JP4879274B2 - 毛髪成長及び皮膚シワの改善を促進するペプチド、並びにこれを含む化粧品組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒトチモシンβ−４(Tβ4)由来ペプチド及びその用途に関する。
毛髪は、毛嚢の成長過程において、多様な成長因子により複雑に調節される小器官である。毛嚢の分化過程及びこれに係る毛周期は、毛髪が成長する段階である成長期(anagen)、毛髪の消滅につながる退化期(catagen)、成長停止期である休止期(telogen)、及び新規毛髪が発生して成長する発生期に分けられる(Paus, R., et. Al and Cotsarelis, G. (1999) The biology of hair follicles. N. Engl. J. Med. 341, 491-497)。
生長期／成長期（Anagen stage）は、毛髪が成長する段階であって、これはさらに２段階に分けられる。即ち、毛髪が毛球から毛嚢に出ようと毛髪を生成する段階と、硬いケラチンが毛嚢の中で作られる段階であって、退化期まで自己成長を続ける。成長期の毛髪の寿命は、３〜６年であり、全体毛髪(10〜15万個)の８０〜９０％を占めて、成長段階において髪の毛は、一ヶ月に１〜１．５ｃｍ程度成長する。
退化期(catagen stage)は、成長期が終わって、毛髪の形態を維持しながら代謝過程が遅くなる時期であって、この時期に毛髪は、徐々に成長する。また、この段階では、ケラチンは作らない。退化期の寿命は、１〜１．５ヶ月であって、全体毛髪の１％を占める。毛球部が収縮して毛乳頭に分かれ、毛嚢に取り囲まれて上方に上がっていく。この時、細胞分裂は、停止している。
休止期(telogen stage)は、毛乳頭が萎縮されて、毛嚢は次第に収縮され、毛根は上方に押し上げられ抜けてしまう(毛根部は、上方に上がっており、毛嚢の深さは、1/3となっている)。この時期は、髪の毛がなくなる時期であって、次の成長期段階が始まるまでの寿命は、３〜４ヶ月、全体毛髪の４〜１４％に該当(分娩後30〜40%)し、この時期の毛髪は、強いコーミングや刺激だけでも抜けやすくなっている。
最後に、発生期は、成長期初には毛嚢に取り囲まれていた毛球部が、毛乳頭と結合して新しい毛髪を成長させる。次に、新しい毛髪は、休止期に入った毛髪を上方に押し上げて、自然脱毛させる。
しかしながら、このような毛周期は、常に同じパターンで繰り返されるものではなく、病、遺伝、体質、年齢など、あらゆる状況によって変わるものである。例えば、休止期に入ったまま発生期を迎えるとか、成長期を迎えたが、硬毛までは至らないとか、柔軟な硬毛の状態で退化期に入るなど、様々な状況があり得る。
さらに、社会が複雑多様化されるにつれて、環境汚染、ストレス、各種化学物質などのように、人間の脱毛を誘発する要因もだんだん増えていく趨勢であって、これにより、脱毛で苦しむ人も増加する趨勢である。
ところが、現在、確実に脱毛が防止できるとか、脱毛された毛髪の成長を促進できるような物質の開発が十分になされていない状況である。したがって、毛髪の成長を促進できる物質などの開発が切実に求められている。
一方、チモシンβ−４(Tβ4)は、１９８１年、牛の胸腺から発見された。Ｔβ４は、４４個のアミノ酸からなっており、分子量は、４．９８２ｋＤａ、理論的な等電点は、５．１であって、弱酸性を帯びるタンパク質である。Ｔβ４には、グルタミン酸とリシン残基など、極性を帯びたアミノ酸が多く存在して、陰性電荷を帯びるアスパラギン酸とグルタミン酸がトータル１１個、リシンとアルギニン酸残基がトータル９個存在する。図１は、Ｔβ４の仮想的な２次構造を示したもので、２個の螺旋構造が内在されている。
このようなＴβ４は、細胞の移動と分化の調節子として重要な機能を行い、傷の回復と新生血管生成に関与すると知られている(Frohm, M., Gunne, H., Bergman, A. C., Agerberth, B., Bergman, T., Boman, A., Liden, S., Jornvall, H., and Boman, H. G. (1996) Biochemical and antibacterial analysis of human wound and blister fluid. Eur. J. Biochem. 237, 86-92)。
しかしながら、このようなＴβ４の場合、天然タンパク質の形態をそのまま利用する場合、生物学的に非常に不安定で、物理化学的にも不均質であるため、治療効果が減少する場合があり、また、皮膚内透過率も比較的低いという問題点があった。
したがって、Ｔβ４の安定性、透過率などを高められる方法が切実に求められている状況である。
本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
上述の従来技術の問題点を解決するために、本発明者らは、天然ヒトチモシンβ−４(Tβ4)と同一な機能または作用ができる多様な種類のヒトＴβ４由来ペプチドを製造及びスクリーニングして、その中、生理活性に優れるだけではなく、安定性にも優れているペプチドを選別することにより、本発明を完成した。
したがって、本発明の目的は、ヒトチモシンβ−４の活性を示すペプチドを提供することにある。
本発明の他の目的は、チモシンβ−４有効性(Tβ4-effective)の疾患または状態の予防または治療用組成物を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、チモシンβ−４有効性の疾患または状態を予防または治療する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、チモシンβ−４−有効性(Tβ4-effective)の疾患または状態を予防または治療用組成物を製造するための、ヒトチモシンβ−４(Tβ4)の活性を示すペプチドの用途を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
本発明の一様態によると、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ヒトチモシンβ−４(Tβ4)の活性を示すペプチドを提供する。
本発明の他の様態によると、本発明は、ヒトチモシンβ−４の活性を示す本発明のペプチドを有効成分として含む、チモシンβ−４−有効性(thymosin β-4-effective)の疾患または状態の予防または治療用組成物を提供する。
本発明のまた他の様態によると、本発明は、ヒトチモシンβ−４の活性を示す本発明のペプチドを有効成分として含む組成物を対象に投与する段階を含む、チモシンβ−４−有効性(Tβ4-effective)の疾患または状態を予防または治療する方法を提供する。
本発明の他の様態によると、本発明は、チモシンβ−４−有効性(Tβ4-effective)の疾患または状態を予防または治療用組成物を製造するための、ヒトチモシンβ−４(Tβ4)の活性を示す本発明のペプチドの用途を提供する。
本発明者らは、天然ヒトチモシンβ−４(Tβ4)と同一な機能または作用ができる多様な種類のＴβ４由来ペプチドを製造及びスクリーニングして、その中、生理活性に優れるだけではなく、安定性にも優れているペプチドを選択した。さらに、選択したヒトＴβ４由来ペプチドのアミノ酸配列を変形し、熱、酸及びアルカリなどの物理化学的因子に対する安定性がより増加された変形ペプチドを開発した。
配列番号１のアミノ酸配列を含む本発明のペプチドは、天然Ｔβ４のアクチン付着部位である。
本発明のペプチドは、ヒトＴβ４由来の配列番号１のアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明におけるペプチドは、必須的に配列番号１のアミノ酸配列から構成されている。最も好ましくは、本発明におけるペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から構成されている。
本明細書において用語‘ペプチド’は、ペプチド結合により、アミノ酸残基がお互い結合されて形成された線形の分子を意味する。
本発明のペプチドは、当業界に公知された化学的合成方法、特に固相合成技術(solid-phase synthesis techniques)により製造できる(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984))。
本発明のペプチドは、Ｔβ４関連活性を保有して、生体に適用時、天然Ｔβ４が発揮する作用または機能を発揮する。本明細書において、用語“Ｔβ４−関連活性”は、従来天然Ｔβ４に対して究明された全ての活性、例えば、細胞増殖と分化促進、新生血管生成及び傷の治療などの活性を意味する。本発明のペプチドは、天然Ｔβ４の作用を真似るように制作されたものであるため、天然Ｔβ４の多様な生体内活性を全て発揮できる。
本発明で利用されるペプチドは、天然Ｔβ４と同一な機能または作用をするだけではなく、生理活性度も類似しているため、Ｔβ４−有効性の疾患または状態の予防または治療に有利に利用できる。下記の試験例１で立証されたように、本発明のペプチドは、天然Ｔβ４とほぼ等しい生理活性度を示す(参照：図５)。
本明細書で使用される用語“Ｔβ４−有効性の疾患または状態”は、天然のＴβ４により治療または予防できる疾患または状態を意味する。好ましくは、本発明のペプチドにより治療または予防効能が発揮される活性は、抗炎症活性、細胞の増殖と分裂促進、角質細胞の生理活性促進、傷の治癒、コラーゲン、エラスチン、ラミニンまたはヒアルロン酸の合成促進、歯周疾患の治療または皮膚状態の改善で表現できる。
より好ましい具現例によると、本発明の組成物は、皮膚状態の改善の効能または活性を有する。特に、本発明の組成物で有効成分として利用されるペプチドは、天然Ｔβ４より分子量が遥かに少ないため、皮膚浸透率に非常に優れている。したがって、本発明の組成物を局所的に皮膚に塗布する場合、皮膚状態の改善を大きく達成することができる。より好ましくは、本発明の組成物による皮膚状態の改善は、シワの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、脱毛の防止または毛髪成長の促進、アトピー疾患の治療、皮膚保湿の改善、シミの除去、またはニキビの治療であり、最も好ましくは、シワの改善または毛髪成長の促進である。
