形式储存。两种中的任一种均可含有生物活性因子，其优选为融合蛋白。在使用前，向纤维蛋白原中加入tris缓冲液或组氨酸缓冲液，所述缓冲液可另外含抑肽酶。冻干的凝血酶溶解在氯化钙溶液中。随后，纤维蛋白原和凝血酶溶液置于独立的容器/管形瓶/注射管中，并通过双路连接装置如双路注射器混合。可选地，容器/管形瓶/注射管是两分的，因此具有由垂直于注射管壁的可调隔断分开的两个室。其中一个室含冻干纤维蛋白原或凝血酶，而另一个室含合适的缓冲溶液。当下压柱塞时，隔断移开，并释放缓冲液进入纤维蛋白原室中，以溶解纤维蛋白原。纤维蛋白原和凝血酶这二者一溶解，就将两个两分的注射管连接至双路连接装置，通过连接至连接装置的注射针挤压内容物而使内容物混合。可选地，连接装置含静态混合器，以提升内容物的混合。
在一个优选实施方案中，在混合前纤维蛋白原稀释8倍，凝血酶稀释20倍。该比率产生约1分钟的胶凝时间。
在另一个优选实施方案中，补充基质由能够进行Michael加成反应的合成前体组分形成。因为亲核前体组分(多巯基)仅与多受体组分(共轭不饱和基团)于碱性pH反应，所以在混合前必须分开储存的3种组分是：碱、亲核组分和多受体组分。多受体组分和多巯基组分均作为在缓冲液中的溶液储存。两种组合物都可包含细胞附着位点，并额外地包含生物活性分子。因此，所述系统的第一种组合物例如可包含亲核组分溶液，所述系统的第二种组合物可包含多受体组分的溶液。两种组合物中的任一种或这二者都可包含碱。在另一个实施方案中，多受体和多巯基可作为溶液包含在第一种组合物中，第二种组合物可包含碱。连接和混合可以和先前对纤维蛋白原的描述相同的方式发生。两分注射管同样适于合成前体组分。多受体和多巯基组分可代替纤维蛋白原和凝血酶以粉末化形式储存在其中一个室中，另一个室含碱性缓冲液。
另外，除了上述成分以外的其它组分也可掺入到本发明的系统中。例如，可使用含钙矿物质的材料，即含钙离子的天然均一物质，如羟磷灰石。
尽管已就优选实施方案描述了组合物和方法，但对本领域技术人员显而易见的是，可在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下。对所述组合物、方法和本文所述方法的步骤或步骤次序加以改变。
实施例
实施例1：PTH1-34和TGplPTH1-34的生物活性
PTH1-34肽显示出与全长PTH1-84相似的活性，该长度的蛋白可通过标准固态肽合成法合成。
所有肽都使用自动化肽合成仪使用标准9-芴基甲氧羰基化学法在固体树脂上合成。肽通过c18色谱纯化，并使用经由HPLC的反相层析分析，以测定纯度，以及使用质谱测定法(MALDI)分析，以鉴定各个产物的分子量。使用该方法，合成PTH1-34以及TG-pl-PTH1-34(NQEQ
VSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF(SEQ ID NO：12)和TGPTH1-34(NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF(SEQ ID NO：13))。TGplPTH1-34和TGPTH1-34与PTH1-34的不同之处在于其额外含XIIIa因子底物结构域，对于TGplPTH1-34而言，该结构域经纤溶酶可降解pl-序列YKNR(SEQ ID NO：15)连接至PTH1-34，对于TGPTH1-34而言，该结构域直接连接至PTH1-34。
为研究PTH融合肽的生物活性，建立报告基因测定。在该测定中，将含萤光素酶报告基因的质粒转染入细胞中，其中所述萤光素酶报告基因连接至甲状旁腺激素受体的启动子。然后，如果所述细胞接触PTH并且PTH随后结合细胞上的其受体，则启动通过cAMP水平提升引导的信号级联。通过天然反馈调节，其随后导致PTH受体水平下降。因为下降被传导至启动子，所以其随后又导致连接的报告基因的生产下降。使用该测定，研究天然PTH1-34以及TG-pl-PTH1-34这二者的活性，并与国际标准品对比。观察到这两种分子都显示出相似的活性水平，因为这二者的报告基因表达的下降相同，该活性水平与国际标准品的活性水平相同。结果示于图1。
实施例2：由纤维蛋白基质释放PTH
纤维蛋白基质由TISSEEL试剂盒(Baxter AG，CH-8604Volketswil/ZH)纤维蛋白前体组分制备。组合物列于表2。在存在0.1μg/ml PTH1-34或TGPTH1-34的情况下，则将它们加入凝血酶中并混合，以形成均一浓度。TGPTH1-34仅在氨基末端具有谷氨酰胺转移酶序列，没有降解位点。因此，TGPTH1-34仅可通过纤维蛋白基质自身降解而被释放。该肽如以上实施例1所述合成。
