CN1993469B - 重组甲胎蛋白，其制备方法及手段，以其为基础的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物和医药行业、遗传工程学、生物工艺学。在构建重组质粒DNA的基础上获得啤酒糖酵母酵母菌株，所述重组质粒DNA包括在调节启动子控制下的人甲胎蛋白(AFP)的结构基因，所述菌株提供以被分泌的溶解形式合成和生产的AFP，这种AFP具有与人AFP活性相同或相似的活性。所获得的重组AFP可以用作制备治疗剂的活性物质，所述治疗剂用于肿瘤学、免疫治疗、美容学并且还用于癌症和胚胎病理诊断。

Description

重组甲胎蛋白,其制备方法及手段,以其为基础的组合物及其用途
发明领域
本发明涉及微生物和医药行业、遗传工程学、生物工艺学。根据本发明的重组甲胎蛋白(AFP)保留了从血清获得的人AFP的活性，希望用于肿瘤学、免疫治疗、美容学。
发明背景
甲胎蛋白(AFP)是哺乳动物胚胎血清中的主要组分，它在围产期发育过程中由胚胎肝脏和卵黄囊合成。出生后血清中的AFP水平立即急剧下降并且其表达在正常成人个体中变得无法检测(Deutsch H.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)。在肝脏肿瘤和种系发生的(germinogenic)畸胎细胞瘤恶性发展后AFP合成重新开始并且在肝脏化学和机械损伤的情况下(伴随再生)，例如，在急性病毒性肝炎或肝硬化过程中可以检测到较少的程度(Mizejewsky G.J.，2002，Expert Rev.Anticancer.Ther.2：89-115)。
人AFP是由590个氨基酸组成的糖蛋白并包括约4％的糖类组分(Morinaga T.，等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.，80，4604-4608；Pucci P.等人，1991，Biochemistry 30，5061-5066)。AFP的一个主要特性是非共价吸附不同的低分子化学物质，例如多不饱和脂肪酸、类固醇激素、金属、类视黄醇、疏水性抗生素及其他(Aussel S.&Masseyeff R.，1994，Biochem.Biophys.Res.Commun.119：1122-1127；Deutsch H.F.，1994，J.Tumor Marker Oncol.，9：11-14)。在胚胎发育早期，AFP代替白蛋白作为脂肪酸及其他低分子物质的运输工具(Deutsch H.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)。
AFP分子由3个球形结构域组成，所述结构域由15个链间二硫键结合，这显著增加了蛋白质三级结构装配过程的复杂性(Morinaga T.，等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80，4604-4608；PucciP.，等人，1991，Biochemistry 30，5061-5066)。此外，AFP分子的重要结构元件是糖类组分，它提供了分子的正确接纳和功能(DeutschH.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)。
除由590个氨基酸残基组成的多肽链之外，依照N型糖基化，血清胚胎AFP或由肝癌细胞分泌的AFP分子结构包括一个与天冬酰胺(asparagin)连接的寡糖基团(Yamashita K.等人，1993，Cancer Res.53：2970-2975)。AFP寡糖链的结构是异质的并且取决于不同因素：肝癌发展阶段或胚胎发育阶段。影响AFP分子结构特性的寡糖可以包括在抗原决定簇和受体结合中心中(Deutsch H.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)。与血清AFP不同，在细菌细胞中表达的重组AFP不是糖基化的，这是Murgita工作中表征的产物特征性差异(美国专利6,331,611；6,627,440；6,416,734)，并且因此具有使其与血清类似物并且也与酵母系统中表达的重组AFP区别开的结构和功能特性。已知异源蛋白在酵母中表达时，其糖基化的进行就氨基酸残基而言与血清类似物中的相同，但就链的组成、长度和分支而言，寡糖自身的结构明显不同，这也预先确定了相应蛋白质在结构和功能特性方面的必然差异(Hard K.等人，1998，FEBS Lett.248：111)。
AFP可以被表达特异性AFP受体(AFPR)的细胞选择性吸收，所述细胞例如胚胎细胞、干细胞、活化的免疫细胞、癌细胞或由某些类型的逆转录病毒转化的细胞(Uriel J.等人，1989，in JizejewskyG.I.，Jakobson H.I.(eds)：Biological Properties ofAlpha-Fetoprotein.Boca Raton，CRC Press，vol.2：103-117)。正常的成熟细胞丧失了吸收AFP的能力并且不表达特异性AFPR。考虑到AFP的这种特性，已提出关于AFP治疗用途的方法以便向肿瘤靶向输送抑制癌细胞生长的细胞抑制剂及其他物质(Deutsch H.F.，1994，J.Tumor Marker Oncol.9：11-14；Tsukada Y.等人，1994，J.TumorMarker Oncol.9：99-103)。