例えば、本発明で有効成分として利用されるペプチドは、繊維芽細胞または角質細胞の増殖を促進し、これらの細胞からプロコラーゲン、ラミニン、ヒアルロン酸及びフィブロネクチンの合成増加を誘導し、皮膚の角質細胞層、上皮層及び真皮層を再生または成長させることにより、シワの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、皮膚保湿の改善、及びアトピー疾患の治療効能を奏する。
また、本発明で有効成分として利用されるペプチドは、毛髪成長を促進するに非常に有用である。下記の試験例５で立証されたように、本発明のペプチドは、動物モデルにおいて、対照群（非処理群）に比べ、約２５〜３０％の毛髪成長促進効果を示す。
本発明のペプチドは、それ自体が天然Ｔβ４より非常に優れた安定性を示すが、ペプチドのアミノ酸残基を変形させることで、より一層安定性を向上させることができる。本発明の好ましい具現例によると、 配列番号１のアミノ酸配列において、少なくとも一つのアミノ酸は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基またはポリエチレングリコール、最も好ましくは、アセチル基の保護基が結合されている。
本明細書において用語‘安定性’は、インビボ安定性だけではなく、貯蔵安定性(例えば、常温貯蔵安定性)も意味する。上述の保護基は、生体内の蛋白質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。
より好ましくは、前記保護基が結合されるアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｎ−末端またはＣ−末端、最も好ましくは、Ｎ−末端にあるＬｙｓ残基である。また、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列でＣ−末端にあるＧｌｎ残基の−ＣＯＯＨは、−ＯＨまたは−ＮＨ2に変形させて、ペプチドの安定性を増加させることができる。
本発明によるペプチド、好ましくは、保護基が結合された変形ペプチドは、Ｎ−末端及び/またはＣ−末端が保護されているため、３７℃温度で優れた熱安定性(または長期間温度安定性)を示し、また、酸とアルカリなどの物理化学的因子に対する安定性に優れている。したがって、本発明のペプチドは、長期保存性に優れているため、医薬品、医薬外品、化粧品及び口腔用品のような、長期間貯蔵が要求される製品に有利に適用できる。
本発明の組成物は、薬剤学的組成物と化粧品組成物として製造できる。
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物は、(a)配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドの薬剤学的有効量、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物である。
本明細書において用語‘薬剤学的有効量’は、上述のペプチドの効能または活性を達成するに十分な量を意味する。
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適合する薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)に詳細に記載されている。
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口、好ましくは、非経口で投与でき、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などにより投与できる。
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により様々である。一方、本発明の薬剤学的組成物の好ましい投与量は、１日当たり、０．０００１〜１００μｇである。
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び/または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造できる。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物は、(a)配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドの化粧品学的有効量、及び(b)化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物である。
本明細書において用語‘化粧品学的有効量’は、上述の本発明の組成物の皮膚改善効能を達成するに十分な量を意味する。
本発明の化粧品組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形にも製造でき、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。より詳しくは、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤形に製造することができる。
本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合は、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、または酸化亜鉛などが利用できる。
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーである場合は、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、またはポリアミドパウダーが利用でき、特にスプレーの場合は、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン/ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体をさらに含むことができる。
本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合は、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が利用されて、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、またはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
本発明の剤形が懸濁液である場合は、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラガカントなどが利用できる。
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合は、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イソチオネート、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用できる。
本発明の化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分としてのペプチドと担体成分の他に、化粧料組成物に通常的に利用される成分を含むが、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常的な補助剤を含むことができる。
本発明で有効成分として利用されるペプチドは、ヒトＴβ４と同一な機能または作用をすることができて、その生理活性度も天然チモシンβ−４(Tβ4)とほぼ等しい水準である。また、本発明のペプチドは、天然Ｔβ４と比較し、安定性に非常に優れ、皮膚透過度も非常に高い。したがって、本発明のペプチドを含む組成物は、Ｔβ４活性が要求される疾患または状態を治療、予防または改善するに非常に優れた効能を発揮する。また、本発明のペプチドは、医薬、医薬外品、化粧品、歯磨き、口腔清浄用組成物または口腔保護用組成物に非常に有利に適用でき、最も好ましくは、化粧品に適用される。特に、毛髪促進用途の化粧品に適用することが好ましい。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
合成例１：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL-resinの合成
クロロトリチルクロライドレジン(chloro trityl chloride resin；CTL resin, Nova Biochem Cat No. 01-64-0021)７００ｍｇを反応容器に入れて、メチレンクロライド(MC)１０ｍｌを加えて３分間攪拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド(DMF)を１０ｍｌ入れて３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液を入れて、Fmoc-Gln(trt)-OH 200mmole、ジイソプロピルエチルアミン(DIEA）400mmoleを入れた後、攪拌してよく溶かして、１時間攪拌しながら反応させた。反応後、洗浄して、メタノールとＤＩＥＡ(2:1)をＤＣＭに溶かして１０分間反応した後、過量のＤＣＭ/ＤＭＦ(1:1)で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド(DMF)を１０ｍｌ入れて３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液(20%のピペリジン/DMF)１０ｍｌを反応容器に入れて、１０分間常温で攪拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、再び１０分間反応を維持した後、溶液を除去し、ＤＭＦで２回、ＭＣで１回、再びＤＭＦで３分間１回洗浄して、Gln-(trt)-CTLレジンを製造した。新しい反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れて、Fmoc-Thr(tBu)-OH 200mmole、HoBt 200mmole、Bop 200mmoleを入れた後、攪拌してよく溶解させた。