PT1807518E - Alfa-fetoproteína recombinante, método e meios para a sua preparação, composições baseadas na mesma e sua utilização - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ALFA-FETOPROTEÍNA RECOMBINANTE, MÉTODO E MEIOS PARA A SUA PREPARAÇÃO, COMPOSIÇÕES BASEADAS NA MESMA E SUA UTILIZAÇÃO"

Campo do invento 0 invento está relacionado com a indústria microbiológica e médica, engenharia genética e biotecnologia. Uma alfa-fetoproteina (AFP) humana recombinante de acordo com o presente invento, mantendo a actividade de uma AFP humana, obtida a partir do soro, destina-se a usar em oncologia, imunoterapia e cosmetologia.

Fundamento do invento A alfa-fetoproteina (AFP) é o principal componente do soro do sangue embrionário de mamíferos, a qual é sintetizada pelo fígado embrionário e pelo saco da gema durante o desenvolvimento perinatal. Imediatamente após o nascimento, o nível de AFP no soro baixa abruptamente e a sua expressão torna-se indetectável nos indivíduos adultos saudáveis (Deutsch H.F., 1991, Adv. Canc. Res. 56, 253-312). A síntese de AFP é retomada quando do desenvolvimento maligno de tumores do fígado e teratoblastomas germinogénicos e poderá ser detectada num grau menor no caso de lesão química ou mecânica do fígado, acompanhada de 2 ΡΕ1807518 regeneração, por exemplo, durante a hepatite virai aguda ou cirrose (Mizejewsky G.J., 2002, Expert Rev. Anticancer. Ther. 2: 89-115).). AFP humana é uma glicoproteína que consiste em 590 aminoácidos e compreende cerca de 4% de um componente açúcar (Morinaga T., et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 80,4604-4608; Pucci P. et al., 1991, Biochemistry 20 30, 5061-5066)). Uma das principais propriedades de AFP é a associação não covalente de diferentes substâncias quimicas de massa molecular baixa, tais como ácidos gordos polinsaturados, hormonas esteróides, metais, retinóides, antibióticos hidrofóbicos e outros (Aussel S. & Masseyeff R., 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 119: 1122-1127; Deutsch H.F., 1994, J. Tumor Marker Oncol., 9: 11-14). Nas fases precoces do desenvolvimento embrionário, AFP substitui albumina como um veiculo de transporte de ácidos gordos e de outras substâncias de massa molecular baixa (Deutsch H.F., 1991, Adv. Canc. Res. 56, 253-312). A molécula de AFP consiste em três domínios estruturais globulares ligados por 15 ligações dissulfureto entre cadeias, o que aumenta significativamente a complexidade do processo de montagem da estrutura terciária de uma proteína (Morinaga T., et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80, 4604-4608; Pucci P., et al., 1991, Biochemistry 30, 5061-5066).). Ainda, um elemento estrutural importante de uma molécula de AFP é o componente açúcar, o qual proporciona a recepção e o funcionamento 3 ΡΕ1807518 correctos da molécula (Deutsch H.F., 1991, Adv. Canc. Res. 56, 253-312).

Para além de uma cadeia polipeptidica consistindo em 590 aminoácidos, a estrutura da molécula de uma AFP sérica embrionária ou de uma forma secretada pelas células de hepatocarcinoma inclui um grupo oligossacárido ligado a asparagina de acordo com a glicosilação tipo N (Yamashita K. et al., 1993, Câncer Res. 53:2970-2975). A estrutura de uma cadeia de oligossacário de AFP é heterogénea e depende de diferentes factores: da fase de desenvolvimento do hepatocarcinoma ou da fase do desenvolvimento do embrião. Os oligossacáridos afectam as propriedades estruturais de uma molécula AFP, podendo estar incluídos no teor dos determinantes antigénicos e nos centros de ligação a receptores (Deutsch H.F., 1991, Adv. Canc. Res. 56, 253- 312). Diferente da AFP sérica, a AFP recombinante expressa em células bacterianas não é glicosilada, o que é uma característica distinta do produto caracterizado nos trabalhos de Murgita (Patentes US 6331611; 6627440; 6416734) e, consequentemente, possui propriedades estruturais e funcionais que a distingue do análogo sérico e também da AFP recombinante expressa em sistemas de levedura. Sabe-se que durante a expressão heteróloga de proteínas em leveduras, a sua glicosilação é realizada nos mesmos resíduos de aminoácidos do análogo do soro, mas a estrutura dos próprios oligossacáridos difere significativamente relativamente à composição, comprimento e ramificação da cadeia, o que também pré-determina determinadas distinções 4 ΡΕ1807518 nas propriedades estruturais e funcionais das correspondentes proteínas (Hard K. et ai., 1998, FEBS Lett. 248:111). AFP pode ser selectivamente absorvida pelas células que expressam receptores específicos de AFP (AFPR), tais como células embrionárias, células estaminais, células imunes activadas, células de cancro ou células transformadas por determinados tipos de retrovírus (Uriel J. et al., 1989, em Jizejewsky G.I., Jakobson H.I. (eds): Biological Properties of Alpha-Fetoprotein. Boca Raton, CRC Press, vol. 2:103-117). Células maduras normais perdem a capacidade para absorver AFP e não expressam AFPR específico. Face a esta propriedade de AFP, foram propostos métodos para o uso terapêutico de AFP com o objectivo de dirigir a entrega de citostáticos e de outras substâncias, suprimindo o crescimento das células cancerosas, num tumor (Deutsch H.F., 1994, J. Tumor Marker Oncol. 9: 11-14; Tsukada Y. et al., 1994, J. Tumor Marker Oncol. 9: 99-103). A AFP possui uma série de propriedades funcionais, as quais presentemente estão a ser intensivamente estudadas. O conceito clássico de AFP como um análogo de albumina sérica embrionária é, presentemente, suplementado pelos dados respeitantes à capacidade de AFP para realizar a regulação do crescimento, desenvolvimento e morte celular programada de células (Mizejewsky G.J., 2002, Expert Rev. Anticancer. Ther. 2: 89-115). Em particular, foi mostrado que uma AFP recombinante, semelhante a um análogo sérico e cultural, é capaz de suprimir o crescimento dependente de 5 ΡΕ1807518 estrogénios de tecidos tumorais e normais (Bennett J.A. et ai., 1997, Breast Câncer Res. Treat. 45, 169-179; Bennet J.A. et al., 1998, Clinicai Câncer Research, 4, 2877-2884). Recentemente, foi estabelecido que a actividade oncossu-pressora de AFP é efectuada de acordo com o mecanismo de indução da apoptose, o qual se caracteriza por alterações morfológicas tipicas, paragem do crescimento, citotoxi-cidade e fragmentação do DNA (Semenkova L.N., 1997, Tumor

Biol. 18, 261-274; Dudich E.I., et ai., 1998, Tumor Biol. 19, 30-40; Dudich E.I., et ai., 1999, Eur. J. Biochem. 266: 1-13; Semenkova L., et ai., 2003, Eur.; J. Biochem. 70: 4388-4399).

Estudos anteriores demonstraram a capacidade de AFP para regular as diferenciação e activação de células imunes. Em particular, AFP é capaz de suprimir células imunes activadas com alo- ou auto-antigénios e de inibir a expressão de vários genes de citocinas (Yamashita K., et ai., 1993, Câncer Res. 53, 2970-2975; Patente US No. 5,965,528). Por outro lado, AFP induz estimulação pronunciada do crescimento de células da medula óssea imaturas, células estaminais e células embrionárias (Dudich E.I., et ai., 1998, Tumor Biol. 19, 30-40; Patente US No. 6627440).

Estas propriedades de AFP e também o aumento da selectividade de absorção de AFP pelas células de cancro in vivo (Uriel J., et ai., 1989, in Mizejewsky G.I., Jakobson H.I.,eds: Biological Properties of Alpha-Fetoprotein. Boca 6 ΡΕ1807518

Raton, CRC Press. 10 vol. 2:103-117) revelaram a base para a sua utilização em medicina como preparação terapêutica no tratamento de doenças auto-imunes (Patente US No. 5965528) e oncológicas (Patente US No. 6416734; Mizejewsky G.J., 2002, Expert Rev. Anticancer. Ther. 2: 89-115). Ainda, tradicionalmente AFP é usada como um marcador onco-embrionário para o disgnóstico precoce de doenças oncológicas e patologias do desenvolvimento embrionário (Deutsch H.F., 1991, Adv. Canc. Res. 56, 253-312). No entanto, a utilização de AFP natural como um fármaco é tecnologicamente impossível devido à escassez de material de partida.

