ES2384863T3 - Alfa-fetoproteína recombinante, procedimiento y medios para la preparación de la misma, composiciones basadas en la misma y uso de la misma - Google Patents

Abstract

Un plásmido pKX recombinante que comprende: un módulo de expresión de SEQ ID NO:1 que codifica una alfa-fetoproteína humana madura (SEQ ID NO: 2), un fragmento del plásmido bacteriano pUC18, una región de inicio de la replicación de un plásmido de levadura de 2 μm, un gen KAR2 que proporciona el correcto ensamblado de la proteína y la secreción del producto deseado a un medio de cultivo, un gen PDI1 que proporciona la correcta formación de enlaces disulfuro, un marcador de levadura URA3 selectivo y PGK1 selectivo.

Description

Alfa-fetoproteína recombinante, procedimiento y medios para la preparación de la misma, composiciones basadas en la misma y uso de la misma

Campo de la invención

5 La invención se refiere a la industria microbiológica y médica, la ingeniería genética y la biotecnología. Se pretende una a-fetoproteína (AFP) recombinante según la presente invención, que retiene la actividad de la AFP humana y se obtiene a partir de suero, para uso en oncología, inmunoterapia y cosmetología.

Antecedentes de la invención

La alfa-fetoproteína (AFP) es el componente principal del suero sanguíneo embrionario de mamíferos, que se

10 sintetiza por hígado embrionario y saco vitelino durante el desarrollo perinatal. Inmediatamente después del nacimiento, se reduce bruscamente el nivel de AFP en el suero y su expresión se vuelve indetectable en individuos adultos sanos (Deutsch H.F., 1991, Adv. Canc. Res. 56, 253-312). Se renueva la síntesis de AFP con el desarrollo maligno de tumores hepáticos y teratoblastomas germinogénicos, y podría ser detectable en menor grado en el caso de lesión química y mecánica del hígado acompañada de regeneración, por ejemplo, durante hepatitis vírica aguda o

15 cirrosis (Mizejewsky G.J., 2002, Expert Rev. Anticancer. Ther. 2: 89-115).

La AFP humana es una glucoproteína consistente en 590 aminoácidos y que comprende aproximadamente un 4% de componente carbohidrato (Morinaga T., et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80, 4604-4608; Pucci P. et al., 1991, Biochemistry 30, 5061-5066). Una de las propiedades principales de la AFP es la captación no covalente de diferentes sustancias químicas de bajo peso molecular, tales como ácidos grasos poliinsaturados, hormonas

20 esteroideas, metales, retinoides, antibióticos hidrofóbicos y otros (Aussel S. y Masseyeff R., 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 119: 1122-1127; Deutsch H.F., 1994, J. Tumor Marker Oncol., 9: 11-14). En las etapas tempranas del desarrollo embrionario, la AFP reemplaza a la albúmina como vehículo de transporte de ácidos grasos y otras sustancias de bajo peso molecular (Deutsch H.F., 1991, Adv. Canc. Res. 56, 253-312).

La molécula de AFP consiste en tres dominios estructurales globulares unidos por 15 enlaces disulfuro

25 intercatenarios que aumentan significativamente la complejidad del proceso de ensamblado de la estructura terciaria de una proteína (Morinaga T., et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 4604-4608; Pucci P., et al., 1991, Biochemistry 30, 5061-5066). Además, es un elemento estructural importante de la molécula de AFP el componente carbohidrato, que proporciona una correcta recepción y funcionamiento de la molécula (Deutsch H.F., 1991, Adv. Canc. Res. 56, 253-312).

30 Además de la cadena polipeptídica consistente en 590 residuos aminoacídicos, la estructura de la molécula de AFP embrionaria sérica o la secretada por células de hepatocarcinoma incluye un grupo oligosacarídico ligado a asparagina según la glucosilación de tipo N (Yamashita K. et al., 1993, Cancer Res. 53: 2970-2975). La estructura de una cadena oligosacarídica de AFP es heterogénea y depende de diferentes factores: la etapa de desarrollo del hepatocarcinoma o la etapa de desarrollo del embrión. Los oligosacáridos afectan a las propiedades estructurales de

35 la molécula de AFP, y podrían incluirse en el contenido de determinantes antigénicos y centros de unión a receptor (Deutsch H.F., 1991, Adv. Canc. Res. 56, 253-312). A diferencia de la AFP sérica, la AFP recombinante expresada en células bacterianas no está glucosilada, lo que es una distinción característica del producto caracterizado en los trabajos de Murgita (patentes de EE.UU. 6.331.611, 6.627.440, 6.416.734) y, en consecuencia, tiene propiedades estructurales y funcionales que la distinguen del análogo sérico y también de la AFP recombinante expresada en

40 sistemas de levadura. Es conocido que, durante la expresión de proteínas heterólogas en levaduras, se lleva a cabo su glucosilación con respecto a los mismos residuos aminoacídicos que en el análogo sérico, pero la estructura de los oligosacáridos mismos difiere significativamente con respecto a la constitución, longitud y ramificación de la cadena, lo que predetermina también ciertas distinciones en las propiedades estructurales y funcionales de las correspondientes proteínas (Hard K. et al., 1998, FEBS Lett. 248: 111).

45 La AFP puede absorberse selectivamente por células que expresan receptores específicos de AFP (AFPR), tales como células embrionarias, citoblastos, células inmunitarias activadas, células cancerosas o células transformadas por ciertos tipos de retrovirus (Uriel J. et al., 1989, en Jizejewsky G.I., Jakobson H.I. (eds): “Biological Properties of Alpha-Fetoprotein”. Boca Ratón, CRC Press, vol. 2: 103-117). Las células maduras normales pierden la capacidad de absorber AFP y no expresan AFPR específicos. En vista de esta propiedad de la AFP, se han propuesto

50 procedimientos para el uso terapéutico de AFP con el fin de orientar el suministro de citostáticos y otras sustancias a un tumor, suprimiendo el crecimiento de células cancerosas (Deutsch H.F., 1994, J. Tumor Marker Oncol. 9: 11-14; Tsukada Y. et al., 1994, J. Tumor Marker Oncol. 9: 99-103).

La AFP tiene una serie de propiedades funcionales que se están estudiando intensamente en la actualidad. El concepto clásico de AFP como análogo de seroalbúmina embrionaria está actualmente complementado con datos 55 referentes a la capacidad de la AFP de llevar a cabo la regulación del crecimiento, desarrollo y muerte programada de células (Mizejewsky G.J., 2002, Expert Rev. Anticancer. Ther. 2: 89-115). En particular, se ha mostrado que la AFP recombinante, de forma similar al análogo sérico y cultivado, es capaz de suprimir el crecimiento de tejidos tumorales y normales dependientes de estrógeno (Bennett J.A. et al., 1997, Breast Cancer Res. Treat. 45, 169-179;

Bennet J.A. et al., 1998, Clinical Cancer Research, 4, 2877-2884). Recientemente, se ha establecido que la actividad oncosupresora de la AFP se lleva a cabo de acuerdo con el mecanismo de desencadenamiento de la apoptosis, que se caracteriza por cambios morfológicos típicos, la detención del crecimiento, citotoxicidad y fragmentación de ADN (Semenkova L.N., 1997, Tumor Biol. 18, 261-274; Dudich E.I., et al., 1998, Tumor Biol. 19, 30-40; Dudich E.I., et al.,

5 1999, Eur. J. Biochem. 266: 1-13; Semenkova L., et al., 2003, Eur. J. Biochem. 70: 4388-4399).