反応器に400mmoleのＤＩＥＡ(N,N’−Diisopropyl ethylamine)を分画で２回にかけて入れて、全ての固体が溶解されるまで少なくとも５分間攪拌した。溶解されたアミノ酸混合溶液を、脱保護されたレジンが入っている反応容器に入れて、１時間常温で攪拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で５分間ずつ３回攪拌して除去した。反応レジンを少量取って、カイザーテスト(Ninhydrine test)を利用して反応程度を点検した。２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で上記と同様に脱保護反応し、Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL resinを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分洗浄し、再びカイザーテストを行った後、上記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。即ち、図１のように選定されたアミノ酸配列に基づき、Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OHの順に連鎖反応を行った。製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、Ｐ2Ｏ5下で真空に減圧して完全に乾燥し、Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL-resinを製造した。
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL-resinの合成
クロロトリチルクロライドレジン(chloro trityl chloride resin；CTL resin, Nova Biochem Cat No. 01-64-0021)７００ｍｇを反応容器に入れて、メチレンクロライド(MC)１０ｍｌを加えて３分間攪拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド(DMF)を１０ｍｌ入れて３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液を入れて、Fmoc-Gln(trt)-OH 200mmole、ジイソプロピルエチルアミン(DIEA）400mmoleを入れた後、攪拌してよく溶かして、１時間攪拌しながら反応させた。反応後、洗浄して、メタノールとＤＩＥＡ(2:1)をＤＣＭに溶かして１０分間反応した後、過量のＤＣＭ/ＤＭＦ(1:1)で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド(DMF)を１０ｍｌ入れて３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液(20%のピペリジン/DMF)１０ｍｌを反応容器に入れて、１０分間常温で攪拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、再び１０分間反応を維持した後、溶液を除去し、ＤＭＦで２回、ＭＣで１回、再びＤＭＦで３分間１回洗浄して、Gln-(trt)-CTLレジンを製造した。新しい反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れて、Fmoc-Thr(tBu)-OH 200mmole、HoBt 200mmole、Bop 200mmoleを入れた後、攪拌してよく溶解させた。反応器に400mmoleのＤＩＥＡ(N,N’−Diisopropyl ethylamine)を分画で２回にかけて入れて、全ての固体が溶解されるまで少なくとも５分間攪拌した。溶解されたアミノ酸混合溶液を、脱保護されたレジンが入っている反応容器に入れて、１時間常温で攪拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で５分間ずつ３回攪拌して除去した。反応レジンを少量取って、カイザーテスト(Ninhydrine test)を利用して反応程度を点検した。２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で上記と同様に脱保護反応し、Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL resinを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分洗浄し、再びカイザーテストを行った後、上記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。即ち、図１のように選定されたアミノ酸配列に基づき、Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OHの順に連鎖反応を行った。製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、Ｐ2Ｏ5下で真空に減圧して完全に乾燥し、Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL-resinを製造した。
合成例２：
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide Resinの合成
Fmoc-Rink amide resin(Nova Biochem Cat No. 01-64-0013)１．４２ｇ(1mmole)を正確に測量して反応容器に入れ、メチレンクロライド(MC)１０ｍｌを加えて３分間攪拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド(DMF)を１０ｍｌ入れて３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。２０％のピペリジン/ＤＭＦ溶液１０ｍｌを反応容器に入れて、１０分間常温で攪拌した後、溶液を除去した。同量の２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液を入れて、再び１０分間反応を維持した後、溶液を除去し、ＤＭＦで２回、ＭＣで１回、再びＤＭＦで３分間１回洗浄した。新しい反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れて、Fmoc-Gln(trt)-OH 2mmole、HoBt 2mmole、及びBop 2mmoleを入れた後、攪拌してよく溶解させた。反応器に4mmoleのＤＩＥＡを分画で２回にかけて入れて、全ての固体が溶解されるまで少なくとも５分間攪拌した。溶解されたアミノ酸混合溶液を、脱保護されたレジンが入っている反応容器に入れて、１時間常温で攪拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で５分間ずつ３回攪拌して除去した。反応レジンを少量取って、カイザーテスト(Ninhydrine test)を利用して反応程度を点検した。２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で上記と同様に２回脱保護反応し、Gln(trt)-Rink amide resinを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分洗浄し、再びカイザーテストを行った後、上記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。即ち、図１のように選定されたアミノ酸配列に基づき、Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OHの順に連鎖反応を行った。製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、Ｐ2Ｏ5下で真空に減圧して完全に乾燥し、Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln (trt)-CTL-resinを製造した。
Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide Resinの合成
Fmoc-Rink amide resin(Nova Biochem Cat No. 01-64-0013)１．４２ｇ(1mmole)を正確に測量して反応容器に入れ、メチレンクロライド(MC)１０ｍｌを加えて３分間攪拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド(DMF)を１０ｍｌ入れて３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。２０％のピペリジン/ＤＭＦ溶液１０ｍｌを反応容器に入れて、１０分間常温で攪拌した後、溶液を除去した。同量の２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液を入れて、再び１０分間反応を維持した後、溶液を除去し、ＤＭＦで２回、ＭＣで１回、再びＤＭＦで３分間１回洗浄した。新しい反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れて、Fmoc-Gln(trt)-OH 2mmole、HoBt 2mmole、及びBop 2mmoleを入れた後、攪拌してよく溶解させた。反応器に4mmoleのＤＩＥＡを分画で２回にかけて入れて、全ての固体が溶解されるまで少なくとも５分間攪拌した。溶解されたアミノ酸混合溶液を、脱保護されたレジンが入っている反応容器に入れて、１時間常温で攪拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で５分間ずつ３回攪拌して除去した。反応レジンを少量取って、カイザーテスト(Ninhydrine test)を利用して反応程度を点検した。２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で上記と同様に２回脱保護反応し、Gln(trt)-Rink amide resinを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分洗浄し、再びカイザーテストを行った後、上記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。即ち、図１のように選定されたアミノ酸配列に基づき、Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OHの順に連鎖反応を行った。製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、Ｐ2Ｏ5下で真空に減圧して完全に乾燥し、Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln (trt)-CTL-resinを製造した。