Tradicionalmente, uma fonte para a obtenção de AFP era o soro do sangue de mulheres grávidas, soro embrionário fúnico ou fluido ascitico de doentes com cancro. Obviamente, nenhuma destas fontes são aceitáveis para a produção de uma substância proteica para fins médicos devido, em primeiro lugar, a haver um acesso extremamente limitado à fonte de material e o teor de AFP ali existente ser baixo e, em segundo lugar, existir um risco cada vez maior de infecção com virus ou priões.

Foram anteriormente publicados dados relacionados com a expressão e purificação de AFP recombinante (rAFP) em diferentes microrganismos (Yamamoto R., et ai., 1990, Life Sciences, 46:1679-1686; Nishi S., et al., 1988, J. Biochem. 104:968-972; Patente US 5206153; Patente US 6331611). Assim, a produção intracelular de rAFP humana foi realizada 7 ΡΕ1807518 em Saccharomyces cerevisiae (Yamamoto R., et al., 1990, Life Sciences, 46:1679-1686; Patente US 5206153) e Escherichia coli (Patente US 6331611; Boismenu R., et al., 1997, Protein Expression and Purification. 10:10-26). Foi demonstrado que AFP recombinante expressa em Escherichia coli mantém a actividade imunorreguladora e oncossupressora do análogo embrionário (Boismenu R., et al., 1997, Protein Expression and Purification. 10:10-26; Bennett J.A., et al., 1997, Breast Câncer Res. Treat. 45, 169-179). A principal desvantagem deste sistema de expressão é a incapacidade para secretar proteina heteróloga e o nivel extremamente baixo da sua produção. Ainda, a obtenção do produto pretendido, a partir de uma biomassa de estirpes recombinantes produtoras, requere que procedimentos adicionais de desnaturação e renaturação sejam efectuados, o que resulta numa redução significativa do rendimento do produto e, consequentemente, num aumento substancial dos seus custos. Igualmente, no caso de utilização dos sistemas de expressão bacterianos, o problema de contaminação do produto com os lipopolissacáridos da parede, os quais possuem endotoxicidade conhecida, é igualmente importante. A solução técnica mais semelhante ao presente invento é a estirpe produtora de AFP humana que está descrita nas referências (Yamamoto R., et al., 1990, Life Sciences, 46:1679-1686; Patente US 5206153). Nestas fontes, é descrita a estirpe produtora da levedura Saccharomyces cerevisiae com produção intracelular de AFP humana, a sequência de aminoácidos da qual compreende uma secção ΡΕ1807518 adicional correspondendo ao péptido sinal da AFP de rato. Este invento identifica o produto de secreção de uma estirpe de levedura, produto esse que possui as propriedades de uma AFP humana madura e possui a sequência original de SEQ ID NO;2, a qual corresponde à sequência de uma AFP madura. Esta especificidade distingue o produto descrito no presente invento do anteriormente descrito (Yamamoto R., et al., 1990, Life Sciences, 46:1679-1686;

Patente US 5206153). Ainda, uma desvantagem desta estirpe descrita nas referências citadas é a ausência de mecanismos de montagem intracelular e secreção de AFP para o liquido de cultura, o que aumenta significativamente o custo, torna o processo de preparação de uma AFP recombinante em quantidades preparativas mais complexo e proporciona um nivel extremamente baixo de AFP. Ainda, os autores do trabalho citado (Yamamoto R., et al., 1990, Life Sciences, 46:1679-1686; Patente Us 5206153) obtiveram uma AFP recombinante modificada, a sequência da qual compreende igualmente o péptido sinal e de ligação, o que limita a possibilidade do seu uso médico devido à modificação da estrutura da proteina, resultando numa alteração da especificidade imunológica e, como resultado, num aumento do risco de patologia imunorreactiva com administração intravenosa ou subcutânea.

No caso de produção com secreção heteróloga nas células de levedura de proteínas, para as quais o enrolamento correcto ocorre com a formação de ligações dissulfureto (entre elas AFP), é importante o nivel de 9 ΡΕ1807518 produção da isomerase de dissulfureto de levedura (Pdi) nas células produtoras Shusta E.V., et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16: 773-777). Ainda, uma quantidade maior da proteína tipo chaperone BiP de levedura proporciona actuação sinergística com esta enzima (Robinson A.S.,et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 10017-10022).

Apesar do facto de as leveduras serem tradicionalmente consideradas como organismos sem proteinases secretadas (Chung B.H. & Park K.S., 1998, Biotechnol. Bioeng. 57:245-249), para uma série de proteínas, incluindo para HSA, a sua degradação durante a cultura de leveduras é conhecida, o que está relacionado com a presença de proteinases não identificadas associadas à célula (Chung B.H. & Park K.S., 1998, Biotechnol. Bioeng. 57:245-249; Kang H.A., et al., 2000, Appl. Microbiol. Biotechnol. 53: 575-582). Todos os factores enumerados necessitam de ser considerados durante a criação de uma levedura produtora de AFP, eficazmente secretada para o líquido de cultura.

Considerando as desvantagens dos métodos actual-mente existentes para a preparação de AFP recombinante, torna-se óbvio que existe a necessidade de melhorar a tecnologia dos sistemas para a expressão e secreção de AFP recombinante, em particular para o desenvolvimento de novas estirpes recombinantes tendo a capacidade de uma expressão mais elevada de uma proteína heteróloga com a condição da montagem intracelular de uma estrutura terciária nativa e subsequente secreção do produto pretendido para o líquido de cultura. 10 ΡΕ1807518

Assim, a necessidade de desenvolvimento de métodos industrialmente aplicáveis de preparação de AFP, a qual relativamente às suas propriedades seria idêntica ou semelhante a AFP humana e assim tornaria possivel usá-la nos campos em que é tradicionalmente usada a AFP sérica humana, objectivamente deriva do estado da arte.

Alcançar o objectivo estabelecido é possivel através da criação de uma nova estirpe de microrqanismos, a qual poderá produzir num meio de cultura um polipéptido idêntico ou semelhante a AFP sérica humana relativamente a estas propriedades.

Sumário do invento

Para preparar uma AFP recombinante, as propriedades da qual seriam idênticas ou semelhantes às propriedades de AFP sérica humana, foi necessário desenvolver uma estirpe produtora que proporciona a sintese e produção de AFP numa forma solúvel secretada. A estirpe produtora foi obtida com a utilização de métodos de engenharia genética através da transformação de uma estirpe parental, a qual compreende uma sequência de DNA codificadora de uma proteina tendo a actividade de uma AFP humana madura.

Uma AFP secretada recombinante produzida num sistema de expressão de levedura possui propriedades 11 ΡΕ1807518 idênticas ou semelhantes às propriedades de uma AFP humana madura, as quais são determinadas numa análise imunológica e pela sua capacidade para suprimir o crescimento de células Raji de linfoma das células B e outras linhas celulares humanas sensíveis à acção apoptogénica numa cultura in vitro. Isto proporciona um mecanismo idêntico de actuação da AFP obtida e de uma AFP sérica humana madura, obtida por um método tradicional e tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:2. As condições de realização do método de preparação de AFP de acordo com o presente invento proporcionam a montagem de um polipéptido com defeitos minimos comparativamente à AFP humana nativa. A proximidade das propriedades de AFP recombi-nante humana, produzida em leveduras, e de AFP sérica humana é proporcionada pela inclusão de uma cassete de expressão, compreendendo uma sequência de DNA codificadora de uma AFP madura, na composição do plasmídeo, pelo que o processo de isolamento não requere o passo de desnaturação-renaturação e ao mesmo tempo proporciona glicosilação do polipéptido obtido e também enrolamento da molécula e formação das ligações dissulfureto. AFP humana recombinante produzida na forma secretada num sistema de expressão de levedura difere do análogo recombinante produzido num sistema de expressão procariótico por ser glicosilada de acordo com o tipo N, enquanto que AFP recombinante bacteriana descrita nas patentes (Murgita R.A. Patentes U.S. 6331611; 6627440; 6416734) não é glicosilada. AFP humana recombinante produzida numa forma secretada num 12 ΡΕ1807518 sistema de expressão de levedura difere do análogo sérico pela composição e estrutura da cadeia do oligossacárido, as quais são determinadas pela estirpe de levedura e composição dos açúcares incluídos no meio nutritivo.

De forma a obter um rendimento elevado da proteína secretada com a actividade necessária de uma célula hospedeira, vários ouros genes foram adicionados ao plasmídeo codificador do gene AFP, os genes adicionais proporcionam um nível elevado de transcrição do gene, enrolamento das proteínas no processo de secreção e formação correcta de ligações dissulfureto.