Estudios anteriores han mostrado la capacidad de la AFP de regular la diferenciación y activación de células inmunitarias. En particular, la AFP es capaz de suprimir células inmunitarias activadas con aloantígenos o autoantígenos e inhibir la expresión de diversos genes de citocinas (Yamashita K., et al., 1993, Cancer Res. 53, 2970-2975; patente de EE.UU. nº 5.965.528). Por otro lado, la AFP induce una notable estimulación del crecimiento

10 de células de médula ósea inmaduras, citoblastos y células embrionarias (Dudich E.I., et al., 1998, Tumor Biol. 19, 30-40; patente de EE.UU. nº 6.627.440).

Estas propiedades de la AFP, y también la selectividad aumentada de la absorción de AFP por células cancerosas in vivo (Uriel J., et al., 1989, en Mizejewsky G.I., Jakobson H.I., eds: “Biological Properties of Alpha-Fetoprotein”. Boca Ratón, CRC Press. vol, 2: 103-117), han revelado la base para su uso en medicina como preparación terapéutica en

15 el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias (patente de EE.UU. nº 5.965.528) y oncológicas (patente de EE.UU. nº 6.416.734; Mizejewsky G.J., 2002, Expert Rev. Anticancer. Ther. 2: 89-115). Además, la AFP se usa tradicionalmente como marcador oncoembrionario para el diagnóstico temprano de enfermedades oncológicas y patologías del desarrollo embrionario (Deutsch H.F., 1991, Adv. Canc. Res. 56, 253-312). Sin embargo, el uso de AFP natural como fármaco es tecnológicamente imposible debido a la deficiencia de material bruto.

20 Tradicionalmente, es una fuente para la obtención de AFP el suero sanguíneo de mujeres embarazadas, el suero embrionario de cordón umbilical o el fluido ascítico de pacientes de cáncer. Obviamente, ninguna de estas fuentes es aceptable para la producción de una sustancia proteica con fines médicos debido, en primer lugar, a que está extremadamente limitado el acceso a la fuente de material bruto y a que el contenido de AFP en el mismo es bajo, y en segundo lugar, existe el riesgo creciente de infección con virus o priones.

25 Se han publicado datos anteriormente respecto a la expresión y purificación de AFP recombinante (AFPr) en diferentes microorganismos (Yamamoto R., et al., 1990, Life Sciences, 46: 1679-1686; Nishi S., et al., 1988, J. Biochem. 104: 968-972; patente de EE.UU. 5.206.153; patente de EE.UU. 6.331.611). Por tanto, se ha llevado a cabo la producción intracelular de AFPr humana en Saccharomyces cerevisiae (Yamamoto R., et al., 1990, Life Sciences, 46: 1679-1686; patente de EE.UU. 5.206.153) y Escherichia coli (patente de EE.UU. 6.331.611; Boismenu

30 R., et al., 1997, Protein Expression and Purification. 10: 10-26). Se ha mostrado que la AFP recombinante, expresada en Escherichia coli, retiene la actividad inmunoreguladora y oncosupresora del análogo embrionario (Boismenu R., et al., 1997, Protein Expression and Purification. 10: 10-26; Bennett J.A., et al., 1997, Breast Cancer Res. Treat. 45, 169-179). La principal desventaja de estos sistemas de expresión es la incapacidad de secretar proteína heteróloga y el nivel extremadamente bajo de su producción. Además, la obtención del producto deseado a

35 partir de una biomasa de cepas productoras recombinantes requería llevar a cabo procedimientos adicionales de desnaturalización y renaturalización, que daban como resultado una reducción significativa del rendimiento del producto y, como consecuencia, un aumento sustancial de su coste. También en el caso de uso de sistemas de expresión bacterianos, es también importante el problema de la contaminación del producto con los lipopolisacáridos de la cubierta, que tienen actividad endotóxica conocida.

40 La solución técnica más similar a la presente invención es la cepa productora de AFP humana que se describe en las referencias (Yamamoto R., et al., 1990, Life Sciences, 46: 1679-1686; patente de EE.UU. 5.206.153). En estas fuentes, se dan a conocer cepas productoras de levadura Saccharomyces cerevisiae con producción intracelular de AFP humana, cuya secuencia aminoacídica comprende una sección adicional correspondiente al péptido señal de AFP de rata. Esta invención identifica el producto de secreción de una cepa de levadura, teniendo dicho producto las

45 propiedades de una AFP humana madura y la secuencia original SEQ ID NO: 2, que corresponde a la secuencia de una AFP humana madura. Esta especificidad distingue el producto descrito en la presente invención de los dados a conocer anteriormente (Yamamoto R., et al., 1990, Life Sciences, 46: 1679-1686; patente de EE.UU. 5.206.153). Además, es una desventaja de esta cepa descrita en las referencias citadas la ausencia de mecanismos para el ensamblado intracelular y la secreción de AFP en un líquido de cultivo, lo que eleva significativamente el coste y

50 hace más complejo el proceso de preparación de una AFP recombinante purificada en cantidades preparativas y proporciona un nivel extremadamente bajo de producción de AFP. Además, los autores del citado trabajo (Yamamoto R., et al., 1990, Life Sciences, 46: 1679-1686; patente de EE.UU. 5.206.153) obtuvieron una AFP recombinante modificada cuya secuencia comprende también un péptido señal y ligador, lo que limita la posibilidad de su uso médico debido a la modificación de la estructura de la proteína, dando como resultado un cambio de la

55 especificidad inmunológica y, como resultado de ello, un aumento del riesgo de patología inmunorreactiva con la administración intravenosa o subcutánea.

En el caso de producción por secreción heteróloga con células de levadura de proteínas para las que el plegamiento correcto tiene lugar con la formación de enlaces disulfuro (entre ellas la AFP), es importante el nivel de producción de disulfuro isomerasa de levadura (Pdi) con células productoras (Shusta E.V., et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16: 773

60 777). Además, se proporciona una acción sinérgica con esta enzima por una cantidad aumentada de proteína de levadura de tipo chaperona BiP (Robinson A.S., et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 10017-10022).

A pesar del hecho de se considera tradicionalmente que las levaduras son organismos exentos de proteinasas secretadas (Chung B.H. y Park K.S., 1998, Biotechnol. Bioeng. 57: 245-249), para una serie de proteínas, incluyendo HSA, se muestra su degradación en el transcurso del cultivo de levaduras, que está relacionada con la presencia de proteinasas aún no identificadas asociadas a la célula (Chung B.H. y Park K.S., 1998, Biotechnol.

5 Bioeng. 57: 245-249; Kang H.A., et al., 2000, Appl. Microbiol. Biotechnol. 53: 575-582). Todos los factores enumerados han de tomarse en cuenta durante la creación de una levadura productora de AFP secretada eficazmente a un líquido de cultivo.

Teniendo en cuenta los inconvenientes de los procedimientos existentes actualmente para la preparación de una AFP recombinante, resulta obvio que existe la necesidad de una mejora adicional de la tecnología de los sistemas

10 de expresión y secreción de AFP recombinante, en particular, el desarrollo de nuevas cepas recombinantes que tengan la capacidad de una mayor expresión de proteína heteróloga con la provisión de un ensamblado intracelular de una estructura terciaria nativa y la posterior secreción del producto deseado al líquido de cultivo.