実施例１：
Fmoc-Octapeptide (Fmoc-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)の合成
前記合成例１で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL resinを、ＴＦＡ：ＴＩＳ：水(95:2.5:2.5)で構成された溶液で１時間反応させた後、フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、十分量の冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。窒素雰囲気下で十分乾燥して、精製前のFmoc-オクタペプチド(Fmoc-KLKKTETQ)１．１ｇを合成した(収率91.9%)。分子量測定器を利用して測定時、１１９８．５(理論値1197.4)が得られた。
Fmoc-Octapeptide (Fmoc-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)の合成
前記合成例１で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL resinを、ＴＦＡ：ＴＩＳ：水(95:2.5:2.5)で構成された溶液で１時間反応させた後、フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、十分量の冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。窒素雰囲気下で十分乾燥して、精製前のFmoc-オクタペプチド(Fmoc-KLKKTETQ)１．１ｇを合成した(収率91.9%)。分子量測定器を利用して測定時、１１９８．５(理論値1197.4)が得られた。
実施例２： Ac-Octapeptide(Ac-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)の合成及び精製
前記合成例１で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL resinをＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄し、保護されたＦｍｏｃを除去した。新しい反応器に無水酢酸2ml、HoBt 610mg、及びBop 1.77gを入れて、1.56mlのＤＩＥＡを分画で２回にかけて入れた後、十分に攪拌した。レジン反応器に予め混合した無水酢酸溶液を投入し、３０分間反応を維持した。ＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールの順に３回ずつ洗浄した後、完全に乾燥した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジンを入れた。予め調製した脱漏溶液[トリフルオロ化酢酸(TFA) 95%、蒸留水2.5%、及びチオアニソール2.5%]３０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のアセチルオクタペプチド(Ac-KTKKTETQ)０．９３ｇを合成した(収率91.4%)。
前記合成例１で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL resinをＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄し、保護されたＦｍｏｃを除去した。新しい反応器に無水酢酸2ml、HoBt 610mg、及びBop 1.77gを入れて、1.56mlのＤＩＥＡを分画で２回にかけて入れた後、十分に攪拌した。レジン反応器に予め混合した無水酢酸溶液を投入し、３０分間反応を維持した。ＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールの順に３回ずつ洗浄した後、完全に乾燥した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジンを入れた。予め調製した脱漏溶液[トリフルオロ化酢酸(TFA) 95%、蒸留水2.5%、及びチオアニソール2.5%]３０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のアセチルオクタペプチド(Ac-KTKKTETQ)０．９３ｇを合成した(収率91.4%)。
精製前のペプチドを、大容量高性能液体クロマトグラフィを利用して分取し、主ペプチドのみを集め蒸留して、アセトニトリルを除去した後、凍結乾燥により、精製された合成ペプチド０．７２ｇを得た。最終結果物のペプチドは、高性能液体クロマトグラフィを利用して分析した時(図３)、９６％の純度を示し、最終収率は７０．９％で、非常に優れた結果を示した。さらに、主ピーク部位を選定して分子量測定器で測定した結果、１０１８．０(理論的計算時1017.2)が得られ、所望のペプチドのAc- KTKKTETQが効果的によく合成されたことを確認することができた(図４)。
実施例３：
Formyl-Octapeptide (Formyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)の合成
前記合成例１で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL resinをＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄し、保護されたＦｍｏｃを除去した。新しい反応器に無水酢酸2ml、HoBt 610mg、及びBop 1.77gを入れて、1.56mlのＤＩＥＡを分画で２回にかけて入れた後、十分に攪拌した。レジン反応器に予め混合した無水酢酸溶液を投入し、３０分間反応を維持した。ＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールの順に３回ずつ洗浄した後、完全に乾燥した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジンを入れた。予め調製した脱漏溶液[トリフルオロ化酢酸(TFA) 95%、蒸留水2.5%、及びチオアニソール2.5%]３０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のホルミルオクタペプチド(Formyl-KTKKTETQ)０．８８ｇを合成した(収率87.7%)。分子量測定器を利用して測定時、１００３．６(理論値1003.2)が得られた。
Formyl-Octapeptide (Formyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)の合成
前記合成例１で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL resinをＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄し、保護されたＦｍｏｃを除去した。新しい反応器に無水酢酸2ml、HoBt 610mg、及びBop 1.77gを入れて、1.56mlのＤＩＥＡを分画で２回にかけて入れた後、十分に攪拌した。レジン反応器に予め混合した無水酢酸溶液を投入し、３０分間反応を維持した。ＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールの順に３回ずつ洗浄した後、完全に乾燥した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジンを入れた。予め調製した脱漏溶液[トリフルオロ化酢酸(TFA) 95%、蒸留水2.5%、及びチオアニソール2.5%]３０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のホルミルオクタペプチド(Formyl-KTKKTETQ)０．８８ｇを合成した(収率87.7%)。分子量測定器を利用して測定時、１００３．６(理論値1003.2)が得られた。
実施例４：
Palmitoyl-Octapeptide (Palmitoyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)の合成
合成例１により製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL resinをＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄し、保護されたＦｍｏｃを除去した。パルミトイルクロライド１．５ｍｍｏｌをＤＭＦ ５ｍｌに溶解した後、膨らましたレジンが入っている反応容器に入れて、ＤＩＰＥＡ １．５６ｍｌを入れた後、３５℃で１時間反応を維持した。ＤＭＦ ３０ｍｌで３回、ＤＣＭ ３０ｍｌで４回洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥した後、五酸化リン(P2O5)を利用して減圧状態で乾燥し、側鎖がパルミトイル基で保護されたオクタペプチドを製造した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジン１ｇを入れた。予め調製した脱漏溶液[TEA 95%、蒸留水2.5%、及びチオアニソール2.5%]３０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら１時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のパルミトイルオクタペプチド(Palmitoyl- KTKKTETQ)１．４ｇを合成した(収率113.9%)。分子量測定器を利用して測定時、１２３０．２(理論値1229.6)が得られた。