Como resultado, foi obtido um pKX tendo a capacidade de transformar células para a expressão e secreção de AFP.

Uma célula produtora eucariótica tendo a capacidade de secretar alfa-fetoproteína recombinante foi obtida com a ajuda do referido plasmídeo.

Numa variante preferida, uma estirpe recipiente de Saccharomyces cerevisiae YBS723 foi usada como célula inicial, esta estirpe foi transformada pelo plasmídeo pKX para obter uma estirpe produtora de Saccharomyces cerevisiae YBS732/pKX, depositado na Colecção Russa de Microrganismos Industriais ("Russian Collection of Industrial Microorganisms", VKPM) com o N° Y-3115. 13 ΡΕ1807518

Durante a cultura de uma estirpe transformada, AFP foi secretada para o meio, a partir do qual pode ser isolada numa forma pura com a utilização de métodos bioquímicos tradicionais.

Uma AFP isolada, obtida a partir de células transformadas, foi usada como parte de uma composição farmacêutica inibidora do crescimento de células tumorais, a qual compreende a AFP obtida e veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Uma AFP isolada foi usada na preparação de uma composição sinergística, inibidora do crescimento de células tumorais, a qual compreende a AFP obtida e preparações quimioterapêuticas e veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Com a utilização da AFP isolada, foi desenvolvida uma composição farmacêutica baseada na mesma ou compreendendo a sua composição sinergística, um método para o tratamento de cancro ou prevenção do seu desenvolvimento, o qual presume a administração a um doente de uma quantidade eficaz de AFP, composição farmacêutica ou composição sinergística.

Uma vez que a AFP obtida é semelhante a AFP sérica humana no que respeita às suas propriedades, a AFP obtida foi usada na preparação de uma composição sinergística tendo uma acção imunossupressora e imunorregula- 14 ΡΕ1807518 dora, em que a composição compreende AFP e ciclosporina C e veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Face à capacidade de AFP para estimular o crescimento de células estaminais, os inventores propuseram uma composição farmacêutica estimuladora do crescimento das células estaminais, a composição compreendendo a AFP obtida e veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis e uma composição sinergística estimuladora do crescimento das células estaminais é igualmente proposta, esta composição compreendendo a AFP obtida e derivados de vitaminas A, E, D, antioxidantes, hormonas esteróides, isoflavonas de origem vegetal com veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. E proposto um método para estimular o crescimento de células estaminais in vitro com a utilização da AFP isolada, a referida composição farmacêutica ou sinergística, o método compreendendo a actuação sobre as células de uma quantidade eficaz de AFP ou composições correspondentes .

Ainda, é proposto um método para estimular o crescimento de células estaminais in vivo, o método compreendendo a administração a um doente de uma quantidade eficaz de AFP ou da referida composição farmacêutica ou sinergística.

Uma composição cosmética para rejuvenescimento da pele e prevenção do envelhecimento da pele é proposta com 15 ΡΕ1807518 base na actividade funcional de AFP isolada, compreendendo a AFP obtida com veículos e excipientes aceitáveis em cosmetologia e, facultativamente, derivados de vitaminas A, E, D, antioxidantes, hormonas esteróides, isoflavonas de origem vegetal.

Um método de utilização da composição cosmética obtida para rejuvenescimento da pele e prevenção do envelhecimento da pele é proposto denrto do quadro do presente invento, o método compreendendo a aplicação da composição na pele de um indivíduo.

Breve descrição dos desenhos

Os desenhos que se seguem ilustram o presente invento.

Fig. 1 mostra a estrutura de um plasmídeo pKX codificador da sequência de uma alfa-fetoproteína humana madura, compreendendo uma cassete de expressão com um gene de alfa-proteína humana; um fragmento de um plasmídeo bacteriano pUC18; uma região de iniciação da replicação do plasmídeo 2-ym de levedura; uma marca selectiva para levedura PGK1, um gene PDll codificador de uma enzima isomerase de dissulfureto e um gene KAR2 que proporciona a montagem correcta da proteína e secreção do produto pretendido no meio de cultura.

Fig. 2 mostra a estrutura de uma cassete de expressão compreendendo uma sequência codificadora de uma alfa- 16 ΡΕ1807518 fetoproteína humana dentro da composição de um plasmídeo pKX. A região do promotor do gene de levedura GAL1 está apresentada em itálico. A região pre-pro de secreção do gene de levedura MFal está apresentada a negrito. A sequência de aminoácidos da molécula de alfa-fetoproteina humana está apresentada em maiúsculas.

Fig. 3 mostra a estrutura de um gene sintético codificador da AFP e consistindo nos codões mais usados em levedura. A sequência de aminoácidos de AFP, a qual é idêntica à sequência de aminoácidos de AFP sérica humana, está assinalada a rosa escuro.

Fig. 4 mostra os resultados de electroforese SDS-PAGE (A) e análise por imunotransferência (B) de diferentes quantidades, aplicadas numa linha, de uma alfa-fetoproteína recombinante obtida a partir do meio de cultura liquido de uma cultura de leveduras Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX. 1. Proteinas marcadoras (94, 67, 43, 30, 20 kDa). 2. rAFP após cromatografia de afinidade numa coluna com anti-AFP-Sepharose (0,3 yg) . 3. rAFP após cromatograf ia em gel numa coluna de

Sephacryl S-200 (0,4 yg) . 4 . rAFP (0,1 yg) . 5. rAFP após Sephacryl S-200 (0, 6 yg) . 6. rAFP após Sephacryl S-200 (0,5 yg) . 7. eAFP embrionária (0,4 yg). 17 ΡΕ1807518

Fig. 5 mostra uma dependência da proliferação de células Raji de linfoma das células B da concentração de AFP para duas amostras diferentes de AFP purificada, a qual foi obtida a partir de eAFP sérica embrionária e de rAFP recombinante, a qual é expressa pela estirpe de levedura produtora de Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX. A proliferação das células foi medida pela incorporação de [3H]-timidina e expressa como a percentagem de inibição do crescimento em culturas experimentais após 12 horas de incubação com AFP relativamente a um controlo sem aditivos.

Fig. 6 mostra: (A) aumento sinergistico da acção oncossupressora de doxorrubicina relativamente às células de mieloblastoma U937 com a utilização combinada de rAFP de acordo com o presente invento; (B) aumento sinergistico do efeito oncossupressor geral com a utilização combinada de rAFP de acordo com o presente invento e ácido retinóico (pro-vitamina A, ácido). A proliferação das células foi medida pela incorporação de [3H]-timidina e expressa como a percentagem de inibição do crescimento em culturas experimentais após 12 horas de incubação com AFP relativamente a um controlo sem aditivos.

Fig. 7 mostra o efeito estimulador de rAFP de acordo com o presente invento no crescimento de células estaminais embrionárias obtidas a partir de uma 18 ΡΕ1807518 cultura primária de células de pulmão embrionário e retina. A proliferação das células foi medida pelo método convencional de incorporação de [ H]-trmrdina durante as últimas quatro horas de cultura e expressa em percentagem da estimulação do crescimento de culturas a testar relativamente ao controlo sem AFP. A lista de sequências compreende sequências de SEQ ID N0:1 e SEQ ID N0:2, as quais são respectivamente a sequência nucleotidica de uma cassete de expressão compreendendo a sequência codificadora de uma alfa-fetoproteína humana na composição de um plasmideo pKX e a sequência de aminoácidos de uma AFP humana madura. A sequência nucleotidica de uma cassete de expressão compreende uma região de promotor do gene GAL1 de levedura, uma região pre-pro de secreção do gene de levedura MFal, a sequência codificadora de um gene de alfa-fetoproteina e uma sequência de terminação da transcrição de um gene CYC1 de levedura. Esta cassete de expressão está incluida na composição do plasmideo pKX codificador da sequência de uma alfa-fetoproteina humana madura numa estirpe produtora de levedura de um sistema de Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX.

Descrição detalhada do invento

Para realizar o presente invento, o principal objectivo técnico foi a criação de uma estirpe de levedura 19 ΡΕ1807518 produtora de AFP, capaz de eficazmente secretar a proteína pretendida para o líquido de cultura. Este objectivo foi atingido pela construção de um plasmídeo pKX de DNA recombinante codificador da síntese regulada de AFP humana e a estirpe Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX proporciona a síntese e produção de AFP numa forma secretada solúvel com um nível de expressão não inferior a 10 mg/1. O nível elevado de síntese da proteína pretendida na forma secretada solúvel é proporcionado pelo facto do plasmídeo pKX compreender um promotor do gene GAL1 com amplificação simultânea do gene KAR2 (Robinson A.S., et al., 1996, J.

