KR102450644B1 - 기능성 펩타이드의 분리정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기능성 펩타이드의 분리정제 방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 모노머 전환 효소가 내부에 고정된 컬럼을 가지는 분리장치를 준비하고, 멀티머 펩타이드가 혼합된 용액을 상기 컬럼을 통과시킴으로써 간단하게 대량의 모노머 펩타이드를 얻을 수 있으며, 상기 분리장치의 세척을 통해 반복적으로 멀티머 펩타이드를 모노머 펩타이드로 전환할 수 있고, 복수 개의 모노머 전환효소들과, 상기 복수개의 모노머 전환효소들을 에워싸며 다공성을 가지는 캡슐층을 포함하는 비드를 화학적 결합없이 컬럼 내에 패킹함으로써 모노머 전환효소를 용이하게 컬럼 내에 고정시킬 수 있어, 경제성을 향상시킬 수 있는 기능성 펩타이드의 분리정제 방법에 대한 것이다.

Description

기능성 펩타이드의 분리정제 방법{Method for seperating and purifying functional peptide}

본 발명은 기능성 펩타이드의 분리정제 방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 모노머 전환 효소가 내부에 고정된 컬럼을 가지는 분리장치를 준비하고, 멀티머 펩타이드가 혼합된 용액을 상기 컬럼을 통과시킴으로써 간단하게 대량의 모노머 펩타이드를 얻을 수 있으며, 상기 분리장치의 세척을 통해 반복적으로 멀티머 펩타이드를 모노머 펩타이드로 전환할 수 있고, 복수 개의 모노머 전환효소들과, 상기 복수개의 모노머 전환효소들을 에워싸며 다공성을 가지는 캡슐층을 포함하는 비드를 화학적 결합없이 컬럼 내에 패킹함으로써 모노머 전환효소를 용이하게 컬럼 내에 고정시킬 수 있어, 경제성을 향상시킬 수 있는 기능성 펩타이드의 분리정제 방법에 대한 것이다.

일반적으로 펩타이드는 독성이 적어 안전하며, 강력한 생리활성을 가지고 있고, 빛에 안정적이고 물과의 친화력이 강한 특성이 있는데, 특정 펩타이드는 피부 미백, 탈모 방지, 주름 개선, 보습 등의 효과도 제공하므로, 상기 펩타이드를 기능성 소재로 이용한 화장품이 널리 개발되고 있다.

상기 화장품의 기능성 소재로 사용되는 펩타이드는 대표적으로 하기 특허문헌 1에 기재된 바와 같이 화학 합성에 의해 제조되는데, 상기 펩타이드를 화학 합성 방법에 의해 제조 시, 합성 기기의 한계로 인해 경제성이 떨어지고, 미량의 유해물질을 함유할 수 있어 피부 자극 가능성 등이 존재한다. 상기와 같이 화장품용 펩타이드를 화학 합성 시 문제점을 해결하기 위해, 하기 특허문헌 2에 기재된 바와 같이, 펩타이드 제조용 발현 카세트를 이용한 효모 발효 공정 등의 생물학적 과정을 통해 모노머 펩타이드가 여러 개 결합되어 있는 멀티머 펩타이드를 생산하여 화장품 원료로 사용하고 있다.

<특허문헌>

특허문헌 1: 국제특허출원 공개공보 제WO2012/166810호(2012. 12. 06. 공개) "BIOLOGICALLY ACTIVE TRI-PEPTIDE"

특허문헌 2: 특허 제10-1766876호(2017. 08. 03. 등록) "카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트 및 이의 이용"

하지만, 상기 생물학적 방법에 의해 생산된 멀티머 펩타이드는 순도가 떨어지는 문제가 있어, 멀티머 펩타이드를 단백질 분해효소를 사용하여 모노머 펩타이드로 전환하여 화장품 원료로 사용하게 되는데, 멀티머 펩타이드를 모노머 펩타이드로 전환하는 과정에서 대용량의 멀티머 펩타이드를 처리할 수 없고, 단백질 분해효소의 재사용이 불가능하여 경제성이 떨어지는 문제가 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,