对于首个释放测定，将含0.1mg PTH或TGPTH/ml纤维蛋白基质的50μl纤维蛋白基质于37℃在10ml缓冲液中温育。因此，就总释放而言，缓冲液中的PTH或TGPTH的浓度应为0.5μg PTH或TGPTH/mL纤维蛋白基质。为了对比测定过程中的PTH或TGPTH的稳定性，将PTH或TGPTH样品在缓冲液中直接稀释至0.5μg PTH或TGPTH/mL纤维蛋白基质的浓度。测试不同的缓冲液：蒸馏水、磷酸缓冲盐水、tris-缓冲盐水。
在第0、1、2、4和6天取等份样品，并通过直接ELISA分析。结果表明，PTH在任一种缓冲液中稳定不超过2天。因此，对释放数据不能做出结论。PTH稳定性无疑受到其低浓度和非最适缓冲液的影响。
使用含50mM甘露醇的10mM乙酸钠缓冲液的稳定缓冲液重复释放实验。另外，每2天更换一次缓冲液，以防止任何肽降解。PTH或TGPTH的浓度增加至1mg PTH或TGPTH/mL纤维蛋白基质的100μl纤维蛋白基质溶液，在1ml缓冲液中实现温育。就总释放而言，缓冲液中的PTH或TGPTH的浓度应为100μg/mL纤维蛋白基质(多达以前的200倍)。如在第一个实验中一样，制备添加样品(相同量的PTH或TGPTH溶解在缓冲液中作为对照)，以评价实验过程中PTH或TGPTH的稳定性(100μg/ml)。样品在2周内每2-4天收集1次(同时更换缓冲液)，并通过直接ELISA分析。还每2天收集1次添加样品。结果表明，在这些条件下，PTH和TGPTH在2周内稳定。
由图2可见，纤维蛋白基质的大释放在3天内达到。大约60％的PTH和13％的TGPTH在3天后释放。这些数据表明，纤维蛋白基质中的PTH保留通过加入TG序列而得到很大增强。
实施例3：合成含PTH融合肽的补充纤维蛋白基质
纤维蛋白基质由TISSEEL试剂盒(Baxter AG，CH-8604Volketswil/ZH)开始形成，产生4mL纤维蛋白基质。TISSEEL由人源混合血浆生产，活性成分的含量可在批料之间于预定范围内变化。
表2列出了使用的最终组成。
表2：含TISSEEL和活性组分的最终组成
| 成分 | 剂量/2ml凝胶 |
| 注射器1 | |
| 活性组分PTH1-34融合肽(TGplPTH1-34) | 0.2-20mg |
| 凝结剂纤维蛋白原其它蛋白抑肽酶(牛)人白蛋白缓冲组分烟酰胺L-组氨酸柠檬酸钠聚山梨醇酯80注射用水 | 66-100mg2046-3409KIE9.1-18.2mg2.7-8.2mg9.1-22.7mg4.4-8.8mg0.6-1.7mg至1mL |
| 注射器2 | |
| 凝结剂凝血酶(人)缓冲组分氯化钙氯化钠蛋白(人血清白蛋白)注射用水 | 2.5-6.5I.U.5.88±0.6mg3.5-5.5mg45-55mg至1mL |
纤维蛋白原悬浮在含抑肽酶的溶液中，抑肽酶是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，有助于减少纤维溶解，以保持纤维蛋白基质的完整性。将该溶液注入双路注射器的第一个室(注射器1)中。凝血酶的氯化钙溶液在双路注射器的第二个室(注射器2)中单独提供。纤维蛋白密封剂还包含其它纤维蛋白支架组分，诸如血浆纤连蛋白、XIII因子、纤溶酶原和人白蛋白。将TGpl-PTH1-34配制成纤维蛋白原组分，以获得在基质中0.1mg/mL至10mg/mL的基质中终浓度。使用的确切组分在表2中给出。
当纤维蛋白原和凝血酶组分以等体积混合时，发生凝结过程，形成一种天然的胞外基质-纤维蛋白。在胶凝过程中，TGpl-PTH1-34与基质交联。凝结过程在45-60秒之内发生，这使得可以通过混合器尖端将液体同时注入凝胶在其中固化的缺损中。
实施例4：使用交联至可注射纤维蛋白基质的PTH1-34治疗马中的软骨下囊肿病灶
马中的软骨下骨囊肿是与人中的单腔骨囊肿相似的临床实体，因此一直用作评价PTH1-34交联至纤维蛋白基质的愈合潜力的模型。
对12匹马(12个囊肿)进行手术，由此通过吸刮术去除囊肿内容物。囊肿位于前肢以及后肢的不同关节中。
将含等体积纤维蛋白原和凝血酶的实施例3组合物与终浓度为10、1和0.4mg/mL的TGplPTH1-34一起注射入SCL中，并令其原位聚合。使用平均体积2mL的补充基质填充缺损，体积在0.2-5mL补充基质的范围内。马的年龄在2个月至11岁的范围内。于手术后2、4、6和12个月进行随访，调查射线照相愈合以及临床愈合。
病灶内施用产生非常好的SCL愈合。分析所有的马，所有的马在临床愈合和射线照相愈合方面均显示出显著进展。射线照相愈合由较高的囊肿内容物浓度和囊肿尺寸减小反映，并在手术后2-6个月发生，趋势是在较低浓度的PTH1-34愈合较快。几乎所有马在手术后仅2-4个月之后都有临床愈合，因此再也没有显示出跛行。
这些结果特别令人鼓舞，因为在已知骨再生预后特别不良的3岁或以上年龄的成年马中实现了成功愈合。
