TWI656212B - 用於製備藍銅胜肽之表現卡匣及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明係有關於用於製備藍銅胜肽之表現卡匣及其用途，及更明確言之，係有關於包含編碼胜肽之多核苷酸序列的用於製備藍銅胜肽之表現卡匣，於該胜肽中Gly-His-Lys單體係重複複數次，包含該表現卡匣之表現載體，包含該表現載體之轉形體，使用該轉形體用於製備藍銅胜肽之方法，藉由該方法製備的藍銅胜肽，包含該藍銅胜肽用於預防毛髮脫落或促進毛髮生長之醫藥組成物、化妝品組成物、及準藥物組成物。

使用含有本發明之藍銅胜肽的表現卡匣、表現載體、及轉形體，能以低成本大規模地製備具有高純度的藍銅胜肽。此外，依據本發明製備之藍銅胜肽具有預防毛髮脫落及促進毛髮生長的優異功效，因此可廣泛地運用在產業上作為預防毛髮脫落及促進毛髮生長的化妝品、準藥物、及藥物的材料。

Description

用於製備藍銅胜肽之表現卡匣及其用途

本發明係有關於用於製備藍銅胜肽之表現卡匣及其用途，及更明確言之，係有關於包括編碼胜肽之多核苷酸序列的用於製備藍銅胜肽之表現卡匣，於該胜肽中Gly-His-Lys單體係重複複數次；包括該表現卡匣之表現載體；包括該表現載體之轉形體；使用該轉形體用於製備藍銅胜肽之方法；及用於預防毛髮脫落或促進毛髮生長之醫藥組成物、化妝品組成物、及準藥物組成物。

藍銅胜肽為存在於人體血漿中之胜肽，已知藍銅胜肽為當皮膚出現傷口時，藉由快速再生而具有修復受傷皮膚的胜肽。藍銅胜肽由銅離子結合其上的三種胺基酸(亦即，甘胺酸、組胺酸、及離胺酸)組成，藉此顯現活性。

晚近，確證藍銅胜肽於膠原蛋白及彈力蛋白(其乃皮膚的真皮層中最重要的組成分)的合成上扮演要角，及促進頭皮細胞與毛囊細胞的增生放大與細胞分裂。因此，藍銅胜肽包含於毛髮產品中，包括各種護髮產品及 洗髮精中以供使用。

此外，已經報告藍銅胜肽具有各種功效，諸如幹細胞活化、糖尿病病人的皮膚潰瘍治療、胃潰瘍之治療、提升消化器官功能、抗癌活性等。因此，對此種藍銅胜肽之安全的大規模生產技術的發展研究目前正在進行中。

目前，藍銅胜肽主要係藉由化學合成生產。舉例言之，藍銅胜肽之一種化學合成方法係揭示於國際專利公告案第WO 2012/166810號。因藍銅胜肽係呈錯合物形式，於其中三個短胺基酸與銅一起結合，故其大半係藉由化學合成方法製備。然而，因藍銅胜肽乃使用於人體內的材料，化學合成製程期間使用的各種毒性物質可能摻混入藍銅胜肽內，故化學合成方法要求高純度分離/純化製程。因此，持續需要發展能够替代化學合成，藉由使用酵母發酵製程的安全生物製程而大規模製備高純度藍銅胜肽的技術。

發明人付出眾多努力，致力於藉由利用酵母發酵製程的生物製程製備藍銅胜肽。結果，發明人確證藉由將包括編碼胜肽之多核苷酸序列的表現載體(於該胜肽中Gly-His-Lys單體係重複複數次)，導入巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)(一種酵母菌種)內，培養酵母及分離/純化 所表現的胜肽，能够以低成本大規模地製備高純度藍銅胜肽，因而完成了本發明。