Biol. Chem. 271:10017-10022), codificador de uma chaperone de proteínas BiP de ligação a cadeias pesadas. No genoma da estirpe recipiente, existe amplificação do gene PD11 (Robinson A.S., et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 10017-10022), codificador de uma enzima isomerase de dissulfureto, a qual participa na formação de ligações dissulfureto durante o processo secretor das proteínas. O DNA de plasmídeo recombinante compreende um gene AFP humano sob o controlo de um promotor do gene GAL1, proporcionando um elevado nível de transcrição do gene e um gene KAR2, codificador de uma chaperone de proteínas BiP de ligação a cadeias pesadas, que participa no enrolamento de proteínas durante o processo secretor das proteínas e proporciona um nível elevado de produção da proteína pretendida no líquido de cultura. Ainda, para proporcionar a formação correcta de ligações dissulfureto e a formação de uma estrutura terciária nativa da proteína, foi usado um gene PS11 codificador de isomerase de dissulfureto. 20 ΡΕ1807518

Um DNA de plasmídeo recombinante pKX (Fig. 1) , codificador de um gene de AFP humana, é caracterizado pelas seguintes caracteristicas: - é um plasmideo de expressão para a secreção eficaz de AFP humana; - possui um tamanho de 13301 pb; - compreende um fragmento codificador da sequência de aminoácidos de uma alfa-fetoproteina humana madura SEQ ID NO:2; - compreende um fragmento do plasmideo bacteriano pUC18; uma região de iniciação de um plasmideo 2-ym de levedura; uma marca selectiva para levedura PGK1; um gene de levedura KAR2 codificador de uma chaperone de proteínas BiP de ligação a cadeias pesadas, um gene PD11 codificador de uma enzima isomerase de dissulfureto; uma cassete de expressão com um gene AFP; na estrutura da cassete de expressão representada pela sequência nucleotídica SEQ ID NO:l está incluída: uma região de promotor do gene GAL1 de levedura; uma região pre-pro de secreção do gene de levedura MFal; uma região codificadora de uma AFP humana madura; uma sequência de terminação da transcrição de um gene de levedura CYC1. Quando este plasmídeo é introduzido numa célula, é conseguido um nível elevado de transcrição do gene AFP devido à utilização de um promotor GAL1 altamente eficaz. A introdução de uma região pre-pro de secreção de MFal proporciona o processamento correcto de AFP, 21 ΡΕ1807518 acompanhado da secreção eficaz da proteína com a sequência de aminoácidos esperada SEQ ID N0:2, se a região codificadora corresponder à sequência de DNA codificadora de uma AFP humana madura num líquido de cultura; - uma distinção significativa da construção de plasmídeo proposta é que um gene afp está sob o controlo de um promotor altamente eficaz GAL1 e, para proporcionar a formação correcta de ligações dissulfureto e a formação de uma estrutura terciária nativa da proteína, são usados os genes PD11 e KAR2.

Qualquer célula eucariótica susceptível de tal transformação com o plasmídeo indicado pode ser transformada com a ajuda do plasmídeo criado. A selecção da célula não é crítica, uma vez que o método e os passos de transformação são conhecidos dos familiarizados com a área. No entanto, dependendo do tipo de célula e das condições de cultura do transformante obtido, o nível de expressão de AFP pode variar, apesar do facto da expressão do péptido necessário ocorrer em condições de transformação com êxito da célula parental.

Uma estirpe recipiente YBS723 do genótipo pgkl/pgkl foi usada para obter a estirpe Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX. A homozigotia de pgkl/pgkl torna esta estirpe incapaz de crescer em todos os meios contendo qualquer fonte simples de carbono dentro das normalmente digeridas pelas leveduras S. cerevisiae. A homozigotia de gal80::PDll/gal80::PD11 resulta numa alteração da regulação 22 ΡΕ1807518 do promotor do gene GAL1 com amplificação simultânea no genoma do gene PD11 codificador da enzima isomerase de dissulfureto e participação na formação de ligações dissulfureto durante o processo secretor das proteínas. A estirpe YBS723 foi transformada pelo plasmídeo pKX de acordo com um método publicado (Ito H., et al., 1983, J. Bacteriol. 153:163-168). Os transformantes foram seleccionados de acordo com a capacidade para crescer num meio completo para leveduras (bactopeptona - 20 g/1, extracto de levedura - 10 g/1, bacto-agar - 20 g/1) compreendendo 2% de glucose como fonte de carbono. Um desses clones foi designado YBS723/pKX. A estirpe de levedura diplóide obtida, Saccha-romyces cerevisiae YBS723/pKX, caracteriza-se pelas seguintes características:

Caracteristicas genéticas: Genótipo pgkl/pgkl gal8 0::PDll/gal80::PD11;

Caracteristicas morfológicas: Células vegetativas de uma cultura crescida durante 48 horas num meio nutritivo sólido com 2% de glucose como fonte única de carbono possuem uma forma oval, tamanho celular de 3,6 x 7,1 pm, o protoplasma é homogéneo, a reprodução é por gemulação. Quando do crescimento num meio sólido compreendendo um extracto de levedura e peptona (YEP), a 30°C, após 72 horas de crescimento, as colónias têm o seguinte aspecto: 23 ΡΕ1807518 1) num meio YEP com glucose - uma colónia de cor branca com um bordo suave, superfície brilhante, perfil em forma de cone, consistência tipo nata; 2) num meio YEP com amido - uma colónia de cor branca com um bordo irregular, superfície baça, perfil tipo lente e consistência granulosa; 3) num meio YEP com melaço - uma colónia de cor branca com uma superfície enrugada baça, bordo irregular, perfil convexo e consistência tipo nata.

Crescimento num meio líquido - num meio YEP com amido a 32°C durante as primeiras 24 horas de cultura - um líquido leitoso, resíduo branco, não forma uma massa, não forma filmes parietais.

Caracteristicas fisicoquímicas: Anaeróbio facultativo. Temperatura de crescimento - 23-33°C (óptimo 31°C). pH de cultura - 3,8-6,7 (óptimo - 5,0). O nível mais alto de secreção de AFP foi observado a pH 6,8-7,0.

Assimilação de fontes de carbono: fermenta glucose, galactose, frutose, maltose, sacarose, dextrina, amido.

Assimilação de fontes de azoto: assimila amino-ácidos, ureia, sulfato de amónio, nitrato de amónio. 24 ΡΕ1807518

Especificidades distintivas: no caso de cultura num meio rico com amido (2%), a zonas de atenuação do amido rodeadas por orla escura após incubação da placa a +4°C durante 24 h.

Patogenicidade: a estirpe Saccharomyces cere- vísíae YBS723/pKX é não patogénica. Método de armazenamento: a estirpe é armazenada num meio rico em agar com glucose durante 3 meses a +4°C. A estirpe obtida Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX - produtora de AFP numa forma secretada foi depositada na Russian Collection of Industrial Micro-organisms (VKPM) com o N° Y-3115. A estirpe celular produtora de AFP recombinante proposta pelo Requerente possui um número de vantagens relativamente aos protótipos já existentes: - produção do produto pretendido realizada numa forma secretada para o liquido de cultura; - a sequência de aminoácidos do produto final corresponde à sequência de uma AFP humana madura - SEQ ID NO: 2 ; - de forma semelhante ao análogo sérico embrionário, rAFP, produzida pela estirpe produtora Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKS, é glicosilada; 25 ΡΕ1807518 o rendimento do produto pretendido foi significativamente aumentada devido a um aumento da expressão do gene codificador da enzima isomerase de dissulfureto PD11 proporcionando a formação de ligações dissulfureto e o gene KAR2 codificador da chaperone de proteínas BiP de ligação a cadeias pesadas proporciona a montagem correcta da proteína e secreção do produto pretendido para o meio de cultura. É totalmente óbvio que a sequência de DNA codificadora pode compreender substituições relacionadas com degeneração do código genético e também algumas substituições, inserções, deleções, as quais como um todo não resultam na obtenção de formas inactivas da fetoproteína. Variações possíveis são conhecidas dos familiarizados com a área. 0 polipéptido obtido pode também incluir dentro da grelha da sequência de aminoácidos substituições conservadas de aminoácidos, presumindo a substituição de um aminoácido com outro tendo propriedades semelhantes. No entanto, dentro dos limites das caracte-rísticas do presente invento existem apenas polipéptidos que possuem estrutura primária, secundária e terciária, que não perturbam a actividade necessária do polipéptido obtido, em particular - para ter propriedades idênticas ou semelhantes às propriedades de uma AFP humana madura, determinada numa análise imunológica e de acordo com a sua capacidade para suprimir o crescimento de células Raji de um linfoma de células B numa cultura in vitro. 26 ΡΕ1807518

Os indices de actividade funcional, para os quais é considerado que o polipéptido obtido terá as propriedades de uma AFP sérica humana madura, são determinados de acordo com a reacção imunológica e de acordo com a sua capacidade para inibir o crescimento in vitro de células Raj i do linfoma de células B num nível não inferior 10% da actividade de uma AFP sérica humana madura.