AFP具有众多的功能特性，目前所述功能特性正在深入研究。AFP作为胚胎血清白蛋白类似物的传统概念目前已由关于AFP执行细胞生长、发育和按程序死亡调节能力的数据进行补充(Mizejewsky G.J.，2002，Expert Rev.Anticancer.Ther.2：89-115)。特别是，与血清和培养类似物相似的重组AFP显示能够抑制雌激素依赖性肿瘤和正常组织的生长(Bennett J.A.等人，1997，Breast Cancer Res.Treat.45，169-179；Bennet J.A.等人1998，Clinical Cancer Research，4，2877-2884)。近来，确定了AFP的肿瘤抑制活性根据触发凋亡的机制来实现，所述凋亡的特征为典型的形态学改变、生长停滞、细胞毒性以及DNA断裂(Semenkova L.N.，1997，Tumor Biol.18，261-274；Dudich E.I.，等人，1998，Tumor Biol.19，30-40；Dudich E.I.，等人，1999，Eur.J.Biochem.266：1-13；Semenkova L.，等人，2003，Eur.；J.Biochem.70：4388-4399)。
早期研究显示了AFP调节免疫细胞分化和活化的能力。特别是，AFP能够抑制由同种抗原或自身抗原激活的免疫细胞并且能够抑制各种细胞因子基因表达(Yamashita K.，等人，1993，Cancer Res.53，2970-2975；美国专利号5,965,528)。另一方面，AFP诱导未成熟的骨髓细胞、干细胞和胚胎细胞的显著刺激生长(Dudich E.I.，等人，1998，Tumor Biol.19，30-40；美国专利号6,627,440)。
AFP的这些特性，以及体内癌细胞吸收AFP的增加的选择性(UrielJ.，等人，1989，in Mizejewsky G.I.，Jakobson H.I.，eds：Biological Properties of Alpha-Fetoprotein.Boca Raton，CRCPress，vol.2：103-117)，揭示其在自身免疫(美国专利号5,965,528)和肿瘤疾病(美国专利号6,416,734；Mizejewsky G.J.，2002，ExpertRev.Anticancer.Ther.2：89-115)治疗中作为治疗制剂的药物用途的基础。此外，AFP通常被用作关于肿瘤疾病早期诊断和胚胎发育病理的肿瘤胚胎标记(Deutsch H.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)。然而，由于原料缺乏，天然AFP用作药物在技术上是不可能的。
获得AFP的通常来源是孕妇的血清、胚胎脐带血清或癌症患者的腹水。很明显这些来源没有一个适合于生产医疗用途的蛋白物质，因为，首先，原料来源的获取是非常有限的并且其中的AFP含量很低，其次，存在不断增长的感染病毒或朊病毒的危险。
公开了涉及重组AFP(rAFP)在不同微生物中表达和纯化的早期数据(Yamamoto R.，等人，1990，Life Sciences，46：1679-1686；NishiS.，等人，1988，J.Biochem.104：968-972；美国专利5,206,153；美国专利6,331,611)。因此，在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)(Yamamoto R.，等人，1990，Life Sciences，46：1679-1686；美国专利5,206,153)和大肠杆菌(Escherichia coli)(美国专利6,331,611；Boismenu R.，等人，1997，Protein Expressionand Purification.10：10-26)中进行了人rAFP的细胞内生产。在大肠杆菌中表达的重组AFP显示保留了胚胎类似物的免疫调节和肿瘤抑制活性(Boismenu R.，等人，1997，Protein Expression andPurification.10：10-26；Bennett J.A.，等人，1997，Breast CancerRes.Treat.45，169-179)。这些表达系统的主要缺陷是不能分泌异源蛋白及其生产水平极低。此外，从重组生产菌株生物量获得所需产物需要执行另外的变性和复性操作，这导致产物产量显著减少并因此实际上增加其成本。同样地，在使用细菌表达系统的情况下，具有已知的内毒素活性的外壳脂多糖污染产物的问题同样重要。
与本发明最相似的技术解决方案是参考文献中所述人AFP生产菌株(Yamamoto R.，等人，1990，Life Sciences，46：1679-1686；美国专利5,206,153)。在这些来源中公开了细胞内生产人AFP的酵母生产菌株啤酒糖酵母，其氨基酸序列包括与大鼠AFP信号肽对应的附加部分。本发明鉴别了酵母菌株的产物分泌，这个产物具有成熟人AFP的特性并且具有SEQ ID NO：2的原始序列，这对应成熟的人AFP的序列。这个特异性使本发明中描述的产物显著超过早期所公开的(YamamotoR.，等人，1990，Life Sciences，46：1679-1686；美国专利5,206,153)。此外，所引用的参考文献中描述的这种菌株的缺点是缺少细胞内装配以及将AFP分泌到培养液中的机制，这明显增加了成本，使得以制备量制备纯化的重组AFP的方法更加复杂并且提供了极低水平的AFP产物。此外，所引用工作的作者(Yamamoto R.，等人，1990，Life Sciences，46：1679-1686；美国专利5,206,153)获得了修饰的重组AFP，其序列也包括信号和连接肽，这限制了其医疗用途的可能性，因为蛋白质结构的修饰导致免疫特异性的改变并且其结果是增加了静脉内或皮下施用的免疫反应病理危险。
在酵母细胞异源分泌生产蛋白的情况下，为了使正确折叠伴随二硫键形成发生(在它们中AFP)，重要的是生产细胞内酵母二硫化物异构酶(Pdi)的产生水平(Shusta E.V.，等人，1998，Nat.Biotechnol.16：773-777)。此外，这种酶的协同作用由增加量的shaperon样酵母蛋白BiP提供(Robinson A.S.，等人，1996，J.Biol.Chem.271：10017-10022)。