본 발명은 모노머 전환 효소가 내부에 고정된 컬럼을 가지는 분리장치를 준비하고, 멀티머 펩타이드가 혼합된 용액을 상기 컬럼을 통과시킴으로써 간단하게 대량의 모노머 펩타이드를 얻을 수 있는 기능성 펩타이드의 분리정제 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 분리장치의 세척을 통해 반복적으로 멀티머 펩타이드를 모노머 펩타이드로 전환할 수 있는 기능성 펩타이드의 분리정제 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 복수 개의 모노머 전환효소와, 상기 모노머 전환효소들을 에워싸며 다공성을 가지는 캡슐층을 포함하는 비드를 화학적 결합없이 컬럼 내에 패킹함으로써, 모노머 전환효소를 용이하게 컬럼 내에 고정시킬 수 있는 기능성 펩타이드의 분리정제 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 앞서 본 목적을 달성하기 위해서 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해서 구현된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 기능성 펩타이드 분리장치는 유입구와 유출구를 가지는 컬럼과, 상기 컬럼 내에 패킹되는 모노머 전환효소 비드를 포함하며, 상기 모노머 전환효소 비드는 복수 개의 모노머 전환효소들과, 상기 모노머 전환효소들을 에워싸며 다공성을 가지는 캡슐층을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 기능성 펩타이드 분리장치에 있어서 상기 모노머 전환효소 비드는 내부에 복수 개의 모노머 전환 효소가 위치하는 알지네이트 비드인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 기능성 펩타이드 분리정제 방법은 멀티머 펩타이드가 혼합된 혼합 용액을 기능성 펩타이드 분리장치의 컬럼의 유입구에 투입하여 컬럼을 통과시켜 멀티머 펩타이드와 모노머 전환효소를 반응시키는 반응단계와, 상기 반응단계 후 상기 컬럼의 유출구에서 배출된 모노머 펩타이드를 회수하는 회수단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 기능성 펩타이드 분리정제 방법에 있어서 상기 기능성 펩타이드 분리장치는 제1항의 기능성 펩타이드 분리장치가 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 기능성 펩타이드 분리정제 방법에 있어서 상기 기능성 펩타이드 분리장치는 유입구와 유출구를 가지는 컬럼과, 상기 컬럼 내에 고정되는 모노머 전환효소를 포함하며, 상기 모노머 전환효소는 레진에 의해 컬럼 내에 고정되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 기능성 펩타이드 분리정제 방법은 상기 회수단계 후 세척 용액을 상기 기능성 펩타이드 분리장치의 컬럼을 통과시켜 모노머 전환효소를 세척하는 세척단계를 추가로 포함하여, 상기 기능성 펩타이드 분리장치를 재사용할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 앞서 본 실시예와 하기에 설명할 구성과 결합, 사용관계에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.

본 발명은 모노머 전환 효소가 내부에 고정된 컬럼을 가지는 분리장치를 준비하고, 멀티머 펩타이드가 혼합된 용액을 상기 컬럼을 통과시킴으로써 간단하게 대량의 모노머 펩타이드를 얻을 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 상기 분리장치의 세척을 통해 반복적으로 멀티머 펩타이드를 모노머 펩타이드로 전환할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 복수 개의 모노머 전환효소와, 상기 모노머 전환효소들을 에워싸며 다공성을 가지는 캡슐층을 포함하는 비드를 화학적 결합없이 컬럼 내에 패킹함으로써, 모노머 전환효소를 용이하게 컬럼 내에 고정시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 기능성 펩타이드의 분리정제 방법을 설명하기 위한 참고도.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 기능성 펩타이드의 분리정제 방법을 설명하기 위한 참고도.

이하에서는 본 발명에 따른 기능성 펩타이드의 분리정제 방법을 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대해 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 일 실시예는 기능성 펩타이드의 분리정제 방법에 대한 것으로, 상기 분리정제 방법은 컬럼 내에 모노머 전환효소를 고정하여 기능성 펩타이드 분리장치를 준비하는 장치준비단계와, 멀티머 펩타이드가 혼합된 혼합 용액을 상기 장치준비단계에서 준비된 기능성 펩타이드 분리장치의 컬럼의 유입구에 투입하여 컬럼을 통과시켜 멀티머 펩타이드와 모노머 전환효소를 반응시키는 반응단계와, 상기 반응단계 후 상기 컬럼의 유출구에서 배출된 모노머 펩타이드를 회수하는 회수단계를 포함한다.