No caso do uso prático do polipéptido obtido numa composição, são usados outros componentes tradicionais, tais como excipientes, diluentes, preservativos, soluções tampão, solução fisiológica, uma solução a 0,9% de cloreto de sódio, aditivos tecnológicos usados durante a produção de formas do fármaco, etc. As composições podem ser fluidas (soluções, suspensões, cremes, emulsões, etc.), sólidas (pó liofilizado, reconstituídas antes de usar, uma preparação adsorvida num veículo, etc.), servindo para administração parentérica, oral, intravenosa, intramuscular, etc. ou para uso externo. Em que, as composições para uso externo podem compreender aditivos promotores da absorção e difusão da substância activa no tecido.

As composições sinergísticas do presente invento proporcionam a presença, na composição, de uma outra substância activa, neste caso duas substâncias activas estão presentes simultaneamente, uma das quais é a AFP de acordo com o presente invento, o efeito da sua actuação é consistentemente superior à situação em que cada substância é usada separadamente. Por exemplo, no caso da terapia anticancro, cada uma das preparações de um componente 27 ΡΕ1807518 activo pode ser administrada separadamente e conjuntamente, com separação temporal ou através de diferentes formas de administração. A selecção concreta depende do estado do doente, da gravidade da doença, de tratamentos anteriores, etc. A selecção das dosagens terapêuticas para tratamento pode ser qualquer dose numa larga gama entre 0,001 e 10 mg//kg do peso de um doente, com a condição de ser obtido o efeito terapêutico. Corresponde às dosagens tradicionais de AFP humana, uma vez que a AFP obtida terá propriedades que são semelhantes ou idênticas em termos de actividade. As dosagens limitantes de AFP de acordo com o invento correspondem às dosagens de AFP humana, uma vez que possuem uma sequência de aminoácidos semelhante, a qual não é reconhecida pelo sistema imune normal de um ser humano como "estranho". O presente invento é ilustrado pelos exemplos que se seguem, os quais não têm carácter restritivo, mas destinam-se a demonstrar a realização do invento e a realização da melhor variante do invento.

Exemplo 1

Isolamento de mRNA e construção de DNA do plasmldeo recombinante intermédio pTrcafp O mRNA total foi isolado a partir de uma linha celular de hepatoma humano HepG2 com a ajuda do reagente 28 ΡΕ1807518

Trizol (Gibco BRL, USA) de acordo com um método do fabricante. 0 cDNA foi obtido usando o kit First Strand cDNA Synthesis (MBI Fermentas) na presença de sequências iniciadoras oligonucleotidicas (dT)is ou GAAGTAATTTAAAC-TCCCAAAGC (3R), complementar do extremo 3' do gene afp. A amplificação da matriz obtida para subsequente clonagem foi realizada na presença das sequências iniciadoras: C T T CAATCGATAT GACACTGCATAGAAATG (Cia) CTTCCAAGCTTAAACTCCCAAAGCAG (Hind), a primeira das quais corresponde à sequência 5' do gene da proteina madura (evidenciado a negrito) e compreende o local de reconhecimento da enzima de restrição Cia I, enquanto a segunda é complementar da secção do extremo 3', num volume de 100 μΐ. A mistura de reacção compreende 10 ng de cDNA, 30 pM de cada uma das sequências iniciadoras (1) e (2), uma mistura de dNTPs (0,2 mM de cada), 10 mM de Tris-HC1, pH 8,8, 10 mM de KC1, 2,5 mM de MgSCh, 2,5 unidades de DNA-polimerase Pfu (Stratagene) e 1 unidade de DNA-polimerase Taq (Fermentas). Realizaram-se 25 ciclos de acordo com o esquema: 95°C/40 seg, 39°C/40 seg, 72°C/1 min. Os produtos da reacção foram analisados por electroforese num gel de 1% de agarose; secções correspondentes a um comprimento de aproximadamente 1790 pb foram cortadas. O DNA foi extraido do gel, tratado com as enzimas de restrição Ciai e HindIII e clonado no plasmideo pTrcTEGF, obtido anteriormente com base no vector pTrc99A (Amann E., et al., 1988, Gene, 69, 301-315) e tratado com as mesmas enzimas de restrição. Como resultado foi obtido o plasmideo 29 ΡΕ1807518 pTrcafp; a sua estrutura foi confirmada por análise de restrição, usando as enzimas de restrição Ciai e HindIII, relativamente à clonagem efectuada, e também Spel, Mun I, Sec I e Sty I, os locais de reconhecimento dos quais estão dentro do gene AFP e através da determinação da sequência nucleotidica da secção de DNA clonada com a ajuda de PCR. A sequenciação foi realizada de acordo com o método e utilização do kit de sequenciação Cycle Reader TM DNA Sequencing (Fermentas, Lithuania).

Exemplo 2

Preparação de cDNA sintético, codificador de um gene AFP humano

De forma a obter um gene AFP sintetizado quimicamente, 36 oligonucleótidos tendo um comprimento de 62-68 b foram obtidos por sintese quimica. Com base nestes oligonucleótidos seis fragmentos de cadeia dupla foram obtidos pelo método de reacção em cadeia da polimerase, cada um dos quais foi clonado num vector pUC18. A estrutura primária de todos os fragmentos clonados foi confirmada por sequenciação. Os fragmentos com a estrutura nucleotidica correcta foram então sequencialmente montados num gene pretendido pelo método de restrição/ligação na forma de um fragmento do plasmideo pUC18. De forma semelhante, foi obtido um cDNA para a expressão das formas modificadas de AFP, compreendendo a deleção, mutação ou adição de residuos de aminoácidos. 30 ΡΕ1807518

Exemplo 3

Construção de um plasmídeo recombinante pKX 0 plasmídeo pTrcafp foi usado como matriz para PCR na presença de sequências iniciadoras:

CAACCCTCGAGTTAAACTCCCAAAGC CCAACCCATGGCTAAGAGAACACTGCATAGAAA-TG.

Os locais de restrição Ncol e Xhol (sublinhados) foram inseridos na sequências das sequências iniciadoras. O fragmento de DNA obtido como resultado de amplificação após tratamento com as endonucleases de restrição Ncol/Xhol foi clonado no vector pUC18/GALl-pp, compreendendo um promotor GAL1 e a região prep-pro de secreção de MFal. Como resultado, foi obtido o plasmídeo pUCIB/GALl-pp/afp. De forma a excluir possíveis erros de PCR, o fragmento Ncol/Xhol do plasmídeo foi sequenciado. O fragmento HindIII/Xhol do plasmídeo pUC18/GALl-pp/afp, compreendendo o promotor GAL1, a região pre-pro de secreção de MFal e a parte codificadora do gene AFP humana (Fig. 2) foi transferidoi para o vector bi-replicão (levedura-E. coli)pPDX cortado com HindIII/Xhol. Como resultado, foi obtido o plasmídeo pPDX/GALl-pp/afp. O fragmento Clal/Xhol do plasmídeo pPDX/GALl-pp/afp foi transferida para o vector pPK cortado com Clal/Xhol, diferindo do pPDX pela presença do gene KAR2. O plasmídeo obtido como resultado foi designado pKX (Fig. 1). De forma semelhante, foi obtido o 31 ΡΕ1807518 plasmídeo pKX-1, compreendendo o gene AFP humano sintético consistindo nos codões de levedura mais frequentemente usados (Fig. 3) . 0 plasmídeo pKX-1 difere de pKX por compreender o gene sintético de uma AFP humana madura.

Exemplo 4

Obtenção de uma estirpe produtora de AFP humana

Para obter a estirpe de Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX, a estirpe recipiente YBS723 foi transformada pelo plasmídeo pKX de acordo com um método publicado (Ito H., et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163-168). Os transformantes foram seleccionados pela capacidade para crescer em meio completo para leveduras (bactopeptona - 20 g/1, extracto de levedura - 10g/l de bactoagar - 20 g/1) , compreendendo 2% de glucose como fonte de carbono. Um desses clones foi designado YBS723/pKX.