尽管事实上酵母通常被认为是不含被分泌的蛋白水解酶的生物(Chung B.H.&Park K.S.，1998，Biotechnol.Bioeng.57：245-249)，对于众多蛋白质，包括--对于HSA，显示了它们在酵母培养过程中的降解，这涉及与细胞相关的仍未鉴别的蛋白水解酶的存在(ChungB.H.&Park K.S.，1998，Biotechnol.Bioeng.57：245-249；KangH.A.，等人，2000，Appl.Microbiol.Biotechnol.53：575-582)。所有被列出的因素需要在创建AFP有效地分泌在培养液中的酵母生产者的过程中对它们加以考虑。
考虑到目前制备重组AFP的方法中存在的缺点，明显需要进一步改进关于表达并分泌重组AFP的系统的技术，特别是开发具有较高异源蛋白表达能力的新型重组菌株，提供天然三级结构的细胞内装配以及随后所需产物分泌到培养液中。
因此，需要开发工业上可用的AFP制备方法，所述AFP就其特性而言将与人血清AFP相同或相似，并且因此将使得它能够用于人血清AFP通常使用的那些领域中。
通过创建微生物的新型菌株可以完成所述目标，所述菌株可以在培养基中生产就其特性而言与人血清AFP相同或相似的多肽。
发明概述
为了制备其特性将与人血清AFP特性相同或相似的重组AFP，必须开发提供被分泌的可溶形式AFP合成及生产的生产菌株。
利用基因工程方法通过用质粒转化亲本菌株获得生产菌株，所述质粒包括编码具有成熟的人AFP活性的蛋白的DNA序列。
在酵母表达系统中生产的重组被分泌AFP具有与成熟的人AFP相同或相似的特性，这在免疫学分析中以及通过其抑制B细胞淋巴瘤Raji及其他人细胞系细胞生长的能力得到确定，所述细胞在体外培养中对促凋亡作用敏感。这使所获得的AFP和成熟的人血清AFP具有相同的作用机制，所述获得的AFP通过常规方法获得并具有如SEQ IDNO：2所呈现的氨基酸序列。根据本发明的AFP制备方法的执行条件提供与天然人AFP相比具有最小缺陷的多肽装配。
在酵母中生产的人重组AFP与人血清AFP特性的近似性由质粒组成中包含的表达盒提供，所述表达盒包括编码成熟的人AFP的DNA序列，其中分离过程不要求变性-复性步骤，并且同时提供所获得多肽的糖基化以及分子折叠和二硫键的形成。在酵母表达系统中以被分泌的形式生产的重组人AFP与在原核表达系统中生产的重组类似物的不同之处在于前者依照N型进行糖基化，而专利(Murgita R.A.美国专利6,331,611；6,627,440；6,416,734)中所描述的重组细菌AFP是非糖基化的。在酵母表达系统中以被分泌的形式生产的人重组AFP通过寡糖链的组成和结构不同于血清类似物，所述寡糖链的组成和结构由酵母菌株和营养培养基中所包括糖类的组成决定。
为了从宿主细胞获得具有所需活性的高产量的分泌蛋白，向编码AFP基因的质粒中加入几种另外的基因，所述另外的基因提供高水平的基因转录、分泌过程中的蛋白质折叠以及二硫键的正确形成。
因此获得了具有转化细胞用于表达并分泌AFP能力的pKX质粒。
利用上述质粒获得了具有分泌重组甲胎蛋白能力的真核生产细胞。
在优选变异体中，受体菌株啤酒糖酵母YBS723被用作原始细胞，用pKX质粒转化这种菌株以获得生产菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX，它保存于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian Collection ofIndustrial Microorganisms)(VKPM)，保藏号Y-3115。
在转化菌株的培养过程中，AFP被分泌到培养基中，从所述培养基中它可以利用传统的生物化学方法以纯化的形式被分离。
从转化细胞获得的被分离的AFP用于抑制肿瘤细胞生长的药物组合物中，所述药物组合物包括所获得的AFP以及药物学上可接受的载体和赋形剂。
被分离的AFP用于抑制肿瘤细胞生长的协同组合物中，所述协同组合物包括所获得的AFP和化学治疗制剂以及药物学上可接受的载体和赋形剂。
利用所分离的AFP，已开发了以其为基础的药物组合物或包括其的协同组合物，治疗癌症或阻止癌症发展的方法，所述方法设想给患者施用有效量的AFP、药物组合物或协同组合物。
由于所获得的AFP就特性而言与人血清AFP相似，因此所获得的AFP用于具有免疫抑制和免疫调节作用的协同组合物中，其中所述组合物包括AFP和环孢菌素C以及药物学上可接受的载体和赋形剂。
已开发了利用被分离的AFP或上述协同组合物治疗自身免疫性疾病并调整免疫状态的方法，所述方法包括给患者施用有效量的AFP或含环孢菌素C的协同组合物。
考虑到AFP能够刺激干细胞生长，本发明人已提出刺激干细胞生长的药物组合物，所述组合物包括所获得的AFP以及药物学上可接受的载体和赋形剂，并且还提出了刺激干细胞生长的协同组合物，这种组合物包括所获得的AFP和维生素A、E、D的衍生物、抗氧化剂、类固醇激素、植物来源的异黄酮以及药物学上可接受的载体和赋形剂。
提出了利用被分离的AFP、上述药物或协同组合物在体外刺激干细胞生长的方法，所述方法包括用有效量的AFP或相应的组合物作用于细胞。
此外，提出了在体内刺激干细胞生长的方法，所述方法包括给患者施用有效量的AFP或上述药物或协同组合物。
在被分离的AFP功能活性的基础上提出了使皮肤更新并防止皮肤衰老的化妆品组合物，所述组合物包括所获得的AFP以及美容学上可接受的载体和赋形剂，以及任选的维生素A、E、D的衍生物、抗氧化剂、类固醇激素、植物来源的异黄酮。
在本发明的框架内提出了利用所获得的化妆品组合物使皮肤更新并防止皮肤衰老的方法，所述方法包括在个体皮肤上应用所述组合物。
附图简述
下列图举例说明了本发明所提出的主题。
附图1显示了编码成熟的人甲胎蛋白序列的pKX质粒的结构，包括含人甲胎蛋白基因的表达盒；细菌质粒pUC18的片段；2-μm酵母质粒的复制起始区；选择性PGK1酵母标记、编码二硫化物异构酶的PD11基因和提供蛋白质正确装配并将所需产物分泌到培养基中的KAR2基因。