Palmitoyl-Octapeptide (Palmitoyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)の合成
合成例１により製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL resinをＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄し、保護されたＦｍｏｃを除去した。パルミトイルクロライド１．５ｍｍｏｌをＤＭＦ ５ｍｌに溶解した後、膨らましたレジンが入っている反応容器に入れて、ＤＩＰＥＡ １．５６ｍｌを入れた後、３５℃で１時間反応を維持した。ＤＭＦ ３０ｍｌで３回、ＤＣＭ ３０ｍｌで４回洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥した後、五酸化リン(P2O5)を利用して減圧状態で乾燥し、側鎖がパルミトイル基で保護されたオクタペプチドを製造した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジン１ｇを入れた。予め調製した脱漏溶液[TEA 95%、蒸留水2.5%、及びチオアニソール2.5%]３０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら１時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のパルミトイルオクタペプチド(Palmitoyl- KTKKTETQ)１．４ｇを合成した(収率113.9%)。分子量測定器を利用して測定時、１２３０．２(理論値1229.6)が得られた。
実施例５〜６：
Stearyl-Octapeptide(Stearyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)及び Myristyl-Octapeptide(Myristyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)の合成
合成例１により製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL resinを二つのバッチ反応器にそれぞれ入れて、ＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄して、保護されたＦｍｏｃを除去した。容器にそれぞれミリスチルクロライド１．５ｍｍｏｌ(ミリスチルオクタペプチドの場合)とステアリルクロライド１．５ｍｍｏｌ(ステアリルオクタペプチドの場合)をＤＭＦ ５ｍｌに溶解した後、膨らました各バッチのレジンを各反応容器に入れて、ＤＩＰＥＡ １．５６ｍｌを入れた後、３５℃で１時間反応を維持した。ＤＭＦ ３０ｍｌで３回、ＤＣＭ ３０ｍｌで４回洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥した。五酸化リン(P2O5)を利用して減圧状態で乾燥し、側鎖がそれぞれミリスチル基、ステアリル基で保護されたオクタペプチドを製造した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジン１ｇを入れた。予め調製した脱漏溶液[TEA 81.5%、蒸留水5%、チオアニソール5%、フェノール5%、EDT 2.5%及びTIS 1%]１０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら１時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のミリスチルオクタペプチド(Myristyl-KTKKTETQ)１．０１ｇ(収率84.1%)と、ステアリルオクタペプチド(Stearyl-KTKKTETQ)１．１ｇ(収率87.5%)を合成した。分子量測定器を利用して測定時、ミリスチルオクタペプチドの場合は、１２０２．４(理論値1201.5)が、ステアリルオクタペプチドの場合は、１２５８．５(理論値1257.7)が得られた。
Stearyl-Octapeptide(Stearyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)及び Myristyl-Octapeptide(Myristyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)の合成
合成例１により製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL resinを二つのバッチ反応器にそれぞれ入れて、ＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄して、保護されたＦｍｏｃを除去した。容器にそれぞれミリスチルクロライド１．５ｍｍｏｌ(ミリスチルオクタペプチドの場合)とステアリルクロライド１．５ｍｍｏｌ(ステアリルオクタペプチドの場合)をＤＭＦ ５ｍｌに溶解した後、膨らました各バッチのレジンを各反応容器に入れて、ＤＩＰＥＡ １．５６ｍｌを入れた後、３５℃で１時間反応を維持した。ＤＭＦ ３０ｍｌで３回、ＤＣＭ ３０ｍｌで４回洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥した。五酸化リン(P2O5)を利用して減圧状態で乾燥し、側鎖がそれぞれミリスチル基、ステアリル基で保護されたオクタペプチドを製造した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジン１ｇを入れた。予め調製した脱漏溶液[TEA 81.5%、蒸留水5%、チオアニソール5%、フェノール5%、EDT 2.5%及びTIS 1%]１０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら１時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のミリスチルオクタペプチド(Myristyl-KTKKTETQ)１．０１ｇ(収率84.1%)と、ステアリルオクタペプチド(Stearyl-KTKKTETQ)１．１ｇ(収率87.5%)を合成した。分子量測定器を利用して測定時、ミリスチルオクタペプチドの場合は、１２０２．４(理論値1201.5)が、ステアリルオクタペプチドの場合は、１２５８．５(理論値1257.7)が得られた。
実施例７： Fmoc-Octapeptide(Fmoc-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-NH2)の合成
前記合成例２で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide resinを、ＴＦＡ：ＴＩＳ：水(95:2.5:2.5)で構成された溶液で１時間反応させた後、フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、十分量の冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。窒素雰囲気下で十分乾燥して、精製前のFmoc-オクタペプチド(Fmoc-KLKKTETQ-NH2)０．９８ｇを合成した(収率81.9%)。分子量測定器を利用して測定時、１１９６．９(理論値1196.4)が得られた。
前記合成例２で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide resinを、ＴＦＡ：ＴＩＳ：水(95:2.5:2.5)で構成された溶液で１時間反応させた後、フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、十分量の冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。窒素雰囲気下で十分乾燥して、精製前のFmoc-オクタペプチド(Fmoc-KLKKTETQ-NH2)０．９８ｇを合成した(収率81.9%)。分子量測定器を利用して測定時、１１９６．９(理論値1196.4)が得られた。
実施例８：Ac-Octapeptide (Ac-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-NH2)の合成
前記合成例２で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide resinをＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄し、保護されたＦｍｏｃを除去した。新しい反応器に無水酢酸2ml、HoBt 610mg、及びBop 1.77gを入れて、1.56mlのＤＩＥＡを分画で２回にかけて入れた後、十分に攪拌した。レジン反応器に予め混合した無水酢酸溶液を投入し、３０分間反応を維持した。ＤＭＦ、ＭＣ、メタノールの順に３回ずつ洗浄した後、完全に乾燥した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジンを入れた。予め調製した脱漏溶液[トリフルオロ化酢酸(TFA) 95%、蒸留水2.5%、及びチオアニソール2.5%]３０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のアセチルオクタペプチド(Ac-KTKKTETQ-NH2)０．８７ｇを合成した(収率85.6%)。