Exemplo 5

Determinação da produtividade da estirpe produtora de AFP humana Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKS

As células da estirpe produtora YBS723/pKX foram crescidas a 26°C (250 rpm) num meio com a seguinte composição: glucose - 2%, glicerina - 1,5%, extracto de levedura - 1%, peptona - 2%, água destilada. O pH do meio foi mantido a 7,0 pela adição de 0,1M de tampão de 32 ΡΕ1807518 fosfatos. A concentração inicial das células foi 5 x 105. Retiraram-se amostras após 72 horas de crescimento da cultura, após transição para a fase estacionária de crescimento, com uma concentração de 7-8 x 108. Uma amostra do liquido de cultura foi obtida após centrifugação da cultura a 10000 rpm durante 1 min e foi usado nas análises seguintes. Amostras de CL foram analisadas por electroforese num gel de 12,5% de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio. Os géis foram corados com

Coomassie R-250 (Fig. 4) e varridos para determinar a proteína total e o teor relativo da proteína específica de AFP. De acordo com os dados de electroforese e varrimento, o teor total de AFP no líquido de cultura foi determinado pelo método de imunotransferência na presença de anticorpos policlonais contra AFP (Fig. 4). Igualmente, o teor quantitativo de AFP no líquido de cultura foi determinado pelo método de análise imunoenzimática (IEA), com utilização de uma série de anticorpos monoclonais e policlonais contra AFP humano. De acordo com os dados de IEA, o teor médio de AFP em meios líquidos atingiu 5 mg/1.

Exemplo 6

Determinação da produtividade da estirpe produtora de AFP humana Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX em meios de elevada densidade A cultura da estirpe YBS723/pKX foi realizada num fermentador com alimentação descontínua, a 26°C e pH 7,0 33 ΡΕ1807518 (manutenção automática) , o teor do oxigénio dissolvido dO foi mantido em >20%. Durante a fermentação, procedeu-se à alimentação com meio tendo a seguinte composição: extracto de levedura - 30 g/1, peptona - 60 g/1, glucose - 100 g/1. A velocidade da alimentação com meio foi tal que proporcionou uma taxa de crescimento da cultura μ=0,03. Após se atingir uma DO50, igual a 280 unidades ópticas, o teor de AFP no liquido de cultura foi analisado. O teor relativo e total de AFP no liquido de cultura das culturas de elevada densidade de YBS723/pKX foi determinado como descrito atrás no exemplo 4. No caso da cultura em meios de densidade elevada, o teor de rAFP no liquido de cultura de acordo com os dados de IFA atingiu 70 mg/1.

Exemplo 7

Isolamento e caracterização de AFP recombinante a partir do líquido de cultura de uma estirpe produtora YBS723/pKX O isolamento de rAFP a partir do liquido de cultura da estirpe produtora YBS723/pKX foi realizado como descrito anteriormente (Dudich et al., 1999, Biochemistry, 38:10406-10414) com ligeiras alterações. 0 liquido de cultura foi concentrado a partir de 3 1 para 200 ml por ultrafiltração numa célula de concentração "Millipore" e dialisado contra Tris-HCl 0,005M, pH 7,5, tampão NaCl 0,1M, 4°C, depois centrifugado durante 0,5 horas a 10000 rpm. 34 ΡΕ1807518

Cromatografia de permuta iónica. 0 sobrenadante obtido após centrifugação foi aplicado numa coluna de permuta iónica DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, 27 x 4 cm), equilibrada com Tris-HCl 0,01M, pH 7,5, 0,1 M NaCl. Os componentes não ligados foram lavados da coluna com o tampão de partida, enquanto a eluição do produto pretendido foi realizada com NaCl 0,2M num tampão Tris-HCl, pH 7,5 a uma velocidade de 1 ml/min.

Cromatografia de afinidade. As fracções compreendendo rAFP foram combinadas, a concentração de NaCl foi levada até 0,5M e aplicada numa coluna de afinidade com Sepharose CL-4B conjugada com os anticorpos policlonais de coelho anti-AFP, a qual estava equilibrada com Tris-HCl 0,05M, pH 7,5 e NaCl 0,5M. Após lavagem das proteínas não ligadas aos anticorpos, a rAFP adsorvida foi eluída com HC1 0,005M. O pico do material eluído quando da passagem do pH de 5,0 para 3,5 foi determinado por absorção a 280 nm. A solução de rAFP foi neutralizada para pH 7,5 pela adição de uma solução 2M de Tris-HCl, pH 7,5.

Cromatografia em gel. Subsequente purificação de rAFP foi realizada por cromatografia em gel numa coluna com Sephacryl S-200 (1,8 x 70 cm) num tampão de fosfatos 0,1M, pH 7,0; NaCl 0,15M, a um fluxo de 0,5 ml/min. A solução de rAFP purificada foi concentrada numa célula "Amicon" (membrana YM-30) sob pressão de azoto.

Análise das amostras. A identificação e pureza da 35 ΡΕ1807518 preparação de rAFP obtida foram controladas pelos métodos de electroforese em gel de acordo com Laemmly, em 12,5% SDS-PAGE com β-mercaptoetanol , com subsequente coloração por Coomassie (Fig. 4A) , análise de transferências Western numa membrana de PVDF com um titulo de anticorpos primários de 1:500 e de secundários de 1:5000, transferência de pontos numa membrana de nitrocelulose Hybond ECL (Fig. 4B), IFA. A determinação da concentração da proteina nas soluções foi realizada de acordo com o método de Bredford, usando uma solução padrão de AFP embrionária como controlo e também espectrofotometricamente a 278 nm, tendo em consideração o coeficiente de extinção Ei%, 278 m. = 0,53.

Exemplo 8

Determinação da actividade biológica da AFP humana recombinante in vitro A actividade funcional de rAFP e das suas formas modificadas foi determinada de acordo com a sua capacidade de suprimir o crescimento de células Raj i do linfoma de células B na cultura in vitro, como anteriormente descrito (Semenkova L.N., 1997, Tumor Biol. 18, 261-274; Dudich E.I., et al., 1998, Tumor Biol. 19, 30-40). Previamente lavadas com meio fresco, as células Raji foram colocadas em alvéolos de uma placa de 96 alvéolos de acordo com 5 x 103 em 0,1 ml de meio RPMI-1640 na presença de 10% de soro 36 ΡΕ1807518 fetal bovino, depois diferentes doses de AFP foram adicionadas durante 12 horas. A proliferação das células foi medida por um método convencional, através da incorporação de [3H]-timidina durante as últimas 4 horas de cultura. Para comparação a reactividade dependente de dose foi estudada para duas amostras de AFP de origem embrionária embrAFP e rAFP de levedura (Fig. 5). É evidente que ambas as preparações apresentam uma actividade citostática marcada relativamente a estas células. De forma semelhante, para determinar a actividade das preparações com base em AFP in vitro, podem ser usadas quaisquer outras linhas celulares que sejam sensíveis à acção supressora de AFP, tais como hepatocarcinoma humano HepG2, cancro da mama MCF-7, cancro da próstata LnCap, mieloblastoma U-937 e outras (Semenkova L.N., 1997, Tumor Biol. 18,261-274;

Dudich E.I., et al., 1998, Tumor Biol. 19, 30-40).

Exemplo 9

Utilização de AFP recombinante como preparação anticancro

As preparações anticancro com base em rAFP e formas modificadas da mesma podem ser usadas na inibição do crescimento de neoplasmas malignos, tais como cancro metás-tico do fígado, cancro do sangue (leucose, mieloblastoma, linfoma), cancro da mama, cancro da próstata. Para determinar a sensibilidade deste tipo de células tumorais a AFP é possível usar diferentes métodos in vitro e também in vivo. O método de determinação da actividade in vitro está 37 ΡΕ1807518 descrito no exemplo 8 anterior. Para determinar a acção oncossupressora das preparações baseadas em AFP in vi vo, podem ser usados modelos animais, por exemplo com a utilização de murganhos labro com linhas celulares humanas de cancro implantadas subcutaneamente e intraperito-nealmente, tais como Raji, HepG2, LnCap, MCF-7 e outras. Por exemplo, as células Raji de linfoma de células B foram administradas subcutaneamente numa quantidade de 1-5 x 106 por murganho. A administração da AFP e seus derivados começou 7 dias antes da implantação de células tumorais, intraperitonealmente ou intravenosamente, numa quantidade de 1-10 mg/kg. A solução fisiológica tamponada (PBS) foi usada como controlo. O tamanho do tumor foi avaliado medindo diariamente com a ajuda de um micrómetro.

