KR20200032800A

KR20200032800A - 아지레닌 제조용 발현 카세트 및 이의 이용

Info

Publication number: KR20200032800A
Application number: KR1020180111646A
Authority: KR
Inventors: 유병조; 장지연; 장인승
Original assignee: 한국생산기술연구원
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2018-09-18
Publication date: 2020-03-27
Also published as: KR102124036B1

Abstract

본 발명은 아지레닌 제조용 발현 카세트 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 아지레닌을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 효모에서 발현될 수 있는 프로모터 서열 및 고분비 신호 서열과 작동가능하게 연결되어 있는, 아지레닌(argireline) 제조용 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 아지레닌의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 아지레닌을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 아지레닌 제조용 발현 카세트, 발현 벡터 및 이를 포함하는 형질전환체를 이용하면, 적은 비용으로 고순도의 아지레닌을 대량으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 아지레닌은 주름 개선 효과는 우수하고, 독성이 매우 낮으므로, 주름 개선 용도의 화장품 소재 및 의약외품 등 산업 전반에 널리 이용될 수 있다.

Description

아지레닌 제조용 발현 카세트 및 이의 이용{A expression cassette for preparation of argireline and use thereof}

본 발명은 아지레닌 제조용 발현 카세트 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 아지레닌을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 효모에서 발현될 수 있는 프로모터 서열 및 고분비 신호 서열과 작동가능하게 연결되어 있는, 아지레닌(argireline) 제조용 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 아지레닌의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 아지레닌을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.

피부의 주름 개선을 위한 시술 소재로서, 현재 가장 널리 사용되고 있는 보툴리눔톡신(보톡스)는 식중독균인 클로스트리디업 보눌리넘(Clostidium botulinum)이라는 미생물에서 추출한 독성 물질이다. 보톡스는 주름의 원인이 되는 근육의 반복적 수축에 관여하는 신경전달 복합체인 SNARE 복합체를 분해시킴으로써, 근육 수축에 관여하는 아세틸콜린(acetylcholine)이 근육 세포에 전달되지 못하게 하여 주름 생성을 지연시켜주게 되며, SNARE 복합체가 다시 생성될 때까지 그 효과가 3-4개월 지속되게 된다.

다만, 이러한 보톡스는 현재 인류가 개발한 모든 독소 및 생물학적 독소 중에서 가장 독성이 강한 물질으로서, 점막 흡입시 성인 남성 기준으로 치사량이 0.5 g이다. 이처럼, 보톡스는 독성이 매우 강하여, 인간의 신경세포에 문제를 줄 수 있으며, 지속적 사용시에는 생체 내에 항체가 생기게 되어 내성이 생기게 된다. 또한, 다양한 시술 부작용이 발생하고 잇으며, 대표적인 것이 눈썹 시술에서 발생될 수 잇는 '사무라이 눈썹'이 있다. 이러한 보톡스가 가진 한계점으로 인해, 보톡스를 대체할 수 있는 안전성 대체 소재의 개발 필요성이 시급하였다.

최근에는, 근육 수축에 관여하는 SNARE 복합체의 구성 단백질인 SNAP-25 단백질의 일부 아미노산 구조로서, 12 내지 17번째 사이의 아미노산으로 구성된 펩타이드(Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg)가 보톡스와 같은 효과를 보이지만 독성은 10만배 정도 낮은 것으로 분석되었고, 이를 '아지레닌(argireline)'으로 명명하였다. 상기 설명한 바와 같이, 보톡스의 경우 신경전달 물질인 아세틸콜린의 분비 및 신경전달 복합체인 SNARE 복합체를 분해함으로써 방해하지만, 아지레닌은 신경세포가 근육세포에 접촉하는 것을 방해하여, 아세틸콜린의 근육세포로의 전달을 방해한다.

구체적으로, 아지레닌은 보톡스 대비 주름 개선 효과는 4000배 낮지만, 독성이 10배 낮으며, 6개의 아미노산 서열로 이루어진 짧은 펩타이드로서 피부투과성이 매우 높다. 이에 따라, 보톡스와 같이 시술에 쓰이는 주사제 대신에, 바르는 화장품 용도로 활용될 가능성이 높다. 실제로 중국에서는 바르는 보톡스로 아지레닌이 함유된 화장품이 시판되고 있으며, 우리나라의 경우에도 Lipotec 사에서 생산된 제품이 수입되어 사용되고 있다.

