BRPI0215192B1 - peptídeo de fusão, kit e matriz que compreendem o mesmo, e método para criar uma matriz - Google Patents

Abstract

"matrizes de proteína modificadas pelo fator de desenvolvimento para construção do tecido". proteínas são incorporadas em matrizes de proteína ou polissacarídeo para uso em reparo, regeneração e/ou remodelagem de tecido e /ou liberação de droga. as proteínas podem ser incorporadas para que elas sejam liberadas por degradação da matriz, por difusão e/ou ação enzimática. como demonstrado pelos exemplos, um método é para ligar heparina à matriz por métodos ou covalentes ou não-covalentes, para formar uma matriz de heparina. a heparina, em seguida, liga não-covalentemente fatores de desenvolvimento de ligação de heparina à matriz de proteína. alternativamente, uma proteína de fusão pode ser construída a qual contém uma região de reticulação, tal como um substrato de fator xiiia e a seqüência de proteína natural. a incorporação de ligações degradáveis entre a matriz e os fatores bioativos pode ser particularmente útil quando liberação de droga de longa duração é desejada, por exemplo, no caso de regeneração de nervo, onde é desejável variar a taxa de liberação de droga espacialmente como uma função de regeneração, por exemplo, ligeiramente próximo da interface de tecido vivo e mais lentamente afastado dentro da zona de lesão. benefícios adicionais incluem a dose de droga total mais baixa no sistema de liberação, e ajuste espacial de liberação que permite uma porcentagem maior da droga a ser liberada no momento de maior atividade celular.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDEO DE FUSÃO, KIT E MATRIZ QUE COMPREENDEM O MESMO, E MÉTODO PARA CRIAR UMA MATRIZ".

Campo da Invenção A invenção refere-se às proteínas de fusão ou peptídeos que contem PTH e uma seqüência de aminoácido que levam em conta interações de ligação em matrizes e ao uso das proteínas de fusão ou peptídeos na regeneração e reparo de tecido, e na liberação controlada de PTH. Antecedentes da Invenção Hormônio paratireóideo (PTH) é um peptídeo de 84 aminoácidos que é feito e segregado pela glândula paratireóide. Este hormônio desempenha um papel primário no controle dos níveis de cálcio de soro por meio de sua adição em vários tecidos, incluindo osso. Estudos em ser humano com várias formas de PTH têm demonstrado um efeito anabólico sobre o osso, que torna-o interessante para o tratamento da osteoporose e distúrbios ósseos relacionados (Patente dos Estados Unidos N° 5.747.456 por Chorev, e outros e WO 00/10596 por Eli Lilly & Co.). O hormônio paratireóideo age sobre as células ligando-se a um receptor de superfície celular. Este receptor é conhecido por ser encontrado sobre os osteoblastos, as células que são responsáveis para formar novo osso. O domínio de 34 aminoácidos de N-terminal do hormônio humano foi relatado ser biologicamente equivalente ao hormônio de tamanho natural. PTH 1-34 e seu modo de ação foi primeiro relatado em Patente dos Estados Unidos N° 4.086.196. Desde que a investigação foi realizada em PTH 1-34 e outras versões truncadas da forma de PTH humana nativa, como por exemplo PTH 1-25, PTH 1-31 e PTH 1-38 (observe por exemplo Rixon RH, e outros, J Bone Miner. Res., 9 (8): 1179-89 (Aug. 1994). O mecanismo por qual PTH influencia a remodelagem do osso é complicado, que tem levado a divergir os resultados e subseqüentemente, um número significante de estudos sobre certos mecanismos envolvidos. Foi demonstrado que se PTH for administrado sistemicamente de uma maneira contínua, a densidade do osso diminuirá. Ao contrário, foi relatado que se a mesma molécula for administrada no aspecto pulsátil, a densidade do osso diminuirá (observe por exemplo, WO 99/31137 por Eli Lilly & Co.). Esta contradição evidente pode ser esclarecida pelo mecanismo em que PTH modula a remodelagem do osso e subseqüentemente o parâmetro observável da densidade do osso. Dentro do osso maduro, o receptor de PTH foi apenas mostrado estar presente sobre a superfície das células da linhagem de os-teoblasto, porém não sobre os osteoclastos. Um papel que o PTH desempenha na remodelagem do osso é direcionado por meio dos osteoblastos quando oposto aos osteoclastos. Entretanto, as células em estágios diferentes da linhagem de osteoblasto respondem diferentemente quando elas se ligam ao PTH. Portanto, as diferenças dramáticas que são observadas quando o PTH é administrado usando métodos diferentes podem ser responsáveis pelo entendimento dos diferentes efeitos que a mesma molécula tem sobre as diferentes células dentro da linhagem do osteoblasto.

Quando o PTH se liga em uma célula tronco mesenquimatosa, a célula é induzida a diferenciar em um preosteoblasto. Desse modo, adicio-nando-se PTH ao sistema, existe um aumento na população do preosteoblasto. Entretanto, estas células de preosteoblasto têm o receptor de PTH também, e a ligação subseqüente do PTH ao receptor sobre estas células levam a uma resposta diferente. Quando PTH liga-se ao preoteoblasto, ele resulta em duas consequências separadas que levam à reabsorção óssea. Primeiro, ele inibe a outra diferenciação dos preosteoblastos em osteoblastos. Segundo, ele aumenta a segregação de Interleucina 6 (IL-6) dos preosteoblastos. IL-6 inibe igualmente a diferenciação do preosteoblasto bem como aumenta a diferenciação de preosteoclasto em osteoclastos. Esta resposta dual das células dentro da linhagem de osteoblasto é aquela que fornece a reação de complexo entre a remodelagem do osso e exposição de PTH. Se o PTH é dosado periodicamente durante curtos períodos de tempo, em seguida as células tronco mesenquimatosas são induzidas a diferenciar em osteoblastos. Os curtos períodos de dosagem em seguida impedem os preosteoblastos recentemente formados a partir da produção de IL-6, impedindo a ativação dos osteoclastos. Portanto, durante os intervalos de dosa- gem, estes preosteoblastos recentemente formados podem também diferenciar em osteoblastos, resultando na formação do osso. Entretanto, se uma dose constante de PTH for aplicada, em seguida os preosteoblastos terão a oportunidade de começar a produção de IL-6, desse modo ativando os os-teoclastos e inibindo eles mesmos, levando ao efeito oposto: reabsorção óssea.

Para regeneração ou reparo do tecido, as células devem migrar em um leito ferido, proliferar, expressar os componentes de matriz ou formar a matriz extracelular, e formar uma forma de tecido final. Populações de célula múltipla devem freqüentemente participar nesta resposta morfogenética, freqüentemente incluindo as células do nervo e vasculares. As matrizes foram demonstradas para realçar grandemente, e em alguns casos foram constatadas serem essenciais, para isto ocorrer. Métodos foram feitos desenvolvendo-se matrizes de origens naturais ou sintéticas ou uma mistura de ambas. As matrizes em desenvolvimento de célula natural são submetidas a remodelagem por influências celulares, todas com base em proteólise, por exemplo, por piasmina (fibrina degradante) e metaloproteinases matriz (co-lágeno degradante, elastina, etc.). Tal degradação é altamente localizada e ocorre apenas no contato direto com a célula de migração. Além disso, a liberação das proteínas de sinalização de célula específica tal como fatores de desenvolvimento é firmemente regulada. No modelo natural, as matrizes em desenvolvimento de célula macroporosa não são usadas, porém de preferência matrizes microporosas que as células podem degradar-se, localmente e na demanda, como as células migram-se na matriz. Devido às relações com respeito à imunogenicidade, a produção cara, disponibilidade limitada, variabilidade de batelada e purificação, matrizes com base em moléculas precursoras sintéticas, tal como polietilenoglicol modificado, foram desenvolvidos para a regeneração do tecido em e/ou sobre o corpo.

Ao mesmo tempo que muito trabalho foi feito estudando os efeitos sistêmicos de PTH, pesquisa não tem explorado a administração local ou tópica de PTH. Como o PTH tem um efeito anabólico direto sobre a linhagem de célula de osteoblasto, ele deve ter um forte potencial para cica- trizar os defeitos do osso além de influenciar a densidade do osso se apresentado apropriadamente dentro do sítio do defeito. Assim que o defeito foi enchido com preosteoblastos, se o sinal de PTH é desviado, os preosteo-blastos recentemente formados podem então diferenciarem-se em osteo-blastos e começar a converter o leito ferido, primeiro no tecido ósseo não-tecido e em seguida em uma estrutura óssea madura. É portanto um objetivo da presente invenção fornecer PTH em uma forma que pode ser ligada em uma matriz para reparo, regeneração e remodelagem do tecido. É um outro objetivo da invenção apresentar um PTH em uma forma adequada para administração tópica ou local em um paciente para cicatrizar os defeitos do osso.

Sumário da Invenção Os peptídeos de fusão que contêm um hormônio paratireóideo (PTH) em um domínio e um domínio de substrato capaz de ser covalente-mente reticulado em uma matriz em outro domínio e matrizes e kits que contêm tais peptídeos ou proteínas de fusão são descritos aqui. As proteínas de fusão covalentemente ligam-se aos materiais sintéticos ou naturais para formar matrizes, que podem ser usadas para cicatrizar os defeitos do osso. Opcionalmente, todos os compostos para formar a matriz são aplicadas em um defeito do osso e a matriz é formada no sítio de aplicação. O peptídeo de fusão pode ser incorporado na matriz tal que ou o peptídeo de fusão como um todo ou justamente a seqüência de PTH respectiva do primeiro domínio é liberado por degradação da matriz, por ação enzimática e/ou hidrolítica. Da mesma forma, o peptídeo de fusão pode conter uma ligação degradável entre o primeiro e o segundo domínio que contém sítios de divagem enzimática ou hidrolítica. Em particular, o peptídeo de fusão contém PTH em um domínio, um domínio de substrato capaz de ser covalentemente reticulado em uma matriz em um segundo domínio, e o sítio de degradação entre o primeiro e o segundo domínio. Preferivelmente, o PTH é PTH humano, embora o PTH de outras fontes, tal como PTH bovino, possa ser adequado. O PTH pode ser PTH 1-84 (nativo), PTH 1-38, PTH 1-34, ΡΤΗ 1-31, ou ΡΤΗ 1-25, ou quaisquer versões alélicas ou modificadas de propriedades exibindo PTH, isto é formação do osso, similar a anterior. O sítio de degradação permite a taxa de liberação ser variada em diferentes localizações dentro da matriz dependendo da atividade celular naquela localização e/ou dentro da matriz. Benefícios adicionais incluem a dose de droga total inferior dentro do sistema de liberação, e regulamento espacial de liberação que permite uma porcentagem maior da droga a ser liberada no momento da atividade celular maior.

Breve Descrição dos Desenhos FIGURA 1 é um cromatograma de detecção de fluorescência dos géis de fibrina contendo peptídeo degradado por plasmina e peptídeo livre. Cromatografia de exclusão de tamanho de um gel de fibrina degradado com o peptídeo α2ΡΙ1.7-ΑΤΙΙΙ121.134 incorporado (- ), com o mesmo peptídeo livre adicionado ao gel de fibrina degradado contendo peptídeo incorporado ( ), e o peptídeo livre sozinho (- -), são mostrados. O resíduo de leucina de N-terminal foi dansilado (abreviado dL).0 peptídeo livre eluído em tempos mais longos, correspondendo a um peso molecular mais baixo do que o peptídeo incorporado no gel de fibrina durante a coagulação, demonstrando a ligação covalente em fibrina degradada e desse modo a incorporação covalente por meio da ação da atividade de fator XIlia. FIGURA 2 é um gráfico da incorporação de dLNQEQVSPLRGD (SEQ ID NO: 1) em géis de fibrina com Fator exógeno XIII adicionado. Quando 1 U/mL foi adicionado, o nível de incorporação aumentado tal que mais do que 25 mol de peptídeo/mol de fibriogênio pode ser obtido. FIGURA 3 é um gráfico da incorporação do peptídeo de bidomí-nio, dLNQEQVSPLRGD (SEQ ID NO: 1) em cola de fibrina não-diluída. Três kits separados foram testados e em cada caso um alto nível de incorporação pode ser observado, alcançando 25 mol de peptídeo/mol de fibrinogênio. A concentração do peptídeo exógeno requerida para incorporação máxima foi pelo menos 5 mM, possivelmente devido às limitações de difusão dentro da matriz de fibrina altamente densa que é criada. O nível de incorporação foi muito consistente, com cada kit fornecendo um perfil de incorporação similar.