0.4-10mg/mL的浓度已显示出有效，趋势是较低浓度愈合较好。
用含较低剂量的TGplPTH1-34(0.1mg/mL)的补充基质治疗也已显示出促进SCL愈合。
表3：一般患者信息和SCL部位
| 内部编号 | 品种 | 性别 | 年龄 | SCL部位 |
| 1 | Inlnder | 母马 | 1岁 | 第一趾骨/前左系关节 |
| 2 | Inlnder | 母马 | 10岁 | 胫骨(cannon bone)/前右球关节 |
| 3 | Württemberger | 母马 | 11岁 | 右桡骨 |
| 5 | Pinto | 母马 | 3岁 | 膝/右后膝关节 |
| 7 | VolIbult | 母马 | 3岁 | 籽骨/前右球关节 |
| 12 | Oldenburger | 母马 | 3岁 | 籽骨/前左球关节 |
| 13 | Inlnder | 母马 | 3岁 | 股骨/右后膝关节 |
| 15 | Inlnder | 母马 | 2个月 | 骨髓炎股骨/右后膝关节 |
| 16 | Inlnder | 阉畜 | 2个月 | 骨髓炎股骨/右后膝关节 |
| 18 | Araber | 阉畜 | 5岁 | 胫骨/前左球关节 |
| 19 | Inlnder | 公马 | 3岁 | 胫骨/前右球关节 |
| 20 | Inlnder | 阉畜 | 9岁 | 跟骨、右跗关节 |
表4：治疗前和治疗当中的跛行等级
| 内部编号 | 纤维蛋白基质中的TGplPTH1-34[mg/mL] | 临床愈合(跛行等级) | ||||
| 治疗前 | 2个月 | 4个月 | 6个月 | 12个月 | ||
| 2 | 10 | 3 | 2 | 愈合 | 愈合 | 愈合 |
| 1 | 1 | 3-4 | 1 | 愈合 | - | 愈合 |
| 3 | 1 | 2 | 愈合 | 愈合 | - | - |
| 5 | 1 | 3 | 愈合 | - | 愈合 | |
| 7 | 1 | 2 | 1 | 愈合 | - | |
| 19 | 1 | 1 | 愈合 | 愈合 | ||
| 12 | 0.4 | 3 | 愈合 | 愈合 | - | |
| 13 | 0.4 | 2 | 愈合 | - | ||
| 15 | 0.4 | 5 | 2 | - | 愈合 | |
| 16 | 0.4 | 4 | 1 | |||
| 18 | 0.4 | 1 | 愈合 | |||
| 20 | 0.4 | 3 | - | 1 | ||
愈合＝无跛行存在
-＝无对照观察
使用在表5中陈述的标准对跛行分级。
表5：跛行等级和对应标准
| 跛行等级 | 标准 |
| 1-较轻，不明显 | 跛行始终不明显：行走时无跛行，仅小跑不稳定 |
| 2-较轻，明显 | 在特定环境中跛行始终明显：行走时无跛行，小跑每一步都跛行 |
| 3-中等 | 跛行始终明显：行走和小跑时均明显跛行 |
| 4-高度跛行 | 严重跛行 |
| 5-最高度跛行 | 不再能负重 |
实施例5：兔松质骨(Trabecular bone)模型
为了研究纤维蛋白-TGplPTH诱导松质骨的骨内增厚潜力，建立兔模型。将150μl几种剂量的TGplPTH的纤维蛋白溶液注射入16只新西兰白兔的股骨远端。麻醉兔，暴露股骨髁。钻一个通过皮质骨进入髁侧的小孔，将所述材料通过连接1mL注射器的22G针头导入骨中。测试剂量为0、0.1、0.4和1.0mg TGplPTH1-34/mL纤维蛋白基质，每只兔的对侧腿为未治疗对照。在8周后，处死动物，对股骨髁进行μCT，以评价治疗后的骨密度。骨密度在用1mg TGplPTH1- 34/mL纤维蛋白基质治疗后增加约10％。
实施例6：注射入绵羊骨的不透射线的纤维蛋白的显现、监测和操作实验
为了在荧光镜透视和X射线下显现骨内纤维蛋白基质的流动，将基于碘的造影剂碘海醇掺入纤维蛋白基质中。将600-800mg的碘海醇溶解入凝血酶前体溶液中，以产生300-400mg碘海醇/mL纤维蛋白基质的终浓度。测试凝血酶前体组合物中的凝血酶范围(4-10U/mL)。纤维蛋白基质的其它组分如表2所述。
胶凝测试表明，形成凝胶需要较高浓度的凝血酶。两种为液体的组分经双注射器和置于骨中的针头同时注射入绵羊椎骨和股骨远端，并令其原位聚合。使用X射线和荧光镜透视可清楚显现凝胶。
实施例7：预先聚合的纤维蛋白注射入绵羊骨、显现和操作试验
为了在荧光镜透视和X射线下于骨内显现预先聚合的纤维蛋白基质和测试其操作，将基于碘的造影剂碘海醇掺入凝胶中。将600-800mg的碘海醇溶解入凝血酶稀释缓冲液中，以产生300-400mg碘海醇/mL纤维蛋白基质的终浓度。将凝血酶前体以75U/mL缓冲溶液的浓度加入到缓冲液-碘海醇溶液中。纤维蛋白基质的其它组分如表2所述。
