KR101766876B1 - 카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트 및 이의 이용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 Gly-His-Lys 단량체가 복수회 반복되는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 카퍼펩타이드의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 카퍼펩타이드, 및 상기 카퍼펩타이드를 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트, 발현 벡터 및 이를 포함하는 형질전환체를 이용하면, 적은 비용으로 고순도의 카퍼펩타이드를 대량으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 카퍼펩타이드는 탈모방지 및 발모촉진 효과가 뛰어나므로, 탈모방지 또는 발모촉진 용도의 화장품 소재, 의약외품 및 의약품 등 산업 전반에 널리 이용될 수 있다.
본 발명의 카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트, 발현 벡터 및 이를 포함하는 형질전환체를 이용하면, 적은 비용으로 고순도의 카퍼펩타이드를 대량으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 카퍼펩타이드는 탈모방지 및 발모촉진 효과가 뛰어나므로, 탈모방지 또는 발모촉진 용도의 화장품 소재, 의약외품 및 의약품 등 산업 전반에 널리 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 Gly-His-Lys 단량체가 복수회 반복되는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 카퍼펩타이드의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 카퍼펩타이드, 및 상기 카퍼펩타이드를 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.
카퍼펩타이드(copper peptide)는 우리 몸속의 혈액 내 플라즈마에 존재하는 펩타이드로 피부 내 상처가 났을 때 이를 회복시켜 피부를 빠르게 재생시켜 주는 역할을 하는 펩타이드로 알려져 있는데, 3개의 아미노산, 즉, 글라이신(Glycine), 히스티딘(Histidine) 및 라이신(Lysine)으로 구성되어 있고, 여기에 구리 이온이 결합하여 활성을 나타낸다.
최근에는 이러한 카퍼펩타이드가 피부의 진피층의 가장 중요한 성분인 콜라겐과 엘라스틴의 합성에도 중요한 역할을 하며, 두피 및 모낭세포의 성장확대 및 세포분열을 촉진한다는 사실이 입증되어 다양한 스킨 케어 제품 및 샴푸를 포함하는 헤어 제품에 함유되어 이용되고 있다.
또한, 카퍼펩타이드는 줄기세포의 활성화, 당뇨병 환자의 피부궤양 치료 효능, 위궤양 치료 효능, 소화장기 기능 개선 및 항암 작용 등 다양한 효과가 있는 것으로 보고되고 있어, 이러한 카퍼펩타이드를 안전하게 대량으로 제조하기 위한 기술이 계속해서 연구되고 있다.
현재 카퍼펩타이드는 주로 화학합성에 의해서 제조되고 있는데, 예를 들어 국제특허출원 공개공보 WO2012/166810에 카퍼펩타이드의 화학합성 방법이 개시되어 있다. 카퍼펩타이드는 3개의 짧은 아미노산과 구리가 결합된 형태로 이루어져 있기 때문에 화학합성 방법으로 많이 제조하지만, 인체에 사용하는 물질이므로 화학합성 공정에서 함유되는 여러 유독 물질이 혼합될 수 있기 때문에 이러한 화학합성 방법은 고순도의 분리/정제 공정을 필요로 한다.
따라서, 화학합성 대신 안전성이 높은 효모의 발효공정을 이용한 생물공정으로 고순도의 카퍼펩타이드를 대량생산할 수 있는 기술 개발이 계속해서 요구되고 있는 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 효모의 발효공정을 이용한 생물공정으로 카퍼펩타이드를 제조하기 위하여 예의 노력한 결과, 복수 개의 글라이신(Gly)-히스티딘(His)-라이신(Lys) 단량체를 반복시킨 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 효모의 일종인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 도입하고, 상기 효모를 배양하여 발현된 펩타이드를 분리 및 정제함으로써 고순도의 카퍼펩타이드를 저비용으로 대량 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 Gly-His-Lys 단량체가 복수회 반복되는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 발현 카세트를 포함하는, 카퍼펩타이드 제조용 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 카퍼펩타이드의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된, 복수개의 Gly-His-Lys 단량체를 포함하는 카퍼펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 카퍼펩타이드를 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 카퍼펩타이드를 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 카퍼펩타이드를 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 Gly-His-Lys 단량체가 복수회 반복되는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트를 제공한다.