附图2显示了在pKX质粒组成中的表达盒的结构，所述表达盒包括编码人甲胎蛋白的序列。GAL1酵母基因的启动子区由斜体字显示。MFα1酵母基因的分泌前原区(pre-pro region)由黑印刷体显示。人甲胎蛋白分子的氨基酸序列由大写字母显示。
附图3表示编码AFP并且由最常用的酵母密码子组成的合成基因的结构。与血清人AFP的氨基酸序列相同的AFP氨基酸序列用黑印刷体指出。
附图4显示了在一条线上应用的不同量的纯化重组甲胎蛋白的SDS-PAGE电泳(A)和免疫印迹分析(B)结果，所述重组甲胎蛋白从酵母培养物啤酒糖酵母YBS723/pKX培养液中获得。
1.标记蛋白(94、67、43、30、20kD)。
2.在含抗-AFP-琼脂糖的柱上亲和层析后的rAFP(0.3μg)。
3.在含Sephacryl S-200的柱上凝胶层析后的rAFP(0.4μg)。
4.rAFP(0.1μg)。
5.Sephacryl S-200后的rAFP(0.6μg)。
6.Sephacryl S-200后的rAFP(0.5μg)。
7.胚胎eAFP(0.4μg)。
附图5显示了B细胞Raji淋巴瘤细胞对两种不同纯化AFP样本的AFP浓度的剂量依赖性增殖，所述样本从胚胎血清eAFP和重组rAFP获得，所述重组rAFP由酵母生产菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX表达。在与AFP一起孵育12小时后的实验培养物中相对于无添加的对照通过掺入[H3]-胸腺嘧啶核苷测量细胞的增殖并以生长抑制百分比表示。
附图6证明：(A)就成髓细胞瘤U937细胞而言，与根据本发明rAFP组合使用的阿霉素肿瘤抑制作用的协同增强作用；
(B)与根据本发明rAFP和视黄酸(维生素原A酸)组合使用的一般肿瘤抑制效应的协同增强作用。在与AFP一起孵育12小时后的实验培养物中相对于无添加的对照通过掺入[H3]-胸腺嘧啶核苷测量细胞的增殖并以生长抑制百分比表示。
附图7显示根据本发明的rAFP对胚胎干细胞生长的刺激作用，所述细胞从胚胎肺和视网膜细胞的原代培养中获得。通过在培养最后4小时内掺入[H3]-胸腺嘧啶核苷的标准方法测量细胞的增殖并以测试培养物中相对于无AFP对照的生长刺激百分比表达。
序列表包括序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，它们分别为表达盒的核苷酸序列以及成熟的人AFP的氨基酸序列，所述表达盒在pKX质粒的组成中并且包括人甲胎蛋白的编码序列。
表达盒的核苷酸序列包括GAL1酵母基因的启动子区、MFα1酵母基因的分泌前原区、人甲胎蛋白基因的编码序列以及CYC1酵母基因的转录终止区。这个表达盒包括在pKX质粒中，所述pKX质粒在酵母生产菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX系统中编码成熟的人甲胎蛋白的序列。
发明详述
为了实现本发明，主要的技术目标是创建能将所需蛋白有效分泌到培养液中的AFP酵母生产菌株。通过构建编码调节合成的人AFP的重组DNA pKX质粒以及啤酒糖酵母YBS723/pKX菌株来解决这个目标，所述菌株提供以被分泌的溶解形式合成和生产并且表达水平不低于10mg/l的AFP。提供了以被分泌的溶解形式的高水平合成的所需蛋白，其中pKX质粒包括GAL1基因的启动子与同时扩增的KAR2基因(Robinson A.S.，等人，1996，J.Biol.Chem.271：10017-10022)，所述KAR2基因编码伴侣重链结合蛋白BiP。在受体菌株的基因组中，存在编码二硫化物异构酶的PD11基因扩增(Robinson A.S.，等人，1996，J.Biol.Chem.271：10017-10022)，所述酶在蛋白质分泌过程中参与形成二硫键。
重组质粒DNA包括在GAL1启动子基因控制下的人AFP基因以及编码伴侣重链结合蛋白BiP的KAR2基因，所述GAL1启动子基因提供高水平的基因转录，所述KAR2基因在蛋白质分泌过程中参与蛋白质折叠，并在培养液中提供高水平的所需蛋白产物。此外，为了提供二硫键的正确形成以及蛋白质天然三级结构的形成，使用编码二硫化物异构酶的PS11基因。
编码人AFP基因的重组pKX质粒DNA(附图1)具有下述特征：
-它是有效分泌人AFP的表达质粒；
-它具有13301bp的大小；
-它包括编码成熟人甲胎蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO：2的片段；
-它包括细菌质粒pUC18的片段；2-μm酵母质粒的起始区；选择性酵母标记PGK1；编码伴侣重链结合蛋白BiP的KAR2酵母基因；编码二硫化物异构酶的PD11基因；含AFP基因组的表达盒；
-由核苷酸序列SEQ ID NO：1呈现的表达盒的结构中包括：GAL1酵母基因的启动子区；MFα1酵母基因的分泌前原区；编码成熟的人AFP的区域；CYC1酵母基因的转录终止区。当这个质粒被导入细胞中时，由于使用了高度有效的GAL1启动子实现了AFP基因的高水平转录。如果编码区将对应编码成熟的人AFP的DNA序列，则MFα1分泌前原区的导入为培养液中具有期望的氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质的AFP提供正确的分泌过程以及有效地分泌；
-所提出的质粒构建物的显著特征在于afp基因在高度有效的GAL1启动子的控制下，并且为了提供二硫键的正确形成以及蛋白质天然三级结构的形成，使用PD11和KAR2基因。
对所述质粒转化敏感的任何真核细胞均可用所创建的质粒转化。细胞的选择不是关键，因为转化方法和步骤是本领域技术人员众所周知的。然而，取决于所获得的转化株的细胞类型和培养条件，AFP的表达水平可以改变，但表达所需肽将在亲本细胞成功转化的条件下发生。