胶凝测试表明，在含凝血酶和纤维蛋白原组分的前体组分混合时快速形成基质。两种前体溶液作为液体同时注射入带螺纹的第三个注射器中，并令其完全聚合。通过置于骨中的大针头将含造影剂的基质注射入绵羊脊椎中。使用X射线和荧光镜透视可清楚显现凝胶。
序列表
<110>SCHENSE，JASON
WATSON，JOHN
ARRIGHI，ISABELLE
<120>局部治疗骨缺损
<130>KUROS 132
<150>US 60/641,830
<151>2005-01-06
<150>US 60/642,848
<151>2005-01-10
<160>22
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
Tyr Ile Gly Ser Arg
1 5
<210>2
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
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1 5
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>3
Leu Arg Gly Asp Asn
1 5
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<213>Homo sapiens
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Pro Asp Gly Ser Arg
1 5
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<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
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1 5
<210>6
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>6
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1 5 10
<210>7
<211>13
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>7
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<400>8
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1
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<212>PRT
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<400>10
Tyr Arg Gly Asp Thr Ile Gly Glu Gly Gln Gln His His Leu Gly Gly
1 5 10 15
<210>11
<211>6
<212>PRT
<213>Homo spaiens
<400>11
Leu Ile Lys Met Lys Pro
1 5
<210>12
<211>6
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>12
Asn Phe Lys Ser Gln Leu
1 5
<210>13
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>乙酰化的
<222>(1)..(1)
<400>13
Gly Pro Leu Ala Leu Thr Ala Leu
1 5
<210>14
<211>6
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>乙酰化的
<222>(1)..(1)
<400>14
Pro Phe Glu Leu Arg Ala
1 5
<210>15
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapines
<400>15
Glx Ala Ala Phe Ala
1 5
<210>16
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>16
Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Pro
1 5
<210>17