상기 모노머 펩타이드는 특정 활성(미백, 주름 개선, 탈모 개선 효과 등)을 가지는 최소 단위의 펩타이드를 의미하며, 상기 멀티머 펩타이드는 상기 모노머 펩타이드가 복수 개가 결합되어 있는 펩타이드의 집합체를 의미한다. 상기 멀티머 펩타이드에는 동일한 종류의 모노머 펩타이드가 결합되어 있을 수도 있고, 서로 다른 종류의 모노머 펩타이드가 결합되어 있을 수도 있다. 구체적인 예를 들어 설명하면, 특정 아미노산 서열(EEMQRRR)을 가지며 주름 개선 효과를 제공하는 아지렐린(Argireline)이 모노머 펩타이드에 해당되며, 복수 개의 아지렐린이 결합된 집합체가 멀티머 펩타이드에 해당하게 된다.

상기 모노머 전환효소는 멀티머 펩타이드를 절단하여 모노머 펩타이드로 분리하는 효소를 의미하며, 예컨대, 트립신, 엔테로카이네이즈 등이 사용될 수 있다. 구체적인 예를 들어 설명하면, GHK의 아미노산 서열로 이루어진 모노머 펩타이드가 반복되어 있는 멀티머 펩타이드에 대하여, Lys을 인식하여 Lys 뒤를 절단할 수 있는 효소(모노머 전환효소)를 이용하는 경우, GHK의 아미노산 서열로 이루어진 모노머 펩타이드들로 분리하는 것이 가능하다.

상기 기능성 펩타이드의 분리정제 방법의 설명에 앞서, 상기 방법에 사용되는 기능성 펩타이드 분리장치의 일 예를 도 1을 참조하여 살펴보면, 유입구(11)와 유출구(12)를 가지는 컬럼(1)과, 상기 컬럼(1) 내에 패킹되는 모노머 전환효소 비드(2)를 포함한다. 상기 모노머 전환효소 비드(2)는 복수 개의 모노머 전환효소들(21)과, 상기 모노머 전환효소들(21)을 에워싸며 다공성을 가지는 캡슐층(22)을 포함한다. 상기 모노머 전환효소 비드는 공지의 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으나, 도 1에 도시된 바와 같이 수용액에 모노머 전환효소(21), 소디움 알지네이트(23), 칼슘 이온(24)을 혼합한 후 반응시켜 제조한, 내부에 복수 개의 모노머 전환 효소가 위치하는 알지네이트 비드일 수 있다. 상기 모노머 전환효소 비드(2)는 화학적 결합에 의해 컬럼 내에 결합되지 않고 단순히 컬럼 내에 패킹되어 위치하게 되는데, 상기 비드(2)의 컬럼(1) 내의 패킹은 다양한 방법에 의해 이루어질 수 있으며, 도시하지 않았지만 예컨대 컬럼 하단에 메쉬망이 설치되어 모노머 전환효소 비드(2)가 컬럼의 유출구를 통해서 배출되지 않도록 할 수 있다. 상기 모노머 전환효소 비드(2)는 다공성을 가지므로, 상기 멀티머 펩타이드가 혼합된 혼합 용액이 모노머 전환효소 비드(2)의 세공에 유입되어 모노머 전환효소와 반응을 할 수 있게 된다.

상기 방법에 사용되는 기능성 펩타이드 분리장치의 타 예를 도 2를 참조하여 설명하면, 유입구(11')와 유출구(12')를 가지는 컬럼(1')과, 상기 컬럼(1') 내에 고정되는 모노머 전환효소(21')를 포함하며, 모노머 전환효소(21')는 레진(resin, 3)에 의해 컬럼(1') 내에 고정되게 되며, 상기 레진(3)은 컬럼(1')과 모노머 전환효소(21')를 결합시킬 수 있는 접착력을 가지는 공지의 합성 및 천연 수지가 사용될 수 있다.