基因型pgk1/pgk1的受体菌株YBS723用于获得啤酒糖酵母YBS723/pKX菌株。pgk1/pgk1的纯合性使得这种菌株不能在包含任何单一碳源的所有培养基中生长，所述碳源在啤酒糖酵母正常消化范围之内。ga180::PD11/ga180::PD11的纯合性导致GAL1基因启动子的调节改变与PD11基因基因组的同时增殖，所述PD11基因编码二硫化物异构酶并在蛋白质分泌过程中参与二硫键形成。
利用根据本方法的pKX质粒转化YBS723菌株(Ito H.，等人，1983，J.Bacteriol.153：163-168)。根据在包括2％葡萄糖作为碳源的全价酵母培养基(细菌用蛋白胨-20g/l，酵母提取物-10g/l，细菌培养用琼脂-20g/1)上的生长能力选择转化株。一种此类克隆被命名为YBS723/pKX。
所获得的二倍体酵母菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX具有下述特征：
遗传特征：基因型pgk1/pgk1 ga180::PD11/ga180::PD11；
形态学特征：在含2％葡萄糖作为唯一碳源的固体营养培养基上生长48小时培养物的生长细胞具有椭圆形的形状，细胞大小为3.6×7.1μm，原生质为均质的，通过出芽生殖进行再生。当在包含酵母提取物和蛋白胨的固体培养基(YEP)上30℃生长72小时后，柱具有下述外观：
1)在含葡萄糖的YEP培养基上-白色柱边缘光滑、表面发亮、锥形轮廓、乳膏样粘度；
2)在含淀粉的YEP培养基上-白色柱边缘有图案、表面暗淡、晶状体样轮廓以及颗粒粘度；
3)在含糖蜜的YEP培养基上-白色柱表面暗淡有皱纹、边缘有图案、凸状轮廓以及乳膏样粘度；
在液体培养物中的生长-在含淀粉的YEP培养基上32℃时在培养开始的24小时内-液体混浊、残渣为白色、不结块、不形成侧壁薄膜。
物理化学特征：兼性厌氧菌。生长温度：23-33℃(最佳温度：31℃)。培养pH值：3.8-6.7(最佳pH值：5.0)。在pH6.8-7.0时观察到AFP分泌的最高水平。
碳源的同化：发酵葡萄糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、糊精、淀粉。
氮源的同化：同化氨基酸、尿素、硫酸铵、硝酸铵。
独特的特异性：在含淀粉(2％)的丰富培养基上培养的情况下，培养皿在+4℃孵育24小时后，淀粉褪色带被深色边环绕。
病原性：啤酒糖酵母YBS723/pKX菌株是非致病的。
保存方法：菌株在含葡萄糖的琼脂化(agarized)丰富培养基内+4℃保存3个月。
所获得的啤酒糖酵母YBS723/pKX菌株(分泌形式的AFP的生产者)被存放在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，保藏号Y-3115。
由申请人提出的重组AFP的细胞生产菌株具有超过已存在原型的众多优点：
-所需产物的产生以被分泌到培养液中的形式实现；
-最终产物的氨基酸序列对应成熟的人AFP的序列-SEQ IDNO：2；
-与血清胚胎类似物相似，由生产菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX生产的rAFP是糖基化的；
-由于PD11基因表达以及KAR2基因表达的增加，所需产物的产量显著增加，所述PD11基因编码二硫化物异构酶，提供二硫键形成，所述KAR2基因编码伴侣重链结合蛋白BiP，提供蛋白质的正确装配以及所需产物分泌到培养基中。
非常明显编码DNA的序列可以包括与遗传密码简并性相关的置换，并且还包括就整体而言不会导致得到无活性形式胎蛋白的某些置换、插入、删除。可能的变异是本领域技术人员已知的。所获得的多肽还可包括在氨基酸序列框内的保守氨基酸置换，前提是一个氨基酸被另一个具有相似特性的氨基酸置换。然而，在本发明所要求特征的限制内，只存在具有一级、二级和三级结构的那些多肽，所述结构不会扰乱所获得多肽的所需活性，特别是-具有与成熟的人AFP特性相同或相似的特性，所述特性在免疫学分析中并且根据其在体外培养中抑制B细胞淋巴瘤Raji细胞生长的能力进行确定。
认为所获得的多肽将具有成熟的人血清AFP特性的功能活性指数根据免疫反应并且根据其体外抑制B细胞淋巴瘤Raji细胞生长的能力在不低于成熟的人血清AFP活性10％的水平进行确定。
在所得多肽在组合物中的特殊用途情况下，使用传统的另外组分，例如赋形剂、稀释剂、防腐剂、缓冲液、生理溶液、0.9％氯化钠溶液、在药物剂型生产过程中使用的工艺添加剂等。组合物可以是用作肠胃外、口服、静脉内、肌内等施用或供外部使用的流体(溶液、悬浮液、乳膏、乳状液等)、固体(在使用前重构的冻干粉剂、吸附在载体上的制剂等)。其中，供外部使用的组合物可以包括促进活性物质在组织中吸收和扩散的添加剂。
本发明的协同组合物提供另一种活性物质在组合物中的存在，其中在两种活性物质同时存在(其中之一为根据本发明的AFP)的情况下，它们的作用效果确实比每种物质分开使用的情况更高。
非常明显，协同组合物是本发明实施方案的一个优选方案，因为对于本领域技术人员来说每种活性组分分开施用是显而易见的。例如，在抗癌治疗的情况下，每种活性组分制剂可以分开施用以及一起同时施用，伴随时间上或不同施用方式的分开。具体的选择取决于患者的状态、疾病的严重度、先前的治疗等。
治疗用的治疗剂量的选择可以是0.001-10mg/kg患者体重的广泛范围内的任何剂量，附加条件是获得所需疗效。它对应人AFP的常规剂量，因为所获得的AFP将具有就活性而言相似或接近的特性。根据本发明的AFP的限制剂量对应人AFP的剂量，因为它们具有相似的氨基酸序列，它不会被正常的人免疫系统识别为“外来的”。
本发明由下述实施例来举例说明，所述实施例不是限制性的，但希望证实本发明的实施方案并实现实施方案的最佳改变。
实施例1
分离总RNA并构建中间体重组质粒DNA pTrcafp