다만, 현재 아지레닌은 주로 화학합성에 의해서 제조되고 있는데, 예를 들어, “고체상 펩타이드 합성법(Solid phase peptide synthesis)”에 의해 생산되고 있다 (International journal of cosmetic science. Volume 24, Issue 5, 3030-310, October 2002). 이러한 화학 합성 방법에 의해 생산된 아지레닌은 화학적 불순물 및 인체에 유해한 물질이 함유되어 있으므로, 고순도의 분리/정제 공정을 필요로 한다. 또한, 생산 비용이 고가이고, 스케일-업(scale-up)에 한계가 있어, 상기와 같은 화학적 합성 방법으로는 가격 경쟁력을 높일 수 없는 문제점이 있다.

따라서, 화학합성 대신 안전성이 높은 효모의 발효공정을 이용한 생물공정으로 고순도의 아지레닌을 대량생산할 수 있는 기술 개발이 계속해서 요구되고 있는 실정이다. 다만, 일부 펩타이드의 경우, 효모의 세포 표면에 위치하고 있는 단백질 분해 효소에 민감하여, 효모를 이용하여 분비되고 생산되는 펩타이드가 상기 분해 효소에 의해 분해되어, 최종 산물이 감소할 수 있는 가능성이 있다(Journal of Biotechnology 149 (2010) 1-7, 3p, right pannel).

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 효모의 발효공정을 이용한 생물공정으로 아지레닌을 제조하기 위하여 예의 노력한 결과, 아지레닌를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 효모의 일종인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 도입하고, 상기 효모를 배양하여 발현된 펩타이드를 분리 및 정제함으로써 고순도의 아지레닌을 저비용으로 대량 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 아지레닌을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 효모에서 발현될 수 있는 프로모터 서열 및 고분비 신호 서열과 작동가능하게 연결되어 있는, 아지레닌(argireline) 제조용 발현 카세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 발현 카세트를 포함하는, 아지레닌 제조용 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 배양된 형질전환체로부터 발현된 아지레닌을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 아지레닌의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 아지레닌을 포함하는, 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 아지레닌을 포함하는, 주름 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 아지레닌을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 효모에서 발현될 수 있는 프로모터 서열 및 고분비 신호 서열과 작동가능하게 연결되어 있는, 아지레닌(argireline) 제조용 발현 카세트를 제공한다.

본 발명의 용어, "아지레닌"은 근육 수축에 관여하는 SNARE 복합체의 구성 단백질인 SNAP-25 단백질의 일부 아미노산 구조로서, 12 내지 17번째 사이의 아미노산으로 구성된 펩타이드(Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg)이다. 아지레닌은 보톡스와 동일한 정도의 주름 개선 효과를 보이지만 독성은 10만배 정도 낮은 것으로 분석되었다. 본 명세서에서는 '아지렐린' 또는 'argirelin'로 혼용되어 명명될 수 있다.

본 발명의 용어, "아지레닌 제조용 발현 카세트"는 아지레닌를 발현할 수 있는 발현구조체를 의미한다.

본 발명에서, 상기 발현 카세트는 상기 아지레닌을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 발현 카세트가 포함하는 아지레닌을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 이용되는 염기서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.

따라서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 높은 상동성을 갖는 염기서열, 예를 들면 그 상동성이 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 90%이상의 높은 상동성을 갖는 염기서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

또한, 본 발명의 상기 발현 카세트는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 효모에서 발현될 수 있는 프로모터 서열 및 고분비 신호 서열과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다.

구체적인 예로, 상기 프로모터는 GPD(promoter of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) TDH(promoter of Threonine Dehydrogenase), ADH(promoter of alcohol dehydrogenase), CYC1(promoter of Cytochrome c, isoform 1), STE5 프로모터 또는 이들의 조합일 수 있으나, 효모에서 발현하기에 적절한 프로모터라면 특별히 이에 제한되지 않는다. 상기 예시된 프로모터의 서열은 당업계에 알려진 서열을 사용할 수 있다.

다른 구체적인 예로, 상기 고분비 신호 서열은 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)의 α-접합인자 전서열(α-mating factor pre-sequence)일 수 있으나, 발현하고자 하는 목적 펩타이드인 아지레닌이 잘 분비될 수 있으면 특별히 이에 제한되지 않는다. 상기 예시된 고분비 신호 서열은 당업계에 알려진 서열을 사용할 수 있다.