Descrição Detalhada da Invenção Produtos e métodos de reparo, regeneração ou remodelagem de tecido duro, em particular para o desenvolvimento do osso, usando matrizes sintéticas e naturais tendo PTH liberavelmente incorporado aqui, são descritos aqui. As matrizes naturais são biocompatíveis e biodegradáveis e podem ser formadas in vitro ou in vivo, no momento do implante. O PTH pode ser incorporado nas matrizes e mantém sua bioatividade completa. PTH pode ser liberavelmente incorporado, usando técnicas que fornecem o controle de como e quando e em qual grau o PTH é liberado, de modo que a matriz possa ser usada para o reparo do tecido diretamente ou indiretamente, usando a matriz como um veículo de liberação controlada.

Definições "Biomaterial" como geralmente usado aqui se refere a um material destinado a interface com sistemas biológicos para avaliar, tratar, aumentar, ou substituir qualquer tecido, órgão ou função do corpo dependendo do material ou permanentemente ou temporariamente. Os termos "biomate-rial" ou "matriz" são usados em forma de sinônimo aqui e significa uma rede polimérica reticulada que, dependendo da natureza da matriz, pode ser dilatada com água porém não-dissolvida em água, isto é, forma um hidrogel que permanece no corpo durante um certo período de tempo realizando certas funções de suporte para o tecido duro com defeito ou traumatizado. "Peptídeo de fusão de PTH" como geralmente usado aqui refere-se a um peptídeo que contém pelo menos um primeiro e segundo domínio. Um domínio contem um PTH (formas nativas ou truncadas, em particular PTH 1-34) e o outro domínio contem um domínio de substrato para ser reticulado em uma matriz. Um sítio de degradação enzimática ou hidrolítica pode também estar presente entre o primeiro e o segundo domínio. "Nucleófilo forte" como geralmente usado aqui se refere a uma molécula que é capaz de doar um par de elétron em um eletrófilo em uma região de formação de ligação polar. Preferivelmente, o nucleófilo forte é mais nucleofílico do que água em pH fisiológico. Exemplos de nucleófilos fortes são tióis e aminas. "Ligação insaturada conjugada" como geralmente usada aqui se refere a alternação de ligações múltiplas de carbono-carbono, carbono-heteroátomo ou heteroátomo-heteroátomo com ligações simples, ou a ligação de um grupo funcional em uma macromolécula, tal como polímero sintético ou uma proteína. Tais ligações podem suportar reações de adição. "Grupo insaturado conjugado" como geralmente usado aqui se refere a uma molécula ou uma região de uma molécula, que contém uma alternação de ligações múltiplas de carbono-carbono, carbono-heteroátomo ou heteroátomo-heteroátomo com ligações simples, que tem uma ligação múltipla que pode suportar reações de adição. Exemplos de grupos insatu-rados conjugados incluem, porém não são limitados às vinil sulfonas, acri-latos, acrilamidas, quinonas, e vinilpiridínios, por exemplo, 2- ou 4-vinilpiridínio e itaconatos. "Moléculas precursoras sintéticas" como geralmente usadas aqui se referem às moléculas que não existem na natureza. "Polímeros ou componentes precursores de ocorrência natural" como geralmente usados aqui se referem às moléculas que podem ser encontradas na natureza. "Funcionalizar" como geralmente usado aqui se refere a modificação de uma molécula de uma maneira que resulte na ligação de um grupo funcional ou porção. Por exemplo, uma molécula pode ser funcionalizada pela introdução de uma molécula que torna a molécula um nucleófilo forte ou uma insaturação conjugada. Preferivelmente uma molécula, por exemplo PEG, é funcionalizada para transformar um tiol, amina, acrilato ou quinona. As proteínas, em particular, podem também ser eficazmente funcionalizadas por redução parcial ou completa de ligações de dissulfeto para criar tióis livres. "Funcionalidade" como geralmente usada aqui se refere ao número de sítios reativos sobre uma molécula. "Funcionalidade dos pontos de ramificação" como geralmente usada aqui se refere ao número de ramificações estendendo de um ponto na molécula. "Sítio de adesão ou sítio de ligação de célula" como geralmente usado aqui se refere a uma seqüência de peptídeo em que uma molécula, por exemplo, um receptor de promoção de adesão sobre a superfície de uma célula, liga-se. Exemplos de sítios de adesão incluem, porém não são limitados à seqüência de RGD de fibronectina, e a seqüência YIGSR (SEQ ID NO: 2) de laminina. Preferivelmente, os sítios de adesão são incorporados no biomaterial incluindo-se um domínio de substrato reticulável em uma matriz. "Atividade biológica" como geralmente usada aqui se refere aos eventos funcionais mediados por uma proteína de interesse. Em algumas modalidades, isto inclui eventos ensaiados avaliando-se as interações de um polipeptídeo com outro polipeptídeo. Também inclui ensaiar o efeito que a proteína de interesse tem sobre o desenvolvimento da célula, diferenciação, morte, migração, adesão, interações com outras proteínas, atividade enzimática, fosforilação de proteína ou desfosforilação, transcrição, ou translação. "Molécula biológica sensível" como geralmente usada aqui se refere a uma molécula que é encontrada em uma célula, ou em um corpo, ou que pode ser usada como um produto terapêutico para uma célula ou um corpo, que pode reagir com outras moléculas em sua presença. Exemplos de moléculas biológicas sensíveis incluem, porém não são limitados aos peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos, e drogas. Os biomateriais podem ser feitos na presença de materiais biológicos sensíveis, sem afetar adversamente os materiais biológicos sensíveis "Regenerar" como geralmente usado aqui significa desenvolver outra vez uma porção ou toda de certo modo, tal como tecido duro, em osso particular. "Multifuncional" como geralmente usado aqui se refere a mais do que um grupo funcional eletrofílico e/ ou nucleofílico por molécula (isto é, monômero, oligo e polímero). "Reação auto-seletiva" como geralmente usada aqui significa que o primeiro componente precursor de uma composição reage muito mais rápido com o segundo componente precursor da composição e vice-versa do que com outros compostos presentes em uma mistura ou no sítio da reação. Como usado aqui, o nucleófilo preferencialmente liga-se a um eletrófilo e um eletrófilo preferencialmente liga-se a um nucleófilo forte, em vez de outros compostos biológicos. "Reticulação” como geralmente usado aqui significa a formação de ligações covalentes. Entretanto, pode também referir à formação de ligações não-covalentes, tal como ligações iônicas, ou combinações de ligações covalentes ou não-covalentes. "Rede polimérica" como geralmente usado aqui significa o produto de um processo em que substancialmente todos dentre os monômeros, oligo ou polímeros são ligados por ligações covalentes intermoleculares por meio de seus grupos funcionais disponíveis para resultar em uma enorme molécula. "Fisiológicas" como geralmente usado aqui significa condições como elas podem ser encontradas em vertebrados vivos. Em particular, as condições fisiológicas se referem às condições no corpo humano tal como temperatura, pH, etc. Temperaturas fisiológicas significam em particular uma faixa de temperatura entre 35°C a 42°C, preferivelmente em torno de 37°C. "Densidade de reticulação" como geralmente usado aqui se refere ao peso molecular médio entre duas reticulações (Mc) das moléculas respectivas. "Peso equivalente" como geralmente usado aqui se refere ao mmol do grupo funcional / g da substância. "Dilatação” como geralmente usado aqui se refere ao aumento em volume e massa por captação de água pelo biomaterial. Os termos "captação de água" e "dilatação" são usados em forma de sinônimo em todo este pedido. "Estado de equilíbrio" como geralmente usado aqui como o estado em que um hidrogel não sofre aumento em massa ou perda quando armazenado sob condições constantes em água.

I. Matrizes e PTH A. Materiais Matrizes A matriz é formada reticuiando-se ionicamente, covalentemente, ou por combinações destes de moléculas precursoras em uma rede polimé-rica ou dilatando-se um ou mais materiais poliméricos, isto é, matrizes, para formar uma rede polimérica tendo espaçamento de interpolímero suficiente para levar em conta o encravamento ou migração na matriz das células.

Em uma modalidade, a matriz é formada de proteínas, preferivelmente proteínas naturalmente presentes no paciente em que a matriz deve ser implantada. Uma proteína de matriz particularmente preferida é fibrina, embora as matrizes feitas de outras proteínas, tal como colágeno e gelatina possam também ser usadas. Polissacarídeos e glicoproteínas podem também ser usadas para formar a matriz. É também possível usar polímeros sintéticos que são reticuláveis por ligação iônica ou covalente. Matrizes de fibrina A fibrina é um material natural que foi relatado para várias aplicações biomédicas. A fibrina foi descrita como material para matrizes de encravamento de célula em Patente dos Estados Unidos No. 6.331.422 por Hubbell e outros. Os géis de fibrina foram usados como selantes por causa de sua capacidade de ligar-se a muitos tecidos e seu papel natural na cica-trização de ferimento. Algumas aplicações específicas incluem o uso como um selante para a ligação de enxerto vascular, ligação da válvula do coração, posicionamento do osso em fraturas e reparo do tendão (Sierra, D.H., Journal of Biomaterials Applications, 7:309-352 (1993)). Adicionalmente, estes géis foram usados como dispositivos de liberação de droga, e para a regeneração neuronal (Williams, e outro, Journal of Comparative Neurobio-logy, 264: 284-290 (1987)). Embora as fibrinas forneçam um suporte sólido para a regeneração do tecido e encravamento da célula, existem algumas seqüências ativas no monômero que diretamente realça estes processos. O processo por qual o fibrinogênio é polimerizado em fibrina foi também caracterizado. Inicialmente, uma protease cliva a molécula de fibri- nogênio dimérica nos dois sítios simétricos. Existem várias proteases possíveis que podem clivar o fibrinogênio, incluindo trombina, reptilase, e protea-se III, e cada um separa a proteína em um sítio diferente (Francis, e outros, Blood Cells, 19:291 - 307, 1993). Logo que o fibrinogênio é clivado, uma etapa de autopolimerização ocorre em que os monômeros de fibrinogênio surgem juntos e formam um gel de polímero não-covalentemente reticulado (Sierra, 1993). Esta automontagem acontece porque os sítios de ligação tomam-se expostos depois que a divagem de protease ocorre. Logo que eles são expostos, estes sítios de ligação no centro da molécula podem ligar-se em outros sítios sobre as cadeias de fibrinogênio, que estão presentes nas extremidades das cadeias de peptídeo (Stryer, L. In Biochemistry, W.H. Freeman & Company, NY, 1975). Desta maneira, uma rede polimérica é formada. O Fator Xllla, uma transglutaminase ativada a partir do Fator XIII por proteólise, pode então covalentemente reticular a rede de polímero. Outras transglutaminases existem e podem também estar envolvidas em reti-culação covalente e enxertando à rede de fibrina.

Logo que um gel de fibrina reticulado é formado, a degradação subseqüente é firmemente controlada. Uma das moléculas principais no controle da degradação da fibrina é o inibidor de a2-plasmina (Aoki, N., Pro-gress in Cardiovascular Disease, 21: 267 - 286, 1979). Esta molécula age reticulando-se à cadeia α de fibrina por meio da ação do Fator Xllla (Sakata, e outros, Journal of Clinicai Investigation, 65: 290 -297, 1980). Unindo-se si próprio ao gel, uma alta concentração do inibidor pode ser localizada ao gel. O inibidor em seguida age impedindo-se a ligação do plasminogênio à fibrina (Aoki, e outros, Thrombosis and Haemostasis, 39:22-31, 1978) e inati-vando-se plasmina (Aoki, 1979). O inibidor a2-plasmina contém um substrato de glutamina. A seqüência exata foi identificada como NQEQVSPL (SEQ ID NO: 12), com a primeira glutamina sendo o aminoácido ativo para reticulação.