前記合成例２で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide resinをＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄し、保護されたＦｍｏｃを除去した。新しい反応器に無水酢酸2ml、HoBt 610mg、及びBop 1.77gを入れて、1.56mlのＤＩＥＡを分画で２回にかけて入れた後、十分に攪拌した。レジン反応器に予め混合した無水酢酸溶液を投入し、３０分間反応を維持した。ＤＭＦ、ＭＣ、メタノールの順に３回ずつ洗浄した後、完全に乾燥した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジンを入れた。予め調製した脱漏溶液[トリフルオロ化酢酸(TFA) 95%、蒸留水2.5%、及びチオアニソール2.5%]３０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のアセチルオクタペプチド(Ac-KTKKTETQ-NH2)０．８７ｇを合成した(収率85.6%)。
精製前のペプチドを、大容量高性能液体クロマトグラフィを利用して分取し、主ペプチドのみを集め蒸留して、アセトニトリルを除去した後、凍結乾燥により、精製された合成ペプチド０．７２ｇを得た。最終結果物のペプチドは、高性能液体クロマトグラフィを利用して分析した時、９６％の純度を示し、最終収率は７０．９％で、非常に優れた結果を示した。さらに、主ピーク部位を選定して分子量測定器で測定した結果、１０１６．９(理論的計算時1016.2)が得られ、所望のペプチドの Ac-KTKKTETQ-NH2 が効果的によく合成されたことを確認することができた。
実施例９：
Formyl-Octapeptide(Formyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-NH2)の合成
前記合成例２で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide resinをＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄し、保護されたＦｍｏｃを除去した。新しい反応器に無水酢酸2ml、HoBt 610mg、及びBop 1.77gを入れて、1.56mlのＤＩＥＡを分画で２回にかけて入れた後、十分に攪拌した。レジン反応器に予め混合した無水酢酸溶液を投入し、３０分間反応を維持した。ＤＭＦ、ＭＣ、メタノールの順に３回ずつ洗浄した後、完全に乾燥した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジンを入れた。予め調製した脱漏溶液[トリフルオロ化酢酸(TFA) 95%、蒸留水2.5%、及びチオアニソール2.5%]３０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のホルミルオクタペプチド(Formyl-KTKKTETQ-NH2)０．８９ｇを合成した(収率88.8%)。分子量測定器を利用して測定時、１００２．８(理論値1002.2)が得られた。
Formyl-Octapeptide(Formyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-NH2)の合成
前記合成例２で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide resinをＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄し、保護されたＦｍｏｃを除去した。新しい反応器に無水酢酸2ml、HoBt 610mg、及びBop 1.77gを入れて、1.56mlのＤＩＥＡを分画で２回にかけて入れた後、十分に攪拌した。レジン反応器に予め混合した無水酢酸溶液を投入し、３０分間反応を維持した。ＤＭＦ、ＭＣ、メタノールの順に３回ずつ洗浄した後、完全に乾燥した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジンを入れた。予め調製した脱漏溶液[トリフルオロ化酢酸(TFA) 95%、蒸留水2.5%、及びチオアニソール2.5%]３０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のホルミルオクタペプチド(Formyl-KTKKTETQ-NH2)０．８９ｇを合成した(収率88.8%)。分子量測定器を利用して測定時、１００２．８(理論値1002.2)が得られた。
実施例１０：
Palmitoyl-Octapeptide(Palmitoyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-NH2)の合成
前記合成例２で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide resinをＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄し、保護されたＦｍｏｃを除去した。パルミトイルクロライド１．５ｍｍｏｌをＤＭＦ ５ｍｌに溶解した後、膨らましたレジンが入っている反応容器に入れて、ＤＩＰＥＡ １．５６ｍｌを入れた後、３５℃で１時間反応を維持した。ＤＭＦ ３０ｍｌで３回、ＤＣＭ ３０ｍｌで４回洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥した後、五酸化リン(P2O5)を利用して減圧状態で乾燥し、側鎖がパルミトイル基で保護されたオクタペプチドを製造した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジン１ｇを入れた。予め調製した脱漏溶液[TEA 95%、蒸留水2.5%、及びチオアニソール2.5%]３０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら１時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のパルミトイルオクタペプチド(Palmitoyl-KTKKTETQ-NH2)１．３ｇを合成した(収率105.8%)。分子量測定器を利用して測定時、１２２９．４(理論値1228.6)が得られた。
Palmitoyl-Octapeptide(Palmitoyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-NH2)の合成
前記合成例２で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide resinをＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄し、保護されたＦｍｏｃを除去した。パルミトイルクロライド１．５ｍｍｏｌをＤＭＦ ５ｍｌに溶解した後、膨らましたレジンが入っている反応容器に入れて、ＤＩＰＥＡ １．５６ｍｌを入れた後、３５℃で１時間反応を維持した。ＤＭＦ ３０ｍｌで３回、ＤＣＭ ３０ｍｌで４回洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥した後、五酸化リン(P2O5)を利用して減圧状態で乾燥し、側鎖がパルミトイル基で保護されたオクタペプチドを製造した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジン１ｇを入れた。予め調製した脱漏溶液[TEA 95%、蒸留水2.5%、及びチオアニソール2.5%]３０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら１時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のパルミトイルオクタペプチド(Palmitoyl-KTKKTETQ-NH2)１．３ｇを合成した(収率105.8%)。分子量測定器を利用して測定時、１２２９．４(理論値1228.6)が得られた。
実施例１１〜１２：
Stearyl-Octapeptide(Stearyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-NH2)及びMyristyl-Octapeptide(Myristyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-NH2)の合成
前記合成例２で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide resinを二つのバッチ反応器にそれぞれ入れて、ＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄して、保護されたＦｍｏｃを除去した。容器にそれぞれミリスチルクロライド１．５ｍｍｏｌ(ミリスチルオクタペプチドの場合)とステアリルクロライド１．５ｍｍｏｌ(ステアリルオクタペプチドの場合)をＤＭＦ ５ｍｌに溶解した後、膨らました各バッチのレジンを各反応容器に入れて、ＤＩＰＥＡ １．５６ｍｌを入れた後、３５℃で１時間反応を維持した。ＤＭＦ ３０ｍｌで３回、ＤＣＭ ３０ｍｌで４回洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥した。五酸化リン(P2O5)を利用して減圧状態で乾燥し、側鎖がそれぞれミリスチル基、ステアリル基で保護されたオクタペプチドを製造した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジン１ｇを入れた。予め調製した脱漏溶液[TEA 81.5%、蒸留水5%、チオアニソール5%、フェノール5%、EDT 2.5%及びTIS 1%]１０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら１時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のミリスチルオクタペプチド(Myristyl-KTKKTETQ-NH2)０．９８ｇ(収率81.6%)と、ステアリルオクタペプチド(Stearyl-KTKKTETQ-NH2)１．０２ｇ(収率81.2%)を合成した。分子量測定器を利用して測定時、ミリスチルオクタペプチドの場合は、１２０１．４(理論値1200.5)が、ステアリルオクタペプチドの場合は、１２５７．２(理論値1256.7)が得られた。