상기 프로모터와 고분비 신호 서열은 아지레닌을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결되는 것이 바람직하다.

본 발명의 용어, '작동가능하게 연결된'(operably linked)은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예로, 프로모터와 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위 특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 발현 카세트는, 발현된 아지레닌의 정제를 용이하게 하기 위하여, 상기 발현 카세트 내의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 His, GST 또는 인테인(intein)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 3 내지 9개를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 His, GST 또는 인테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 상기 아지레닌을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 K(Lysine) 또는 DDDDK(Aspartate-Aspartate-Aspartate-Aspartate-Lysine) 링커를 통해 연결된 것일 수 있다. 그러나, 아지레닌의 정제를 용이하게 할 수 있다면 특별히 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 발현 카세트는 프로모터, 고분비 신호 서열, 아지레닌을 코딩하는 서열 및 His 등의 서열 외에도 전사 증강인자, 종결인자, 개시인자 및 다른 유전적 조절 인자들 또는 재조합 아지레닌의 항원성 또는 결합 친화도를 주는 인자들과 같은 아지레닌의 발현을 조절하는 구성요소들을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, AOX1 프로모터, 분비용 신호 서열(사카로마이세스 세레비지에의 α-접합인자 전서열), His-tag 서열, 아지레닌을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 종결 서열이 순차적으로 삽입된 아지레닌 고발현/고분비용 발현 카세트를 제작하였다(도 1).

참고적으로, 본 발명의 발현 카세트에 다양한 종류의 펩타이드를 적용한 결과, 모든 펩타이드가 생산될 수 있는 것은 아님을 확인하였는바, 이를 통해 본 발명의 발현 카세트에 목적 펩타이드 서열을 삽입하였을 때, 실제 생산이 가능한지는 실험을 통해 확인해보지 않는 한, 용이하게 유추할 수 없음을 확인할 수 있다.

다른 하나의 양태는 상기 발현 카세트를 포함하는, 아지레닌 제조용 발현 벡터를 제공한다.

이때, 상기 '발현 카세트' 및 '아지레닌'의 정의는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어, "발현 벡터"는 숙주세포에 DNA를 도입하여 목적 유전자의 발현을 효율적으로 유도하기 위한 수단으로서, 구체적으로 목적 펩타이드인 아지레닌이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미할 수 있다.

본 발명에서, 상기 발현 벡터는 본 발명의 아지레닌을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 아지레닌 제조용 발현 카세트를 포함할 수 있다.

상기 발현 벡터의 구체적인 예로, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 또는 바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 더욱 구체적인 예로, 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pET30a, pET30c 또는 pGEX-GST), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 또는 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50, pPINKα-HC, pPink-HC 또는 pPink-LC) 또는 Ti 플라스미드 등을 사용할 수 있고, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스 또는 식물 바이러스가 사용될 수 있으며, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터를 사용할 수 있다.

더욱 구체적인 예로, 상기 벡터는 효모 유래 플라스미드인 pPINKα-HC일 수 있지만, 본 발명의 발현 카세트를 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 발현 벡터는 발현조절 서열과 기능적으로 연결될 수 있다. 구체적인 예로, 상기 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 발명의 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 아지레닌 제조용 발현 카세트를 통상의 제한효소 처리 방법 및 라이게이션(ligation)을 통해 발현 벡터에 삽입하여 아지레닌 제조용 발현 벡터(pBJY-Ar 벡터)를 제작하였다(실시예 2).

또 다른 하나의 양태는 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

이때, 상기 '벡터'의 정의는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어, "형질전환체"는 외래의 유전물질이 도입되어 유전형질이 변화된 생물체를 의미한다.

구체적인 예로, 상기 형질전환체는 사카로마이세스(Saccharomyces), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 피치아(Pichia), 클루베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 이자켄키아(Issachenkia), 야로이야(Yarrowia) 또는 한세뉼라(Hansenula) 속하는 균주일 수 있으나, 상기 아지레닌을 발현할 수 있으면 특별히 이에 제한되지 않는다.