상기 장치준비단계는 컬럼 내에 모노머 전환효소를 고정하여 기능성 펩타이드 분리장치를 준비하는 단계로, 앞서 설명한 바와 같이, 모노머 전환효소 비드(2)를 컬럼(1) 내에 패킹하여 도 1에 도시된 바와 같은 기능성 펩타이드 분리장치를 준비할 수 있고, 레진(3)을 이용하여 모노머 전환효소(21')를 컬럼(1') 내부에 결합시켜 도 2에 도시된 바와 같은 기능성 펩타이드 분리장치를 준비할 수 있다.

상기 반응단계는 멀티머 펩타이드(100)가 혼합된 혼합 용액을 상기 장치준비단계에서 준비된 분리장치의 컬럼의 유입구에 투입하여 컬럼을 통과시켜 멀티머 펩타이드와 모노머 전환효소를 반응시키는 단계로, 도 1 및 2에 도시된 바와 같이, 기능성 펩타이드 분리장치의 컬럼 유입구에 멀티머 펩타이드(100)가 혼합된 혼합 용액을 투입하면 상기 혼합용액이 하측으로 이동하면서 멀티머 펩타이드는 모노머 전환효소에 의해 절단되어 모노머 펩타이드들(200)로 분리되게 된다.

상기 회수단계는 상기 반응단계 후 상기 컬럼의 유출구에서 배출된 모노머 펩타이드(200)를 회수하는 단계로, 상기 멀티머 펩타이드(100)는 컬럼을 통과하면서 절단되므로, 컬럼의 유출구에서 배출되는 배출물을 회수하여 모노머 펩타이드들(200)을 회수할 수 있다.

상기 기능성 펩타이드 분리정제 방법은, 상기 반응단계 전에 멀티머 펩타이드(100)에서 목적하는 모노머 펩타이드 이외의 이물질을 제거하는 전처리단계와, 상기 회수단계 후 세척 용액을 상기 분리장치의 컬럼을 통과시켜 모노머 전환효소를 세척하는 세척단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 전처리단계는 상기 반응단계 전에 멀티머 펩타이드(100)에서 목적하는 모노머 펩타이드 이외의 이물질을 제거하는 단계로, 상기 멀티머 펩타이드(100)는 천연물에서 추출하거나 생물학적 방법에 의해 생성되므로, 목적하는 모노머 펩타이드 이외에 소량을 이물질(에컨대, 목적하지 않는 펩타이드, His-tag 등)이 존재하므로, 이를 제거하게 된다.

상기 세척단계는 회수단계 후 세척 용액(예컨대 PBS 용액)을 상기 분리장치의 컬럼을 통과시켜 모노머 전환효소를 세척하는 단계이다. 상기 세척단계를 통해 컬럼 내, 비드의 세공 내에 잔류하는 혼합 용액 등의 이물질이 제거되므로, 상기 분리장치를 재사용할 수 있게 된다.

이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.

1, 1': 컬럼 2: 비드 3: 레진
11, 11': 유입구 12, 12': 유출구 21, 21': 모노머 전환효소
22: 캡슐층 23: 소디움 알지네이트 24: 칼슘 이온
100: 멀티머 펩타이드 200: 모노머 펩타이드

Claims (6)

1. 삭제
2. 삭제
3. 화장품의 원료로 사용되는 특정 활성을 가지는 모노머 펩타이드를 얻기 위한 분리정제 방법에 있어서,
   상기 분리정제 방법은 멀티머 펩타이드가 혼합된 혼합 용액을 기능성 펩타이드 분리장치의 컬럼의 유입구에 투입하여 컬럼을 통과시켜 멀티머 펩타이드와 모노머 전환효소를 반응시키는 반응단계와, 상기 반응단계 후 상기 컬럼의 유출구에서 배출된 모노머 펩타이드를 회수하는 회수단계를 포함하며,
   상기 기능성 펩타이드 분리장치는 유입구와 유출구를 가지는 컬럼과, 상기 컬럼 내에 고정되는 모노머 전환효소를 포함하며, 컬럼과 모노머 전환효소를 결합시키는 접착력을 제공하는 레진에 의해 상기 모노머 전환효소는 컬럼 내에 고정되고,
   상기 분리정제 방법은 세척 용액을 상기 기능성 펩타이드 분리장치의 컬럼을 통과시켜 모노머 전환효소를 세척하는 세척단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 기능성 펩타이드 분리정제 방법.
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