Foi demonstrado que os peptídeos de bidomínio, que contém uma seqüência de substrato de fator Xllla e uma seqüência de peptídeo bi-oativo, podem ser reticulados em géis de fibrina e que este peptídeo bioativo mantém sua atividade celular in vitro (Schense, J. C., e outros (1999) Bio-conj. Chem. 10: 75-81).

Matrizes Sintéticas As reações de reticulação para formar matrizes sintéticas para aplicação no corpo incluem (i) polimerização de radical livre entre dois ou mais precursores contendo ligações duplas insaturadas, como descrito em Hem e outros, J. Biomed. Mater. Res. 39: 266-276 (1988), (ii) reação de substituição nucleofílica tal como por exemplo entre um precursor incluindo um grupo de amina e um precursor incluindo um grupo de succinimidila como descrito em Patente dos Estados Unidos No. 5.874.500 por Rhee e outros, (iii) reações de condensação e adição e (iv) reação de adição tipo Michael entre um nucleófilo forte e uma ligação ou grupo insaturado conjugado (como um eletrófilo forte). Particularmente preferida é a reação entre uma molécula precursora tendo um grupo de amina ou tiol como o grupo nucleofílico e moléculas precursoras incluindo grupos de vinil sulfona ou acrilato como grupos eletrofílicos. Mais preferido como o grupo nucleofílico é o grupo de tiol. As reações de adição tipo Michael são descritas em WO 00/44808 por Hubbell e outros, o conteúdo do qual é incorporado aqui por referência. Reações de adição tipo Michael levam em conta a reticulação in situ de pelo menos um primeiro e um segundo componente precursor sob condições fisiológicas de uma maneira auto-seletiva, ainda na presença de materiais biológicos sensíveis. Quando um dentre os componentes precursores tem uma funcionalidade de pelo menos dois, e pelo menos um dentre os outros componentes precursores tem uma funcionalidade maior do que dois, o sistema auto-seletivamente reagirá para formar um biomaterial tridimensional reticulado.

Preferivelmente, os grupos insaturados conjugados ou ligações insaturadas são acrilatos, vinilsulfonas, metacrilatos, acrilamidas, metacrila-midas, acrilonitrilas, vinilsulfonas, 2- ou 4-vinilpiridínio, maleimidas, ou qui-nonas.

Os grupos nucleofílicos são preferivelmente grupos de tiol, grupos de amino ou grupos de hidroxila. Os grupos de tiol são substancial- mente mais reativos do que os grupos de amina desprotonados. Como previamente dito, o pH é um importante nesta consideração: o tiol desprotona-do é substancialmente mais reativo do que o tiol protonado. Portanto, as reações de adição envolvendo uma insaturação conjugada, tal como um acrilato ou uma quinona, com um tiol para converter dois componentes precursores em uma matriz serão freqüentemente melhor realizadas mais fre-qüentemente e a auto-seletividade em um pH de aproximadamente 8. Em pH de aproximadamente 8, a maioria dos tióis de interesse são desprotonados (e desse modo mais reativos) e a maioria das aminas de interesse são ainda protonadas (e desse modo menos reativas). Quanto o tiol é usado como a primeira molécula precursora, uma estrutura conjugada que é seletiva em sua reatividade para o tiol relativa às aminas é altamente desejável.

Primeira e segunda moléculas precursoras adequadas incluem proteínas, peptídeos, polioxialquilenos, poli(vinil álcool), poli(etileno-co-vinil álcool), poli(ácido acrílico), poli(ácido etileno-co-acrílico), poli(etiloxazolina), poli(vinil pirrolidona), poli(etileno-co-vinil pirrolidona), poliíácido maléico), poli(ácido etileno-co-maléico), poli(acrilamída), e poli(óxido de etileno)-co-poli(óxido de propileno) copolímeros de bloco. Uma molécula precursora particularmente preferida é polietileno glicol.

Polietileno glicol (PEG) fornece um bloco de formação conveniente. Alguém pode facilmente adquirir ou sintetizar PEGs ramificados (significando mais do que duas extremidades) ou lineares (significando com duas extremidades) e em seguida funcionalizar os grupos finais de PEG para introduzir ou um nucleófilo forte, tal como um tiol, ou uma estrutura conjugada, tal como um acrilato ou uma vinilsulfona. Quando estes componentes são ou misturados um com ou outro ou com um componentes correspondente em um ambiente ligeiramente básico, uma matriz será formada por reação entre o primeiro e o segundo componente precursor. Um componente de PEG pode ser reagido com um componente não-PEG, e o peso molecular ou hidrofilicidade de cada componente pode ser controlado para manipular as características mecânicas, a permeabilidade, e o teor de água do bio-material resultante.

Estes materiais são geralmente úteis em implantes médicos, como descrito em maiores detalhes abaixo. Na formação das matrizes, especialmente matrizes que são desejadas para degradarem-se in vivo, os peptídeos fornecem um bloco de formação muito conveniente. É franco sintetizar peptídeos que contêm dois ou mais resíduos de cisteína, e este componente pode então facilmente servir como o primeiro componente precursor com grupos nucleofílicos. Por exemplo, um peptídeo com dois resíduos de cisteína livres formará facilmente uma matriz quando misturado com uma trivinilsulfona de PEG (um PEG tendo três ramificações com vinilsulfonas em cada dentre suas ramificações) em pH levemente mais alto ou fisiológico (por exemplo, 8 a 9). A gelificação pode também proceder bem ainda em pH mais altos, porém no gasto potencial da auto-seletividade. Quando os dois componentes precursores líquidos são misturados juntos, eles reagem durante um período de alguns minutos para formar um gel elástico, consistindo em uma rede de cadeias de PEG, transportando os nós da rede, com os peptídeos como ligações de conexão. Os peptídeos podem ser selecionados como substratos de protease, a fim de tornar a rede capaz de ser infiltrada e degradada por células, como é feito em uma rede com base em proteína, tal como em uma matriz de fibrina. Preferivelmente, as seqüências nos domínios são substratos que são envolvidos na migração da célula (por exemplo, como substratos para enzimas tal como colagenase, plasmina, metaloproteinase (MMP) ou elastase), embora os domínios adequados não devam ser limitados a estas seqüências. Uma sequência particularmente útil é um substrato para a plasmina de enzima (observe os Exemplos). As características de degradação dos géis podem ser manipuladas mudando-se os detalhes do peptídeo que servem como os nós de reticulação. Alguém pode fazer um gel que é degradado por colagenase, porém não plasmina, ou por plasmina, porém não colagenase. Além disso, é possível fazer o gel degradar-se mais rápido ou mais devagar em resposta a uma tal enzima, simplesmente mudando-se a seqüência de aminoácido a fim de alterar o Kn ou Kca,, ou ambos, da enzima de reação. Alguém pode desse modo tornar um biomaterial que é biomimético, naquele que é capaz de ser remodelado pelas características de remodelagem normal das células. Por exemplo, um tal estudo mostra os sítios de substrato para a importante plasmina de pro-tease. A gelificação do PEG com o peptídeo é auto-seletiva.

Opcionalmente, os agentes biofuncionais podem ser incorporados na matriz para fornecer a ligação química em outras espécies (por exemplo, uma superfície de tecido). Ter os substratos de protease incorporados na matriz é importante quando a matriz é formada de vinilsulfona de PEG. Exceto matrizes formadas da reação dos acrilatos de PEG e tióis de PEG, as matrizes formadas de vinilsulfonas de PEG e tióis de PEG não contêm ligações hidroliticamente degradáveis. Portanto, a incorporação dos substratos de protease permite a matriz degradar-se no corpo.

As matrizes sintéticas são opcionalmente simples de formarem-se. Dois precursores líquidos são misturados; um precursor contém uma molécula precursora com grupos nucleofílicos e a outra molécula precursora contém os grupos eletrofílicos. Solução salina fisiológica pode servir como o solvente. O aquecimento mínimo é gerado por reação. Portanto, a gelificação pode ser realizada in vivo ou in vitro, em contato direto com o tecido, sem toxicidade desfavorável. Desse modo, os polímeros, exceto PEG, podem ser usados, ou telehelicoidalmente modificados ou modificados em seus grupos laterais.

Para a maioria das indicações de cicatrização, a taxa de encra-vamento da célula ou migração das células na matriz junto com a taxa de degradação adaptada da matriz é crucial para a resposta de cicatrização total. O potencial das matrizes hidroliticamente não-degradáveis ao tomar invadido por células é primeiramente uma função da densidade da rede. Se o espaço existente entre os nós e pontos de ramificação for também pequeno em relação ao tamanho das células ou se a taxa de degradação da matriz, que é resulta na criação de mais espaço dentro da matriz, for também lenta, uma resposta à cicatrização muito limitada será observada. As matrizes de cicatrização encontradas na natureza, como por exemplo matrizes de fibrina, que são formadas como uma resposta ao dano no corpo são conhecidas por consistirem de uma rede muito livre que muito facilmente pode ser invadida por células. A infiltração é promovida por ligandos para a adesão da célula que são uma parte integrada da rede de fibrina.

As matrizes feitas de moléculas precursoras hidrofilicas sintéticas, como polietileno glicol, dilatam em ambiente aquoso depois da formação da rede polimérica. A fim de obter um tempo de formação de gel suficientemente curto (entre 3 a 10 minutos em um pH entre 7 a 8 e uma temperatura em uma faixa de 36 a 38°C) e a reação quantitativa durante a formação in situ da matriz no corpo, a concentração de partida das moléculas precursoras deve ser suficientemente alta. Sob tais condições, a dilatação depois da formação da rede não ocorrería, e as concentrações de partida necessárias resultariam em matrizes muito densas para a infiltração da célula quando a matriz não é degradável em ambiente aquoso. Desse modo, a dilatação da rede polimérica é importante para aumentar e alargar o espaço entre os pontos de ramificação.