보다 구체적인 예로, 상기 형질전환체는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)일 수 있으나, 상기 아지레닌을 발현할 수 있으면 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 상기 용어 '피키아 파스토리스(Pichia pastoris)'는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 함께 재조합 단백질 생산에 가장 널리 활용되는 효모 균주를 의미한다. 상기 효모 균주는 유전자 조작이 용이하며 다양한 발현시스템이 개발되어 있고 대량배양이 용이하다는 장점을 갖는다. 뿐만 아니라, 인체 단백질과 같은 고등세포 유래의 재조합 단백질을 생산할 때 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 분비기능, 및 당쇄 부가 등과 같은 단백질의 번역 후 수식(post-translational modification) 기능을 수행할 수 있는 장점을 제공한다. 재조합 단백질의 분비 생산은 단백질 분비 신호와 목표단백질을 인위적으로 융합(fusion)하여 세포외 분비를 가능하게 한 것으로, 단백질의 분비과정을 통해서 단백질의 폴딩(folding)이나 이황화 결합의 형성 및 당쇄부가 과정이 진행됨에 따라, 생물학적으로 완전한 활성을 갖는 재조합 단백질을 생산할 수 있는 장점이 있다. 또한, 생물학적 활성을 갖는 단백질을 배지로부터 직접 얻을 수 있기 때문에 경제적으로 효율이 낮은 세포의 분쇄나 재접힘 단계를 필요로 하지 않아 매우 경제적이다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 아지레닌 제조용 발현 벡터(pBJY-Ar 벡터)를 전기충격(electroporation transformation) 방법으로 피키아 파스토리스 균주에 도입(형질주입)하여 형질전환체를 제작하였다(실시예 2).

또 다른 하나의 양태는 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 배양된 형질전환체로부터 발현된 아지레닌을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 아지레닌의 제조방법을 제공한다.

이때, 상기 '형질전환체' 및 '아지레닌'의 정의는 전술한 바와 같다.

본 발명에서, 상기 형질전환체를 배양하는 단계는 상기 형질전환체의 영양 요구성을 고려하여 수행될 수 있다. 구체적인 예로, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 메틸영양 요구성 효모 세포로서, 이의 배양을 위해서 완충된 복합 메탄올 배지(BMMY), 완충된 최소 메탄올 배지(BMM) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 발명의 목적에 맞게 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

또한, 상기 형질전환체의 배양물로부터 아지레닌의 회수는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나, 본 발명의 아지레닌을 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 배양된 형질전환체로부터 발현된 아지레닌을 분리 및 정제하는 단계는 상기 발현된 아지레닌의 N-말단 또는 C-말단에 3개 이상 9개 이하의 His, GST 또는 인테인 단백질이 있는 경우, 상기 단백질을 분해하는 효소를 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 배양된 형질전환체로부터 발현된 아지레닌을 분리 및 정제하는 단계에는 Ni-column, Gel chromatograpy 또는 Boiling을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 발명의 목적에 맞게 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 아지레닌 제조용 발현 벡터를 포함하는 피키아 파스토리스 형질전환체를 접종 배지(inoculation media, 효모 질소-함유 염기(아미노산 제외) 6.7 g/L, 효모의 합성 드롭-아웃 배지 보충제(아데닌) 1.39 g/L, 및 글루코스 40 g/L) 및 회분 배지(batch media, 효모 추출액 10 g/L, 펩톤 20 g/L, 인산칼륨 1.36 g/L, 효모 질소 염기 13.4 g/L, 바이오틴 10 g/L, 글루코스 40 g/L)를 선정하여, 작업량 5 L, pH 6.0, 500 rpm 및 30 ℃에서 배양한 후, 이를 수집 및 용해하여 아지레닌을 분리하였다. 또한, Ni-affinity 크로마토그래피로 상기 아지레닌을 발효액에서 분리 및 정제하였으며, 이를 SDS-PAGE를 통해 아지레닌 발효 생산물을 확인하였다(도 6). 아울러, 최종적으로 수득한 아지레닌의 순도는 95% 이상이며, 아지레닌의 생산 농도는 배양액 1L당 100mg 이상의 수율을 나타냄을 확인하였다(도 7).