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>17
Pro His Tyr Gly Arg Ser Gly Gly
1 5
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>18
Pro Gly Ser Gly Arg Ser Ala Ser Gly
1 5
<210>19
<211>4
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>19
Tyr Lys Asn Arg
1
<210>20
<211>46
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的甲状旁腺激素(PHT)，其包含天然PTH的氨基酸1-34以及谷氨酰胺转移酶底物结构域和纤溶酶可降解序列
<400>20
Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Tyr Lys Asn Arg Ser Val Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg
20 25 30
Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe
35 40 45
<210>21
<211>42
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的甲状旁腺激素(PHT)，其包含天然PTH的氨基酸1-34以及谷氨酰胺转移酶底物结构域
<400>21
Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met
1 5 10 15
His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu
20 25 30
Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe
35 40
<210>22
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>融合蛋白，其包含天然甲状旁腺激素的氨基酸283-396和谷氨酰胺转移酶底物结构域
<400>22
Met Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Pro Val Glu Leu Pro Leu Ile
1 5 10 15
Lys Met Lys Pro His
20
Claims (34)
1.一种制剂用于生产局部治疗不健康骨区域的药物的用途，所述制剂含生物活性因子或融合肽和能够在需要治疗的骨中部位形成基质的组合物，所述生物活性因子选自PTH和BMP，所述融合肽在第一个结构域中含PTH或BMP，在第二个结构域中含可共价交联的底物结构域。
2.权利要求1的用途，其中所述融合肽在基质形成过程中共价连接至所述基质。
3.权利要求1或2的用途，其中所述能够形成基质的组合物是可注射的。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述不健康骨区域选自受骨质疏松、骨囊肿和骨肿瘤侵袭的骨区域。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述融合肽还在第一个和第二个结构域之间包含降解位点。
6.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述PTH选自PTH1-84、PTH1-28、PTH1-34、PTH1-31和PTH1-25。
7.权利要求6的用途，其中所述PTH是PTH1-34。
8.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述BMP是BMP 2或BMP 7。
9.权利要求1-8中任一项的用途，其中所述融合肽的第二个结构域包含谷氨酰胺转移酶底物结构域。
10.权利要求9的用途，其中所述谷氨酰胺转移酶底物结构域是XIIIa因子底物结构域。
11.权利要求1-10中任一项的用途，其中所述能够形成基质的组合物包含纤维蛋白原、凝血酶和钙源。
12.权利要求1-11中任一项的用途，其中所述基质通过含n个亲核基团的第一种前体分子和含m个亲电子基团的第二种前体分子之间的迈克尔加成反应形成，其中n和m至少为2，n+m的和至少为5。
13.权利要求12的用途，其中所述亲电子基团是共轭不饱和基团，所述亲核基团选自硫醇和胺。
14.权利要求12的用途，其中所述前体组分是官能化聚乙二醇。
15.权利要求1-14中任一项的用途，其中所述融合肽的第二个结构域含至少一个半胱氨酸。