本發明之一目的係提供一種用於製備藍銅胜肽之表現卡匣，其包括編碼胜肽之多核苷酸序列，於該胜肽中Gly-His-Lys單體係重複複數次。

本發明之另一目的係提供一種包括表現卡匣的用於製備藍銅胜肽之表現載體。

本發明之又另一目的係提供一種包括表現載體之轉形體。

本發明之又另一目的係提供一種包括培養轉形體的用於製備藍銅胜肽之方法。

本發明之又另一目的係提供一種包括藉由如上方法製備的包括複數個Gly-His-Lys單體之藍銅胜肽。

本發明之又另一目的係提供一種含有藍銅胜肽之用於預防毛髮脫落或促進毛髮生長的醫藥組成物。

本發明之又另一目的係提供一種含有藍銅胜肽之用於預防毛髮脫落或促進毛髮生長的化妝品組成物。

本發明之又另一目的係提供一種含有藍銅胜肽之用於預防毛髮脫落或促進毛髮生長的準藥物組成物。

使用含有本發明之藍銅胜肽的表現卡匣、表現載體、及轉形體，可以低成本大規模地製備具有高純度的藍銅胜肽。

此外，依據本發明製備之藍銅胜肽具有預防毛髮脫落及促進毛髮生長的優異功效，因此可廣泛地運用在產業上作為預防毛髮脫落及促進毛髮生長的化妝品、準藥物、及藥物的材料。

第1圖為示意圖，其例示設計用於高度表現/高度分泌本發明之藍銅胜肽的表現卡匣。

第2圖為示意圖及相片，其例示用於將藍銅胜肽表現卡匣轉形入酵母內及用於培養酵母的發酵槽。

第3圖為示意圖及相片，其例示用於以高效率自培養酵母分離及純化本發明之藍銅胜肽之方法。

第4圖為結果，其例示藉由HPLC進行本發明之藍銅胜肽之純度的頻譜分析。

第5圖為結果，其例示藉GC-MS進行本發明之藍銅胜肽之純度的頻譜分析。

[最佳模式]

為了達成前述目的，本發明之一態樣提供一種用於製備藍銅胜肽之表現卡匣，其包括編碼胜肽的多核苷酸序列，於該胜肽中Gly-His-Lys單體係重複複數次。

此外，本發明提供一種用於製備藍銅胜肽之表現卡匣的製備用途，該表現卡匣包括於其中Gly-His-Lys單體係重複複數次的編碼胜肽之多核苷酸序列。

如於本文中使用，術語「Gly」係指胺基酸甘胺酸，且於本文中可與「甘胺酸」、「Gly」、或「G」互換使用。同理，「His」係指胺基酸組胺酸，且於本文中可與「組胺酸」、「His」、或「H」互換使用；及「Lys」係指胺基酸離胺酸，且於本文中可與「離胺酸」、「Lys」、或「L」互換使用。於其中三個胺基酸串接在一起的三胜肽Gly-His-Lys可經命名而與「GHK」互換使用。

如於本文中使用，術語「Gly-His-Lys單體」係指於其中胺基酸甘胺酸、組胺酸、與離胺酸串列鏈接的三胜肽。

如於本文中使用，術語「藍銅胜肽」係指於其中Gly-His-Lys單體係重複複數次的胜肽結合至銅(Cu)，且於本文中可與「Cu-GHK」或「GHK-Cu」互換使用。

如於本文中使用，術語「用於製備藍銅胜肽之表現卡匣」係指能够表現於其中Gly-His-Lys單體係重複複數次的胜肽之表現構築體。

於本發明中，表現卡匣可包括多核苷酸序列，其編碼於其中Gly-His-Lys單體係重複複數次的胜肽。該胜肽可以是於其中如上單體係重複3至20次，更特別地5至15次，及最特別地6至10次的Gly-His-Lys多聚體，但Gly-His-Lys多聚體並非受此所限。當多聚體具有少於3個如上單體時，得自其中的GHK單體數目變過小，因而惡化了生產效率。相反地，當多聚體具有20個或以上的如上單體時，有減低了表現效率的問題。

特定言之，編碼於其中如上單體係重複複數次的胜肽之多核苷酸序列，可以是由SEQ ID NO：1或2之多核苷酸序列所組成者，但多核苷酸序列並非受此所限。

考慮具有生物上等效活性的突變，於本發明中使用的核苷酸序列被解譯成也包括顯示出與序列中列舉的該等序列實質上相同性的序列。

術語「實質上相同性」係指一序列，當本發明之序列與任何其它序列排齊，因而彼此儘可能地匹配且當排齊的序列係藉由業界常用的演算法分析時，具有至少60%同源性，更特別地70%同源性，又更特別地80%同源性，及最特別地90%同源性。

據此，與SEQ ID NO：1及2之該等核苷酸序列具有高度序列相同性的核苷酸序列，舉例言之，具有至少70%同源性，特別地80%同源性，及更特別地90%同源性之該等核苷酸序列須被解譯為也係涵括於本發明之範疇內。