Tabela 1

Resultados dos testes de rAFP em modelos de murganhos labro com implantação de células Raji de linfoma das células B Numero de animais Dose de AFP por injecção Método de administração Resultado 10 1 mg Intraperitonealmente, diariamente durante 20 dias 2-estabilização 5- 50% de estabilização 3- não se desenvolveu o tumor 5 PBS Intraperitonealmente, diariamente durante 20 dias 2-estabilização 5- 50% de estabilização 3- não se desenvolveu o tumor 10 0, 5 mg Intraperitonealmente, diariamente durante 20 dias 2-estabilização 5- 50% de estabilização 3- não se desenvolveu o tumor 1° 2 mg Intraperitonealmente, diariamente durante 20 dias 2-estabilização 5- 50% de estabilização 3- não se desenvolveu o tumor 38 ΡΕ1807518 0 método de administração das preparações baseadas em rAFP de levedura, ou seus derivados, pode também compreender a administração de preparações quimiotera-pêuticas simultaneamente ou sequencialmente. 0 que se segue pode ser apresentado como exemplos de tais preparações qui-mioterapêuticas: doxorubicina, vincristina, fluorouracilo, metotrexato, actinomicina D, mitomicina C, tamoxifeno, flu-tamida, vincristina, vinblastina, ciclosporina, retinóides, carotenóides e outros. De um modo geral, uma preparação quimioterapêutica pode ser administrada em doses convencionais ou em doses subóptimas, abaixo do uso terapêutico. 0 efeito da acção combinada de rAFP e doxorubicina (A) e rAFP e todos os ácidos trans-retinóicos (tRA) está apresentado como exemplo na Fig. 6. No caso da administração simultânea das preparações, a acção oncossupressora siner-gística foi observada no caso do uso de doses subóptimas.

Exemplo 9

Uso de AFP recombinante para a estimulação do crescimento de células estaminais A cultura primária de fibroblastos embrionários do pulmão e retina humana foi obtida por tratamento com uma solução de tripsina a 0,2%, correspondendo a tecidos de embriões com 5-10 semanas obtidos de abortos legais. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 na presença de 39 ΡΕ1807518 10% de soro fetal de vitela (CFS). A actividade citostática de AFP foi medida como anteriormente descrito (Semenkova L.N., 1997, Tumor Biol. 18, 261 - 274; Dudich E.I., et al., 1998, Tumor Biol. 19, 30 - 40). As células numa quantidade de 4 x 104 em 0,15 ml de meio foram intensamente lavadas com meio fresco e colocadas em alvéolos individuais de uma placa de 96 alvéolos, depois diferentes doses de AFP foram adicionadas e cultivadas 24 horas. A proliferação das células foi medida por um método convencional através da incorporação de [3H]-timidina durante as últimas quatro horas de cultura. A dependência de dosagem do efeito de AFP no crescimento celular foi igualmente estudada para a cultura primária de fibroblastos embrionários humanos. AFP teve um efeito estimulador nestas células, atingindo 50-90% relativamente ao controlo (Fig. 7).

Exemplo 10

Utilização de AFP recombinante em cosmetologia

Face ao facto de AFP ter a capacidade de estimular o crescimento de células estaminais e ser um factor de crescimento de células embrionárias, é proposto o seu potencial uso para a preparação de máscaras cosméticas, cremes e loções. rAFP pode ser usado como excipiente para lipossomas, microssomas e nanossomas. Face ao facto de AFP 40 ΡΕ1807518 ser capaz de se ligar a ligandos hidrofóbicos, em particular, vitaminas solúveis em lípidos, esteróides, isoflavonóides, ácidos gordos polinsaturados (Deutsch H.F., 1991, Adv. Canc. Res. 56, 253-312); Aussel C. & Masseyeff R., 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 119: 1122-1127; Deutsch H.F., 1994, J. Tumor Marker Oncol. 9: 11-14), é apresentada a utilização combinada de rAFP com vitaminas solúveis em lipidos, tais como retinóides, carotenóides, tocoferol, vitamina D, com esteróides tais como estrogénios e androgénios. O estradiol e outros podem ser usados como exemplo de tais esteróides.

REFERÊNCIAS

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Listagem de sequências <110> BENEVOLENSKY, Sergei Bladimirovich; MARCHENKO, Alexei

Nikolaevich; KOZLOV, Dmitry Georgievich; ZATSEPIN, Sergei Sergeevich; SHINGAROVA, Lyudmila Nikolaevna; DUDICH, Igor Vyacheslavovich; SEMENKOVA, Lidiya Nikolaevna; DUDICH, Dmitry Igorevich; TATULOV,

Eduard Borisovich; DUDICH, Elena Ivanovna

<12 0> ALFA-FETOPROTEÍNA RECOMBINANTE, MÉTODO E MEIOS PARA A SUA PREPARAÇÃO, COMPOSIÇÕES BASEADAS NA MESMA E SUA UTILIZAÇÃO <160> 2

<210> 1 <211> 2556 <212> DNA <213> Sequência artificial <400> 1 aagctttâgc etaaaaaaac «ttctctttg gaactitcag fcaafcaôgstt aaefcgeteât 60 fcgctafcattg aagtecggat tagaagccge egagcgggtg acagccctce geaggaagac 120 tctcctocgt gcgtssciogt cttcaceggt cgegttcctç aaacgcagat atgcctcgcg 180 ecgoactgct c-egaacaata «agattefcae aatactagct tttatggtts tgaagaggaa 240 «aattggcag taaectggcc cc*caa*C«fc. fceeaafcgaac gs-stcaaatfc asesãccátâ 300 ggatgataat gcgattAftt ttttagectt «ttstctgggg taafctaat<sa gcgaagcgat 360 gatttttgat gtattaaoag atafcataaa* gc«M»aaa«tg cataaccset ttaaciaata 420 ctttcaacat fcttcggtitg tatfc&cfcfccfc. fcattcaaafcg taataaa&gt atcaacaaaa 480 aatfcgttaat atacctctat actttaacgfc caaggagaaa aaacfcaccat gagatttcca S40 tetatstfcea otgcagfcttt atfcafeagea tceteegcat tagetgatec *gieaa«a«t 600 acaa«5aga.ag atgaaacggc aca&attçeg gctgaagctg teatcggtta cttagattta 660 faafgggatfe· tcgatgttgc tgfctttgeca iíttccaaea geacasafcaa cgggfetattg 720 tttats&afca etaetafcfcge eaggafctgct gtsfcaaagaag saggggtatc catgggfcaa* 780 aggad&ctgc atagaaatga atatggaat® gettecaíat tggattctta cceatgtaet 840 geagagataa gfcttagctga cctggctac® atsttttttg ccessgfctfcgt tcsaga&gcc S08 aettaeaagg aagtaag&a* S>ât-çijtgàss gãfcgcatfcgs «tgcsãttga gaaacccact 060 ggagatgaac agtcfcfceagg gtffcttaga» a«cçsagc*ac· etgççfettefe ggaagaagtt 1020 tgccâtgagâ aagaaatfc&t ggagaagtaç ggscatteag actgcfcgcag ecaaagtgaa 1080 gagggaagac ataaotgfctt tcfcígcacac aaaaagccca ctcoagcatQ gatcCcactt 1140 ttçsaaffete oagaaee^gt «aeâagefcgfc gaageatatg ««gaagacag ggagaoattc 1200 atga&caa&fc tcatttatga gatageaaga aggeatceet tectgtsfcge scctaaaalt 1260