Independente da concentração de partida das moléculas precursoras, os hidrogéis feitos das mesmas moléculas precursoras sintéticas, tal como vinilsulfona de PEG de quatro ramificações e um peptídeo com grupos de SH, dilatam-se ao mesmo teor de água no estado de equilíbrio. Isto significa que quando mais alta a concentração de partida das moléculas precursoras for, mais alto o volume final do hidrogel será quando alcançar seu estado de equilíbrio. Se o espaço disponível no corpo é muito pequeno permitir a dilatação suficiente e em particular se a ligação formada a partir dos componentes precursores não for hidroliticamente degradável, a taxa da infiltração da célula e a resposta à cicatrização diminuirão. Como uma con-seqüência, o ideal entre as exigências contraditórias para a aplicação no corpo deve ser encontrado. A boa infiltração de célula e respostas à cicatrização subseqüentes foram observadas com uma rede polimérica tridimensional formada a partir da reação de um polímero ramificado trifuncio-nal com pelo menos três ramificações substancialmente similares no peso molecular e uma segunda molécula precursora que é pelo menos uma molécula bifuncional. A relação de peso equivalente dos grupos funcionais da primeira e segunda moléculas precursoras está entre 0,9 e 1,1. Os pesos moleculares das ramificações da primeira molécula precursora, o peso molecular da segunda molécula precursora e a funcionalidade dos pontos de ramificação são selecionados tal que o teor de água da rede polimérica resultante está entre % em peso de equilíbrio e 92% em peso do peso total da rede polimérica depois da conclusão da captação da água. Preferivelmente, o teor de água está entre 93 e 95% em peso do peso total da rede polimérica e a água depois da conclusão da captação da água. A conclusão da captação da água pode ser obtida ou quando a concentração de equilíbrio é alcançada ou quando o espaço disponível no biomaterial não leva em consideração outro aumento de volume. É portanto preferido selecionar as concentrações de partida dos componentes precursores que serão tão baixas quanto possíveis. Isto é real para todas as matrizes dilatáveis porém em particular para aquelas matrizes que sofrem degradação mediada por célula e não contém ligações hidroliticamente degradáveis na rede polimérica. O equilíbrio entre o tempo de formação de gel e a baixa concentração de partida em particular para géis hidroliticamente não degradáveis devem ser otimizados com base na estrutura das moléculas precursoras. Em particular, o peso molecular das ramificações da primeira molécula precursora, o peso molecular da segunda molécula precursora e o grau de ramificação, isto é a funcionalidade dos pontos de ramificação, tem de ser ajustados consequentemente. O mecanismo de reação atual tem uma menor influência nesta ação. É a primeira molécula precursora um polímero de três ou quatro ramificações com um grupo funcional na extremidade de cada ramificação e é a segunda molécula precursora uma molécula bifuncional linear, preferivelmente um peptídeo contendo pelo menos dois grupos de cisteína, em seguida o peso molecular das ramificações da primeira molécula precursora e o peso molecular da segunda molécula precursora são preferivelmente escolhidos tal que as ligações entre os pontos de ramificação depois da formação da rede tem um peso molecular na faixa entre 10 e 13 kD (sob as condições que as ligações são lineares, não ramificadas), preferivelmente entre 11 e 12 kD. Isto leva em consideração uma concentração de partida da soma da primeira e segunda moléculas precursoras em uma faixa entre 8 a 12% em peso, preferivelmente 9 e 10 % em peso do peso total da primeira e segunda molécula precursora na solução (antes da formação da rede). No caso do grau de ramificação do primeiro componente precursor for aumentado para oito e a segunda molécula precursora for ainda uma molécula bi-funcional linear, o peso molecular das ligações entre os pontos de ramificação é preferivelmente aumentado para um peso molecular entre 18 a 24 kDa. No caso do grau de ramificação da segunda molécula precursora for aumentada de linear a um componente precursor de três a quatro ramificações, o peso molecular, isto é o comprimento das ligações aumentam consequentemente. Em uma modalidade preferida da presente invenção, uma composição é escolhida incluindo como a primeira molécula precursora um polímero de 15kD de três ramificações trifuncionais, isto é cada ramificação tendo um peso molecular de 5kD e como a segunda molécula precursora a molécula linear bifuncional de um peso molecular na faixa entre 0,5 a 1,5kD, ainda mais preferivelmente em torno de 1kD. Preferivelmente, o primeiro e segundo componentes precursores são um polietileno glicol.

Em uma modalidade preferida, o primeiro componente precursor inclui como ligações ou grupos insaturados conjugados por grupos funcionais, mais preferido um acrilato ou uma vinilsulfona e os grupos funcionais da segunda molécula precursora incluem um grupo nucleofílico, preferivelmente um tiol ou grupos de amino. Em outra modalidade preferida da presente invenção, a primeira molécula precursora é um polímero de 20kD de quatro ramificações (cada ramificação um peso molecular de 5kDa) tendo grupos funcionais nos terminais de cada ramificação e a segunda molécula precursora é uma molécula linear bifuncional de um peso molecular na faixa entre 1 a 3 kD, preferivelmente entre 1,5 e 2 kD. Preferivelmente, a primeira molécula precursora é um polietileno glicol tendo grupos de vinilsulfona e a segunda molécula precursora é um peptídeo tendo grupos de cisteína. Em ambas as modalidades , a concentração de partida da soma da primeira e segunda molécula precursora varia de 8 a 11% em peso, preferivelmente entre 9 e 10 % em peso do peso total da primeira e segunda molécula pre- cursora e água (antes da formação da rede polimérica), preferivelmente entre 5 e 8 % em peso para obter um tempo de formação de gel abaixo de 10 minutos. Estas composições tem um tempo de formação de gel em pH 8,0 e 37°C em cerca de 3-10 minutos depois misturar.

Quando a matriz contém ligações hidroliticamente degradáveis, formadas por exemplo pela reação preferida entre acrilatos e tióis, a densidade da rede com referência à infiltração da célula é especialmente importante no princípio, porém em ambiente aquoso as ligações serão hidroliza-das e a rede será alargada, para levar consideração a infiltração da célula. Com um aumento no grau de ramificação total da rede polimérica, o peso molecular das interligações, isto é o comprimento das ligações deve aumentar. B, Sítios de ligação de célula As células interagem com seu ambiente por meio de interações de proteína-proteína, proteína-oligossacarídeo e proteína-polissacarídeo na superfície de célula. Proteínas de matriz extracelular fornecem um hospedeiro de sinais bioativos à célula. Esta densa rede é requerida para suportar as células, e muitas proteínas na matriz foram mostradas para controlar a adesão, dispersão, migração e diferenciação da célula (Carey, Annual Review of Physiology, 53:161 - 177, 1991, 1991). Algumas das proteínas específicas que mostraram ser particularmente ativas incluem, laminina, vitronectina, fibronectina, fibrina, fibrinogênio e colágeno (Lander, Journal of Trends in Neurological Science, 12:189 - 195, 1989). Muitos estudos de laminina foram conduzidos, e tem mostrado que a laminina desempenha um papel vital no desenvolvimento e regeneração de nervos in vivo e células de nervo in vitro (Williams, Neurochemical Research, 12:851 - 869, 1987), bem como em angiogênese.

Algumas das sequências específicas que diretamente interagem com receptores celulares e causam adesão, propagação ou transdução de sinal foram identificadas. A laminina, uma grande proteína de multidomínio (Martin, Annual Review of Cellular Biology, 3:57 - 85, 1987), mostrou consistir em três ca- deias com vários domínios de ligação de receptor. Estes domínios de ligação de receptor incluem a seqüência YIGSR (SEQ ID NO: 2) da cadeia de laminina B1 (Graf, e outros, Cell, 48:989 - 996, 1987; Kleinman, e outros, Archives of Biochemistry and Biophysics, 272: 39 - 45, 1989; e Massia, e outros, J, ofBiol. Chem., 268:8053 - 8059, 1993), LRGDN (SEQ ID NO: 3) da cadeia de laminina A (Ignatius, e outros, J. of Cell Biology, 111:709 - 720, 1990) e PDGSR (SEQ ID NO: 4) da cadeia de laminina B1 (Kleinman, e outros, 1989). Várias outras seqüências de reconhecimento para células foram da mesma forma identificadas. Estas incluem IKVAV (SEQ ID NO: 5) da cadeia de laminina A (Tashiro, e outros, J, of Biol Chem., 264:16174 - 16182, 1989) e a seqüência RNIAEIIKDI (SEQ ID NO: 6) da cadeia de laminina B2 (Liesi, e outros, FEBS Letters, 244:141 - 148, 1989). Os receptores que ligam-se a estas seqüências específicas foram da mesma forma freqüente-mente identificados. O subgrupo de receptores celulares que mostrou ser responsáveis por muitas das ligações, é a super-família de integrina (Rous-lahti, E., J. ofClin. Investigation, 87:1 - 5, 1991). As integrinas são heterodí-meros de proteína que consistem em subunidades α e β. O prévio trabalho tem mostrado que o RGD de tripeptídeo liga-se a várias integrina β1 e β3 (Hynes, R.O., Cell, 69:1 - 25, 1992; Yamada, K.M., J. of Biol. Chem., 266:12809 - 12812, 1991), IKVAV (SEQ ID NO: 5) liga-se a um receptor de 110 kDa (Tashiro, e outros, J. ofBiol. Chem., 264:16174 - 16182,1989); Lu-ckenbill-Edds, e outros, Cell Tissue Research, 279: 371 - 377,1995), YIGSR (SEQ ID NO: 2) liga-se e um receptor de 67 kDa (Graf, e outros, 1987) e DGEA (SEQ ID NO: 7), uma seqüência de colágeno, liga-se à integrina α2,β1 (Zutter & Santaro, Amer. J. ofPatholody, 137:113 - 120, 1990). O receptor da seqüência RNIAEIIKDI (SEQ ID NO: 6) não foi relatado.

Em uma outra modalidade preferida, os sítios de peptídeo para adesão celular são incorporados na matriz, isto é, peptídeos que ligam-se a receptores de promoção de adesão sobre as superfícies de células nos bi-omateriais da presente invenção. Tais peptídeos de promoção de adesão podem ser selecionados do grupo como acima descrito. Particularmente preferidos, são a seqüência RGD de fibronectina, a seqüência YIGSR (SEQ ID NO: 2) de laminina. A incorporação de sítios de ligação de célula é uma modalidade particularmente preferida com matrizes sintéticas, porém pode da mesma forma ser incluída com algumas das matrizes naturais. A incorporação pode ser feita, por exemplo, simplesmente misturando-se um peptídeo de ligação de célula contendo cisteína com a molécula precursora incluindo o grupo insaturado conjugado, tal como acrilato de PEG, acrilamida de PEG ou vinilsulfona de PEG alguns minutos antes da mistura com o restante do componente precursor incluindo o grupo nucleofílico, tal como componente precursor contendo tiol. Se os sítios de ligação de célula não incluem uma cisteína, ele pode ser quimicamente sintetizado para incluir uma. Durante esta primeira etapa, o peptídeo de promoção de adesão tomar-se-á incorporado em uma extremidade do precursor multiplamente funcionalizado com um conjugado insaturado; quando o multitiol restante é adicionado ao sistema, uma rede reticulada se formará. Outra implicação importante da maneira que as redes são aqui preparadas, é a eficácia de incorporação dos li-gandos bioativos pendentes tais como sinais de adesão. Esta etapa tem de ser quantitativa, uma vez que, por exemplo, os ligandos não ligados (por exemplo, sítios de adesão) podem inibir a interação de células com a matriz. Como descrito mais tarde, a derivação do precursor com tais oligonucleotí-deos pendentes, é conduzida em uma primeira etapa em grande excesso estequiométrico (mínimo: 40 vezes) de precursores eletrofílicos multi-subdivididos em tióis e é portanto definitivamente quantitativa. Com exceção da inibição indesejável de prevenção, esta realização é biologicamente ainda mais significante: o comportamento celular é extremamente sensível a pequenas alterações em densidades de ligando e um conhecimento preciso de ligandos incorporados ajuda a planejar e entender as interações de matriz de célula.

Resumida, a concentração de sítios de adesão covalentemente ligados na matriz significantemente influencia a taxa de infiltração celular. Por exemplo, para um dado hidrogel, uma faixa de concentração de RGD pode ser incorporada na matriz com suporte de encravamento de célula e migração de célula em uma maneira ideal. A faixa de concentração ideal de sítios de adesão tipo RGD é entre 0,04 e 0,05 mM e ainda mais preferivelmente 0,05 mM em particular para uma matriz tendo um teor de água entre concentração de equilíbrio e 92% em peso após o término da captação de água.