Por tanto, el requisito de desarrollo de procedimientos aplicables industrialmente para la preparación de AFP que, con respecto a sus propiedades, sería idéntica o similar a la AFP sérica humana y por tanto posibilitaría usarla en

15 aquellos campos en que se usa tradicionalmente la AFP sérica humana, se deduce objetivamente a partir del estado de la técnica.

La consecución del objeto indicado es posible mediante la creación de una nueva cepa de microorganismos que puedan producir en medio de cultivo un polipéptido idéntico o similar a la AFP sérica humana con respecto a sus propiedades.

20 Sumario de la invención

Para preparar una AFP recombinante cuyas propiedades sean idénticas o similares a las propiedades de una AFP sérica humana, era necesario desarrollar una cepa productora que proporcione la síntesis y producción de AFP en forma soluble secretada.

Se obtuvo la cepa productora con el uso de procedimientos de ingeniería genética, transformando una cepa original

25 con un plásmido que comprendía una secuencia de ADN que codificaba una proteína que tenía la actividad de una AFP humana madura.

Una AFP secretada recombinante producida en un sistema de expresión de levadura tiene propiedades idénticas o similares a las propiedades de una AFP humana madura, que se determinan en un análisis inmunológico y por su capacidad de suprimir el crecimiento de células Raji de linfoma de linfocitos B y otras líneas celulares humanas

30 sensibles a la acción apoptogénica en un cultivo in vitro. Esto proporciona un mecanismo de acción idéntico a la AFP obtenida y a una AFP sérica humana madura obtenida mediante un procedimiento tradicional y que tiene una secuencia aminoacídica presentada como la SEQ ID NO: 2. Las condiciones para llevar a cabo el procedimiento de preparación de AFP según la presente invención proporcionan el ensamblado de un polipéptido con defectos mínimos en comparación con la AFP humana nativa.

35 La similitud de las propiedades de la AFP recombinante humana producida en levaduras y la AFP sérica humana se proporciona por la inclusión en la composición del plásmido de un módulo de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica una AFP humana madura, porque el proceso de aislamiento no requiere una etapa de desnaturalización-renaturalización y porque al mismo tiempo se proporciona la glucosilación del polipéptido obtenido, y también el plegamiento de la molécula y la formación de enlaces disulfuro. La AFP humana

40 recombinante producida en forma secretada en un sistema de expresión de levadura difiere del análogo recombinante producido en un sistema de expresión proeucariótico en que está glucosilada según el tipo N, mientras que la AFP bacteriana recombinante descrita en patentes (Murgita R.A. patentes de EE.UU. 6.331.611, 6.627.440, 6.416.734) no está glucosilada. La AFP recombinante humana producida en forma secretada en un sistema de expresión de levadura difiere del análogo sérico por la composición y estructura de la cadena oligosacarídica, que se

45 determina por la cepa de levadura y la composición de los azúcares incluidos en el medio nutriente.

Para obtener un alto rendimiento de la proteína secretada con la actividad requerida de una célula hospedadora, se añadieron varios genes adicionales al plásmido que codifica el gen de AFP, proporcionando los genes adicionales un alto nivel de transcripción génica, plegamiento de las proteínas en el proceso de secreción y formación correcta de puentes disulfuro.

50 Como resultado, se obtuvo un plásmido pKX que tenía la capacidad de transformar células para la expresión y secreción de AFP.

Se obtuvo una célula productora eucariótica que tenía la capacidad de secretar alfa-fetoproteína recombinante con la ayuda del plásmido anteriormente citado.

En una variante preferible, se usó una cepa receptora de Saccharomyces cerevisiae YBS723 como célula inicial,

55 transformándose esta cepa por el plásmido pKX para obtener una cepa productora Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX, depositada en la Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) con el nº Y-3115.

Durante el cultivo de la cepa transformada, se secreta AFP a un medio del que puede aislarse en forma pura con el uso de procedimientos bioquímicos tradicionales.

Se usa una AFP aislada obtenida a partir de células transformadas como contenido de una composición farmacéutica que inhibe el crecimiento de células tumorales, que comprende la AFP obtenida y portadores y 5 excipientes farmacéuticamente aceptables.

Se usa una AFP aislada en la constitución de una composición sinérgica que inhibe el crecimiento de células tumorales, que comprende la AFP obtenida, preparaciones quimioterapéuticas y portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables.

Con el uso de AFP aislada, una composición farmacéutica basada en la misma o que comprende su composición

10 sinérgica, se ha desarrollado un procedimiento para tratar cáncer o prevenir su desarrollo que supone la administración a un paciente de una cantidad eficaz de AFP, composición farmacéutica o composición sinérgica.

Puesto que la AFP obtenida es similar con respecto a las propiedades a la AFP sérica humana, se usa la AFP obtenida en la constitución de una composición sinérgica que tenga acción inmunosupresora e inmunoreguladora, en la que la composición comprende AFP y ciclosporina C y portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables.

15 Se ha desarrollado un procedimiento para tratar enfermedades autoinmunitarias y corregir el estado inmunitario con el uso de la AFP aislada o la composición sinérgica anteriormente citada, comprendiendo el procedimiento la administración a un paciente de una cantidad eficaz de una AFP o una composición sinérgica con ciclosporina C.

En vista de la capacidad de la AFP de estimular el crecimiento de citoblastos, los inventores han propuesto una composición farmacéutica que estimula el crecimiento de citoblastos, comprendiendo la composición la AFP

20 obtenida y portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables, y se propone también una composición sinérgica que estimula el crecimiento de citoblastos, comprendiendo esta composición la AFP obtenida y derivados de las vitaminas A, E, D, antioxidantes, hormonas esteroideas, isoflavonas de origen vegetal y portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables.

Se propone un procedimiento para la estimulación del crecimiento de citoblastos in vitro con el uso de AFP aislada o

25 la composición farmacéutica o sinérgica anteriormente citada, comprendiendo el procedimiento actuar sobre las células con una cantidad eficaz de AFP o las correspondientes composiciones.

Además, se propone un procedimiento para estimular el crecimiento de citoblastos in vivo, comprendiendo el procedimiento administrar a un paciente una cantidad eficaz de AFP o de la composición farmacéutica o sinérgica anteriormente citada.

30 Se propone una composición cosmética para rejuvenecer la piel y evitar el envejecimiento basándose en la actividad funcional de la AFP aislada, comprendiendo la composición la AFP obtenida con portadores y excipientes aceptables en cosmetología y, opcionalmente, derivados de las vitaminas A, E, D, antioxidantes, hormonas esteroideas e isoflavonas de origen vegetal.

Se propone un procedimiento de uso de la composición cosmética obtenida para rejuvenecer la piel y evitar el

35 envejecimiento de la piel dentro del marco de la presente invención, comprendiendo el procedimiento aplicar la composición sobre la piel de un individuo.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos ilustran las materias en cuestión de la invención presentadas.

La Fig. 1 muestra la estructura de un plásmido pKX que codifica la secuencia de una alfa-fetoproteína humana

40 madura, que comprende un módulo de expresión con un gen de alfa-proteína humana, un fragmento de un plásmido bacteriano pUC18, una región de inicio de la replicación de un plásmido de levadura de 2 μm, un marcador de levadura PGK1 selectivo, un gen PD11 que codifica una enzima disulfuro isomerasa y un gen KAR2 que proporciona el correcto ensamblado de la proteína y la secreción del producto deseado a un medio de cultivo.