본 발명의 용어, "Gly"는 글라이신 아미노산을 의미하며, 본 명세서에서 'Glycine', 'Gly' 또는 'G'로 혼용되어 명명될 수 있다. 마찬가지로, "His"는 히스티딘 아미노산을 의미하며, 'Histidine', 'His' 또는 'H'로 혼용되어 명명될 수 있으며, "Lys"은 라이신 아미노산을 의미하며, 'Lysine', 'Lys' 또는 'K'로 혼용되어 명명될 수 있다. 상기 세 아미노산이 순차적으로 결합한 Gly-His-Lys 트리펩타이드는 'GHK'로 혼용되어 명명될 수 있다.
본 발명의 용어, "Gly-His-Lys 단량체"는 글라이신 아미노산, 히스티딘 아미노산 및 라이신 아미노산이 순서대로 연결된 트리펩타이드(tripeptide)를 의미한다.
본 발명의 용어, "카퍼펩타이드"는 상기 Gly-His-Lys 단량체가 복수회 반복되는 펩타이드에 구리(Cu)가 결합된 화합물을 의미하며, 본 명세서에서 'Cu-GHK' 또는 'GHK-Cu'로 혼용되어 명명될 수 있다.
본 발명의 용어, "카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트"는 Gly-His-Lys 단량체가 복수회 반복되는 펩타이드를 발현할 수 있는 발현구조체를 의미한다.
본 발명에서, 상기 발현 카세트는 상기 단량체가 복수회 반복되는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 상기 펩타이드는 상기 단량체가 3 내지 20회, 더욱 구체적으로 5 내지 15회, 가장 구체적으로 6 내지 10회 반복되는 Gly-His-Lys 멀티머인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단량체가 3개 미만인 멀티머의 경우에는 이로부터 얻어지는 GHK 단량체의 수가 너무 적어 생산 효율성이 저하되며, GHK 단량체가 20개 이상인 멀티머의 경우에는 발현 효율이 낮다는 문제점이 있다.
구체적으로, 상기 발현 카세트가 포함하는, 상기 단량체가 복수회 반복되는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용되는 염기서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
따라서, 상기 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열과 높은 상동성을 갖는 염기서열, 예를 들면 그 상동성이 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 90%이상의 높은 상동성을 갖는 염기서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
또한, 상기 발현 카세트는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이, 효모에서 발현될 수 있는 프로모터 서열 및 고분비 신호 서열과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다.
구체적인 예로, 상기 프로모터는 GPD(promoter of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) TDH(promoter of Threonine Dehydrogenase), ADH(promoter of alcohol dehydrogenase), CYC1(promoter of Cytochrome c, isoform 1), STE5 프로모터 또는 이들의 조합일 수 있으나, 효모에서 발현하기에 적절한 프로모터라면 특별히 이에 제한되지 않는다. 상기 예시된 프로모터의 서열은 당업계에 알려진 서열을 사용할 수 있다.
다른 구체적인 예로, 상기 고분비 신호 서열은 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)의 α-접합인자 전서열(α-mating factor pre-sequence)일 수 있으나, 발현하고자 하는 목적 펩타이드(Gly-His-Lys 단량체가 복수회 반복되는 펩타이드, 즉, GHK 멀티머)가 잘 분비될 수 있으면 특별히 이에 제한되지 않는다. 상기 예시된 고분비 신호 서열은 당업계에 알려진 서열을 사용할 수 있다.
상기 프로모터와 고분비 신호 서열은 목적 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결되는 것이 바람직하다.