Stearyl-Octapeptide(Stearyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-NH2)及びMyristyl-Octapeptide(Myristyl-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-NH2)の合成
前記合成例２で製造されたFmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu) -Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide resinを二つのバッチ反応器にそれぞれ入れて、ＤＭＦで十分膨らました後、溶液を除去し、２０％ピペリジン/ＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄して、保護されたＦｍｏｃを除去した。容器にそれぞれミリスチルクロライド１．５ｍｍｏｌ(ミリスチルオクタペプチドの場合)とステアリルクロライド１．５ｍｍｏｌ(ステアリルオクタペプチドの場合)をＤＭＦ ５ｍｌに溶解した後、膨らました各バッチのレジンを各反応容器に入れて、ＤＩＰＥＡ １．５６ｍｌを入れた後、３５℃で１時間反応を維持した。ＤＭＦ ３０ｍｌで３回、ＤＣＭ ３０ｍｌで４回洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥した。五酸化リン(P2O5)を利用して減圧状態で乾燥し、側鎖がそれぞれミリスチル基、ステアリル基で保護されたオクタペプチドを製造した。丸底フラスコに、完全に乾燥したペプチジルレジン１ｇを入れた。予め調製した脱漏溶液[TEA 81.5%、蒸留水5%、チオアニソール5%、フェノール5%、EDT 2.5%及びTIS 1%]１０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら１時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のミリスチルオクタペプチド(Myristyl-KTKKTETQ-NH2)０．９８ｇ(収率81.6%)と、ステアリルオクタペプチド(Stearyl-KTKKTETQ-NH2)１．０２ｇ(収率81.2%)を合成した。分子量測定器を利用して測定時、ミリスチルオクタペプチドの場合は、１２０１．４(理論値1200.5)が、ステアリルオクタペプチドの場合は、１２５７．２(理論値1256.7)が得られた。
実施例１３：ナノ化ペプチドの製造
前記実施例２から得られたアセチルデカペプチド５０ｍｇを正確に秤量した後、蒸留水５００ｍｌで十分に攪拌して溶解した。ペプチド溶液を、レシチン５ｇ、オレイン酸ナトリウム(sodium oleate)０．３ｍｌ、エタノール５０ｍｌ及び少量のオイルと共に混合した後、総量が１Ｌとなるように蒸留水で調節した後、マイクロ流動化装置(microfluidizer)を利用して高圧で乳化し、大きさ１００ｎｍ程度のナノソームを製造した。製造されたナノソームは、最終濃度が約５０ｐｐｍで、化粧品製造用として使用された。
前記実施例２から得られたアセチルデカペプチド５０ｍｇを正確に秤量した後、蒸留水５００ｍｌで十分に攪拌して溶解した。ペプチド溶液を、レシチン５ｇ、オレイン酸ナトリウム(sodium oleate)０．３ｍｌ、エタノール５０ｍｌ及び少量のオイルと共に混合した後、総量が１Ｌとなるように蒸留水で調節した後、マイクロ流動化装置(microfluidizer)を利用して高圧で乳化し、大きさ１００ｎｍ程度のナノソームを製造した。製造されたナノソームは、最終濃度が約５０ｐｐｍで、化粧品製造用として使用された。
剤形例１：柔軟化粧水
前記実施例１３で製造されたアセチルデカペプチドナノソームを含み、下記組成からなる柔軟化粧水を、一般的な化粧水製造方法により製造した。
前記実施例１３で製造されたアセチルデカペプチドナノソームを含み、下記組成からなる柔軟化粧水を、一般的な化粧水製造方法により製造した。
剤形例２：栄養クリーム
前記実施例１３で製造されたアセチルデカペプチドナノソームを含み、下記組成からなる栄養クリームを、一般的な栄養クリームの製造方法により製造した。
前記実施例１３で製造されたアセチルデカペプチドナノソームを含み、下記組成からなる栄養クリームを、一般的な栄養クリームの製造方法により製造した。
剤形例３：栄養化粧水
前記実施例１３で製造されたアセチルデカペプチドナノソームを含み、下記組成からなる栄養化粧水を、一般的な化粧水製造方法により製造した。
前記実施例１３で製造されたアセチルデカペプチドナノソームを含み、下記組成からなる栄養化粧水を、一般的な化粧水製造方法により製造した。
剤形例４：エッセンス
前記実施例１３で製造されたアセチルデカペプチドナノソームを含み、下記組成からなるエッセンスを、一般的なエッセンス製造方法により製造した。
前記実施例１３で製造されたアセチルデカペプチドナノソームを含み、下記組成からなるエッセンスを、一般的なエッセンス製造方法により製造した。
剤形例５〜７：ヘアトナー(Hair Toner)の製造
前記実施例２で製造及び精製されたアセチルオクタペプチドを含むヘアトナーを製造した。下記のような組成からなるヘアトナーを、一般的なヘアトナーの製造方法により製造した。
前記実施例２で製造及び精製されたアセチルオクタペプチドを含むヘアトナーを製造した。下記のような組成からなるヘアトナーを、一般的なヘアトナーの製造方法により製造した。
試験例１：生理活性度の測定実験
前記実施例２で製造及び精製されたアセチルオクタペプチドの生理活性度は、Falcoらの方法(Falco, et al. (1988) Oncogene., 2, 573)を参照し、ＢＡＬＢ/ＭＫ角質細胞株を利用した[3H]-thymidineの吸収率で測定した。ＢＡＬＢ/ＭＫ角質細胞株を、２５０ｍｌ容量の組織培養用フラスコを利用して、１００％ＦＢＳ(fetal bovine serum)が含有されたＥＭＥＭ(Eagle's minimal essential media, Gibco, U.S.A.)で培養した。培養されたＢＡＬＢ/ＭＫ角質細胞株を、０．２５％トリプシン溶液で培養容器の底から取り外した後、遠心分離して細胞沈殿物のみを集めた。これを、ＦＢＳが含有されていないＥＭＥＭ培養液に再び懸濁した後、２４ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり２×１０4細胞/０．３ｍｌ培養液になるように入れて、２４時間３７℃、７％ＣＯ2条件下で培養した。前記実施例２で製造されたアセチルオクタペプチドを、０．２％牛血漿アルブミン(w/v)が含有されたＥＭＥＭ培養液で２ｎｇ/ｍｌの濃度から２倍ずつ連続的に希釈し、各ウェルに０．３ｍｌずつ添加した後、３７℃、７％ＣＯ2条件下でさらに６時間培養した。その後、各ウェルに０．５μ Ｃｉの[3H]-thymidine(Amersham, TRK 686, 68 Ci/mmol)を入れて、一晩中培養した。培養が完了した後、培養上清液を除去して、PBS(phosphate buffered saline)で１回洗浄した。各ウェルに０．２５％トリプシン溶液０．１ｍｌずつを入れて、３７℃で５分間放置した後、細胞を培養板から分離した。１０％ＦＢＳが含有されたＥＭＥＭ培養液０．５ｍｌずつを各ウェルに添加して、細胞捕集器(12 well cell harvester, Millipore, U.S.A.)を使用して、細胞をガラス繊維フィルタに付着させた。フィルタを１ｍｌの蒸留水で１回、１ｍｌのエタノールで１回洗浄した後、６０℃で３０分間放置して乾燥した。乾燥されたフィルタを、２ｍｌの閃光カクテル(scintillation cocktail)と共に閃光バイアル(scintillation vial)に入れて、３０分間常温で放置した後、閃光計数器(Beckman, U.S.A)で細胞内に吸収された放射能量を測定し、その結果を図５に示した。
前記実施例２で製造及び精製されたアセチルオクタペプチドの生理活性度は、Falcoらの方法(Falco, et al. (1988) Oncogene., 2, 573)を参照し、ＢＡＬＢ/ＭＫ角質細胞株を利用した[3H]-thymidineの吸収率で測定した。ＢＡＬＢ/ＭＫ角質細胞株を、２５０ｍｌ容量の組織培養用フラスコを利用して、１００％ＦＢＳ(fetal bovine serum)が含有されたＥＭＥＭ(Eagle's minimal essential media, Gibco, U.S.A.)で培養した。培養されたＢＡＬＢ/ＭＫ角質細胞株を、０．２５％トリプシン溶液で培養容器の底から取り外した後、遠心分離して細胞沈殿物のみを集めた。これを、ＦＢＳが含有されていないＥＭＥＭ培養液に再び懸濁した後、２４ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり２×１０4細胞/０．３ｍｌ培養液になるように入れて、２４時間３７℃、７％ＣＯ2条件下で培養した。前記実施例２で製造されたアセチルオクタペプチドを、０．２％牛血漿アルブミン(w/v)が含有されたＥＭＥＭ培養液で２ｎｇ/ｍｌの濃度から２倍ずつ連続的に希釈し、各ウェルに０．３ｍｌずつ添加した後、３７℃、７％ＣＯ2条件下でさらに６時間培養した。その後、各ウェルに０．５μ Ｃｉの[3H]-thymidine(Amersham, TRK 686, 68 Ci/mmol)を入れて、一晩中培養した。培養が完了した後、培養上清液を除去して、PBS(phosphate buffered saline)で１回洗浄した。各ウェルに０．２５％トリプシン溶液０．１ｍｌずつを入れて、３７℃で５分間放置した後、細胞を培養板から分離した。１０％ＦＢＳが含有されたＥＭＥＭ培養液０．５ｍｌずつを各ウェルに添加して、細胞捕集器(12 well cell harvester, Millipore, U.S.A.)を使用して、細胞をガラス繊維フィルタに付着させた。フィルタを１ｍｌの蒸留水で１回、１ｍｌのエタノールで１回洗浄した後、６０℃で３０分間放置して乾燥した。乾燥されたフィルタを、２ｍｌの閃光カクテル(scintillation cocktail)と共に閃光バイアル(scintillation vial)に入れて、３０分間常温で放置した後、閃光計数器(Beckman, U.S.A)で細胞内に吸収された放射能量を測定し、その結果を図５に示した。