이는, 본 발명에 따른 아지레닌 제조용 발현 카세트, 발현 벡터 및 이를 포함하는 형질전환체는 아지레닌의 제조에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

또 다른 하나의 양태는 상기 제조방법에 의해 제조된 아지레닌을 포함하는, 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 의해 제조된 아지레닌은 피부 주름 개선 효과를 나타낼 수 있으며, 특히 기존에 사용되었던 보톡스 대비 독성이 10만 배 낮으므로, 주름 개선용 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

상기 본 발명의 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는, 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시테이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

또 다른 하나의 양태는 상기 제조방법에 의해 제조된 아지레닌을 포함하는, 주름 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 의해 제조된 아지레닌은 피부 주름 개선 효과를 나타낼 수 있으며, 특히 기존에 사용되었던 보톡스 대비 독성이 10만 배 낮으므로, 주름 개선용 의약외품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 비누, 핸드 워시, 헤어세정제, 헤어 유연제 및 헤어 토닉으로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 아지레닌 제조용 발현 카세트, 발현 벡터 및 이를 포함하는 형질전환체를 이용하면, 적은 비용으로 고순도의 아지레닌을 대량으로 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 제조된 아지레닌은 주름 개선 효과가 우수하고, 기존의 보톡스에 비해 독성이 매우 낮으므로, 화장품 소재 및 의약품 등 산업 전반에 널리 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 아지레닌을 고발현/고분비할 수 있도록 설계한 발현 카세트를 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 상기 발현 카세트가 도입된 아지레닌 생산용 벡터 맵을 나타낸 모식도이다.
도 3은 아지레닌 발현벡터를 효모에 형질전환하는 과정 및 효모를 배양하는 발효조를 나타낸 모식도 및 사진이다.
도 4는 아지레닌 생산용 벡터 삽입 후의 PCR 결과 및 아지레닌 생산용 효모 균주 콜로니를 나타낸 도면 및 사진이다.
도 5는 배양된 효모로부터 본 발명의 아지레닌을 고효율로 분리 정제하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도 및 사진이다.
도 6은 전기영동을 통해 아지레닌 발효 생산을 확인한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 HPLC 및 GC-MS를 통한 아지레닌 순도 분석 시스템의 구축을 나타낸 도면이다.
도 8은 HPLC 분석을 통한 아지레닌 발효 생산을 나타내는 크로마토그래피 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 아지레닌 발효 생산을 위한 발현 카세트 제작

도 1에 도시된 바와 같이, 생산용 균주로 안전성을 인정받은 효모(GRAS 균주)인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현시키기 위한 발현 카세트를 제작하였다.

고발현/고분비를 위하여 P. pastoris 맞춤형 프로모터 및 분비용 신호 서열을 선정하였는데, 상기 프로모터로는 AOX1 프로모터를, 상기 분비용 신호 서열로는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 α-접합인자 전서열을 사용하였다. 그 뒤에 아지레닌(Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 배치하였으며, 다시 그 뒤에 고효율 분리정제를 위한 His-tag 서열을 배치하고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열과 His-tag 서열을 DDDDK(Aspartate-Aspartate-Aspartate-Aspartate-Lysine) 링커를 통해 연결시키고, 최종적으로 절단 서열인 엔테로키나아제 서열(enterokinase site)이 삽입된 아지레닌 고발현/고분비용 발현 카세트를 제작하였다. 또한, 상기 목적 펩타이드인 아지레닌을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화를 통하여 얻어진 것이다.

실시예 2: 발현 벡터 제작 및 발현 벡터가 도입된 효모의 배양

도 2에 도시된 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제작한 발현 카세트를 통상의 제한효소 처리 방법 및 라이게이션(ligation) 등으로 30℃의 형질전환 완충액(0.67% Yeast Nitrogen Base without amino acid, 0.076% Yeast Synthetic Drop-out Adenine, 2% Glucose)에서 발현 벡터 pPinkα-HC(Invitrogen)에 삽입하여 형질전환 벡터 pBJY-Ar을 제작하였다.

도 3에 도시된 바와 같이, 상기 형질전환 벡터 pBJY-Ar을 전기충격(electroporation transformation) 방법으로 P. pastoris 균주에 도입(형질주입)하여 아지레닌 생산용 효모 균주를 제작하였다.

또한, 하기 표 1의 성분을 함유하는 아지레닌 발효 생산 배지를 선정하고, 아지레닌 발효 생산 배지에서 작업량 5L로, pH 6.0, 500 rpm, 30 ℃에서 상기 아지레닌 생산용 효모 균주를 배양하였다.