此外，表現卡匣可以是於其中該多核苷酸序列係可操作地鏈接至於酵母中表現的啟動子序列及高層級分泌信號序列者。

至於特定具體實施例，啟動子可以是甘油醛3-磷酸脫氫酶(GPD)之啟動子、蘇胺酸脫氫酶(TDH)之啟動子、醇脫氫酶(ADH)之啟動子、細胞色素c(CYC1，同型異形體1)之啟動子、STE5啟動子、及其組合，但啟動子並無特殊限制，只要其為適合用於酵母中表現的啟動子即可。 有關舉例說明之啟動子的序列，可使用業界已知之該等序列。

於另一特定具體實施例中，高層級分泌信號序列可以是啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)之α交配因子前序列，但並無特殊限制，只要也分泌用於表現的目標胜肽(於其中Gly-His-Lys單體係重複複數次的胜肽，亦即，GHK多聚體)即可。至於如上舉例說明的高層級分泌信號序列，可使用業界已知之任何序列。

較佳地，啟動子及高層級分泌信號序列係可操作地鏈接至編碼目標胜肽的多核苷酸。

如於本文中使用，術語「可操作地鏈接」表示核酸的控制序列係功能式地鏈接至編碼目標蛋白質或胜肽的核酸，因而可發揮一般功能。舉例言之，編碼啟動子的核酸序列與蛋白質或胜肽可以操作地鏈接，來影響編碼序列的表現。與載體的可操作地鏈接可藉由業界眾所周知之基因重組技術製備，及位點特異性DNA裂解與鏈接可使用業界一般眾所周知的酶等容易地進行。

此外，表現卡匣可進一步包括位在該表現卡匣內部的該多核苷酸序列上游或下游之3個至9個多核苷酸，其編碼His、GST、或內含肽(Intein)，因而有助於所表現目標胜肽之純化。又復，於其中Gly-His-Lys單體係重複複數次的該胜肽，係透過離胺酸(K)連接物或天冬酸根-天冬酸根-天冬酸根-天冬酸根-離胺酸(DDDDK)連接物而鏈接至其編碼His、GST、或內含肽的多核苷酸。然而，只要表 現卡匣能協助目標胜肽的純化，則其並無特殊限制。

此外，表現卡匣可進一步包括控制目標胜肽的表現之組成單元，諸如，轉錄強化子、終結子、起始因子、及其它基因調節因子、或賦予重組目標胜肽的抗原性或結合親和力的因子，以及啟動子、高層級分泌信號序列、編碼目標胜肽之序列、諸如His之序列等。

於本發明之特定具體實施例中，製備用於高度表現/高度分泌GHK的表現卡匣，於其中循序地插入aox啟動子、用於分泌的信號序列(啤酒酵母之α交配因子前序列)、編碼於其中Gly-His-Lys單體係重複6次或10次的胜肽之多核苷酸序列、His標籤序列、及終結序列(第1圖)。

本發明之另一態樣提供一種包括如上表現卡匣的用於製備藍銅胜肽之表現載體。

特別地，「表現卡匣」及「藍銅胜肽」之定義係與如前文描述者相同。

如於本文中使用，術語「表現載體」係指藉由將DNA導入宿主細胞內而用於有效地誘發目標基因的表現之工具，更明確言之，表現載體可指基因構築體，其包括可操作地鏈接以使得胜肽(於該胜肽中Gly-His-Lys單體係重複複數次)能够表現的必需控制單元。

於本發明中，表現載體可包括用於製備藍銅胜肽的表現卡匣，其包括編碼於其中Gly-His-Lys單體係重複複數次，特別地6次至10次的胜肽之多核苷酸序列。

於特定具體實施例中，表現載體可包括質體 載體、黏接載體、噬菌體載體、病毒載體等。表現載體的更特定實例可包括大腸桿菌(E.coli)-衍生質體(pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pET30a、pET30c、或pGEX-GST)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)-衍生質體(pUB110或pTP5)、酵母-衍生質體(YEp13、YEp24、YCp50、pPINK α-HC、pPink-HC、或pPink-LC)、Ti質體等，及可使用動物病毒諸如反錄病毒、腺病毒、牛痘病毒等，及昆蟲病毒或植物病毒諸如桿狀病毒，及二元體載體諸如pPZP-系列、pGA-系列、及pCAMBIA-系列。

於更特定具體實施例中，載體可以是酵母-衍生質體pPINK α-HC，但質體並非受此所限，只要質體可將本發明之表現卡匣導入宿主細胞內即可。

此外，表現載體可功能性地鏈接至表現控制序列。於特定具體實施例中，除了表現控制單元，諸如啟動子、操作子、起始密碼子、終止密碼子、多腺苷酸化信號、及強化子之外，表現載體可包括用於膜靶定或分泌的信號序列或先導子序列，但表現載體並非受此所限，而可依據本發明之目的以各種方式製備。此外，表現載體可包括選擇性標記，其可自行複製或整合入宿主DNA內。此外，表現載體可包括可選擇標記，且可自行複製或整合入宿主DNA內。本發明之載體可使用業界眾所周知之基因重組技術製備，及位點特異性DNA裂解與鏈接可使用業界一般已知之酶進行。