상기 용어, '작동가능하게 연결된'(operably linked)은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예로, 프로모터와 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위 특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 발현 카세트는, 발현된 목적 펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위하여, 상기 발현 카세트 내의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 His, GST 또는 인테인(intein)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 3 내지 9개를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 His, GST 또는 인테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 상기 Gly-His-Lys 단량체가 복수회 반복되는 펩타이드는 K(Lysine) 또는 DDDDK(Aspartate-Aspartate-Aspartate-Aspartate-Lysine) 링커를 통해 연결된 것일 수 있다. 그러나, 목적 펩타이드의 정제를 용이하게 할 수 있다면 특별히 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 발현 카세트는 프로모터, 고분비 신호 서열, 목적 펩타이드를 코딩하는 서열 및 His 등의 서열 외에도 전사 증강인자, 종결인자, 개시인자 및 다른 유전적 조절 인자들 또는 재조합 목적 펩타이드의 항원성 또는 결합 친화도를 주는 인자들과 같은 목적 펩타이드의 발현을 조절하는 구성요소들을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, aox 프로모터, 분비용 신호 서열(사카로마이세스 세레비지에의 α-접합인자 전서열), Gly-His-Lys 단량체가 6회 또는 10회 반복되는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, His-tag 서열, 및 종결 서열이 순차적으로 삽입된 GHK 고발현/고분비용 발현 카세트를 제작하였다(도 1).
다른 하나의 양태는 상기 발현 카세트를 포함하는, 카퍼펩타이드 제조용 발현 벡터를 제공한다.
이때, 상기 '발현 카세트' 및 '카퍼펩타이드'의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "발현 벡터"는 숙주세포에 DNA를 도입하여 목적 유전자의 발현을 효율적으로 유도하기 위한 수단으로서, 구체적으로 Gly-His-Lys 단량체가 복수회 반복되는 펩타이드가 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미할 수 있다.
본 발명에서, 상기 발현 벡터는 본 발명의 Gly-His-Lys 단량체가 복수회, 구체적으로 6 내지 10회 반복되는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트를 포함할 수 있다.
상기 발현 벡터의 구체적인 예로, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 또는 바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 더욱 구체적인 예로, 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pET30a, pET30c 또는 pGEX-GST), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 또는 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50, pPINKα-HC, pPink-HC 또는 pPink-LC) 또는 Ti 플라스미드 등을 사용할 수 있고, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스 또는 식물 바이러스가 사용될 수 있으며, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터를 사용할 수 있다.
더욱 구체적인 예로, 상기 벡터는 효모 유래 플라스미드인 pPINKα-HC일 수 있지만, 본 발명의 발현 카세트를 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 발현 벡터는 발현조절 서열과 기능적으로 연결될 수 있다. 구체적인 예로, 상기 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 발명의 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트를 통상의 제한효소 처리 방법 및 라이게이션(ligation)을 통해 발현 벡터 pPinkα-HC에 삽입하여 카퍼펩타이드 제조용 발현 벡터를 제작하였다(실시예 2).
또 다른 하나의 양태는 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
이때, 상기 '벡터'의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "형질전환체"는 외래의 유전물질이 도입되어 유전형질이 변화된 생물체를 의미한다.
구체적인 예로, 상기 형질 전환체는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)일 수 있으나, 상기 Gly-His-Lys 단량체가 복수회 반복된 펩타이드, 즉 GHK 멀티머를 발현할 수 있으면 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 용어 '피키아 파스토리스(Pichia pastoris)'는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 함께 재조합 단백질 생산에 가장 널리 활용되는 효모 균주를 의미한다. 상기 효모 균주는 유전자 조작이 용이하며 다양한 발현시스템이 개발되어 있고 대량배양이 용이하다는 장점을 갖는다. 뿐만 아니라, 인체 단백질과 같은 고등세포 유래의 재조합 단백질을 생산할 때 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 분비기능, 및 당쇄 부가 등과 같은 단백질의 번역 후 수식(post-translational modification) 기능을 수행할 수 있는 장점을 제공한다. 재조합 단백질의 분비 생산은 단백질 분비 신호와 목표단백질을 인위적으로 융합(fusion)하여 세포외 분비를 가능하게 한 것으로, 단백질의 분비과정을 통해서 단백질의 폴딩(folding)이나 이황화 결합의 형성 및 당쇄부가 과정이 진행됨에 따라, 생물학적으로 완전한 활성을 갖는 재조합 단백질을 생산할 수 있는 장점이 있다. 또한, 생물학적 활성을 갖는 단백질을 배지로부터 직접 얻을 수 있기 때문에 경제적으로 효율이 낮은 세포의 분쇄나 재접힘 단계를 필요로 하지 않아 매우 경제적이다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 카퍼펩타이드 제조용 발현 벡터를 전기충격(electroporation transformation) 방법으로 피키아 파스토리스 균주에 도입(형질주입)하여 형질전환체를 제작하였다(실시예 2).