Excelentes resultados de cicatrização do osso podem ser obtidos mantendo-se a taxa de migração celular e a taxa de degradação de matriz fixa. Com respeito ao projeto matriz ( em particular PTH 1-34 cova-lentemente ligado), um polietilenoglicol com quatro ramificações com um peso molecular de cerca de 20.000 Da reticulado com um sítio de degradação de protease GCRPQGIWGQDRC (SEQ ID NO: 8) e GRGDSP de 0,050 mM (SEQ ID NO: 9) produz particularmente bons resultados de encrava-mento de célula e cicatrização de defeitos do osso. A concentração de partida de PEG e peptídeo abaixo de 10% em peso do peso total das moléculas e água (antes da dilatação). Os géis tem uma consistência utilizável e permitem os osteoblastos e célula precursora facilmente infiltrar a matriz. O material matriz é preferivelmente biodegradável por enzimas naturalmente presentes. A taxa de degradação pode ser manipulada pelo grau de reticulação e a inclusão de inibidores de protease na matriz. C. Domínios de substrato reticulável O peptídeo de fusão de PTH pode ser reticulado e covalente-mente ligado a matrizes através do domínio de substrato reticulável do peptídeo de fusão de PTH. A espécie de domínio de substrato é dependente da natureza da matriz. Para a incorporação em matrizes de fibrina, os domínios de substrato de transglutaminase são particularmente preferidos. O domínio de substrato de transglutaminase pode ser um domínio de substrato de Fator Xllla. Este domínio de substrato Fator Xllla pode ser incluído GAKDV (SEQ ID NO: 10), KKKK (SEQ ID NO: 11), ou NQEQVSPL (SEQ ID NO: 12). A acoplagem entre PTH e o domínio de substrato de transglutaminase pode ser executada por síntese química. O domínio de substrato de transglutaminase pode ser um substrato pata a transglutaminase de outra maneira Fator Xllla. O domínio de substrato de Fator Xllla mais preferido tem uma seqüência de aminoácido de NQEQVSPL (SEQ ID NO: 12) (aqui referido como "TG"). Outras proteínas que transglutaminase reconhece, tal como fibronectina, pode ser acoplada ao peptídeo de substrato de transglutaminase.

Tabela 1 : Domínios de substrato de transglutaminase Para a incorporação de PTH em uma matriz formada de componentes precursores sintéticos, o peptídeo de fusão de PTH ou qualquer outro peptídeo a ser incorporado deve ser sintetizado com pelo menos um grupo de cisteína adicional (-SH) preferivelmente no terminal N de PTH como o domínio de substrato reticulável. A cisteína pode ser ou diretamente ligada ao PTH ou através de uma seqüência ligantea. A seqüência lígantea pode adicionalmente incluir uma seqüência de aminoácido enzimaticamente degradável, a fim de que o PTH possa ser clivado da matriz por enzimas substancialmente na forma ativa. O grupo livre de cisteína reage com o grupo insaturado conjugado do componente precursor em uma reação de adição tipo Michael. No caso de PTH 1-34 a servidão e uma matriz sintética para PTH 1-34 torna-se possível ligando-se uma seqüência de aminoácido adicional ao terminal N de PTH ^ que contém pelo menos uma cisteína. O grupo de tiol da cisteína pode reagir com a ligação insaturada conjugada sobre o polímero sintético para formar uma ligação covalente. Possivelmente (a) apenas uma cisteína é ligada ao peptídeo, em possivelmente (b) um enzimaticamente degradável, em particular uma seqüência degradável de plasmina é ligada como ligantea entre a cisteína e o peptídeo. A seqüên- cia GYKNR (SEQ ID NO: 15) entre o primeiro domínio e o segundo domínio, a cisteína toma a plasmina de ligação degradável.

Desta maneira, os peptídeos de fusão de PTH, podem ser também modificados para conter um sítio degradável entre o sítio de ligação, isto é, o segundo domínio (domínio de substrato de fator Xllla ou a cisteína) e o PTH, isto é, o primeiro domínio. Estes sítios podem ser degradáveis ou por hidrólíse não específica (isto é uma ligação de éster) ou eles podem ser substratos para degradação enzimática específica (degradação proteolítica ou de polissacarídeo). Estes sítios degradáveis permitem a construção de mais liberação específica de PTH de matrizes tipo géis de fibrina. Por exemplo, a degradação com base na atividade enzimática leva em consideração a liberação de PTH a ser controlada por um processo celular em vez de por difusão do fator através do gel. A ligação ou sitio degradável é clivado por enzimas liberadas de células que invadiram a matriz.

Os sítios de degradação permitem o PTH ser liberado com pouca ou nenhuma modificação para a seqüência de peptídeo primária, que pode resultar em atividade superior do fator. Além disso, permite a liberação do fator a ser controlado por processos específicos de célula, tal como pro-teólise localizada, em vez de difusão de alguns materiais porosos. Isto permite os fatores serem liberados em diferentes taxas dentro do mesmo material dependendo do local das células dentro do material. Isto da mesma forma reduz a quantidade de PTH necessária, uma vez que sua liberação é controlada por processos celulares. A conservação de PTH e sua biodispo-nibilidade são vantagens distintas da exploração de atividade proteolítica específica de célula durante o uso de dispositivos de liberação controlados por difusão. Em uma possível explanação para a forte cicatrização de um defeito no osso com PTH covalentemente ligado a uma matriz, é julgado importante que o PTH é administrado localmente durante um prolongado período de tempo (isto é, não justamente uma dose pulsada única) porém não de uma maneira contínua. Isto é realizado por uma vagarosa degradação, através de ou divagem enzimática ou divagem hidrolítica da matriz. Desta maneira, a molécula é em seguida liberada através de um efeito pseudo-pulsado que ocorre durante um período de tempo sustentado. Quando a célula progenitora infiltra a matriz, ela encontrará uma molécula de PTH e poderá diferenciar-se em um preosteoblasto. Entretanto, se essa célula particular não continua liberar PTH ligado da matriz, ela eficazmente se converterá em um osteoblasto e começará produzir matriz óssea. Finalmente, os efeitos terapêuticos do peptídeo estão localizados à região do defeito e são subseqüentemente magnificados.

As enzimas que podem ser usadas para degradação proteolíti-ca, são numerosas. Os sítios proteoliticamente degradáveis poderiam incluir substratos para colagenase, plasmina, elastase, estromelisina, ou ativadores de plasminogênio. Os substratos exemplares são listados abaixo. P1-P5 denota 1-5 posições de aminoácidos em direção ao terminal de amino da proteína do sítio onde a proteólise ocorre. PT-P4’ denota 1-4 posições de aminoácidos em direção ao terminal de carbóxi da proteína do sítio onde a proteólise ocorre. φ Λ <α α> ο α η >_ η>

Q 2 4-· ν> ο ε η V Τ3 Ο 2 » .Ω 3 (Ο Φ ■σ. (Ο η '0 c <φ :3 . σ φ ν> <Ν Λ Φ Δ Φ Η Em outras modalidades preferidas, um domínio de oligo-éster pode ser inserido entre o primeiro e o segundo domínio. Isto pode ser realizado usando um oligo-éster tal como oligômeros de ácido lático. O substrato de degradação não enzimática pode consistir de qualquer ligação que passa por hidrólise por um mecanismo catalisado por base ou ácido. Estes substratos podem incluir oligo-ésteres tais como oligômeros de ácido glicólico ou lático. A taxa de degradação destes materiais pode ser controlada através da escolha de oligômero.

D. PTH O termo "PTH" como aqui empregado inclui a seqüência humana de PTH 1-84 e todas as versões modificadas e alélicas truncadas de PTH que exibem propriedades de formação óssea quando covalentemente ligadas às matrizes naturais ou sintéticas biodegradáveis. Versões truncadas preferidas de PTH são PTH 1-38, PTH 1-34, PTH 1-31 ou PTH 1-25. Mais preferida é PTH 1-34. Preferivelmente, o PTH é PTH humano, embora PTH de outras fontes, tal como PTH bovino, possa ser adequado.' Métodos para incorporação e/ou liberação de fatores bioativos Em uma modalidade preferida para incorporação de um PTH dentro da matriz, a matriz inclui fibrina que é formada de fibrinogênio, uma fonte de cálcio e trombina e o peptídeo de fusão de PTH será incorporado dentro da fibrina durante a coagulação. Peptídeo de fusão de PTH é designado como peptídeo de fusão que inclui dois domínios, um primeiro e um segundo domínio, um domínio, o segundo domínio é um substrato para uma enzima de reticulação tal como o Fator Xllla. O Fator Xllla é uma transglu-taminase que é ativa durante a coagulação. Esta enzima, formada naturalmente de fator XIII por divagem por trombina, funciona para ligar cadeias de fibrina entre si por meio de linhagens de amida, formadas entre cadeias laterais de glutamina e cadeias laterais de lisina. A enzima funciona para ligar outros peptídeos a fibrina durante a coagulação, por exemplo os sítios de ligação da célula fornecidos incluem um fator Xllla também. Especificamente a seqüência NQEQVSP (SEQ ID NO: 16), foi demonstrada funcionar como um substrato eficaz para fator Xllla. Como aqui descrito anteriormente ela é diretamente ligada ao PTH ou pode incluir um sítio de degradação entre o PTH (primeiro domínio) e a seqüência de NQEQVSP (SEQ ID O: 16) (segundo domínio). Como tal, o peptídeo de fusão de PTH pode ser incorporado dentro da fibrina durante a coagulação por meio de um substrato de fator Xllla.

Projeto de proteínas de fusão para incorporação O peptídeo de fusão de PTH que inclui um primeiro domínio incluindo o PTH, um segundo domínio incluindo um domínio de substrato para uma enzima de reticulação e opcionalmente um sítio de degradação entre o primeiro e o segundo domínio podem ser incorporados nos géis de fibrina empregando-se vários diferentes esquemas. Preferivelmente o segundo domínio inclui um domínio de substrato de transglutaminase e ainda mais preferivelmente inclui um domínio de substrato de Fator Xllla. Mais preferivelmente o domínio de substrato de Fator Xllla inclui NQEQVSP (SEQ ID NO: 16). Quando este peptídeo de fusão de PTH está presente durante a polimerização do fibrinogênio, isto é durante a formação da matriz de fibrina, ele está diretamente incorporado na matriz. O sítio de degradação entre o primeiro e o segundo domínio do peptídeo de fusão de PTH pode ser um sítio de degradação enzimática como descrito anteriormente. Preferivelmente o sítio de degradação é clivá-vel por uma enzima selecionada do grupo consistindo em plasmina e meta-loproteinase de matriz. Por seleção cuidadosa de K™ e deste sítio de degradação enzimática, a degradação podería ser controlada para ocorrer antes ou após a matriz de proteína e/ou utilizando-se enzimas similares ou dis-similares para degradar a matriz, com a disposição do sítio de degradação sendo adaptada para cada tipo de proteína e aplicação. Este peptídeo de fusão de PTH poderia ser diretamente reticulado na matriz de fibrina como descrito acima. Entretanto, incorporar um sítio de degradação enzimática altera a liberação do PTH durante a proteólise. Quando as proteases derivadas de célula alcançam o peptídeo de fusão sequestrado, elas podem clivar a proteína construída ao sítio de degradação recentemente formado. Os produtos de degradação resultantes incluiríam o PTH liberado, que esta- ria agora quase livre de quaisquer seqüências de fusão construídas, bem como qualquer fibrina degradada. II. Métodos de Uso As matrizes podem ser empregadas para reparação, regeneração, ou remodelação de tecidos, e/ou liberação de PTH, antes ou no tempo de implantação. Em alguns casos será desejável induzir reticulação no sítio de administração para conformar a matriz ao tecido no sítio de implantação. Em outros casos, será conveniente preparar a matriz antes da implantação. Células podem também ser adicionadas à matriz antes ou no momento de implantação, ou ainda subseqüente a implantação, ou na ou subseqüente a reticulação do polímero para formar a matriz. Isto pode ser em adição a ou no lugar da reticulação da matriz para produzir espaço in-tersticial designado para promover a proliferação celular ou encravamento.

Se bem que na maioria dos casos será desejável implantar a matriz para promover crescimento celular ou proliferação, em alguns casos os fatores bioativos serão empregados para inibir a formação de adesões seguindo a cirurgia. III. Métodos de Aplicação Na modalidade preferida, o material é gelificado in situ em ou sobre o corpo. Em outra modalidade, a matriz pode ser formada fora do corpo e em seguida aplicada na forma pré-formada. O material de matriz pode ser feito de componentes precursores sintéticos ou naturais. Independente da espécie de componente de precursor empregada, os componentes precursores deveriam ser separados antes da aplicação da mistura ao corpo para prevenir a combinação ou contato entre si sob condições que permitem polimerização ou gelação dos componentes. Para prevenir o contato antes da administração, um kit que separa as composições de cada outro pode ser empregado. Em mistura sob condições que permitem a polimerização, as composições formam um fator bioativo suplementado por rede tridimensional. Dependendo dos componentes precursores e suas concentrações, a gelação pode ocorrer quase instantaneamente após a mistura. Tal gelação rápida, toma a injeção, isto é a compressão do material gelificado através da agulha de injeção, quase impossível.