利用Trizol Reagent(Gibco BRL，USA)依照制造商的方法从人肝癌细胞株HepG2中分离出总mRNA。利用First Strand cDNASynthesis Kit(MBI Fermentas)在引物寡聚(dT)18或与基因afp 3’末端互补的GAAGTAATTTAAACTCCCAAAGC(3R)的存在下得到cDNA。在下列引物的存在下进行用于后续克隆的所得基质的扩增：
CTTCAATCGATATGACACTGCATAGAAATG(Cla)
CTTCCAAGCTTAAACTCCCAAAGCAG(Hind)，
第一个引物序列对应成熟的蛋白基因的5’序列(用黑印刷体指出)并且包括限制性酶Cla I的识别位点，而第二个与基因的3’末端部分互补(用黑印刷体指出)并包括Hind III的识别位点。在100μl的体积中进行基因扩增。反应混合物包括10ng cDNA、引物(1)和(2)每种30pM、dNTP混合物(每种0.2mM)、10mM pH 8.8的Tris-HCl、10mM KCl、2.5mM MgSO4、2.5单位Pfu DNA-聚合酶(Stratagene公司)以及1单位的Taq DNA-聚合酶(Fermentas公司)。根据下述方案进行25个循环：95℃/40秒、39℃/40秒、72℃/1分钟。通过在1％琼脂糖凝胶中电泳分析反应产物；切下长度约1790bp的条带，从凝胶中提取DNA，用限制性酶Cla I和Hind III处理并克隆到质粒pTrcTEGF中，所述质粒pTrcTEGF先前在载体pTrc99A的基础上得到(Amann E.，等人，1988，Gene，69，301-315)，并且用那些相同的限制性酶处理。从而获得质粒pTrcafp；其结构通过限制性酶分析并且通过PCR测定所克隆的DNA部分的核苷酸序列进行确认，所述限制性酶分析相对于所得到的克隆利用限制性酶Cla I和Hind III，并且还可利用识别位点在AFP基因内部的Spe I、Mun I、Sec I和Sty I。根据方法并利用Cycle Reader TM DNA Sequencing Kit(Fermentas，Lithuania)进行测序。
实施例2
制备编码人AFP基因的合成cDNA
为了获得合成的AFP基因，化学合成长度为62-68b的36个寡核苷酸。在这些寡核苷酸的基础上，通过聚合酶链式反应法获得6个双链片段，将其中的每一个都克隆到载体pUC18中。通过测序确认所有克隆片段的一级结构。随后通过限制/连接的方法以质粒pUC18片段的形式将具有正确核苷酸结构的片段顺次连接为所需基因。以类似方式获得用于表达修饰形式的AFP的cDNA，所述AFP包括删除、突变或添加的氨基酸残基。
实施例3
构建重组质粒DNA pKX
在引物的存在下质粒pTrcafp被用作PCR的模板：
CAACCCTCGAGTTAAACTCCCAAAGC
CCAACCCATGGCTAAGAGAACACTGCATAGAAA-TG。
限制性位点NcoI和XhoI(有下划线的)被设定在引物序列中。作为扩增结果获得的DNA片段在限制性核酸内切酶NcoI/XhoI处理后克隆到载体pUC18/GAL1-pp中，所述载体包括启动子GAL1以及MFα1的分泌前原区。从而获得质粒pUC18/GAL1-pp/afp。为了排除PCR可能的错误，对质粒的NcoI/XhoI片段进行测序。包括启动子GAL1、MFα1的分泌前原区以及人AFP基因的编码部分的质粒pUC18/GAL1-pp/afp的HindIII/XhoI片段(附图2)转移到HindIII/XhoI双复制子(酵母-大肠杆菌)载体pPDX中。从而得到质粒pPDX/GAL1-pp/afp。质粒pPDX/GAL1-pp/afp的ClaI/XhoI片段转移到pPX的ClaI/XhoI载体中，所述pPX由于KAR2基因的存在而不同于pPDX。从而得到的质粒被命名为pKX(附图1)。以类似的方式得到质粒pKX-1，它包括由最广泛使用的酵母密码子组成的合成人AFP基因(附图3)。质粒pKX-1与pKX的不同之处在于前者包括成熟的人AFP的合成基因。
实施例4
获得人AFP的生产菌株
为了获得啤酒糖酵母YBS723/pKX菌株，依照方法用质粒pPX转化受体菌株YBS723(Ito H.，等人，1983，J.Bacteriol.153：163-168)。根据在包括2％葡萄糖作为碳源的全价酵母培养基(细菌用蛋白胨-20g/l，酵母提取物-10g/l，细菌培养用琼脂-20g/l)上的生长能力选择转化株。一种此类克隆被命名为YBS723/pKX。
实施例5
测定人AFP生产菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX的生产能力
生产菌株YBS723/pKX的细胞在管形瓶中26℃在摇床上(250rpm)在下述组成的培养基上生长：葡萄糖-2％、甘油-1.5％、酵母提取物-1％、蛋白胨-2％、蒸馏水。通过加入0.1M的磷酸盐缓冲液使培养基的pH值维持在7.0。细胞的初始滴定度为5×106。在培养物生长72小时过渡到生长平稳期后滴定度为7-8×108时进行取样。培养物10000rpm离心1分钟后获得培养液的样本并用于下述分析。在含十二烷基硫酸钠的12.5％聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分析CL样本。凝胶用Coomassie R-250染色(附图4)并扫描以确定总蛋白质以及AFP特异性蛋白的相对含量。根据电泳和扫描的数据，CL中的AFP总含量为约10-25％的总蛋白质，但存在蛋白质的部分细胞内降解。在AFP多克隆抗体的存在下通过免疫印迹法确定CL中的AFP相对含量(附图4)。同样地，利用一套针对人AFP的单克隆和多克隆抗体通过免疫酶分析(IEA)法确定培养液中的AFP定量含量。根据IEA数据，液体培养基中CL的AFP平均含量达到5mg/l。
实施例6
测定人AFP生产菌株啤酒糖酵母YBS723/pKX在高密度培养基中的生产能力