또 다른 하나의 양태는 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 카퍼펩타이드의 제조방법을 제공한다.
이때, 상기 '형질전환체' 및 '카퍼펩타이드'의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명에서, 상기 형질전환체를 배양하는 단계는 상기 형질전환체의 영양 요구성을 고려하여 수행될 수 있다. 구체적인 예로, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 메틸영양 요구성 효모 세포로서, 이의 배양을 위해서 완충된 복합 메탄올 배지(BMMY), 완충된 최소 메탄올 배지(BMM) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 발명의 목적에 맞게 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
또한, 상기 형질전환체의 배양물로부터 목적 펩타이드의 회수는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나, 본 발명의 GHK 멀티머를 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제조방법은, (a) 배양된 형질전환체로부터 발현된 펩타이드를 정제하는 단계; (b) 정제된 상기 펩타이드에 단백질분해효소를 처리하여 상기 펩타이드로부터 Gly-His-Lys 단량체를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 Gly-His-Lys 단량체와 구리를 반응시켜 카퍼펩타이드를 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 펩타이드를 정제하는 단계 (a)는, 배양된 형질전환체로부터 발현된 펩타이드를 분리 및 정제하는 단계; 및 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 3개 이상 9개 이하의 His, GST 또는 인테인 단백질이 있는 경우, 상기 단백질을 분해하는 효소를 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 배양된 형질전환체로부터 발현된 펩타이드를 분리 및 정제하는 단계에는 Ni-column, Gel chromatograpy 또는 Boiling을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 발명의 목적에 맞게 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
또한, 상기 Gly-His-Lys 단량체를 분리하는 단계 (b)는, 단계 (a)에 의해 정제된 상기 펩타이드에 단백질분해효소를 처리하여 각각의 단량체들로 분리하는 단계일 수 있다. 상기 단백질분해효소의 구체적인 예로, 트립신, 엔테로카이네이즈 또는 트롬빈 등이 있으나, Lys을 인식하여 Lys 뒤를 절단할 수 있는 효소라면 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 카퍼펩타이드 제조용 발현 벡터를 포함하는 피키아 파스토리스 형질전환체를 메탄올 함유 배지에서 배양한 후, 이를 수집 및 용해하여 GHK-멀티머를 분리하였다. 또한, Ni-affinity 크로마토그래피로 상기 GHK-멀티머를 정제하였으며, 이를 트립신으로 처리하여 수득한 GHK 단량체를 구리와 반응시켜 최종적으로 카퍼펩타이드를 수득하였다(도 3). 아울러, 최종적으로 수득한 카퍼펩타이드의 순도는 95% 이상이며, 카퍼펩타이드의 생산 농도는 배양액 1L당 100mg 이상의 수율을 나타냄을 확인하였다(도 4 및 5).
이는, 본 발명에 따른 카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트, 발현 벡터 및 이를 포함하는 형질전환체는 카퍼펩타이드의 제조에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또 다른 하나의 양태는 상기 제조방법에 의해 제조된, 복수개의 Gly-His-Lys 단량체를 포함하는 카퍼펩타이드를 제공한다.
이때, 상기 'Gly-His-Lys 단량체'의 정의는 전술한 바와 같다.
구체적인 예로, 상기 카퍼펩타이드는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것일 수 있다.
[화학식 1]
또한, 본 발명의 카퍼펩타이드는 Cu2 + 이온이 글라이신의 아미노기의 N, 히스티딘의 아미노기의 N 및 히스티딘의 잔기의 이미다졸 고리의 N과 배위결합을 하는 금속착화합물 형태일 수 있다.