於本發明之特定具體實施例中，用於製備藍 銅胜肽之表現載體係經由習知限制酶處理方法及接合，將用於製備藍銅胜肽之表現卡匣插入pPink α-HC表現載體內而製備(實施例2)。

此外，本發明之又另一態樣提供包括表現載體的轉形體。

特定言之，「載體」之定義係與前述者相同。

如於本文中使用，術語「轉形體」係指其遺傳特徵已藉由外來遺傳物質的導入而予變更的有機體。

於特定體實施例中，轉形體可以是啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、或巴斯德畢赤酵母，但轉形體並無特殊限制，只要其可表現於其中Gly-His-Lys單體係重複多次亦即，GHK多聚體的胜肽即可。

如於本文中使用，術語「巴斯德畢赤酵母」係指最廣用來連同啤酒酵母一起製造重組蛋白質的酵母菌株。該酵母菌株具有下列優點在於該菌株容易遺傳操控，具有多種表現系統，及使其能大規模培養。此外，該酵母菌株具有優點在於其可進行胞外分泌蛋白質功能，及當生產衍生自高級細胞的重組蛋白質諸如人類蛋白質時，可進行轉譯後修飾諸如糖化功能。重組蛋白質之分泌性生產造成目標蛋白質人工融合蛋白質分泌信號，及因而使其能胞外分泌目標蛋白質。透過目標蛋白質之分泌程序，進行蛋白質摺疊、雙硫鍵生成、及糖化製程，及因此，有項優點在於能够製造具有生物學上完整活性的重組蛋白質。此 外，因可從培養基直接獲得生物活性蛋白質，無需碾磨或重新摺疊經濟上無效的細胞，故其極為經濟實惠。

於本發明之特定實施例中，用於製備藍銅胜肽之表現載體係藉由電穿孔而被導入巴斯德畢赤酵母菌株內而製備轉形體(實施例2)。

本發明之另一態樣提供一種用於製備藍銅胜肽之方法，其包括培養該轉形體。

特別地，有關轉形體及藍銅胜肽的定義係與前述者相同。

於本發明中，轉形體可考慮轉形體的營養需求加以培養。於特定具體實施例中，巴斯德畢赤酵母為甲基營養缺陷型酵母細胞，經緩衝之複雜甲醇培養基(BMMY)、經緩衝之最低甲醇培養基(BMM)等可使用於其培養，但培養基並非受此所限，而可由熟諳技藝人士根據發明之目的加以妥適地選擇。

此外，自轉形體之培養回收目標胜肽可藉由業界已知方法進行。特別地，諸如離心、過濾、萃取、噴霧、乾燥、蒸發、沈澱、結晶化、電泳、分級溶解(例如，硫酸銨沈澱)、層析術(例如，離子交換、親和力、斥水性、及尺寸排阻)等方法，但該等方法並無特殊限制，只要其可回收本發明之GHK多聚體即可。

本發明之方法可進一步包括(a)純化自該經培養之轉形體表現的胜肽；(b)使用蛋白酶處理經純化的胜肽以自該胜肽分離該等Gly-His-Lys單體；及(c)讓該等 Gly-His-Lys單體與銅反應以製備藍銅胜肽。

更明確言之，當His、GST、或內含肽係以3個或以上至9個或以下之範圍存在於該胜肽之N端或C端時，純化該胜肽之步驟(a)包含使用可降解該等蛋白質之蛋白酶處理。特定言之，為了表現自該經培養之轉形體的該胜肽之分離與純化，可使用Ni管柱凝膠層析術或沸騰方法，但該方法並非受此所限，而可由熟諳技藝人士根據發明之目的加以妥適地選擇。

此外，分離該等Gly-His-Lys單體之步驟(b)可以是藉由使用蛋白酶處理經純化的胜肽而將Gly-His-Lys單體分離成各個單體之步驟。於特定具體實施例中，該蛋白酶可包括胰蛋白酶、腸激酶、凝血酶等，但蛋白酶並無特殊限制，只要其可辨識Lys及緊接在Lys後方裂解即可。