La Fig. 2 muestra la estructura de un módulo de expresión que comprende una secuencia que codifica una alfa

45 fetoproteína humana en la composición de un plásmido pKX. La región promotora del gen de levadura GAL1 se muestra en cursiva. La región prepro de secreción del gen de levadura MFa1 se muestra en negrita. La secuencia aminoacídica de la molécula de alfa-fetoproteína humana se muestra en mayúsculas.

La Fig. 3 demuestra la estructura de un gen sintético que codifica AFP y consistente en los codones de levadura usados más frecuentemente. La secuencia aminoacídica de AFP, que es idéntica a la secuencia aminoacídica de la

50 AFP humana sérica, se destaca en negrita.

La Fig. 4 muestra los resultados de electroforesis en PAGE-SDS (A) y análisis de inmunotransferencia (B) de diferentes cantidades, aplicadas en una línea, de una alfa-fetoproteína recombinante purificada obtenida a partir de un líquido de cultivo del cultivo de levadura Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX.

1.

Proteínas marcadoras (94, 67, 43, 30, 20 kDa).

2.

AFPr después de cromatografía de afinidad en una columna con anticuerpo anti-AFP-Sepharose (0,3 μg).

3.

AFPr después de cromatografía en gel en una columna con Sephacryl S-200 (0,4 μg).

4.

AFPr (0,1 μg).

5 5. AFPr después de Sephacryl S-200 (0,6 μg).

6.

AFPr después de Sephacryl S-200 (0,5 μg).

7.

AFPe embrionaria (0,4 μg).

La Fig. 5 muestra la dependencia de la dosis de la proliferación de células Raji de linfoma de linfocitos B sobre la concentración de AFP para dos muestras diferentes de AFP purificada, que se obtienen a partir de AFPe sérica

10 embrionaria y AFPr recombinante, que se expresa por la cepa de levadura productora Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX. Se midió la proliferación de las células mediante la incorporación de [3H]-timidina y se expresó en porcentaje de inhibición del crecimiento en cultivos experimentales después de 12 h de incubación con AFP con respecto a un control sin aditivos.

La Fig. 6 demuestra: (A) la potenciación sinérgica de la acción oncosupresora de la doxorubicina con respecto a

15 células U937 de mieloblastoma con el uso combinado con AFPr según la presente invención; (B) la potenciación sinérgica del efecto oncosupresor general con el uso combinado de AFPr según la presente invención y ácido retinoico (pro-vitamina A, ácida). La proliferación de las células se midió mediante la incorporación de [3H]-timidina y se expresó en porcentaje de la inhibición del crecimiento en cultivos experimentales después de 12 h de incubación con AFP con respecto a un control sin aditivos.

20 La Fig. 7 muestra el efecto estimulante de AFPr según la presente invención sobre el crecimiento de citoblastos embrionarios obtenidos a partir de un cultivo primario de células de pulmón y retina embrionarios. Se midió la proliferación de las células mediante un procedimiento estándar de incorporación de [3H]-timidina durante las últimas 4 horas de cultivo y se expresó en porcentaje de la estimulación del crecimiento en cultivos de ensayo con respecto a un control sin AFP.

25 La lista de secuencias comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, que son respectivamente la secuencia nucleotídica de un módulo de expresión que comprende la secuencia codificante de una alfa-fetoproteína humana en la composición de un plásmido pKX y la secuencia aminoacídica de una AFP humana madura.

La secuencia nucleotídica de un módulo de expresión comprende una región promotora del gen de levadura GAL1, una región prepro de secreción del gen de levadura MFa1, la secuencia codificante de un gen de alfa-fetoproteína

30 humana y un campo de terminación de la transcripción de un gen de levadura CYC1. Este módulo de expresión está incluido en la composición del plásmido pKX que codifica la secuencia de una alfa-fetoproteína humana madura en una cepa de levadura productora de un sistema de Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX.

Descripción detallada de la invención

Para realizar la presente invención, el principal objeto técnico era la creación de una cepa de levadura productora de

35 AFP capaz de secretar eficazmente la proteína deseada en un líquido de cultivo. El objeto se consigue construyendo un plásmido de ADN recombinante pKX que codifica la síntesis regulada de AFP humana y la cepa Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX que proporciona la síntesis y producción de AFP en forma disuelta secretada con un nivel de expresión no inferior a 10 mg/l. El alto nivel de síntesis de la proteína deseada en forma disuelta secretada se proporciona porque el plásmido pKX comprende un promotor del gen GAL1 con amplificación simultánea del gen

40 KAR2 (Robinson A.S., et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 10017-10022), que codifica una proteína de unión a cadena pesada chaperona BiP. En el genoma de la cepa del receptor, hay amplificación del gen PD11 (Robinson A.S., et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 10017-10022), que codifica una enzima disulfuro isomerasa que participa en la formación de enlaces disulfuro durante el proceso secretor de las proteínas.

El ADN de plásmido recombinante comprende un gen de AFP humana bajo el control de un gen promotor de GAL1,

45 que proporciona un alto nivel de transcripción del gen, y un gen KAR2, que codifica una proteína de unión a cadena pesada chaperona BiP, que participa en el plegamiento de proteínas durante el proceso secretor de las proteínas y proporciona un alto nivel de producción de la proteína deseada en el líquido de cultivo. Además, para proporcionar la correcta formación de enlaces disulfuro y la formación de una estructura terciaria nativa de la proteína, se usa un gen PS11 que codifica la disulfuro isomerasa.

50 Se caracteriza el ADN del plásmido pKX recombinante (Fig. 1), que codifica un gen de AFP humana, por los siguientes rasgos:

-

es un plásmido de expresión para la secreción eficaz de AFP humana; -tiene un tamaño de 13301 pb;

-

comprende un fragmento que codifica la secuencia aminoacídica de una alfa-fetoproteína humana madura de SEQ ID NO: 2;

-

comprende un fragmento del plásmido bacteriano pUC18, una región de inicio del plásmido de levadura de

5 2 μm, un marcador de levadura selectivo PGK1, un gen de levadura KAR2 que codifica una proteína de unión a cadena pesada chaperona BiP, un gen PD11 que codifica una enzima disulfuro isomerasa y un módulo de expresión con un genoma de AFP;

-

en la estructura del módulo de expresión presentado por la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:1 se incluyen: una región promotora del gen de levadura GAL1, una región prepro de secreción del gen de levadura 10 MFa1, una región que codifica una AFP humana madura y un campo de terminación de la transcripción de un gen de levadura CYC1. Cuando se introduce este plásmido en una célula, se consigue un alto nivel de transcripción del gen de AFP debido al uso de un promotor de GAL1 altamente eficaz. La introducción de una región prepro de secreción de MFa1 proporciona el procesamiento secretor correcto de la AFP, acompañado de la secreción eficaz de la proteína con la secuencia aminoacídica esperada de SEQ ID NO: 2, si la región codificante correspondiera con

15 la secuencia de ADN que codifica una AFP humana madura en un líquido de cultivo;

-

una distinción significativa de la construcción de plásmido propuesta es que el gen afp está bajo el control de un promotor de GAL1 altamente eficaz, y para proporcionar la correcta formación de puentes disulfuro y la formación de una estructura terciaria nativa de la proteína, se usan los genes PD11 y KAR2.