Em uma modalidade a matriz é formada de fibrinogênio. Fibrino-gênio, através de uma cascata de vários géis de reações para formar uma matriz, quando trazido em contato com trombina e uma fonte de cálcio em temperatura apropriada e pH. Os três componentes, fibrinogênio, trombina, e a fonte de cálcio, deveria ser armazenados separadamente. Entretanto, contanto que pelo menos um dos três componentes seja mantido separado dos outros dois componentes pode ser combinado antes da administração.

Em uma primeira modalidade de fibrinogênio é dissolvido (que pode conter adicionalmente aprotinina para aumentar a estabilidade) em uma solução tampão em pH fisiológico (em uma faixa de pH 6,5 a 8,0, preferivelmente de pH 7,0 a 7,5) e armazenado separadamente de uma solução de trombina em um tampão de cloreto de cálcio (por exemplo faixa de concentração de 40 a 50 mM). A solução tampão para o fibrinogênio pode ser uma solução tampão de histidina em uma concentração preferida de 50 mM incluindo adicionalmente NaCI em uma concentração preferida de 150 mM ou solução salina de tampão TRIS (preferivelmente em uma concentração de 33 mM).

Em uma modalidade preferida, um kit, que contém uma proteína de fusão, fibrinogênio, trombina, e uma fonte de cálcio, é fornecido. Opcionalmente, o kit pode conter uma enzima de reticulação, tal como Fator Xllla. A proteína de fusão contém um fator bioativo, um domínio de substrato para uma enzima de reticulação e um sítio de degradação entre o domínio de substrato e fator bioativo. A proteína de fusão pode estar presente no fibrinogênio ou na solução de trombina. Em uma modalidade preferida a solução de fibrinogênio contém a proteína de fusão.

As soluções são preferivelmente misturadas por um dispositivo de seringa de duas vias, no qual a mistura ocorre comprimindo-se os conteúdos de ambas as seringas através de uma câmara de mistura e/ou agulha e/ou misturador estático.

Em uma modalidade preferida ambos fibrinogênio e trombina são armazenados separadamente enn forma liofilizada. Qualquer dos dois pode conter a proteína de fusão. Antes do uso, o tampão de histidina ou tris é adicionado ao fibrinogênio, o tampão pode adicionalmente conter aprotini-na. A trombina liofilizada é dissolvida na solução de cloreto de cálcio. Sub-seqüentemente, as soluções de trombina e fibrinogênio são colocadas em corpos de seringa/frasconetes/recipientes separados e misturadas por um dispositivo de conexão de duas vias, tal como uma seringa de duas vias. Opcionalmente, os corpos de seringa/frasconetes/recipientes são bipartidos desse modo tendo duas câmaras separadas por uma partição ajustável que é perpendicular à parede do corpo da seringa. Uma das câmaras contém o fibrinogênio liofilizado ou trombina, enquanto a outra câmara contém uma solução de tampão apropriada. Quando o êmbolo é pressionado, a partição move-se e libera o tampão na câmara de fibrinogênio para dissolver o fibrinogênio. Ambos os fibrinogênio e trombina são dissolvidos uma vez, os corpos de seringa bipartidos são igualmente ligados a um dispositivo de conexão de duas vias e os conteúdos são misturados por comprimindo-os através da agulha de injeção ligada ao dispositivo de conexão. Opcionalmente, o dispositivo de conexão contém um misturador estático para melhorar a mistura dos conteúdos.

Em uma modalidade preferida o fibrinogênio é diluído oito vezes e trombina é diluída 20 vezes antes da mistura. Esta relação resulta em um tempo de gelação de aproximadamente um minuto.

Em outra modalidade preferida, a matriz é formada de componentes precursores sintéticos capazes de suportar uma reação de adição de Michael. Desde então o componente precursor nucleofílico (o multitiol) somente reage com o componente multiaceptor (o grupo insaturado conjugado) em pH básico, os três componentes que devem ser armazenados separadamente antes da mistura são: a base, o componente nucleofílico e o componente multiaceptor. Ambos os componentes multiaceptor e multitiol são armazenados como umas soluções em tampões. Ambas as composições podem incluir o sítio de fixação celular e adicionalmente a molécula bioativa. Desse modo, a primeira composição do sistema pode por exemplo incluir a solução do componente nucleofílico e a segunda composição do sistema pode incluir a solução do componente multiaceptor. Qualquer das duas ou ambas das duas composições pode incluir a base. Em outra modalidade, o multiaceptor e o multitiol podem ser incluídos como solução na primeira composição e a segunda composição pode incluir a base. A conexão e a mistura ocorrem da mesma maneira como previamente descrito para o fibrinogênio. O corpo de seringa bipartido é igualmente adequado para os componentes precursores sintéticos. Em lugar de fibrinogênio e trombina os componentes multiaceptor e multitiol são armazenados em forma pulverizada em uma das câmaras e a outra câmara contém o tampão básico.

Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Ao mesmo tempo que as composições e métodos foram descritos em termos de modalidades preferidas, será evidente para aqueles versados na técnica que variações podem ser aplicadas à composição, métodos e nas etapas ou na seqüência de etapas do método descrito aqui sem afastar-se do conceito, espírito e escopo da invenção. Exemplo 1: Matrizes contendo TGPTH covalentemente ligado Síntese de TGPTH

Peptídeo PTH 1-34-mer exibindo atividade similar para a proteína total, e proteínas deste tamanho podem ser sintetizadas por métodos de síntese de peptídeo de estado sólido padrão.

Todos os peptídeos foram sintetizados na resina sólida empregando-se um sintetizador de peptídeo automatizado empregando-se química de 9-fluorenílmetiloxicarbonila padrão. Os peptídeos foram purificados por cromatografia c18 e analisados empregando-se cromatografia de fase reversa por meio de HPLC para determinar a pureza bem como espectrosco-pia de massa (MALDI) para identificar o peso molecular de cada produto. Empregando-se este método, o seguinte peptídeo (aqui referido como "TGPTH") foi sintetizado: NH3-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Ser-Val-Ser-Glu-lle-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-Hís-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-GIn-Asp-Val-His-Asn-Phe-COOH (SEQ ID NO: 17).

Resultados In vivo A atividade de TGPTH para realçar a regeneração óssea foi testada em uma matriz TISSUCOL® em um defeito de orifício de broca de carneiro. Orifícios de 8 mm que são de 12 mm de profundidade foram criados no fêmur e úmero proximal e distai de carneiro. Estes orifícios foram enchidos com um gel de fibrina de polimerização in situ. Os defeitos foram deixados vazios, enchidos com TISSUCOL® ou TGPTH foi adicionado à fibrina TISSUCOL® a 400 pg/ml antes da polimerização. Em cada exemplo no qual TISSUCOL® foi empregado, ele foi diluído quatro vezes da concentração padrão disponível, induzindo a uma concentração de 12,5 mg/ml.

Os defeitos foram deixados cicatrizar durante oito semanas. Após este período de cicatrização, os animais foram sacrificados, e as amostras de osso foram removidas e analisadas por topografia microcom-putadorizada (pCT). O percentual do volume de defeito enchido com tecido ósseo calcificado foi então determinado. Quando os defeitos foram deixados vazios, não houve nenhuma formação de tecido calcificado dentro da matriz de fibrina. Quando apenas um gel de fibrina foi adicionado, não houve praticamente nenhuma cicatrização óssea também. Entretanto, com a adição de 400 pg/ml de TGPTH, o nível de cicatrização aumentou dramaticamente, com o defeito enchido 35% com osso calcificado. EXEMPLO 2: Resposta de Cicatrização com PTH 1-34 modificado ligado uma matriz de fibrina.

Materiais A versão modificada de PTH1.34 que pode ser incorporada dentro de uma matriz de fibrina foi testada quanto à resposta de cicatrização no defeito craniano de tamanho crítico.

Um gel de fibrina foi feito de componentes de precursor de selante de fibrina do Kit TISSUCOL® (Baxter AG, CH-8604 Volketswil/ZH). O fibrinogênio foi diluído em solução tamponada por Tris de 0,03M estéril (TBS, pH 7,4) para formar uma solução de 8 mg/ml aproximadamente e a trombina foi diluída em 50 mm de solução de CaCI2 para formar uma solução de 2U/ml. A concentração final de fibrinogênio foi de 1:8 de formulação de TISSUCOL® original (cerca de 100 mg/ml) e 1:160 de concentração de trombina TISSUCOL® original (cerca de 500 ΙΕ/ml). Uma quantidade predeterminada de TG-pl-PTH1.34 ou TGPTH^ foi então adicionada à trombina, e misturada para formar uma concentração homogênea.

Para formar o gel de fibrina, os precursores diluídos foram misturados um ao outro injetando-se o fibrinogênio dentro do tubo contendo a trombina. Em caso do defeito de broca de carneiro (como abaixo descrito) esta mistura foi então injetada imediatamente dentro de um defeito de broca criado em osso de estrutura em treliça de carneiro, onde um gel de fibrina forma-se dentro de 1 a 5 minutos. Na primeira série de experiências, a eficácia de uma proteína de fusão contendo PTH^ como o fator bioativo (NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF, SEQ ID NO: 18) em cicatrização de osso cortical foi testada em um modelo de animal pequeno. A seqüência YKNR (SEQ ID NO: 19), toma a ligação de plasmina degradável ("TG-pl-PTH^J. A TG-pl-PTH^ foi feita por síntese química. A purificação foi executada através de HPLC de fase reversa (Coluna C18) empregando-se um TFA como o contra-íon que resultou em um produto final que foi um sal de TFA. A pureza do TG-pl-PTH^ foi determina ser de 95%. A resposta de cicatrização foi explorada em ambos os tempos de cicatrização curto (3 semanas) e longo (7 semanas) para determinar se um realce em cicatrização poderia ser observado.

Defeito craniano de tamanho crítico de rato.

Os ratos foram anestesiados e o osso craniano foi exposto. O periósteo sobre a superfície externa do crânio foi retraído de modo que ele não desempenhasse um papel no processo de cicatrização, e um defeito circular de 8 mm único foi criado. Este tamanho de defeito foi escolhido como foi anteriormente determinado que os defeitos de 8 mm ou maior não cicatrizam expontaneamente sozinhos, e são defeitos de tamanho crítico. O defeito foi então ajustado com uma matriz de fibrina pré-formada e o animal foi deixado cicatrizar durante 3 e 7 semanas. A região de defeito foi então explantada e analisada por meio de radiologia bem como histologia. Resultados Quando TG-pl-PTH^ foi estudado no ponto do tempo de 3 semanas, o nível de cicatrização era muito similar àquele observado com uma matriz de fibrina sozinha. O ponto do tempo de 3 semanas foi escolhido como um ponto do tempo precoce quando outra morfogênese potente, incluindo rhBMP-2, mostrou um efeito de cicatrização forte em 3 semanas. Ao contrário, o efeito de cicatrização para TG-pl-PTH^ não foi observável neste ponto do tempo precoce. Entretanto, quando o ponto do tempo maior (7 semanas) foi analisado, uma moderada melhora dependente da dose foi observada na cicatrização no defeito craniano de rato de tamanho crítico com a adição de PTH134 modificado às matrizes de fibrina. Os resultados são mostrados na Tabela 3. Quando a dose elevada de PTH^ modificado foi empregada, a resposta de cicatrização aumentou em 65%.

Tabela 3: Resposta de cicatrização no defeito de crânio de rato com PTH modificado Estes resultados demonstram que quando PTH^ é incorporado dentro de uma matriz de fibrina, retém alguma atividade como evidenciado pelo aumento modesto na formação de osso.