於本發明之特定具體實施例中，涵括用於製備藍銅胜肽之表現載體的巴斯德畢赤酵母轉形體在甲醇培養基中培養，及藉溶解而收集與分離GHK多聚體。此外，GHK多聚體係藉Ni親和層析術純化，及藉由使用蛋白酶處理經純化的GHK多聚體所得的GHK單體，與銅反應而最終獲得藍銅胜肽(第3圖)。又復，確證最終所得藍銅胜肽之純度為95%或以上，及藍銅胜肽之生產濃度具有1升培養液100毫克或以上之產率(第4及5圖)。

如此提示用於製備依據本發明之藍銅胜肽的表現卡匣、表現載體、及含有該表現載體之轉形體可被有 效地使用於製備藍銅胜肽。

本發明之又另一態樣提供一種含有藉由如上方法製備的複數個Gly-His-Lys單體之藍銅胜肽。

特別，Gly-His-Lys單體之定義係與前述者相同。

於特定具體實施例中，藍銅胜肽可以是具有下式1結構式之化合物。

此外，本發明之藍銅胜肽可以呈金屬錯合物形式，於其中Cu²⁺離子與甘胺酸之胺基的N、組胺酸之胺基的N、及組胺酸之咪唑環的N配位。

本發明之又另一態樣提供一種含有藍銅胜肽之用於預防毛髮脫落或促進毛髮生長之醫藥組成物。

依據本發明之製備方法製備的藍銅胜肽可具有諸如皮膚再生、傷口癒合、毛囊擴大等功效，及特別於其中，藉由促進頭皮細胞與毛囊細胞的活性而具有預防毛髮脫落或促進毛髮生長的優異效果，及因此藍銅胜肽可有效地用作為用於預防毛髮脫落或促進毛髮生長的醫藥組成物。

可施用本發明之醫藥組成物的毛髮實例可包括各種體毛，諸如頭部毛髮、眉毛、睫毛、陰毛、腋毛、胸毛、鼻毛、腿毛等。

本發明之醫藥組成物可製備成用於預防毛髮脫落或促進毛髮生長的醫藥組成物形式，其進一步含有於醫藥組成物之製備中習用的適當載劑、賦形劑、或稀釋劑。更明確言之，載劑可包括非天然載劑。

特別地，醫藥組成物可分別地依據習知方法調配成口服製劑，諸如粉劑、顆粒劑、錠劑、膠囊劑、懸浮液劑、乳液劑、糖漿劑、噴霧劑等，外用製劑，栓劑，及無菌注射溶液劑。特別，載劑可包括各種非晶形載劑、微球、奈米纖維等。

欲涵括於醫藥組成物中之載劑、賦形劑、或稀釋劑可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、澱粉、金合歡膠、褐藻膠、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯基吡咯啶酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、聚己內酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚左旋乳酸(PLLA)、礦油等。

為了調配，組成物可使用稀釋劑或賦形劑製備，諸如，填充劑、增量劑、黏結劑、保濕劑、崩粉劑、表面活性劑等。

口服投藥用之固體調配物可包括錠劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑等，及此等固體調配物可經由 添加至少一種賦形劑製備，例如，澱粉、碳酸鈣、蔗糖或乳糖、明膠等。此外，除了簡單賦形劑之外，可使用潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、滑石等。

口服投藥用之固體調配物可包括懸浮液劑、內服用的液體藥物、乳液劑、糖漿劑等，除了簡單稀釋劑諸如水及液體石蠟之外，可使用各種賦形劑，諸如保濕劑、甜味劑、芳香劑、保藏劑等。

供腸道外投藥用之調配物可包括無菌水性溶液劑、非水性溶劑、懸浮液劑、乳液劑、凍乾調配物、栓劑等。非水性溶劑及懸浮液劑之實例可包括植物油諸如丙二醇、聚乙二醇、及橄欖油、及可注射酯諸如油酸乙酯等。

用於栓劑之基劑的實例可包括合成脂肪酸酯(Witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐溫(Tween)61、可可脂、肉實樹(laurinum)、甘油明膠等。

以最終組成物之重量為基準，本發明之醫藥組成物可以0.0001wt%至50wt%，及更特別地0.01wt%至20wt%之量含有藍銅胜肽，但其含量並非特別地受此所限。

本發明之醫藥組成物可以醫藥上有效量投予。如於本文中使用，術語「醫藥上有效量」係指可以適用於醫療處理的合理效益/風險比，足够用於疾病的預防或治療而不會引發任何不良效應的用量，及有效劑量水準可基於下列因素決定，包括個體種類、病情嚴重程度、藥物活性、病人年齡、體重、健康狀況、性別、藥物敏感度、投予時間、投予途徑及溶解速率、及使用本發明之組成物 治療的長度、包括欲同時組合使用的藥物因素、及醫學界眾所周知之其它因素。