16.权利要求1-15中任一项的用途，其中所述能够形成基质的组合物含不止一种的组分，其中所述制剂在试剂盒中提供，在所述试剂盒中能够形成基质的组合物的至少一种组分与所述组合物的其它组分分开储存。
17.权利要求16的用途，其中所述试剂盒还包含交联酶。
18.一种制剂，所述制剂包含：
i)能够在生理条件下形成基质的组合物；
ii)PTH、BMP或融合肽，所述融合肽包含至少两个结构域，其中第一个结构域包含PTH或BMP，第二个结构域包含可交联底物结构域；和
iii)造影剂。
19.权利要求18的制剂，其中所述PTH是PTH1-34。
20.权利要求18或19的制剂，其中所述能够形成基质的组合物包含纤维蛋白原、凝血酶和钙源。
21.权利要求18-20中任一项的制剂，其中能够形成基质的组合物包含含n个亲核基团的第一种前体分子和含m个亲电子基团的第二种前体分子，其中n和m至少为2，n+m的和至少为5。
22.权利要求18-21中任一项的制剂，其中所述造影剂选自泛影酸、碘苯扎酸、碘卡酸、碘西他酸、碘达胺、胆影酸、碘沙酸、碘格利酸、碘甘卡酸、碘番酸、碘苯酯、碘普罗酸、碘丝酸、碘拉他酸、碘曲西酸、碘克沙酸、碘羟拉酸和甲泛影酸。
23.权利要求22的制剂，其中所述造影剂是碘海醇。
24.权利要求18或23中任一项的制剂，其中所述能够形成基质的组合物包含不止一种组分，其中所述制剂以试剂盒提供，在所述试剂盒中能够形成基质的组合物的至少一种组分与所述组合物的其它组分分开储存。
25.一种补充基质，所述补充基质包含天然和合成的基质材料、选自PTH和BMP的生物活性因子以及造影剂。
26.权利要求25的补充基质，其中补充基质由能够形成基质的组合物和融合肽形成，所述融合肽在第一个结构域中包含生物活性因子，在第二个结构域中包含可共价交联的底物结构域。
27.权利要求25或26的补充基质，其中所述PTH选自PTH1-84、PTH1-28、PTH1-34、PTH1-31和PTH1-25。
28.权利要求27的补充基质，其中所述PTH是PTH1-34。
29.权利要求25-28中任一项的补充基质，其中所述BMP是BMP2或BMP 7。
30.权利要求26-29中任一项的补充基质，其中所述融合肽的第二个结构域包括谷氨酰胺转移酶底物结构域。
31.权利要求30的补充基质，其中所述谷氨酰胺转移酶底物结构域是XIIIa因子底物结构域。
32.权利要求25-31中任一项的补充基质，其中所述基质材料包含纤维蛋白。
33.权利要求25-32中任一项的补充基质，其中所述基质材料通过含n个亲核基团的第一种前体分子和含m个亲电子基团的第二种前体分子之间的迈克尔加成反应形成，其中n和m至少为2，n+m的和至少为5。
34.一种试剂盒，所述试剂盒含纤维蛋白原、凝血酶、钙源、选自PTH和BMP的生物活性因子以及造影剂。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64183005P | 2005-01-06 | 2005-01-06 | |
| US60/641,830 | 2005-01-06 | ||
| US60/642,848 | 2005-01-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN101141976A true CN101141976A (zh) | 2008-03-12 |
Family
ID=39193535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2006800073311A Pending CN101141976A (zh) | 2005-01-06 | 2006-01-06 | 用释放bmp或pth的基质局部治疗骨缺损 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101141976A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108472243A (zh) * | 2015-10-20 | 2018-08-31 | 恩纳斯医药有限公司 | 固体制剂 |
-
2006
- 2006-01-06 CN CNA2006800073311A patent/CN101141976A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108472243A (zh) * | 2015-10-20 | 2018-08-31 | 恩纳斯医药有限公司 | 固体制剂 |
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