在发酵罐中在26℃和pH7.0时(自动维持)进行菌株YBS723/pKX的分批补料培养。维持＞20％的溶解氧dO含量。在发酵过程中，进行含下述组成培养基的补充：酵母提取物-10g/l、蛋白胨-60g/l、葡萄糖-100g/l。补充物的供应速度是这样的以至提供μ＝0.03的培养物生长速度。达到与280个光学单位相等的OD50后，分析CL中的AFP含量。如上述实施例4中所述确定YBS723/pKX高密度培养的CL中的AFP相对和总含量。在高密度培养的情况下，根据IFA数据CL中的rAFP含量达到70mg/l。
实施例7
分离并鉴定来自生产菌株YBS723/pKX的CL的重组人AFP
如早先所述(Dudich等人，1999，Biochemistry，38：10406-10414)并稍加改变进行来自生产菌株YBS723/pKX的CL的rAFP分离。通过在浓缩室“Millipore”上超滤将培养液从31浓缩至200ml并对pH7.5的0.005M Tris-HCl、0.1M NaCl缓冲液在4℃进行透析，并随后在10000rpm离心0.5小时。
离子交换层析。对离心后得到的上清液应用离子交换柱DEAE-Sepharose Fast Flow(Pharmacia，27×4cm)，用pH7.5的0.01M Tris-HCl、0.1M NaCl平衡该柱。用起始缓冲液从柱上洗去没有与吸附剂结合的组分，而用pH7.5含0.2M NaCl的Tris-HCl缓冲液以1ml/分钟的速度进行所需产物的洗脱。
亲和层析。包含rAFP的级分进行合并，NaCl浓度恢复到0.5M并应用于含与多克隆抗-AFP兔抗体缀合的Sepharose CL-4B的亲和层析柱，该柱用pH7.5的0.05M Tris-HCl和0.5M NaCl平衡。没有与蛋白质的抗体结合的蛋白质输出后，用0.005M HCl洗脱被吸附的rAFP。通过280nm处的吸收确定pH从5.0达到3.5后材料的输出峰。通过加入pH7.5的2M Tris-HCl溶液将rAFP溶液中和至pH7.5。
凝胶层析。在含Sephacryl S-200的柱(1.8×70cm)上在pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液和0.15M NaCl中通过凝胶层析以0.5ml/分钟的速度进行rAFP的进一步纯化。纯化的rAFP溶液在室“Amicon”(膜YM-30)中在氮压力下进行浓缩。
样本分析。通过方法控制所获得的rAFP制剂的性质和纯度，所述方法包括根据Lammly在含β-巯基乙醇的12.5％SDS-PAGE中凝胶电泳随后用Coomassie染色(附图4A)，用滴定度为第一抗体1∶500和第二抗体1∶5000在PVDF膜上的Western印迹分析，在Hybond ECL-硝化纤维膜上的斑点印迹(附图4B)，IFA。
依照Bredford法，利用胚胎AFP标准溶液作为对照，并且还在278nm处用分光光度计进行测量，考虑消光系数E1％，278nm＝0.53，进行溶液中蛋白质浓度的测定。
实施例8
测定重组人AFP在体外的生物学活性
如早先所述(Semenkova L.N.，1997，Tumor Biol.18，261-274；Dudich E.I.，等人，1998，Tumor Biol.19，30-40)根据其在体外培养中抑制B细胞淋巴瘤Raji细胞生长的能力来确定rAFP及其修饰形式的功能活性。预先用新鲜培养基洗涤，在0.1ml的RPMI-1640培养基中在10％胎牛血清的存在下按照5×103将Raji细胞放置在96孔板的每个孔中，随后加入不同剂量的AFP12小时。通过在培养的最后4小时内掺入[H3]胸腺嘧啶核苷的标准方法测量细胞的增殖。为了比较，研究胚胎起源的embrAFP和酵母rAFP的两种AFP样本的剂量依赖性反应(附图5)。很明显两种制剂均显示关于这些细胞的抑制细胞生长活性。类似地，为了测定以AFP为基础的制剂的体外活性，对AFP抑制作用敏感的任何其他癌细胞株均可使用，例如人肝癌HepG2、乳腺癌MCF-7、前列腺癌LnCap、成髓细胞瘤U-937及其他(Semenkova L.N.，1997，Tumor Biol.18，261-274；Dudich E.I.，等人，1998，TumorBiol.19，30-40)。
实施例9
重组AFP作为抗癌制剂的用途
以rAFP及其修饰形式为基础的抗癌制剂可以用于抑制恶性肿瘤的生长，所述恶性肿瘤例如原发性或转移性肝癌、血癌(白血性增生、成髓细胞瘤、淋巴瘤)、乳腺癌、前列腺癌。为了确定这种类型的肿瘤细胞对AFP的敏感性，在体外并且同样在体内可以使用不同的方法。测定体外活性的方法在前述实施例8中得到描述。为了测定以AFP为基础的制剂在体内的肿瘤抑制作用，可以使用动物模型，例如使用皮下或腹膜内植入人癌细胞株的裸鼠，所述细胞株例如Raji、HepG2、LnCap、MCF-7及其他。例如，以1-5×106/小鼠的量皮下施用B细胞淋巴瘤Raji细胞。在腹膜内或静脉内植入肿瘤细胞前7天以1-10mg/kg的量开始施用AFP及其衍生物。使用生理学缓冲液(PBS)作为对照。利用测微计通过每天测量来评估肿瘤的大小。
表1
rAFP对植入B细胞淋巴瘤Raji细胞的裸系小鼠的测试结果
动物数目 AFP每次注射的剂量  给药方法   结果
  10   1mg  腹膜内，每天1次20天   2-稳定5-50％抑制3-肿瘤没有发展
  5   PBS  腹膜内，每天1次20天   肿瘤10-100％发展
  10   0.5mg  腹膜内，每天1次20天   2-稳定5-50％抑制3-肿瘤没有发展
  10   2mg  腹膜内，每天1次20天   2-稳定5-50％抑制3-肿瘤没有发展
以酵母rAFP或其衍生物为基础的制剂的给药方法可以包括在其中同时或顺次施用化学治疗制剂。下述可以被提出作为此类化学治疗制剂的实例：阿霉素、长春新碱、氟尿嘧啶、metatrexate、放线菌素D、丝裂霉素C、它莫西芬、氟他胺、长春新碱、长春碱、环孢菌素、类视黄醇、类胡萝卜素及其他。通常地，化学治疗制剂可以以标准剂量或以通常治疗之下的亚最佳剂量施用。在附图6中作为一个实例展示了rAFP与阿霉素(A)以及rAFP与全反式维甲酸(tRA)的组合作用效果。在制剂同时施用的情况下，观察到亚最佳剂量使用情况下的协同肿瘤抑制作用。