Cualquier célula eucariótica susceptible de dicha transformación con el plásmido indicado puede transformarse con

20 la ayuda del plásmido creado. La selección de la célula no es crítica, puesto que los procedimientos y etapas de transformación son bien conocidos por los especialistas en la materia. Sin embargo, dependiendo del tipo de célula y las condiciones de cultivo del transformante obtenido, puede variar el nivel de expresión de AFP, pero el hecho de la expresión del péptido requerido tendrá lugar en condiciones de transformación exitosa de la célula original.

Se usa una cepa receptora YBS723 de genotipo pgk1/pgk1 para obtener la cepa Saccharomyces cerevisiae

25 YBS723/pKX. La homocigosis de pgk1/pgk1 hace a esta cepa incapaz de crecimiento en todos los medios que contengan cualquier fuente individual de carbono digerible normalmente por levaduras S. cerevisiae. La homocigosis de ga180: :PD11/ga180: :PD11 da como resultado un cambio de la regulación del promotor del gen GAL1 con la amplificación simultánea del genoma del gen PD11 que codifica la enzima disulfuro isomerasa y la participación en la formación de enlaces disulfuro durante el proceso secretor de las proteínas.

30 La cepa YBS723 se transforma por el plásmido pKX según el procedimiento (Ito H., et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163-168). Se seleccionaron los transformantes según la capacidad de crecer en medio de levadura completo (bactopeptona - 20 g/l, extracto de levadura - 10 g/l, bactoagar - 20 g/l) que comprende 2% de glucosa como fuente de carbono. Uno de dichos clones se designa como YBS723/pKX.

La cepa de levadura diploide obtenida Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX se caracteriza por los siguientes 35 rasgos:

Rasgos genéticos: Genotipo pgk1/pgk1 ga180: :PD11/ga180: :PD11.

Rasgos morfológicos: Las células vegetativas de un cultivo de 48 horas cultivado en medio nutriente sólido con 2% de glucosa como única fuente de carbono tienen forma oval, un tamaño de célula de 3,6 x 7,1 μm, el protoplasma es homogéneo y la reproducción es por gemación. Cuando se cultivan en un medio sólido que comprende extracto de

40 levadura y peptona (YEP) a 30ºC después de 72 h de crecimiento, las columnas tienen la siguiente apariencia:

1) en medio YEP con glucosa- una columna de color blanco de borde liso, superficie brillante, perfil en forma de cono y consistencia de tipo crema;

2) en medio YEP con almidón- una columna de color blanco de borde pautado, superficie mate, perfil de tipo lenticular y consistencia granulosa;

45 3) en medio YEP con melazas- una columna de color blanco con superficie mate arrugada, borde pautado, perfil convexo y consistencia de tipo crema.

Crecimiento en medio líquido: En medio YEP con almidón a 32ºC durante las primeras 24 horas de cultivo- un líquido turbio, de residuo blanco, no se apelmaza y no forma películas parietales.

Rasgos fisicoquímicos: Anaerobia facultativa. Temperatura de crecimiento: 23-33ºC (óptima, 31ºC). pH de cultivo, 50 3,8-6,7 (óptimo, 5,0). Se observa el mayor nivel de secreción de AFP a pH 6,8-7,0.

Asimilación de fuentes de carbono: Fermenta glucosa, galactosa, fructosa, maltosa, sacarosa, dextrina y almidón.

Asimilación de fuentes de nitrógeno: Asimila aminoácidos, urea, sulfato de amonio y nitrato de amonio.

Especificidades distintivas: En el caso de cultivo en un medio rico en almidón (2%), zonas de almidón consumido rodeadas por un borde oscuro después de incubación del disco a +4ºC durante 24 h.

Patogenicidad: La cepa Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX no es patogénica.

Procedimiento de almacenamiento: Se almacena la cepa en un medio rico en agarosa con glucosa durante 3 meses 5 a +4ºC.

Se deposita la cepa Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX obtenida, productora de AFP en forma secretada, en la Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) con el nº Y-3115.

La cepa celular productora de AFP recombinante propuesta por los solicitantes tiene una serie de ventajas frente a los prototipos ya existentes:

10 -la producción del producto deseado se lleva a cabo en forma secretada en un líquido de cultivo;

-

la secuencia aminoacídica del producto final corresponde a la secuencia de una AFP humana madura de SEQ ID NO: 2;

-

de forma similar al análogo embrionario sérico, la AFPr producida por la cepa productora Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX está glucosilada;

15 -el rendimiento del producto deseado aumenta significativamente debido al aumento de expresión del gen que codifica la enzima disulfuro isomerasa PD11, que proporciona la formación de enlaces disulfuro, y el gen KAR2, que codifica la proteína de unión a cadena pesada chaperona BiP, que proporciona un correcto ensamblado de la proteína y secreción del producto deseado al medio de cultivo.

Resulta completamente obvio que la secuencia que codifica el ADN puede comprender sustituciones relacionadas

20 con la degeneración del código genético, y también algunas sustituciones, inserciones y deleciones que en conjunto no den como resultado la obtención de formas inactivas de la fetoproteína. Las posibles variaciones son conocidas por los especialistas en la materia. El polipéptido obtenido puede incluir también en el marco de la secuencia aminoacídica sustituciones aminoacídicas conservativas que supongan la sustitución se un aminoácido por otro que tenga propiedades similares. Sin embargo, dentro de los límites de los rasgos reivindicados de la presente

25 invención, están solo aquellos polipéptidos que tengan una estructura primaria, secundaria y terciaria que no altere la actividad requerida del polipéptido obtenido, en particular, que tengan propiedades idénticas o similares a las propiedades de la AFP humana madura, determinadas en un análisis inmunológico y de acuerdo con su capacidad de suprimir el crecimiento de células Raji de linfoma de linfocitos B en un cultivo in vitro.

Se determinan los índices de actividad funcional, en la que se considera que el polipéptido obtenido tendrá las

30 propiedades de una AFP sérica humana madura, según la reacción inmunológica y según su capacidad de inhibir in vitro el crecimiento de células Raji de linfoma de linfocitos B a un nivel no inferior al 10% de la actividad de una AFP sérica humana madura.

En el caso del uso práctico del polipéptido obtenido en la constitución de una composición, se usan componentes adicionales tradicionales tales como excipientes, diluyentes, conservantes, soluciones tampón, solución fisiológica,

35 una solución de cloruro de sodio al 0,9%, aditivos tecnológicos usados durante la producción de formas farmacológicas, etc. Las composiciones pueden ser fluidas (soluciones, suspensiones, cremas, emulsiones, etc.), sólidas (polvo liofilizado, reconstituido antes del uso, una preparación adsorbida sobre un portador, etc.), que sirven para administración parenteral, oral, intravenosa, intramuscular, etc. o para uso externo, pudiendo comprender las composiciones para uso externo aditivos que promuevan la adsorción y difusión de la sustancia activa en tejido.

40 Las composiciones sinérgicas de la presente invención proporcionan la presencia en la composición de otra sustancia activa, en las que el caso de que estén presentes dos sustancias activas al mismo tiempo, uno de las cuales es la AFP según la presente invención, el efecto de su acción es fiablemente mayor que en el caso en que se use cada sustancia separadamente.