또 다른 하나의 양태는 상기 카퍼펩타이드를 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 카퍼펩타이드는 피부재생, 상처 치유, 모낭 확대 등의 효과를 나타낼 수 있으며, 그 중에서도 두피 및 모낭세포 활성 촉진을 통한 탈모방지 및 발모촉진 효과가 뛰어나므로, 탈모방지 또는 발모촉진용 약학 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적용 대상이 되는 모발로는, 두발, 눈썹(미모), 속눈썹(첩모), 음모, 겨드랑이털, 가슴털, 코털, 다리털 등의 각종 체모가 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 담체의 형태로는 각종 부정형의 담체, 마이크로 스피어, 나노파이버 등을 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 구체적인 예로, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 폴리카프로락톤(PCL; polycaprolactone), 폴리락틱액시드(PLA; Poly Lactic Acid), 폴리-L-락틱액시드(PLLA; poly- L -lactic acid), 광물유 등을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 카퍼펩타이드에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당 되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 카퍼펩타이드의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 구체적으로 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 상기 용어, '약제학적으로 유효한 양'은 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 탈모방지 또는 발모촉진용 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 구체적으로 약 1 ng/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또 다른 하나의 양태는 상기 카퍼펩타이드를 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 카퍼펩타이드는 피부재생, 상처 치유, 모낭 확대 등의 효과를 나타낼 수 있으며, 그 중에서도 두피 및 모낭세포 활성 촉진을 통한 탈모방지 및 발모촉진 효과가 뛰어나므로, 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 적용 대상이 되는 모발로는, 두발, 눈썹(미모), 속눈썹(첩모), 음모, 겨드랑이털, 가슴털, 코털, 다리털 등의 각종 체모가 포함될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 총 조성물의 중량 대비 상기 카퍼펩타이드를 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 0.01 중량% 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 상기 범위 내에서 우수한 탈모방지 또는 발모촉진 효과를 나타내는 이점이 있으며, 조성물의 제형이 안정화되는 이점이 있다.
상기 본 발명의 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는, 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시테이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
또 다른 하나의 양태는 상기 카퍼펩타이드를 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 카퍼펩타이드는 피부재생, 상처 치유, 모낭 확대 등의 효과를 나타낼 수 있으며, 그 중에서도 두피 및 모낭세포 활성 촉진을 통한 탈모방지 및 발모촉진 효과가 뛰어나므로, 탈모방지 또는 발모촉진용 의약외품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물의 적용 대상이 되는 모발로는, 두발, 눈썹(미모), 속눈썹(첩모), 음모, 겨드랑이털, 가슴털, 코털, 다리털 등의 각종 체모가 포함될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 비누, 핸드 워시, 헤어세정제, 헤어 유연제 및 헤어 토닉으로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트, 발현 벡터 및 이를 포함하는 형질전환체를 이용하면, 적은 비용으로 고순도의 카퍼펩타이드를 대량으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 제조된 카퍼펩타이드는 탈모방지 및 발모촉진 효과가 뛰어나므로, 탈모방지 또는 발모촉진 용도의 화장품 소재, 의약외품 및 의약품 등 산업 전반에 널리 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 카퍼펩타이드를 고발현/고분비할 수 있도록 설계한 발현 카세트를 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 카퍼펩타이드 발현벡터를 효모에 형질전환하는 과정 및 효모를 배양하는 발효조를 나타낸 모식도 및 사진이다.
도 3은 배양된 효모로부터 본 발명의 카퍼펩타이드를 고효율로 분리 정제하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도 및 사진이다.
도 4는 HPLC로 본 발명의 카퍼펩타이드의 순도를 분석한 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 5는 GC-MS로 본 발명의 카퍼펩타이드의 순도를 분석한 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 2는 카퍼펩타이드 발현벡터를 효모에 형질전환하는 과정 및 효모를 배양하는 발효조를 나타낸 모식도 및 사진이다.
도 3은 배양된 효모로부터 본 발명의 카퍼펩타이드를 고효율로 분리 정제하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도 및 사진이다.