本發明之醫藥組成物可單獨投予或與其它治療劑組合投予。要緊地係考慮前述因素，投予以最小量獲得最大功效而沒有不良效應之量。

本發明之醫藥組成物之投予劑量可由熟諳技藝人士考慮使用目的、疾病嚴重度、病人年齡、體重、性別、及醫療病史、用作為活性成分的材料種類等決定。舉例言之，本發明之醫藥組成物可以每位成人約0.1奈克/千克至約100毫克/千克，及特別地約1奈克/千克至約10毫克/千克之用量投予。本發明之組成物可以每日一次或平分數劑投予，但投藥頻率並非特別受此所限。劑量不應以任何方式限制本發明之範圍。

本發明之又另一態樣提供一種含有藍銅胜肽之用於預防毛髮脫落或促進毛髮生長的化妝品組成物。

依據本發明之製備方法製備的藍銅胜肽可具有諸如皮膚再生、傷口癒合、毛囊擴大等功效，及特別於其中，藉由促進頭皮細胞與毛囊細胞的活性而具有預防毛髮脫落或促進毛髮生長的優異效果，及因此藍銅胜肽可有效地用作為用於預防毛髮脫落或促進毛髮生長的化妝品組成物。

可施用本發明之化妝品組成物的毛髮實例可包括各種體毛，諸如頭部毛髮、眉毛、睫毛、陰毛、腋毛、胸毛、鼻毛、腿毛等。

以最終組成物之重量為基準，本發明之化妝品組成物可以0.0001wt%至50wt%，及更特別地0.01wt%至10wt%之量含有藍銅胜肽，但其含量並非特別地受此所限。化妝品組成物具有優點在於其於如上範圍內具有預防毛髮脫落及促進毛髮生長的優異功效，及也具有優點在於其安定組成物之調配物。

本發明之化妝品組成物可製備成選自於由下列所組成之組群中之調配物：溶液劑、外用軟膏劑、乳膏劑、泡沫劑、滋養潤膚霜、軟性潤膚霜、敷料、軟水、乳膠、化妝品基劑、精油、護脣膏、肥皂、液體清潔劑、沐浴製劑、防曬霜、防曬油、懸浮液劑、乳液劑、糊膏劑、膠漿劑、擦劑、粉劑、含表面活性劑之清潔劑、油、粉劑粉底、乳液劑粉底、蠟粉底、貼片、及噴霧劑，但該調配物並非受此所限。

本發明之化妝品組成物可進一步含有欲混合入用於皮膚的常見化妝品組成物中之至少一種化妝上可接受之載劑，及舉例言之，常用成分諸如脂肪內容物、水、表面活性劑、保濕劑、低碳烷醇、增稠劑、螯合劑、顏料、保藏劑、芳香劑等可妥適地混合於其中，但額外成分並非受此所限。

涵括於本發明之化妝品組成物中之化妝上可接受之載劑可隨化妝品組成物之調配物而改變。

當本發明之調配物為軟膏劑、糊膏劑、乳膏劑、或膠漿劑時，可使用下列各者作為載劑成分：動物油、 植物油、蠟、石蠟、澱粉、西黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、聚矽氧、膨潤土、二氧化矽、滑石、氧化鋅等，但載劑成分並非受此所限。此等載劑成分可單獨使用或藉混合兩種或多種使用。

當本發明之調配物為粉劑或噴霧劑時，可使用乳糖、滑石、二氧化矽、氫氧化鋁、矽酸鈣、聚醯胺粉末等作為載劑成分。特別，當調配物為噴霧劑時，其可額外涵括推進劑，諸如氯氟烴、丙烷/丁烷、及二甲基醚，但載劑成分並非受此所限。此等載劑成分可單獨使用或藉混合兩種或多種使用。

當本發明之調配物為溶液劑或乳液劑時，可使用溶劑、增溶劑、乳化劑等(例如，水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油等)作為載劑成分，及特定言之，可使用棉籽油、花生油、玉米籽油、橄欖油、蓖麻油、芝麻油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇之脂肪酸酯、或山梨聚糖，但載劑成分並非受此所限。此等載劑成分可單獨使用或藉由混合兩種或多種使用。