Ofctctttggg etgetxgcta tgassa.aaats attccatetfc gctgcaeagc tgaaaatge» 1320 gttgaatgct teeaaaeaaa ggcageaeca gfctacaaaag sattaagsf& aageageitg 1380 ttaá&tcsac atgcatgtgc agt&atgaaa aattttggga cocgaacttt ccasgceafca 1440

astgtfcaeta aacfcgagfcea gaagtttasc aaagttaatt fefcaetgaaat ccagaaacta 2 SOO gtcctggatg tggcccatgt scatgagcac tgttgcagag gagafcgtgct ggattgtctg 1580 caggatgggg aa&aaatcat gta*tseata tgtfteteaas aagacactct gtç&aacaaa 1620 atáácsgaafc gcfegeaaact facçaagctg gaaísgtggtc aatgtátâet tcatgcagaa 2680 aatgatgsaa aacctgaagg tetatetcça aafcçfcâãaea ggtttttagg agatagaçat. 1140 tttaaseaat: ttfccttcagg çgaaassasfc âtcfetettgg eaagttttgfc fccatgaatafc 1800 tc-a&gaagac: atectcaget tgjctgtctca gtaâttçtsa gafttgcffcaa aggataccag 2860 gagt&attgg agsagfegttt eeagseigsa aaccetettg aatgcesag® fcaaaggsgaa 1020

gaag&attac agaaataeat ccagg&gsge -eaageattgg easagcgasg ctggggcctc ISSO ttccagasac tagfagaata fct#cttacea aatgcgtttc tcgttgetts caeaaagaas 2040 gccccocagc tgaccfecgtc ggagetgstg gceatcaeca gaaaaatggc agccacagca 2100 gccacttgtt gcssaactcsg tgaggacsaa ístattggect gtggegaggg sgõggctgae 2160 sfcfcsttafccg gasaetfcafcg tatcagacat gaaatgactc g*$taaaceç tggtgfctggc: 2220 cagtg*tgca «ttcttcata tgccaaeagg «ggcoatgct tcagcâgêtt ggtggtggat 2230 gaaacatatg 't«cc*.cct-gc attçítctgat gscaagttca tttteeatâã ggatctgtgc 2340 caagctcagg gtgtagcgct gqaaacgatg aagtiaágagt ttctcattaa «cfctgfcgaag 2401 caaaâgccac aa&taaeaga ggaacaactt gaggctgtca ttgcagattt ctcaggcctg 2460 ttggagaaat fatgceaagg ssaggaaeag gaagtctgct ttgctgaaga gggaesiaaa® 2S20 46 ΡΕ1807518

<210> 2 <211> 590 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Thr Bis Mg Mm GXú Tyr Gly lie Ala Ser Ile Leu A&p Ser Tyr 1 5 10 15 01η Cys Thr Mh Glu Ϊ1® Ser Leu ÂX.& Asp Leu .Ala Thr Il& Phe Fhe Ala ϋΐΆ Fhs •j£ V Vai £5 In Glu Ala W\f Ihr Tyr Lys Glu Vai Ser Lys Mêt Vai 35 40 45 Lys &sp· Ala Leu Thr A1& iXê εε Glu Lys Pr® •Jhr Gly Asp Glu Glu, S#r Ser ísly Cys Leu Glu Ãsn GXh Lau Pro Ais Phe Leu Glu Glu Léu Cys 65 70 . 75 80 H.is Glu Lys Glv lie Leu 01 u r»3?fs· Tyr 51 y ais *Ser Asp Cys Cys S®r 35 00 ss Slrs Ser Blu Glu Sly Arg Ai# A#.« Cys Phe Leu M® His Lys Lys Ft;« 100 105 110 Thr Pr<s Ala Ser Ile Pr o Lsu Fhe <31» Vai Pr© Glu Pr© Vai. Thr S»r 115 120 125 Cys È91\í Ma Tyr G la Glu .ΑϊΓ^. G.Xu Thr Phe Met. Asn Lys Fhe lie 130 135 140 Tyr Glu Ile Ma Arq Arq Sis Pr© Pha Leu Μ* jXL-si Pro Thr llê Lev 145 ISO 15 § 160 tí^U Trp Ala Ala Agr Tyr Asp Lys Ile lie Pr© Ser Cys Cys Lys AXâ 165 170 175 Glu ÂSK Ma Vai Slu Cys Fhe Gin Thr Lys Ala Ma Thx Vai Thr Lys 180 I@5 ISO Glu 1*8« Arq Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gin His ÂXbS. Cys AX& Vai Mefe 135 200 20§ Lya Asn Pfo© C&Ly Thr Arq Thr Fhe SXn. AX â ile Thr Vai Thr Lys 210 215· 220 Ser Gin Lys Ph-a Thr l.ys Vai Asn Phe Thr Glu Ile fíln Lya Leu Vsl 230 235 240 Leu Asp Vai Ma His ¥ai His .Glu Ais Cys Cys Arg Gly Aep Vsi Leu 24 5 250 255 &Sp Cys Leu Glrs ASp Gly Glu Lys n® Met Psr Tyr Ile Cys Ser Gin 200 263 27G Asp ihr Ser A®n Lys lie Thr Glu Cys Cys Le« Thr Thr 275 2:80 SH5 Ιι&·& Glu Arg Êly Gin Cys 11® íL-Xs Mis Ala Glu Asn Asp Glu Lys Fríj 2.90 205 300 t?Xu. Giy Leu Ser Fm ASO. LêV Asa Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe 305 310 315 320 ASÍJ. :Glíi Phe Ser ^3- ¾ G. Sly Glu Lys As:n. si® Fhe Leu Ser Fb® Vai His íle Tyr Sèr Arg Arg AÍS Prô Glé. Léu Ala Vai Ser Vai 0i ,-í lie LêU 340 34 5 350 Mg Vai Ale Ly& Giy Tyr Gin. Glu Leu t-es.i Glu Lys Cys Ph® Glu Thr 355 360 36 S GlU A.siri Pre Leu Glu Cys 31o Asp Lys Gly Glu GXu Glu Lers Gin Lys 370 375 ISO Tyr Li® Girt Glu ser Glu ÃX s Leu Ala Lys Arg Ser Cys Cl y Lsu Phe 385 390 400 47 ΡΕ1807518 SIrt Lys Leu My lyx Tyr teu Gin Asn Ala Phs Leu Vai Ale Tyr 4 05 410 415 Thr Lys Lys Ala Pt O Gin Leu fhr Ser Ser Glu Lers Met Ala He Thr 4 20 425 430 Arg ty.S tfet Ala Ala Thr Ala Ale Tbr Cys Cys Cia Leu Ser slu &sp 43S 4 40 445 Lys Leu Lesa Alâ Cya 61 y Slu Sly Ais Ala Asp Ik ris lie Sly Hia 450 455 4 60 Lêu Cy4 lie Aíf$ Ma êiv Hat Th.r Pró Vai ASn Pro Sly V®1 Gly fíln 4! 65 470 415 480 Cys cya Thr S«r Ssí xyi· Ala ASíi Acg Arç Pr* CyS Físe Ser Ser Leu 485 4 90 495 Vai Vai Àsp Glu Thr 'lyr Vai Fso P:ro Ala Pfcg Ser Asp Assp Lye Pfce 300 505 510 lie Phe H.ÍS Iíy.3 Asp Leu Cys Sln Ala Sln Sly Vai Ala Leu Gin Thr SIS 520 525 S4et lys Sln Qlu Phs Leu. He ksr·. Leu vai Lys Gin i.ys F£ç> Gin He 530 535 540 Thr Slu Glu ÍÈIíí L-su Glu AI& Vai II# Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu 545 550 535 5«Q GÍu Lys Cys Cys Gin Gly Gin Glu Gin Salll ¥al Cys Pha Ala G.lu éiu 56S 570 575 Giy 6'Ifi LyB Lee Si® Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Sly Vai 580 585 500 Lisboa , 9 de Julho de 2012

Claims (4)

1. ΡΕ1807518 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um plasmideo pKX recombinante compreendendo: uma cassete de expressão de SEQ ID N0:1 codificadora de uma alfa-fetoproteina humana madura (SEQ ID N0:2); um fragmento do plasmideo bacteriano pUC18; uma região de iniciação da replicação do plasmideo 2-pm de levedura; um gene KAR2 que proporciona a montagem correcta da proteina e secreção do produto pretendido no meio de cultura; um gene PD11 que proporciona a formação correcta de ligações dissulfureto; uma marca selectiva para levedura URA3 e uma marca selectiva PGK1.
2. 2. Uma célula produtora eucariótica, com capacidade para secretar alfa-fetoproteina humana recombinante através da sua transformação com o plasmideo pKX de acordo com a reivindicação 1.
3. 3. Um método de preparação de uma alfa-fetoproteina recombinante (SEQ ID N0:2), compreendendo: cultura de uma célula eucariótica de acordo com a reivindicação 2, a célula tendo a capacidade de secretar uma alfa-fetoproteina recombinante no meio de cultura, e o passo de isolamento da alfa-fetoproteina recombinante a partir do meio de cultura.
4. 4. 0 método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por uma célula eucariótica ser uma célula de levedura. 2 ΡΕ1807518 5. 0 método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a cultura ser realizada a uma temperatura de 23-33°C num meio compreendendo: glucose - 2%, glicerina 1,5%, extracto de levedura - 1%, peptona - 2%, água destilada; com manutenção do pH do meio a 4,5-7,0 por tamponamento adicional e adição de oxigénio solúvel para pO>20%. Lisboa, 9 de Julho de 2012