Defeito de broca de osso de carneiro TG-pl-PTH^ foi testado também em um modelo de defeito de osso longo para testar o efeito deste hormônio em cicatrização de osso. No modelo de defeito de broca de carneiro, defeitos de broca em forma circular de 8 mm que tinham profundidade de aproximadamente 15 mm foram colocados tanto na região proximal quanto na distai dos ossos úmero e fêmur. Desde que o defeito foi colocado na epífise dos ossos longos, o defeito foi circundado por osso trabecular com uma camada fina de osso cortical na beira do defeito. Estes defeitos foram, então, preenchidos com uma fibrina de polimerização in situ (cerca de 750 μ!_) que continha várias doses de TG- ρΙ-ΡΤΗ,.34 ou TGPTH^. Os animais foram deixados cicatrizar durante oito semanas e, então, foram sacrificados. O defeito foi analisado com μΟΤ e histologia.

Para esta série de experimentos, três tipos de composições foram testados. Primeiro, TG-pl-PTH^ foi testado sobre uma faixa de concentração larga. Em segundo lugar, outro PTH1.34 modificado, TGPTH^ (NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF; SEQ ID NO : 17) foi empregado o qual tinha apenas uma seqüência de transgluta-minase no término do amino, sem um sítio de degradação. Assim, TGPTH^ 34 pode somente ser liberado por degradação da matriz da própria fibrina. TGPTH^ foi produzido e purificado semelhantemente a TG-pl-PTH^. A pureza foi determinada ser 95%. TGPTH1.34 foi testado em diversas concentrações que foram similares às concentrações de TG-pl-PTH^ para comparar a eficácia. Finalmente, as matrizes foram feitas na presença de material granular, ou com TGPTH^ ou TG-pl-PTH,^. O material granular era uma mistura de hidroxiapatitâ / fosfato de tricálcio que foi implantada na matriz durante a gelação. O efeito da adição destes grânulos na eficácia de PTH^ foi explorado. Como controle, a fibrina não modificada foi testada. Resultados Quando oito das moléculas de PTH^ modificadas foram colocadas nos defeitos de osso longo, uma melhora significante na resposta de cicatrização foi observada durante o uso de matrizes de fibrina (controle) somente. O uso de fibrina somente resultou em pouca cicatrização, onde somente 20% do defeito original foi preenchido com osso recentemente formado. TG-pl-PTH.,.34 foi testado em uma série de concentração de 20 -1000 μg/mL. Para cada dose testada, um aumento significante na resposta de cicatrização foi observado. Por exemplo, quando 100 pg/mL de TG-pl-PTH1_34 foram usados, a taxa de cicatrização foi aumentada até quase 60%.

Em uma segunda série de experimentos, TGPTH^ foi testado. O uso de TGPTH^ também aumentou a cicatrização de osso. Por exemplo, o uso de 400 pg/mL melhorou a resposta de cicatrização para 40%, e 1000 pg/mL aumentou a cicatrização de osso para 65%. Assim, a adição de qualquer uma seqüência de PTH.,_34 modificado resultou em uma resposta de cicatrização mais forte que o controle.

Finalmente, quando qualquer molécula de PTH^ modificado foi unida à matriz e uma mistura de matriz / grânulo foi empregada, a eficácia do PTH1_34 foi mantida. Isso foi testado tanto para TG-pl-PTH^ (ver Tabela 4) assim como para TGPTH1.34 (ver Tabela 5).

Tabela 4: Cicatrização de um defeito de broca de carneiro com TG-pl-PTH^ incorporado em uma matriz de fibrina; Tempo de cicatrização de 8 semanas._________________________________________________________ Amostra Dose Cicatrização (% de defeito enchido com osso) Fibrina (Controle) 0 20 TG-pl-PTH1,34_______50 31,3 TG-pl-PTH^ 100 59,7 TG-pl-PTH^ 400_____________________73_____________________ TG-pl-PTH^ 1000 77 TG-pl-PTH^ 400 68 400TCP_____________________________________________________________ Tabela 5: Cicatrização de um defeito de broca de carneiro com PTH104 ligado a uma matriz de fibrina; Tempo de cicatrização de 8 semanas Amostra Dose Cicatrização (% de defeito enchido com osso) Fibrina 0 20 TGPTH^ 400 40 TGPTH^_____________1000 65 TGPTH^g, 400 77 400TCP_____________________________________________________________ A avaliação histológica apresentou elevada infiltração no defeito original de células progenitoras de osteoblasto e fusiforme suportadas em uma matriz extracelular. Os osteóides ativos com osteoblastos arredondados largos foram comuns, e sinais de ossificação endocondreal (condróci-tos) foram observados. Por oito semanas, osteoclastos e sinais sadios de remodelagem podem ser encontrados. Mas diferente dos resultados obtidos da exposição contínua a PTH sistêmico, nenhuma resposta visível dos oste-oclastos foi observada e nova formação de osso foi significativamente maior que absorção em e ao redor da área de defeito. Nenhuma resposta infla-matória de corpo estranho foi detectada (isto é, nenhuma célula gigante e somente presença de monócito suave). Os grânulos estavam ainda presentes em amostras com partículas minerais adicionadas.

Exemplo 3: Preparação de componentes precursores para matrizes sintéticas.

Preparação de PEG-vinilsulfonas PEGs ramificados comercialmente disponíveis (PEG de 4 ramificações, peso mol. 14.800, PEG de 4 ramificações, peso mol. 10.000 e PEG de 8 ramificações, peso mol 20.000; Shearwater Polymers, Huntsville, AL, USA) foram funcionalizados na terminação OH.

Sulfonas de vinila de PEG foram produzidas sob atmosfera de argônio por reação de uma solução de diclorometano dos polímeros precursores (previamente secos sobre peneiras moleculares) com NaH e então, após evolução de hidrogênio, com divinilsulfona (relações molares: OH 1 : NaH 5 : divinilsulfona 50). A reação foi executada em temperatura ambiente durante 3 dias sob argônio com agitação constante. Após a neutralização da solução de reação com ácido acético concentrado, a solução foi filtrada através de papel até clarear. O polímero derivatizado foi isolado por precipitação em dietiléter gelado. O produto foi redissolvido em diclorometano e re-precipitado em dietiléter (com lavagem completa) duas vezes para remover todo o excesso de divinilsulfona. Finalmente, o produto foi seco sob vácuo. A derivatização foi confirmada com 1H RMN. O produto apresentou picos de sulfona de vinila característicos a 6,21 ppm (dois hidrogênios) e 6,97 ppm (um hidrogênio). O grau da conversão do grupo final foi descoberto ser 100%.

Preparação de PEG-acrilatos Acrilatos de PEG foram produzidos sob atmosfera de argônio por reação de uma solução de tolueno azeotropicamente seco dos polímeros precursores com cloreto de acriloíla, na presença de trietilamina (rela- ções molares: OH 1 : cloreto de acriloíla 2 : trietilamina 2,2). A reação prosseguiu com agitação durante a noite no escuro em temperatura ambiente. A solução amarelo clara resultante foi filtrada por meio de leito de alumina neutro; após a evaporação do solvente, o produto de reação foi dissolvido em diclorometano, lavado com água, seco sobre sulfato de sódio e precipitado em éter de dietila frio. Produção: 88%; conversão de OH para acrilato: 100% (da análise de 1H-RMN) 1H-RMN (CDCI3) : 3,6 (341H (14800 4 ramificações : 337H teor.), 230 (10000 4 ramificações : 227H teor.), ou 210H (20000 8 ramificações : 227H teor.), prótons de cadeia de PEG), 4,3 (t, 2H, -CH2-CH2-0-C0-CH=CH2), 5,8 (dd, 1H, CH2=CH-COO-), 6,1 e 6,4 (dd, 1H, CH2=CH-COO-) ppm. FT-IV (película em placa ATR): 2990 - 2790 (υ C-H), 1724 (υ C=0), 1460 (υ8 CH2), 1344, 1281, 1242, 1097 (uas C-O-C), 952, 842 (ds C-O-C) cm1. Síntese de peptídeo Todos os peptídeos foram sintetizados em resina sólida usando um sintetizador de peptídeo automatizado (9050 Pep Plus Synthesizer, Milli-pore, Framingham, Estados Unidos da América) com química de 9-fluorenilmetiloxicarbonila padrão. Grupos de proteção clivados e seqües-trantes idrofóbicos foram removidos por precipitação do peptídeo em éter de dietila frio e dissolução em água desionizada. Após liofilização, os peptídeos foram redissolvidos em solução salina tamponada por Tris a 0,03 M (TBS, pH 7,0) e purificados usando HPLC (Waters; Milford, Estados Unidos da América) em uma coluna de exclusão de tamanho com TBS, pH 7,0 como o tampão de funcionamento.

Formação de matriz por reações de adição conjugada Géis sensíveis a MMP formados por adição conjugada com um nucleófilo ligado a peptídeo e uma insaturação conjugada ligada a PEG que permite migração de célula proteolítica. A síntese de géis é efetuada totalmente por meio de reação de adição do tipo Michael de tiol-PEG sobre PEG funcionalizado por vinilsulfo-na. Em uma primeira etapa, peptídeos de adesão foram ligados pendentemente (por exemplo o peptídeo Ac-GCGYGRGDSPG-NH2 (SEQ ID NO: 20)) a uma vinilsulfona de PEG de múltiplas ramificações e, então, este precursor foi ligado cruzado com um peptídeo contendo ditiol (por exemplo, o substrato de MMP Ac-GCRDGPQGIAGFDRCG-NH2 (SEQ ID NO: 21)). Em uma preparação de gel típica para estudos in vitro tridimensional, 4 ramificações de PEG-vinilsulfona (peso mol. 15000) foi dissolvida em um tampão de TE-OA (0,3M, pH 8,0) para produzir uma solução a 10% (peso/peso). A fim de tornar os géis adesivos à célula, o peptídeo dissolvido Ac-GCGYGRGDSPG-NH2 (SEQ ID NO: 20) (mesmo tampão) foi adicionado a esta solução. O peptídeo de adesão foi deixado reagir durante 30 minutos a 37°C. Mais tarde, o peptídeo reticulante Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2 (SEQ ID NO: 21) foi misturado com a solução acima e géis foram sintetizados. A gelação ocorreu dentro de poucos minutos, entretanto, a reação de reticulação foi realizada durante uma hora a 37°C para garantir a reação completa. Géis não-sensíveis a MMP formados por adição conjugada com um nucleófilo ligado a PEG e uma insaturação conjugada ligada a PEG que permite migração de célula não-proteolítica. A síntese de géis é também executada totalmente por meio de uma reação de adição do tipo Michael de tiol-PEG sobre PEG funcionaliza-do por vinilsulfona. Em uma primeira etapa, peptídeos de adesão foram ligados pendentemente (por exemplo, o peptídeo Ac-GCGYGRGDSPG-NH2 (SEQ ID NO:20)) a uma vinilsulfona de PEG de múltiplas ramificações e em seguida este precursor foi reticulado com um PEG-ditiol (peso mol. 3,4 kD). Em uma preparação de gel típica para estudos in vitro tridimensionais, 4 ramificações de PEG-vinilsulfona (peso mol. 15000) foi dissolvida em um tampão de TEOA (0,3M, pH 8,0) para produzir uma solução a 10% (p/p). A fim de tomar os géis adesivos à célula, o peptídeo dissolvido Ac-GCGYGRGDSPG-NH2 (SEQ ID NO: 20) (no mesmo tampão) foi adicionado a esta solução. O peptídeo de adesão foi deixado reagir durante 30 minutos a 37°C. Mais tarde, o precursor de PEG-ditiol foi misturado com a solução acima e géis foram sintetizados. A gelação ocorreu dentro de poucos minutos, entretanto, a reação de reticulação foi executada durante uma hora a 37°C para garantir a reação completa.

Formação de matriz por reações de condensação Géis sensíveis a MMP formado por reações de condensação com um ligante X de peptídeo contendo múltiplas aminas e um PEG eletrofi-licamente ativo que permite migração de célula proteolítico.