도 4는 HPLC로 본 발명의 카퍼펩타이드의 순도를 분석한 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 5는 GC-MS로 본 발명의 카퍼펩타이드의 순도를 분석한 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1:
Gly
-His-
Lys
단량체가
복수회
반복되는
펩타이드
(
GHK
멀티머
) 발현을 위한 발현 카세트 제작
도 1에 도시된 바와 같이, 생산용 균주로 안전성을 인정받은 효모(GRAS 균주)인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현시키기 위한 발현 카세트를 제작하였다.
고발현/고분비를 위하여 P. pastoris 맞춤형 프로모터 및 분비용 신호 서열을 선정하였는데, 상기 프로모터로는 aox 프로모터를, 상기 분비용 신호 서열로는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 α-접합인자 전서열을 사용하였다. 그 뒤에 목적 펩타이드(Gly-His-Lys 단량체가 6회 또는 10회 반복되는 펩타이드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 배치하였으며, 다시 그 뒤에 고효율 분리정제를 위한 His-tag 서열을 배치하고 최종적으로 종결(terminator) 서열이 삽입된 GHK 고발현/고분비용 발현 카세트를 제작하였다. 또한, 상기 목적 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈최적화를 통하여 얻어진 것이다.
GHK 멀티머를 코딩하는 구체적인 염기서열은 하기 표 1에 기재하였다.
구분 | 염기서열 (5'→3') |
GHK 6회 반복 | CATCATCATCATCATCATACCGGTCATAAGGGTCATAAGGGTCATAAGGGTCATAAGGGTCACAAGGGTCACAAG (서열번호 1) |
GHK 10회 반복 | CATCATCATCATCATCATACCGGTCATAAGGGTCATAAGGGTCATAGGGTCATAAGGGTCACAAGGGTCATAAGGGTCATAAGGGTCATAAGGTCATAAGGGTCACAAGTA (서열번호 2) |
실시예
2: 발현 벡터 제작 및 발현 벡터가 도입된 효모의 배양
도 2에 도시된 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제작한 발현 카세트를 통상의 제한효소 처리 방법 및 라이게이션(ligation) 등으로 30℃의 형질전환 완충액(0.67% Yeast Nitrogen Base without amino acid, 0.076% Yeast Synthetic Drop-out Adenine, 2% Glucose)에서 발현 벡터 pPinkα-HC(Invitrogen)에 삽입하여 형질전환 벡터 pBJY_GHK6 또는 pBJY_GHK10을 제작 후, 이를 전기충격(electroporation transformation) 방법으로 P. pastoris 균주에 도입(형질주입)하여 형질전환체를 제작하였으며, 이를 메탄올 함유 배지를 사용하여 배양하였다.
먼저, 상기 P. pastoris의 콜로니를 포도당을 함유하는 YPD 배지에 접종하여 제1 배양물을 생성시키고, 29~30℃의 온도 및 280rpm으로 진탕되는 진탕 플라스크에서 거의 포화 상태로 상기 제1 배양물을 성장시켰다. 이후, 상기 제1 배양물을 사용하여 완충된 배지 글리세롤 효모 추출물(BMGY)에 접종하여 제2 배양물을 생성 및 8.0 OD600으로 성장시킨 후 원심분리하여 펠렛을 형성시킨 다음, 상기 펠렛을 BMMY 및 BMM에 재현탁하여 제3 배양물을 생성하였는데, 상기 제3 배양물에 최종 농도 0.6%로 매 24시간 마다 이후 120-144시간 동안 메탄올을 부가하여 목적 펩타이드의 유도를 유지할 수 있었다.
실시예
3: 배양된 효모로부터 발현된 목적
펩타이드의
고효율/고순도 분리 정제
상기 배양된 효모를 수집하여 일반적인 방법으로 세포를 용해시킨 후, 세포 용해물로부터 목적 펩타이드인 GHK-멀티머를 분리하였다. 물리적/화학적 분리정제 기술을 사용하여 목적 펩타이드를 분리하였는데, 실시예 1에서 제작한 발현 카세트에 His-tag 서열을 포함시켰기 때문에 His가 잘 흡착할 수 있는 Ni-affinity 크로마토그래피로 목적 펩타이드를 정제하였다(도 3).