Resulta bastante obvio que las composiciones sinérgicas son una de las variantes preferidas de realización de la

45 invención, puesto que para un especialista en la materia la variante de administración de cada componente activo separadamente es obvia. Por ejemplo, en el caso de terapia anticancerosa, puede administrarse separada o simultáneamente cada preparación de un componente activo, con separación en el tiempo o con diferentes modos de administración. La selección concreta depende del estado del paciente, la gravedad de la enfermedad, el tratamiento previo, etc.

50 La selección de las dosificaciones terapéuticas para tratamiento puede ser cualquier dosis en un amplio intervalo de 0,001-10 mg/kg del peso del paciente, con la condición de que se obtenga el efecto terapéutico requerido. Corresponde a las dosificaciones tradicionales de AFP humana, puesto que la AFP obtenida tendrá propiedades similares o cercanas con respecto a la actividad. Las dosificaciones limitantes de AFP según la invención corresponden a dosificaciones de AFP humana, puesto que tienen una secuencia aminoacídica similar que no se reconoce por un sistema inmunitario normal humano como “extraña”.

La presente invención se ilustra con los siguientes ejemplos, que no son de carácter restrictivo, sino que se pretende que demuestren realizaciones de la invención y prácticas de la mejor variante de la realización.

5 Ejemplo 1

Aislamiento de ARNm total y construcción del plásmido recombinante intermedio de ADN pTrcafp

Se aisló el ARNm total de la línea celular de hepatoma humano HepG2 con la ayuda de reactivo Trizol (Gibco BRL, EE.UU.) de acuerdo con el procedimiento del productor. Se obtuvo el ADNc usando el kit de síntesis de ADNc First Strand (MBI Fermentas) en presencia de cebadores oligo(dT)18 o GAAGTAATTTAAACTCCCAAAGC (3R),

10 complementario del extremo 3’ del gen afp. Se llevó a cabo la amplificación de la matriz obtenida para posterior clonación en presencia de los cebadores:

el primero de los cuales corresponde a la secuencia 5’ del gen de proteína madura (marcado en negrita) y comprende un sitio de reconocimiento de la restrictasa Cla I, mientras que el segundo es complementario de la 15 sección del extremo 3’ del gen (marcado en negrita) y comprende un sitio de reconocimiento de Hind III. Se llevó a cabo la amplificación del gen en un volumen de 100 μl. La mezcla de reacción comprendía 10 ng de ADNc, 30 pM

de cada cebador (1) y (2), una mezcla de dNTP (0,2 mM cada uno), Tris-HCl 10 mM, pH 8,8, KCl 10 mM, MgSO4 2,5 mM, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu (compañía Stratagene) y 1 unidad de ADN polimerasa Taq (compañía Fermentas). Se llevaron a cabo 25 ciclos según el esquema: 95ºC/40 s, 39ºC/40 s, 72ºC/1 min. Se analizaron los

20 productos de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%; se cortaron tiras de una longitud de aproximadamente 1790 pb, se extrajo el ADN del gel, se trató con las restrictasas ClaI e Hindi, se clonó en el plásmido pTrcTEGF, obtenido anteriormente basándose en el vector pTrc99A (Amann E., et al., 1988, Gene, 69, 301-315), y se trató con esas mismas restrictasas. Como resultado, se obtuvo el plásmido pTrcafp; se confirmó su estructura por análisis de restrictasa usando las restrictasas Cla I e Hind III, respecto a las cuales se llevó a cabo la

25 clonación, y también Spe I, Mun I, Sec I y Sty I, cuyos sitios de reconocimiento están dentro del gen de AFP, y mediante la determinación de la secuencia nucleotídica de la sección de ADN clonada con la ayuda de PCR. Se llevó a cabo al secuenciación según el procedimiento y con el uso del kit secuenciador de ADN Cycle Reader™ (Fermentas, Lituania).

Ejemplo 2

30 Preparación de ADNc sintético que codifica un gen de AFP humana

Para obtener un gen de AFP sintetizado, se sintetizaron químicamente 36 oligonucleótidos que tenían una longitud de 62-68 b. Basándose en estos oligonucleótidos, se obtuvieron 6 fragmentos bicatenarios mediante el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa, cada uno de los cuales se clonó en un vector pUC18. Se confirmó la estructura primaria de todos los fragmentos clonados mediante secuenciación. Se recogieron entonces

35 secuencialmente los fragmentos con la estructura nucleotídica correcta en un gen deseado mediante el procedimiento de restricción/ligamiento en forma de un fragmento del plásmido pUC18. Se obtuvo de manera similar un ADNc para la expresión de formas modificadas de AFP, que comprende la deleción, mutación o adición de residuos aminoacídicos.

Ejemplo 3

40 Construcción de un plásmido recombinante de ADN pKX

Se usó el plásmido pTrcafp como matriz de PCR en presencia de los cebadores:

Los sitios de restricción de NcoI y XhoI (subrayado) están fijados en la secuencia de los cebadores. El fragmento de ADN obtenido como resultado de la amplificación después del tratamiento con las endonucleasas de restricción 45 NcoI/XhoI se clonó en el vector pUC18/GAL1-pp, que comprende un promotor de GAL1 y la región prepro de secreción de MFa1. Como resultado, se obtuvo el plásmido pUC1B/GAL1-pp/afp. Para excluir posibles errores de PCR, se secuenció el fragmento NcoI/XhoI del plásmido. Se transfirió el fragmento HindIII/XhoI del plásmido pUC18/GAL1-pp/afp, que comprende el promotor de GAL1, la región prepro de secreción de MFa1 y que codifica parte del gen de AFP humano (Fig. 2), al vector pPDX birreplicón de HindIII/XhoI (levadura E. coli). Como resultado, 50 se obtuvo el plásmido pPDX/GAL1-pp/afp. Se transfirió el fragmento ClaI/XhoI del plásmido pPDX/GAL1-pp/afp al

vector ClaI/XhoI de pPK, que difiere de pPDX por la presencia del gen KAR2. El plásmido obtenido como resultado se denomina pKX (Fig. 1). De manera similar, se obtuvo el plásmido pKX-1, que comprende el gen de AFP humano sintético consistente en los codones de levadura más ampliamente usados (Fig. 3). El plásmido pKX-1 difiere de pKX en que comprende el gen sintético de una AFP humana madura.

5 Ejemplo 4

Obtención de una cepa productora de AFP humana

Para obtener la cepa Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX, se transformó la cepa receptora YBS723 por el plásmido pKX de acuerdo con el procedimiento (Ito H., et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163-168). Se seleccionaron los transformantes por la capacidad de crecer en medio de levadura completo (bactopeptona - 20 g/l, extracto de

10 levadura – 10 g/l, bactoagar - 20 g/l), que comprende un 2% de glucosa como fuente de carbono. Uno de dichos clones se designa YBS723/pKX.