Hidrogéis sensíveis a MMP foram também criados por condução de uma reação de condensação entre oligopeptídeo sensível a MMP contendo dois substratos de MMP e três Lys (Ac-GKGPQGIAGQKGPQGIAGQKG-NH2 (SEQ ID NO: 22) e um duplo éster di-funcional comercialmente disponível PEG-N-hidroxissuccinimida (Shearwa-ter polymers) (NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS). Em uma primeira etapa, peptídeos de adesão (por exemplo o peptídeo Ac-GCGYGRGDSPG-NH2) (SEQ ID NO:20) foram reagidos com uma pequena fração de NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS e, então, este precursor foi reticulado a uma rede por mistura com o peptídeo Ac-GKGPQGIAGQKGPQGIAGQKG-NH2 (SEQ ID NO:22) transportando três aminas (e uma amina primária). Em uma preparação de gel típica para estudos in vitro tridimensionais, ambos componentes foram dissolvidos em 10 mM de PBS a pH 7,4 para produzir uma solução a 10% (peso/peso) e hidrogéis formaram-se em menos de uma hora.

Em contraste com os presentes hidrogéis formados por reação de tipo Michael, a desejada auto-seletividade neste método não é garantida, desde que aminas presentes em materiais biológicos como células ou tecidos também reajam com os ésteres duplos ativados difuncionais. Isto também é real para outras PEGs tendo funcionalidades eletrofílicas, tais como PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), ou carbonato de nitrofenila de PEG.

Hidrogéis não-sensíveis a MMP formados por reações de condensação com um reticulador de PEG-amina e um PEG eletrofilicamente ativo que permite migração de célula não-proteolítica. Hidrogéis foram também formados por condução de uma reação de condensação entre PEG-aminas ramificadas comercialmente disponíveis (Jeffamines) e o mesmo duplo éster difuncional PEG-N-hidroxissuccinimida difuncional (NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS). Em uma primeira etapa, os peptídeos de adesão (por exemplo, o peptídeo Ac-GCGYGRGDSPG-NH2) (SEQ ID NO:20) foram reagidos com uma pequena fração de NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS e, então, este precursor foi reticulado a uma rede por mistura com a PEG-amina de múltiplas ramificações. Em uma preparação de gel típica para estudos in vitro tridimensionais, ambos componentes foram dissolvidos em 10 mM de PBS em pH 7,4 para produzir uma solução a 10% (peso/peso total) e hidrogéis formaram-se em menos de uma hora. Novamente, em contraste com os presentes hidrogéis formados por reação de tipo Michael, a a desejada auto-seletividade neste método não é garantida, desde que aminas presentes nos materiais biológicos como células ou tecidos também reajam com os ésteres duplos ativados difuncionais. Isto também é real para outros PEGs tendo funcionalidades eletrofílicas, tais como PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), ou carbonato de nitrofenila de PEG.

Exemplo 4: Regeneração de Osso com matrizes enzimaticamente de-gradáveis sintéticas Duas concentrações de partida diferentes dos géis degradáveis enzimáticos foram empregadas. Em cada uma dessas, a concentração de RGD e o fator ativo (CpIPTH a 100 pg/mL) foram mantidos constantes. A rede polimérica foi formada a partir de um PEG de quatro ramificações fun-cionalizado com quatro grupos terminais de vinilsulfona de um peso molecular de 20kD (peso molecular de cada uma das ramificações de 5 KD) e peptídeo de ditiol da seguinte seqüência Gly-Cys-Arg-Asp-(Gly-Pro-Gln-Gly-lle-Trp-Gly-Gln)-Asp-Arg-Cys-Gly (SEQ ID NO: 21). Ambos componentes precursores foram dissolvidos em Trietanolamina a 0,3 M. As concentrações de partida do PEG funcionalizado (primeira molécula precursora) e do peptídeo de ditiol (segunda molécula precursora) foram variadas. Em um caso, a concentração foi de 12,6 % em peso do peso total da composição (primeiro e segundo componentes precursores + solução de trietanolamina). Os 12,6% em peso correspondem a uma solução de 10% em peso quando calculada com base somente no primeiro componentes precursores. (100 mg/mL da primeira molécula precursora). A segunda concentração de partida foi 9,5% em peso do peso total da composição (primeiro e segundo com- ponente precursor + solução de trietanolamina) que corresponde a 7,5% peso com base somente na primeira molécula precursora (75 mg/mL da primeira molécula precursora) de peso total. Isso tem a conseqüência que a quantidade de peptídeo de ditiol foi alterada tal que a relação molar entre tióis e sulfonas de vinila foi mantida. O gel que começou a partir de uma concentração de partida de 12,6% em peso aumentou para uma concentração de 8,9% em peso do peso total da rede polimérica mais água, assim a matriz teve um conteúdo de água de 91,1. O gel que iniciou a partir de uma concentração de partida de 9,5% em peso aumentou para uma concentração final de 7,4% em peso do peso total da rede polimérica mais água, assim teve um conteúdo de água de 92,6. A fim de explorar o efeito desta mudança, estes materiais foram testados no defeito de broca de carneiro. Aqui, um defeito de 750 μΙ_ foi colocado no osso em estrutura de treliça das diáfises do úmero e fêmur de carneiro e preenchido com um gel enzimático de gelação in situ, A quantidade seguinte de tecido calcificado foi obtida, determinada via pCT, com cada grupo em N=2: Concentração de partida de gel Tecido Calcificado 12,6% 2,7% 9,5% 38,4% Fazendo os géis menos densos e mais fáceis para penetração de célula, a resposta de cicatrização resultante com a adição de um fator ativo foi mais forte. O efeito de ter concentrações de sólido finais abaixo de 8,5% peso é óbvio a partir desses resultados.

Claramente, então, o projeto da matriz é crucial para permitir cicatrização em defeitos de ferimento. Cada um desses hidrogéis era composto de grandes cadeias de polietileno glicol, de extremidade ligada para criar uma matriz. Entretanto, os detalhes de como foram ligados, por meio de sítios de degradação enzimática, a densidade dos ligantees e muitas outras variáveis foram cruciais para permitir uma resposta de cicatrização funcional. Estas diferenças foram observadas muito nitidamente no modelo de defeito de broca de carneiro.

Exemplo 5 : Formação de osso com matrizes hidroliticamente degradá-veis sintéticas.

Peptídeo de fusão de PTH 1-34 foi testado em um gel sintético também no modelo de defeito de broca de carneiro exatamente como descrito para as matrizes de fibrina. A rede de hidrogel foi criada misturando-se entre si polietileno glicol de 4 ramificações acrilado, PM 15.000 (Peg 4*15 Acr) com um ditiol de polietileno glicol linear de PM 3400. Através de uma reação de tipo Michael, quando os dois componentes são misturados um tampão de Trietanolamina a 0,3 M a pH 8,0, os tiolatos resultantes que são formados neste pH podem, então, reagir com a insaturação conjugada do acrilato para criar uma ligação covalente. Misturando-se entre si precursores multifuncionais, tal que a multifuncionalidade combinada é maior que ou igual a cinco, um hidrogel é formado. Além disso, fatores bioativos podem ser adicionados à matriz por meio de um esquema de reação idêntico. Neste caso, fatores bioativos, incluindo motivos de adesão de célula ou fatores mitogênicos ou morfogênicos podem ser ligados à matriz por adição de uma cistina, o tiol contendo aminoácido, à seqüência. Aqui, adicionou-se uma cistina à seqüência de adesão de célula, RGD, e mais especificamente, RGDSP (SEQ ID NO: 23) assim como à seqüência de PTH,^ e ambos foram ligados à matriz por meio dos acrilatos no reticulador. Subseqüente-mente, estes hidrogéis recentemente formados, por conseguinte, têm numerosos ésteres próximo a um tiol, que tem mostrado ser hidroliticamente instável. Esta instabilidade permite o géis degradarem-se lentamente e ser substituídos pelo tecido formado recentemente.

Estes géis particulares, hidroliticamente degradáveis com RGD e PTH covalentemente ligados à matriz, foram testados no modelo de defeito de broca de carneiro para testar a capacidade de C-PTH1.34 ligada a matriz realçar o desenvolvimento ósseo. A fim de determinar a quantidade de realce, 0, 100 e 400 pg/ml de peptídeo de fusão PTH1.34 foram adicionados à matriz. Quando isto foi feito, um aumento em formação de osso foi observado com a adição de PTH^. Em cada teste, a resposta de cicatrização foi avaliada na mesma hora em oito semanas. Esta foi comparada a defeitos que foram deixados vazios. Quando a matriz hidroliticamente degradável sintética sem peptídeo de fusão PTH foi empregada, a resposta de cicatri-zação foi avaliada em cerca de 40%. Isto significa que 40% do volume de defeitos original foi enchido com tecido ósseo recentemente formado. Em seguida, quando 400 pg/ml de peptídeo de fusão modificado foi em- pregado, a resposta de cicatrização aumentou para aproximadamente 60%. Em comparação, quando os defeitos foram deixados vazios, aproximadamente 10% foi enchido com tecido calcificado. Este dado é mostrado na Tabela 6 abaixo.

Tabela 6: Resposta de cicatrização com matrizes sintéticas com e sem PTH modificado________________ __________________________________________ Em comparação a um defeito vazio, a adição do gel de peg hidroliticamente degradável sozinho teve um grande efeito sobre a cicatrização óssea, aumentando a quantidade de tecido calcificado em 300%. Quando PTH 1-34 foi ligado a esta matriz, a cicatrização aumentou ainda mais com o nível sendo até 50% mais elevado do que quando a matriz é empregada sozinha e 500% mais elevado do que o nível de cicatrização obtido quando o defeito foi deixado vazio.

Claims (17)

1. Peptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro domínio compreendendo PTH e um segundo domínio compreendendo um domínio de substrato covalentemente reticulável em uma matriz, em que o domínio de substrato covalentemente reticulável compreende um domínio de substrato de trans-glutaminase.

2. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que também compreende um sítio de degradação entre o primeiro e o segundo domínio.

3. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o PTH é selecionado do grupo consistindo em PTH 1-84, PTH 1-38, PTH 1-34, PTH 1-31 e PTH 1-25.

4. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o PTH é PTH 1-34.

5. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de substrato de transglutaminase compreende um domínio de substrato de Fator Xllla.

6. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o domínio de substrato de Fator Xllla compreende a SEQ ID N° 12.

7. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de substrato de transglutaminase compreende pelo menos uma cisteína.

8. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o sítio de degradação é um sítio de degradação enzi-mática ou hidrolítica.

9. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o sítio de degradação é um sítio de degradação enzi-mática, o qual é clivado por uma enzima selecionada do grupo consistindo em plasmina e metaloproteinase de matriz.

10. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o peptídeo de fusão como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, fibrino-gênio, trombina e uma fonte de cálcio.

11. Kit de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o kit também compreende uma enzima de reticulação.

12. Matriz adequada para crescimento ou encravamento celular, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo de fusão como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o peptídeo de fusão é covalentemente ligado à matriz.

13. Matriz de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a matriz é fibrina.

14. Matriz de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a matriz é formada por uma reação de adição do tipo Michael entre uma primeira molécula de precursor compreendendo n grupos nucleo-fílicos e uma segunda molécula de precursor compreendendo m grupos ele-trofílicos, onde nem são pelo menos dois e a soma n+m é pelo menos cinco.

15. Matriz de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que os grupos eletrofílicos são grupos não-saturados conjugados e os grupos nucleofílicos são selecionados do grupo consistindo em tióis e aminas.

16. Matriz de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a matriz compreende polietilenoglicol.

17. Método para criar uma matriz, caracterizado pelo fato de que compreende fornecimento de pelo menos um material de matriz capaz de formar uma matriz reticulada, onde o material de matriz é selecionado do grupo consistindo em proteínas e materiais sintéticos, adição do peptídeo de fusão como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ao material de matriz, e reticulação do material de matriz, de modo que o peptídeo de fusão é ligado à matriz através do segundo domínio.