또한, 도 3에 도시된 바와 같이 상기 목적 펩타이드를 트립신으로 처리하여 GHK 단량체를 분리할 수 있었으며, 분리된 GHK 단량체에 구리를 반응시켜 최종적으로 카퍼펩타이드를 수득할 수 있었다.
도 4 및 도 5에 HPLC 및 GC-MS를 이용하여 GHK의 순도를 나타낸 스펙트럼을 각각 도시하였다. 분석을 통하여, 최종적으로 수득한 카퍼펩타이드의 순도는 95% 이상임을 확인할 수 있었다. 또한, 카퍼펩타이드의 생산 농도를 계산한 결과, 배양액 1L당 100mg 이상의 수율을 나타냄을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GHK multimer (6)
<400> 1
catcatcatc atcatcatac cggtcataag ggtcataagg gtcataaggg tcataagggt 60
cacaagggtc acaag 75
<210> 2
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GHK multimer (10)
<400> 2
catcatcatc atcatcatac cggtcataag ggtcataagg gtcatagggt cataagggtc 60
acaagggtca taagggtcat aagggtcata aggtcataag ggtcacaagt a 111
Claims (19)
- Gly-His-Lys 단량체가 복수회 반복되는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 카퍼펩타이드 제조용 발현 카세트.
- 제1항에 있어서, 상기 Gly-His-Lys 단량체가 복수회 반복되는 펩타이드는 Gly-His-Lys 단량체가 6 내지 10회 반복되는 Gly-His-Lys 멀티머인 것을 특징으로 하는, 발현 카세트.
- 제1항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이, 효모에서 발현될 수 있는 프로모터 서열 및 고분비 신호 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 것인, 발현 카세트.
- 제3항에 있어서, 상기 프로모터는 GPD, TDH, ADH, CYC1 또는 STE5 프로모터인 것을 특징으로 하는, 발현 카세트.
- 제3항에 있어서, 상기 고분비 신호 서열은 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)의 α-접합인자 전서열(α-mating factor pre-sequence)인 것을 특징으로 하는, 발현 카세트.
- 제1항에 있어서, 상기 발현 카세트는, 상기 발현 카세트 내의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 His, GST 또는 인테인(Intein)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 3 내지 9개를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현 카세트.
- 제6항에 있어서, 상기 His, GST 또는 인테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 상기 Gly-His-Lys 단량체가 복수회 반복되는 펩타이드는 K 또는 DDDDK 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는, 발현 카세트.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는, 카퍼펩타이드 제조용 발현 벡터.
- 제8항의 발현 벡터를 포함하는 형질전환체.
- 제9항에 있어서,
상기 형질 전환체는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)인 것인, 형질전환체.
- 제10항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 카퍼펩타이드의 제조방법.
- 제11항에 있어서, 상기 제조방법은,
(a) 배양된 형질전환체로부터 발현된 펩타이드를 정제하는 단계;
(b) 정제된 상기 펩타이드에 단백질분해효소를 처리하여 상기 펩타이드로부터 Gly-His-Lys 단량체를 분리하는 단계; 및
(c) 상기 Gly-His-Lys 단량체와 구리를 반응시켜 카퍼펩타이드를 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 카퍼펩타이드의 제조방법.
- 제12항에 있어서, 상기 펩타이드를 정제하는 단계 (a)는,
상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 3개 이상 9개 이하의 His, GST 또는 인테인 단백질이 있는 경우, 상기 단백질을 분해하는 효소를 처리하는 단계를 포함하는 것인, 카퍼펩타이드의 제조방법.
- 제12항에 있어서, 상기 단백질분해효소는 트립신, 엔테로카이네이즈 또는 트롬빈인 것을 특징으로 하는 카퍼펩타이드의 제조방법.
- 제12항의 제조방법에 의해 제조된, 복수개의 Gly-His-Lys 단량체를 포함하는 카퍼펩타이드.
- 제15항의 카퍼펩타이드를 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 약학 조성물.
- 제15항의 카퍼펩타이드를 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 화장료는 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어에어졸, 포마드, 분말, 젤, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스 및 에어졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 모발용 화장료인 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물.
- 제15항의 카퍼펩타이드를 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 의약외품 조성물.
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