접종 배지(Inoculation media)
효모 질소 염기 (Yeast Nitrogen Base Without Amino Acid)	6.7g/L
효모 합성 드롭-아웃 배지 보충제 (아데닌) (Yeast Synthetic Drop-Out Medium Supplements, adenine)	1.39g/L
글루코스	40g/L
회분 배지(Batch media)
효모 추출액	10g/L
펩톤	20g/L
인산칼륨	1.36g/L
효모 질소 염기(Yeast Nitrogen Base)	13.4g/L
바이오틴	10g/L
글루코스	40g/L

그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 게놈 DNA 기반의 PCR을 사용하여 형질전환 벡터 pBJY-Ar의 P. pastoris 균주에 도입된 것을 확인하였고, 아지레닌 생산용 벡터가 도입된 형질전환 균주는 아지레닌 콜로니를 형성함으로써, 아지레닌 생산용 효모 균주임을 확인하였다.

실시예 3: 배양된 효모로부터 발현된 아지레닌의 고효율/고순도 분리 정제

도 5에 도시된 바와 같이, 상기 배양된 효모를 수집하여 일반적인 방법으로 세포를 용해시킨 후, 세포 용해물로부터 목적 펩타이드인 아지레닌을 분리하였다. 물리적/화학적 분리정제 기술을 사용하여 목적 펩타이드를 분리하였는데, 실시예 1에서 제작한 발현 카세트에 His-tag 서열을 포함시켰기 때문에 His가 잘 흡착할 수 있는 Ni-affinity 크로마토그래피로 목적 펩타이드를 정제하였고, 최종적으로, 상기 목적 펩타이드를 엔테로키나아제로 처리하여 아지레닌을 수득할 수 있었다.

구체적으로는, 도 6에 도시된 바와 같이, 상기의 방법을 통해 아지레닌을 분리 및 정제한 후, 전기영동을 이용한 SDS-PAGE 결과를 통해, 상기 배양된 효모로부터 아지레닌이 발효 생산되었음을 확인할 수 있었다.

또한, 도 7에 도시된 바와 같이, HPLC 및 GC-MS를 이용하여 아지레닌의 순도를 나타낸 스펙트럼을 도시하였다. 분석을 통하여, 최종적으로 수득한 아지레닌의 순도는 95% 이상임을 확인할 수 있었다. 또한, 아지레닌의 생산 농도를 계산한 결과, 배양액 1L당 100mg 이상의 수율을 나타냄을 알 수 있었다.

구체적으로는, 도 8에 도시된 바와 같이, 14.7 g/L의 아지레닌이 생산됨을 확인할 수 있었으며, 기존의 화학합성 방법이 1g당 가격이 약 40만원임을 감안하면, 본 발명의 아지레닌 생산용 효모 균주를 이용한 아지레닌 발효 생산을 통해, 기존의 화학적 생산 방법에 비해 아지레닌을 고효율로 생산할 수 있음을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA INSTITUTE OF INDUSTRIAL TECHNOLOGY <120> A expression cassette for preparation of argireline and use thereof <130> KPA180536-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Argirelin <400> 1 caccaccatc atcatcatga cgatgatgat aaggaagaga tgcaaagaag aactgctgct 60 taa 63

Claims

아지레닌을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 폴리뉴클레오티드 서열이 효모에서 발현될 수 있는 프로모터 서열 및 고분비 신호 서열과 작동가능하게 연결되어 있는,
아지레닌(argireline) 제조용 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 프로모터는 GPD, TDH, ADH, CYC1 또는 STE5 프로모터인 것을 특징으로 하는, 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 고분비 신호 서열은 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 맞춤형 분비 신호 서열인 것을 특징으로 하는, 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 발현 카세트는, 상기 발현 카세트 내의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 His, GST 또는 인테인(Intein)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 3 내지 9개를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현 카세트.
제4항에 있어서, 상기 His, GST 또는 인테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 상기 아지레닌을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 K 또는 DDDDK 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는, 발현 카세트.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는, 아지레닌 제조용 발현 벡터.
제6항의 발현 벡터를 포함하는 형질전환체.
제7항에 있어서,
상기 형질 전환체는 사카로마이세스(Saccharomyces), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 피치아(Pichia), 클루베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 이자켄키아(Issachenkia), 야로이야(Yarrowia) 및 한세뉼라(Hansenula) 속하는 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 형질전환체.
제7항에 있어서,
상기 형질 전환체는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 형질전환체.
(a) 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 형질전환체로부터 발현된 아지레닌을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 아지레닌의 제조방법.
제10항의 제조방법에 의해 제조된 아지레닌을 포함하는, 주름 개선용 화장료 조성물.
제10항의 제조방법에 의해 제조된 아지레닌을 포함하는, 주름 개선용 의약외품 조성물.