实施例9
重组AFP刺激干细胞生长的用途
通过用0.2％胰蛋白酶溶液处理合法流产后得到的5-10周的胚胎组织获得肺和人视网膜的胚胎成纤维细胞的原代培养物。细胞在10％胎牛血清(CFS)的存在下在RPMI-1640培养基中进行培养。如早先所述(Semenkova L.N.，1997，Tumor Biol.18，261-274；DudichE.I.，等人，1998，Tumor Biol.19，30-40)测量AFP抑制细胞生长的活性。细胞以每0.15ml培养基4×104的量用新鲜培养基彻底洗涤并放置在96孔板的每个孔中，随后加入不同剂量的AFP并培养24小时。通过在培养的最后4小时内掺入[H3]胸腺嘧啶核苷的标准方法测量细胞的增殖。
还对人胚胎成纤维细胞的原代培养物进行AFP对细胞生长的剂量依赖效应研究。AFP对这些细胞具有刺激效应，其达到对照的50-90％(附图7)。
实施例10
重组AFP在美容学中的用途
考虑到AFP具有刺激干细胞生长的能力并且是胚胎细胞的生长因子的事实，提出其可以用于制备化妆品面膜、乳膏和洗剂。rAFP可以用作脂质体、微粒体和纳米体(nanosome)的赋形剂。考虑到AFP能够结合疏水性配体的事实，所述配体特别是脂溶性维生素、类固醇、异黄酮类(isoflavinoid)、多不饱和脂肪酸(Deutsch H.F.，1991，Adv.Canc.Res.56，253-312)；Aussel C.&Masseyeff R.，1994，Biochem.Biophys.Res.Commun.119：1122-1127；Deutsch H.F.，1994，J.Tumor Marker Oncol.9：11-14)，显示了rAFP与脂溶性维生素例如类视黄醇、类胡萝卜素、tokoferol、维生素D的衍生物，与类固醇例如雌激素和雄激素的衍生物的组合用途。雌二醇及其他也可用作此类类固醇的实例。
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Figure I2005800261655I00011
Figure I2005800261655I00021

Claims (17)

1.一种SEQ ID NO：1的表达盒，其包括：GAL1酵母基因的启动子区；MF α1酵母基因的分泌前原区；编码具有成熟的人甲胎蛋白活性的蛋白质的DNA序列，以及CYC1酵母基因的转录终止区。
2.一种重组的pKX质粒，其包括：根据权利要求1的表达盒；2-μm酵母质粒的复制起始区；提供蛋白质正确装配并将所需产物分泌到培养基中的KAR2基因；提供二硫键正确形成的PD11基因；选择性的URA3和选择性的PGK1酵母标记。
3.一种通过用根据权利要求2的pKX质粒转化的真核生产细胞，其具有分泌人重组甲胎蛋白的能力。
4.一种制备重组甲胎蛋白的方法，所述重组甲胎蛋白具有血清来源的成熟人甲胎蛋白的生物学活性，其包括：培养根据权利要求3的真核细胞，所述细胞具有将重组甲胎蛋白分泌到培养基中的能力，以及从所述培养基中分离所述重组甲胎蛋白的步骤。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于真核细胞是酵母细胞。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于培养在23℃至33℃下在培养基中进行，所述培养基包括：2％的葡萄糖、1.5％的甘油、1％的酵母提取物、2％的蛋白胨、和蒸馏水；通过另外的缓冲作用使培养基的pH维持在4.5至7.0并加入可溶氧至pO＞20％。
7.一种根据权利要求5的方法制备的重组甲胎蛋白，其具有成熟的人血清AFP的特性，所述特性根据免疫反应及其体外抑制B细胞Raji淋巴瘤细胞生长的能力在不低于成熟的人血清AFP活性的10％的水平上而进行确定。
8.一种抑制肿瘤细胞生长的药物组合物，其包括(i)根据权利要求7的重组甲胎蛋白以及(ii)药物学上可接受的载体和/或赋形剂。
9.一种抑制肿瘤细胞生长的协同组合物，其包括(i)根据权利要求7的重组甲胎蛋白和(ii)化学治疗制剂以及(iii)药物学上可接受的载体和/或赋形剂，所述化学治疗制剂选自：阿霉素、长春新碱、氟尿嘧啶、metatrexate、放线菌素D、丝裂霉素C、它莫西芬、氟他胺、长春新碱、长春碱、环孢菌素C、视黄酸衍生物、类胡萝卜素、类固醇激素。
10.根据权利要求7的rAFP在制备药物中的应用，其中所述药物用于治疗或预防癌症。
11.一种具有免疫抑制和免疫调节作用的协同组合物，其包括(i)根据权利要求7的重组甲胎蛋白，(ii)环孢菌素C，以及(iii)药物学上可接受的载体和/或赋形剂。
12.权利要求7的rAFP在制备药物中的应用，其中所述药物用于治疗自身免疫性疾病并纠正免疫状态。
13.一种刺激干细胞生长的药物组合物，所述组合物包括根据权利要求7的重组甲胎蛋白以及药物学上可接受的载体和赋形剂。
14.一种刺激干细胞生长的协同组合物，所述组合物包括(i)根据权利要求7的重组甲胎蛋白，和(ii)选自抗氧化剂或类固醇激素的一种或多种活性剂，以及(iii)药物学上可接受的载体和/或赋形剂。
15.一种在体外刺激非胚胎来源的干细胞生长的方法，其包括用有效量的根据权利要求7的重组甲胎蛋白，权利要求13的药物组合物或根据权利要求14的协同组合物作用于细胞。
16.根据权利要求7的rAFP在制备药物中的应用，其中所述药物用于在体内刺激干细胞生长。
17.一种使皮肤更新并防止皮肤衰老的化妆品组合物，其包括(i)根据权利要求7的重组甲胎蛋白，(ii)美容学上可接受的载体和/或赋形剂，以及(iii)任选的选自抗氧化剂或类固醇激素的一种或多种活性剂。
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