當本發明之調配物為懸浮液劑時，可使用液體稀釋劑諸如水、乙醇、及丙二醇；懸浮劑諸如乙氧化異硬脂醇、聚氧基伸乙基山梨糖醇酯、及聚氧基伸乙基山梨聚糖酯；微晶纖維素；偏氫氧化鋁；膨潤土；瓊脂；西黃蓍膠等作為載劑成分，但載劑成分並非受此所限。此等載劑成分可單獨使用或藉混合兩種或多種使用。

當本發明之調配物為懸浮液劑時，可使用脂肪酸之鹼金屬鹽、脂肪酸半酯鹽、脂肪酸蛋白質水解產物、羥基乙基磺酸鹽、羊毛脂衍生物、脂族醇、植物油、甘油、醣等作為載劑成分，但載劑成分並非受此所限。此等載劑成分可單獨使用或藉混合兩種或多種使用。

當本發明之調配物為含表面活性劑之清潔劑時，可使用脂族醇硫酸酯、脂族醇醚硫酸酯、磺基丁二酸一酯、羥基乙基磺酸鹽、咪唑啉鎓衍生物、牛磺酸甲酯、亞肌胺酸酯(sarcosite)、脂肪酸醯胺醚硫酸酯、烷基醯胺基菜鹼、脂族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇醯胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧化甘油脂肪酸酯等作為載劑成分，但載劑成分並非受此所限。此等載劑成分可單獨使用或藉混合兩種或多種使用。

本發明之又另一態樣提供一種含有藍銅胜肽之用於預防毛髮脫落或促進毛髮生長的準藥物組成物。

依據本發明之製備方法製備的藍銅胜肽可具有諸如皮膚再生、傷口癒合、毛囊擴大等功效，及特別於其中，藉由促進頭皮細胞與毛囊細胞的活性而具有預防毛髮脫落或促進毛髮生長的優異效果，及因此藍銅胜肽可有效地用作為用於預防毛髮脫落或促進毛髮生長的準藥物組成物。

可施用本發明之準藥物組成物的毛髮實例可包括各種體毛，諸如頭部毛髮、眉毛、睫毛、陰毛、腋毛、胸毛、鼻毛、腿毛等。

本發明之準藥物組成物可製備成選自於由沐浴精、肥皂、洗手乳、洗髮精、毛髮軟化劑、及養髮水所組成的組群之調配物，但該調配物並非受此所限。

[發明之詳細說明]

後文中，將參考下列實施例以進一步細節描述本發明。然而，此等實例僅供例示目的，本發明並非意圖受此等實例所限。

實施例1：用於表現於其中Gly-His-Lys單體係重複複數次的胜肽(GHK多聚體)之表現卡匣的製備

如於第1圖中顯示，製備用於巴斯德畢赤酵母(核准作為用於生產的安全菌株之酵母菌株(GRAS菌株))中表現的表現卡匣。選擇為巴斯德畢赤酵母訂製的啟動子及分泌信號序列用於高度表現/高度分泌。更明確言之，aox啟動子用作為啟動子，及啤酒酵母之α交配因子前序列用作為分泌信號序列。然後，目標多核苷酸序列(於其中Gly-His-Lys單體係重複6次或10次的胜肽)排列於其下游，及再度，用於高效率分離/純化的His-tag序列排列於其下游，及最後，製備於其中插入終結子序列的用於高度表現/高度分泌GHK之表現卡匣。此外，藉密碼子優化，獲得編碼目標胜肽之多核苷酸序列。

編碼GHK多聚體之特定核苷酸序列顯示於下表1。

實施例2：表現載體之製備及被導入表現載體之酵母的培養

如於第2圖中顯示，實施例1製備的表現卡匣於30℃於轉形緩衝液(不含任何胺基酸的0.67%酵母氮基劑，0.076%酵母合成流失腺嘌呤，及2%葡萄糖)中，藉由限制酶處理、接合等習知方法，插入表現載體pPink α-HC(英維托吉(Invitrogen))內部以製備轉形載體pBJY_GHK6或pBJY_GHK10。該等載體藉電泳方法分別地導入(轉形入)巴斯德畢赤酵母菌株內部而製備轉形體，及轉形體使用含甲醇培養基培養。

首先，巴斯德畢赤酵母菌落接種入含葡萄糖之YPD培養基內部而製備第一培養物，及讓第一培養物於 振搖瓶中生長(於29℃至30℃以280rpm振搖)至接近融合狀態。然後，第一培養物接種入緩衝甘油複合培養基(BMGY)內以製備第二培養物，及讓第二培養物生長至8.0 OD₆₀₀，及所得第二培養經離心獲得丸粒。丸粒再懸浮於BMMY及BMM各自內以製備第三培養物。第三培養以24小時間隔，歷時120小時至144小時，進給甲醇至0.6%終濃度而維持目標胜肽的誘發。