Ejemplo 5

Determinación de la productividad de la cepa productora de AFP humana Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX

Se cultivaron células de la cepa productora YBS723/pKX en viales a 26ºC en un agitador (250 rpm) en medio de la

15 siguiente composición: glucosa - 2%, glicerina – 1,5%, extracto de levadura - 1%, peptona - 2%, agua destilada. Se mantuvo el pH del medio a 7,0 mediante la adición de tampón fosfato 0,1 M. La valoración inicial de las células fue de 5x106. Se tomaron muestras después de 72 horas de crecimiento del cultivo después de la transición al estado estacionario de crecimiento a una valoración de 7-8x108. Se obtuvo una muestra del líquido cultivado después de centrifugación del cultivo a 10.000 rpm durante 1 min y se usó en los siguientes análisis. Se analizaron muestras del

20 LC mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12,5% con dodecilsulfato de sodio. Se colorearon los geles con Coomassie R-250 (Fig. 4) y se examinaron para determinar la proteína total y el contenido relativo de la proteína específica AFP. Según los datos de electroforesis y examen, el contenido total de AFP en el LC es de aproximadamente un 10-25% de la proteína total, pero hay una degradación intracelular parcial de la proteína. El contenido relativo de AFP en la LC se determinó mediante el procedimiento de inmunotransferencia en presencia de

25 anticuerpos policlonales de AFP (Fig. 4). Se determinó también el contenido cuantitativo de AFP en el líquido de cultivo mediante el procedimiento de análisis inmunoenzimático (IEA), con el uso de un conjunto de anticuerpos monoclonales y policlonales de AFP humana. Según los datos de IEA, el contenido medio de AFP en el LC en medio líquido alcanzo los 5 mg/l.

Ejemplo 6

30 Determinación de la productividad de la cepa productora de AFP humana Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX en medios de alta densidad

Se llevó a cabo el cultivo alimentado por lotes de la cepa YBS723/pKX en un fermentador a 26ºC y pH 7,0 (mantenimiento automático). Se mantuvo el contenido de oxígeno disuelto Od >20%. Durante la fermentación, se llevó a cabo el relleno con medio de la siguiente composición: extracto de levadura - 30 g/l, peptona - 60 g/l, glucosa

35 - 100 g/l. La velocidad de alimentación del relleno era tal que proporcionara una velocidad de crecimiento del cultivo μ= 0,03. Después de conseguir una DO50 igual a 280 unidades ópticas, se analizó el contenido de AFP en el LC. Se determinó el contenido relativo y total de AFP en el LC de cultivos de alta densidad de YBS723/pKX como se describe anteriormente en el ejemplo 4. En el caso de cultivar en medios de alta densidad, el contenido de AFPr en el LC según los datos de IEA alcanzó los 70 mg/l.

40 Ejemplo 7

Aislamiento y caracterización de AFP humana recombinante de LC de una cepa productora YBS723/pKX

El aislamiento de AFPr del LC de la cepa productora YBS723/pKX se llevó a cabo como se describe anteriormente (Dudich et al., 1999, Biochemistry, 38: 10406-10414) con ligeros cambios. Se concentró el líquido de cultivo de 3 l a 200 ml mediante ultrafiltración en una celda concentradora "Millipore" y se dializó frente a un tampón de Tris-HCl

45 0,005 M, pH 7,5, NaCl 0,1 M, 4ºC, y se centrifugó entonces durante 0,5 horas a 10.000 rpm.

Cromatografía de intercambio iónico. Se aplicó el sobrenadante obtenido después de la centrifugación a una columna de intercambio iónico DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, 27 x 4 cm), equilibrada con Tris-HCl 0,01M, pH 7,5, NaCl 0,1 M. Se retiraron los componentes no unidos al adsorbente de la columna por lavado con un tampón de partida, mientras que la elución del producto deseado se llevó a cabo con NaCl 0,2 M en tampón de Tris-HCl, pH

50 7,5, a una velocidad de 1 ml/min.

Cromatografía de afinidad. Se combinaron las fracciones que comprenden AFPr, se llevó la concentración de NaCl a 0,5 M y se aplicó a una columna de afinidad con Sepharose CL-4B conjugada con anticuerpos policlonales anti-AFP de conejo, que se equilibró con Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 y NaCl 0,5 M. Después de la salida de las proteínas no unidas a los anticuerpos de las proteínas, se eluyó la AFPr adsorbida con HCl 0,005 M. Se determinó el pico de la salida de material tras alcanzar un pH de 5,0 a 3,5 mediante la absorción a 280 nm. Se neutralizó la solución de AFPr a pH 7,5 mediante la adición de una solución de Tris-HCl 2 M, pH 7,5.

Cromatografía en gel. Se llevó a cabo la purificación adicional de AFPr mediante cromatografía en gel en una columna con Sephacryl S-200 (1,8 x 70 cm) en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0, NaCl 0,15 M, a una velocidad de 0,5 5 ml/min. Se concentró la solución de AFPr purificada en una celda "Amicon" (membrana YM-30) a presión de nitrógeno.

Análisis de muestras. Se controlaron la identificación y pureza de la preparación de AFPr obtenida mediante procedimientos de electroforesis en gel según Lammly en PAGE-SDS al 12,5% con �-mercaptoetanol con posterior coloración con Coomassie (Fig. 4A), análisis de transferencia Western en una membrana de PVDF con una

10 valoración de anticuerpos primarios 1:500 y de anticuerpos secundarios 1:5000, transferencia puntual en una membrana de ECL-nitrocelulosa Hybond (Fig. 4B), e IEA.

Determinación de la concentración de proteína en las soluciones: Se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento de Bredford, usando una solución estándar de AFP embrionaria como control, y también espectrofotométricamente a 278 nm, teniendo en cuenta un coeficiente de extinción E1%, 278 nm= 0,53.

15 Ejemplo 8

Determinación de la actividad biológica de AFP humana recombinante in vitro

Se determinaron la actividad funcional de AFPr y las formas modificadas de la misma de acuerdo con su capacidad de suprimir el crecimiento de células Raji de linfoma de linfocitos B en el cultivo in vitro, como se ha descrito anteriormente (Semenkova L.N., 1997, Tumor Biol. 18, 261-274; Dudich E.I., et al., 1998, Tumor Biol. 19, 30-40). Se 20 lavaron preliminarmente con un medio reciente, se dispusieron las células Raji en cada celda de una placa de 96 alvéolos a 5x103 en 0,1 ml de medo RPMI-1640 en presencia de 10% de suero fetal de ternero y se añadieron entonces diferentes dosis de AFP durante 12 horas. Se midió la proliferación de las células mediante un procedimiento estándar mediante la introducción de [3H]-timidina durante las últimas 4 horas de cultivo. Para comparación, se estudió la reactividad dependiente de la dosis para dos muestras de AFP de origen embrionario, 25 AFPembr y AFPr de levadura (Fig. 5). Resulta evidente que ambas preparaciones manifiestan una actividad citostática expresada con respecto a estas células. De forma similar, para determinar la actividad de preparaciones basadas en AFP in vitro, puede usarse cualquier otra línea de células cancerosas que sean sensibles a la acción supresora de AFP, tales como HepG2 de hepatocarcinoma, MCF-7 de cáncer de mama, LnCap de cáncer de próstata, U-937 de mieloblastoma y otras (Semenkova L.N., 1997, Tumor Biol. 18,261-274; Dudich E.I., et al., 1998,

30 Tumor Biol. 19, 30-40).

Ejemplo 9

Uso de AFP recombinante como preparación anticancerosa

Las preparaciones anticancerosas basadas en AFPr y formas modificadas de la misma pueden usarse para la inhibición del crecimiento de neoplasias malignas, tales como cáncer primario o mestastásico del hígado, cáncer de 35 sangre (leucemia, mieloblastoma, linfoma), cáncer de mama y cáncer de próstata. Para determinar la sensibilidad de este tipo de células cancerosas a la AFP, es posible usar diferentes procedimientos tanto in vitro como in vivo. El procedimiento de determinación de la actividad in vitro se describe en el ejemplo precedente 8. Para determinar la acción oncosupresora de las preparaciones basadas en AFP in vivo, pueden usarse modelos animales, por ejemplo, con el uso de ratones atímicos con líneas celulares humanas de células cancerosas implantadas subcutánea o

40 intraperitonealmente tales como Raji, HepG2, LnCap, MCF-7 y otras. Por ejemplo, se administraron por vía subcutánea células Raji de linfoma de linfocitos B en una cantidad de 1-5 x 106 por ratón. La administración de AFP y derivadas de la misma se inició 7 días antes del implante de células tumorales por vía intraperitoneal o intravenosa a una cantidad de 1-10 mg/kg. Se usó solución tamponada fisiológica (PBS) como control. Se evaluó el tamaño del tumor mediante medidas diarias con la ayuda de un micrométro.