實施例3：於培養酵母中表現的目標胜肽之高效率/高純度分離與純化

收集培養酵母之後，酵母細胞藉通用方法溶解，及自溶解產物分離目標胜肽亦即GHK多聚體。胜肽使用物理/化學分離/純化技術分離。但因His標籤序列係涵括於實例1中製備的表現卡匣內，故目標胜肽係藉His能被良好地吸附於其中的Ni親和層析術純化(第3圖)。

此外，如於第3圖中顯示，GHK單體係藉以胰蛋白酶處理目標胜肽分離，及已分離的GHK單體與銅反應而最終獲得藍銅胜肽。

指示藉HPLC及GC-MS分析GHK之純度的頻譜圖係分別顯示於第4圖及第5圖。藉由分析，證實最終所得藍銅胜肽具有95%或以上之純度。此外，至於藍銅胜肽之濃度的計算結果，證實產率為每1升培養液100毫克或以上。

自前文說明，熟諳本發明相關技藝人士將能瞭解，未修改本發明之技術構想或主要特徵，可以其它特 定形式具體實施本發明。就此方面而言，本文中揭示之具體實施例僅用於例示目的，而不應解譯為限制本發明之範圍。相反地，本發明意圖不僅涵蓋具體實施例，同時也涵蓋如由隨附之申請專利範圍定義的涵括於本發明之精髓及範疇內的各種替代、修改、等效物、及其它實施例。

<110> 韓國生產技術研究院

<120> 用於製備藍銅胜肽之表現卡匣及其用途

<130> OPA17185-TW

<150> KR 10-2016-0133794

<151> 2016-10-14

<160> 2

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GHK多聚體(6)

<400> 1

<210> 2

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GHK多聚體(10)

<400> 2

Claims (14)

1. 一種用於製備藍銅胜肽之表現卡匣，其包含編碼胜肽之多核苷酸序列，於該胜肽中Gly-His-Lys單體係重複複數次。
2. 如申請專利範圍第1項所述之表現卡匣，其中，該於其中Gly-His-Lys單體係重複複數次的胜肽為於其中Gly-His-Lys單體係重複6次至10次的Gly-His-Lys多聚體。
3. 如申請專利範圍第1項所述之表現卡匣，其中，該多核苷酸序列係可操作地鏈接至於酵母中表現的啟動子序列及用於分泌該胜肽的信號序列。
4. 如申請專利範圍第3項所述之表現卡匣，其中，該啟動子為GPD、TDH、ADH、CYC1、或STE5啟動子。
5. 如申請專利範圍第3項所述之表現卡匣，其中，該信號序列為啤酒酵母之α交配因子前序列。
6. 如申請專利範圍第1項所述之表現卡匣，其中，該表現卡匣進一步包含位在該表現卡匣內部的該多核苷酸序列上游或下游之3個至9個編碼His、GST、或內含肽的多核苷酸。
7. 如申請專利範圍第6項所述之表現卡匣，其中，該於其中Gly-His-Lys單體係重複複數次的胜肽係透過離胺酸(K)連接物或天冬酸根-天冬酸根-天冬酸根-天冬酸根-離胺酸(DDDDK)連接物而鏈接至編碼His、GST、或內含肽的多核苷酸。
8. 一種用於製備藍銅胜肽之表現載體，其包含如申請專利範圍第1至7項中任一項中所述之表現卡匣。
9. 一種轉形體，其包含如申請專利範圍第8項所述之表現載體。
10. 如申請專利範圍第9項所述之轉形體，其為啤酒酵母、粟酒裂殖酵母、或巴斯德畢赤酵母。
11. 一種用於製備藍銅胜肽之方法，其包含培養如申請專利範圍第10項所述之轉形體。
12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其進一步包含：(a)純化自該經培養之轉形體表現的該胜肽；(b)使用蛋白酶處理該經純化的胜肽，以自該胜肽分離該Gly-His-Lys單體；及(c)讓該Gly-His-Lys單體與銅反應，以製備藍銅胜肽。
13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中，當His、GST、或內含肽係以3個或以上至9個或以下之範圍存在於該胜肽之N端或C端時，純化該胜肽之步驟(a)包含以降解該蛋白質之蛋白酶進行處理。
14. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中，該蛋白酶為胰蛋白酶、腸激酶、或凝血酶。