45 Tabla 1

Resultados de ensayos de AFPr sobre modelos de ratones de línea atímica implantados con células Raji de linfoma de linfocitos B

Número de animales

Dosis de AFP por inyección Procedimiento de administración Resultado

10

1 mg Intraperitoneal, diariamente durante 20 días 2- Estabilización 5- Inhibición del 50% 3- No se desarrolló tumor

(continuación)

5

PBS Intraperitoneal, diariamente durante días 20 10- 100% de desarrollo del tumor

10

0,5 mg Intraperitoneal, diariamente durante días 20 2- Estabilización 5- Inhibición del 50% 3- No se desarrolló tumor

10

2 mg Intraperitoneal, diariamente durante días 20 2- Estabilización 5- Inhibición del 50% 3- No se desarrolló tumor

El procedimiento de administración de preparaciones basadas en AFPr de levadura o derivados de la misma puede comprender también la administración de preparaciones quimioterapéuticas simultánea o secuencialmente. Pueden presentarse como ejemplos de dichas preparaciones quimioterapéuticas las siguientes: doxorubicina, vincristina, fluorouracilo, metotrexato, actinomicina D, mitomicina C, tamoxifeno, flutamida, vincristina, vinblastina, ciclosporina,

5 retinoides, carotenoides y otros. Habitualmente, puede administrarse una preparación quimioterapéutica en dosis estándares o en dosis subóptimas, por debajo de la terapéutica habitual. El efecto de la acción combinada de AFPr y doxorubicina (A) y AFPr y ácido todo-trans-retinoico (tRA) se presenta como ejemplo en la Fig. 6. En el caso de la administración simultánea de las preparaciones, se observa una acción oncosupresora sinérgica en el caso de uso de dosis subóptimas.

10 Ejemplo 10

Uso de AFP recombinante para la estimulación del crecimiento de citoblastos

Se obtuvo el cultivo primario de fibroblastos embrionarios de pulmón y retina humanoa tratando con una solución de tripsina al 0,2% los tejidos correspondientes de embriones de 5-10 semanas obtenidos después de abortos legales. Se cultivaron las células en medio RPMI-1640 en presencia de suero fetal bovino (CFS) al 10%. Se midió la

15 actividad citostática de la AFP como se describe anteriormente (Semenkova L.N., 1997, Tumor Biol. 18, 261-274; Dudich E.I., et al., 1998, Tumor Biol. 19, 30 -40). Se lavaron intensivamente células a una cantidad de 4x104 en 0,15 ml de medio con un medio reciente, se dispusieron en cada celda de una placa de 96 pocillos, se añadieron entonces diferentes dosis de AFP y se cultivaron durante 24 horas. Se midió la proliferación de células por un procedimiento estándar mediante la inclusión de [3H]-timidina durante las últimas 4 horas de cultivo.

20 Se estudió también la dependencia de la dosificación del efecto de la AFP sobre el crecimiento celular para el cultivo primario de fibroblastos embrionarios humanos. La AFP tenía efecto un estimulante sobre estas células, alcanzando un 50-90% con respecto al control (Fig. 7).

Ejemplo 11

Uso de AFP recombinante en cosmetología

25 En vista del hecho de que la AFP tiene la capacidad de estimular el crecimiento de citoblastos y de que es un factor de crecimiento para células embrionarias, se propone su posible uso para la preparación de máscaras cosméticas, cremas y lociones. La AFPr puede usarse como excipiente para liposomas, microsomas y nanosomas. En vista del hecho de que la AFP es capaz de unirse a ligandos hidrófobos, en particular vitaminas liposolubles, esteroides, isoflavinoides y ácidos grasos poliinsaturados (Deutsch H.F., 1991, Adv. Canc. Res. 56, 253-312); Aussel C. y

30 Masseyeff R., 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 119: 1122-1127; Deutsch H.F., 1994, J. Tumor Marker Oncol.

9: 11-14), se muestra el uso combinado de AFPr con vitaminas liposolubles, tales como derivados de retinoides, carotenoides, tocoferol, vitamina D y esteroides tales como derivados de estrógenos y andrógenos. Pueden usarse también estradiol y otros como ejemplos de dichos esteroides.

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Listado de secuencias

<110> BENEVOLENSKY, Sergei Bladimirovich; MARCHENKO, Alexei Nikolaevich; KOZLOV, Dmitry Georgievich;

25 ZATSEPIN, Sergei Sergeevich; SHINGAROVA, Lyudmila Nikolaevna; DUDICH, Igor Vyacheslavovich; SEMENKOVA, Lidiya Nikolaevna; DUDICH, Dmitry Igorevich; TATULOV, Eduard Borisovich; DUDICH, Elena Ivanovna

<120> ALFA-FETOPROTEÍNA RECOMBINANTE, PROCEDIMIENTO Y MEDIO PARA LA PREPARACIÓN DE LA MISMA, COMPOSICIONES BASADAS EN LA MISMA Y USO DE LA MISMA

30 <160> 2

<210> 1

<211> 2556

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 35 <400> 1

<210>

2

<211>

590

5

<212> PRT

<213>

Homo sapiens

<400>

2

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un plásmido pKX recombinante que comprende: un módulo de expresión de SEQ ID NO:1 que codifica una alfa-fetoproteína humana madura (SEQ ID NO: 2), un fragmento del plásmido bacteriano pUC18, una región de inicio de la replicación de un plásmido de levadura de 2 μm, un gen KAR2 que proporciona el correcto ensamblado

   5 de la proteína y la secreción del producto deseado a un medio de cultivo, un gen PDI1 que proporciona la correcta formación de enlaces disulfuro, un marcador de levadura URA3 selectivo y PGK1 selectivo.

2. 2.

   Una célula productora eucarótica que tiene la capacidad de secretar alfa-fetoproteína recombinante humana transformándola con el plásmido pKX según la reivindicación 1.

3. 3.

   Un procedimiento para la preparación de una alfa-fetoproteína recombinante (SEQ ID NO: 2) que

   10 comprende: cultivar una célula eucariótica según la reivindicación 2, teniendo la célula la capacidad de secretar una alfa-fetoproteína recombinante al medio de cultivo, y la etapa de aislar la alfa-fetoproteína recombinante a partir del medio de cultivo.
4. 4. El procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la célula eucariótica es una célula de levadura.

   15 5. El procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque el cultivo se lleva a cabo a una temperatura de 23-33ºC en un medio que comprende: glucosa - 2%, glicerina – 1,5%, extracto de levadura - 1%, peptona - 2%, agua destilada, con el mantenimiento del pH del medio a 4,5-7,0 mediante tamponación adicional y añadiendo oxígeno soluble hasta pO > 20%.