図５から分かるように、本発明のアセチルオクタペプチド及びオクタペプチドは、チミジンの角質細胞への挿入(incorporation)を濃度依存的に促進させていることが分かる。従って、本発明のアセチルオクタペプチド及びオクタペプチドは、Ｔβ−４Ｆと同様に、高い生理活性度(biological activities)を有していることが分かる。
試験例２：安定性実験
精製されたオクタペプチドの安定性を確認するために、１０μｇ/ｍｌとなるように、オクタペプチドとアセチルオクタペプチドを50 mM Tris-HCl (pH 8.0)緩衝溶液に溶かして用意した。対照群として、１μｇ/ｍｌの濃度で大腸菌から生産された組換えチモシンβ−４を同一緩衝溶液に用意した。用意した溶液をガラスバイアルに入れて、３７℃で静置した。３７℃で静置された溶液を、０、１、１０、２５、５０、７５、そして１００日目にサンプリングして、ＢＡＬＢ/ＭＫ角質細胞株に対する[3H]-thymidine incorporation assayを行って、残っているペプチドと組換えチモシンβ−４の活性を測定した。この時、０日のサンプル活性を１００％と基準し、その測定された残余活性を計算して図６に示した。
精製されたオクタペプチドの安定性を確認するために、１０μｇ/ｍｌとなるように、オクタペプチドとアセチルオクタペプチドを50 mM Tris-HCl (pH 8.0)緩衝溶液に溶かして用意した。対照群として、１μｇ/ｍｌの濃度で大腸菌から生産された組換えチモシンβ−４を同一緩衝溶液に用意した。用意した溶液をガラスバイアルに入れて、３７℃で静置した。３７℃で静置された溶液を、０、１、１０、２５、５０、７５、そして１００日目にサンプリングして、ＢＡＬＢ/ＭＫ角質細胞株に対する[3H]-thymidine incorporation assayを行って、残っているペプチドと組換えチモシンβ−４の活性を測定した。この時、０日のサンプル活性を１００％と基準し、その測定された残余活性を計算して図６に示した。
図６から分かるように、天然Ｔβ−４の場合、時間が経過するにつれて、活性度が急激に減少するが、本発明によるオクタペプチドの場合は、活性度が長く持続されることを確認することができた。特に、Ｎ−末端がアセチル基で保護されたアセチルオクタペプチドは、非常に優れた安定性を示した。
試験例３：本発明のペプチドのＨａＣａＴ角質細胞成長能力の分析
本発明のペプチドに対する角質細胞の成長効果を分析するために、Rizzinoらの方法(Rizzino, et al. Cancer Res., 48:4266(1988))などを参照し、ＨａＣａＴ角質細胞株を利用したＳＲＢ(Sulforhodamine B)の比色法を利用して測定した。ＨａＣａＴ角質細胞株(The Korean Cell Line Bank)を、１００％ＦＢＳ(fetal bovine serum)の含有されたＥＭＥＭ(Eagle's minimal essential media, Gibco, U.S.A.)が入っている２５０ｍｌ容量の組織培養用フラスコを利用して培養した。培養されたＨａＣａＴ角質細胞株を、０．２５％トリプシン溶液で培養容器の底から取り外した後、遠心分離して細胞沈殿物のみを集めた。これを、ＦＢＳが含有されていないＥＭＥＭ培養液に再び懸濁した後、９６ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり４×１０3細胞となるように入れて、２４時間３７℃、７％ＣＯ2条件下で培養した。２４時間後、血清を完全に排除した同一な培養液で培地を入れ替えた後、標準を取るための空試料、ヒトのチモシンβ−４、アセチルオクタペプチドを、水と１０％ＤＭＳＯに滅菌状態で溶解した後、１０ｎｇと１，０００ｎｇの濃度で７２時間、上記の同一条件で培養した。培養が完了した後、培養上清液を除去して、ＰＢＳで１回洗浄した。洗浄溶液を除去した後、比色ＳＲＢ溶液(Sigma-Aldrich)で処理し、ＰＢＳで十分洗浄した後、顕微鏡で細胞を観察し、生存細胞の状態を観察して(図７)、紫外線５９０ｎｍで吸光度を測定し、細胞の生存状態を、ペプチドを処理しなかった場合に対する相対値で示した(図８)。
本発明のペプチドに対する角質細胞の成長効果を分析するために、Rizzinoらの方法(Rizzino, et al. Cancer Res., 48:4266(1988))などを参照し、ＨａＣａＴ角質細胞株を利用したＳＲＢ(Sulforhodamine B)の比色法を利用して測定した。ＨａＣａＴ角質細胞株(The Korean Cell Line Bank)を、１００％ＦＢＳ(fetal bovine serum)の含有されたＥＭＥＭ(Eagle's minimal essential media, Gibco, U.S.A.)が入っている２５０ｍｌ容量の組織培養用フラスコを利用して培養した。培養されたＨａＣａＴ角質細胞株を、０．２５％トリプシン溶液で培養容器の底から取り外した後、遠心分離して細胞沈殿物のみを集めた。これを、ＦＢＳが含有されていないＥＭＥＭ培養液に再び懸濁した後、９６ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり４×１０3細胞となるように入れて、２４時間３７℃、７％ＣＯ2条件下で培養した。２４時間後、血清を完全に排除した同一な培養液で培地を入れ替えた後、標準を取るための空試料、ヒトのチモシンβ−４、アセチルオクタペプチドを、水と１０％ＤＭＳＯに滅菌状態で溶解した後、１０ｎｇと１，０００ｎｇの濃度で７２時間、上記の同一条件で培養した。培養が完了した後、培養上清液を除去して、ＰＢＳで１回洗浄した。洗浄溶液を除去した後、比色ＳＲＢ溶液(Sigma-Aldrich)で処理し、ＰＢＳで十分洗浄した後、顕微鏡で細胞を観察し、生存細胞の状態を観察して(図７)、紫外線５９０ｎｍで吸光度を測定し、細胞の生存状態を、ペプチドを処理しなかった場合に対する相対値で示した(図８)。
一方、６日間、本発明のアセチルオクタペプチド(1μg/ml)をＨａＣａＴ細胞株に処理して、皮膚シワ改善の標識因子であるプロコラーゲンの量の変化を観察した(図９)。プロコラーゲンの量は、Procollagen ELISAキット(Takara、Japan)を利用して測定した。また、７２時間本発明のアセチルオクタペプチド５μmoleをＨａＣａＴ細胞株に処理して、皮膚シワ改善のまた他の標識因子であるヒアルロン酸(図１０)の濃度を測定した。ヒアルロン酸の濃度は、Hyaluronic acid ELISAキット(Echelon Biosciences Inc, USA)を利用して測定した。
図７及び８から分かるように、本発明のペプチドは、対照群に比べ、高い細胞生存率を示すことが分かる。本発明のペプチドをＨａＣａＴ角質細胞株に処理した場合、細胞内プロコラーゲンとヒアルロン酸の含量が処理量に依存的に増加することが分かる(図９、図１０)。
したがって、本発明のペプチドは、非常に優れた皮膚改善効能を奏することが分かる。
試験例４：本発明のペプチドによる皮膚厚さの変化の測定
本発明のペプチドの化粧品としての有用性と生体内効能を調べるために、製造した化粧品組成物をマウス皮膚に適用した。
本発明のペプチドの化粧品としての有用性と生体内効能を調べるために、製造した化粧品組成物をマウス皮膚に適用した。
実験に使用したＢａｌｂ Ｃマウス(Central Lab. Animal, Inc., Korea)は、６週齢の雄で、購入後、一週間の安定期を経た後、背中部位を、チオグリコール酸含有クリームを利用して部分除毛した。除毛後、マウスを二つのグループに分け、一つのグループは、剤形例２のアセチルオクタペプチドを含有したナノソームを含むクリームで、他のグループは、ペプチドの入っていない空クリームで、朝８時３０分と夜６時に、１００ｍｇずつを除毛した部位に塗布した。５日間クリームを処理後、動物を頚椎脱骨で致死させた後、皮膚の組織を切断してパラフィンで固定し、microtombにより４μｍ厚の薄片試料を作った後、スライドに固定し、ヘマトキシリン・エオシン染色をして、光学顕微鏡で検鏡した(図１１)。
図１１から分かるように、本発明のアセチルオクタペプチドを含有するナノソーム化粧品は、マウスの角質細胞層及び上皮細胞層を成長させることができることが明確に分かる。したがって、本発明のペプチドを化粧品として皮膚に適用すると、優れた皮膚シワ改善及び弾力改善効能を奏することが分かる。
試験例５：毛髪成長効果実験
正常の８週齢Ｃ３Ｈ/ＨｅＮマウスを、理髪器と除毛剤を使用して、背中部位の毛を完璧に除去した。一日後にアセチルオクタペプチドを含む剤形例５の化粧水を皮膚に十分塗布し、対照群として、ペプチドの入っていない空試料化粧水を皮膚に十分塗布した。２５日間同じ方法で塗布し、背中における発毛効果を観察した。
正常の８週齢Ｃ３Ｈ/ＨｅＮマウスを、理髪器と除毛剤を使用して、背中部位の毛を完璧に除去した。一日後にアセチルオクタペプチドを含む剤形例５の化粧水を皮膚に十分塗布し、対照群として、ペプチドの入っていない空試料化粧水を皮膚に十分塗布した。２５日間同じ方法で塗布し、背中における発毛効果を観察した。
発毛効果を観察した結果、図１２から分かるように、初期発毛の時間的な効果と共に、毛の長さ及び数などを換算してみると、対照群に比べ、約２５〜３０％の増加効果があることが分かった。
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
Claims (6)
- 配列番号１のアミノ酸配列からなるヒトチモシンβ−４（Ｔβ４）の活性を示すペプチドを有効成分として含む、チモシンβ−４−有効性(thymosin β-4-effective)の疾患または状態の予防または治療用組成物。
- 前記組成物は、(a)配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの薬剤学的有効量、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物は、(a)配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの化粧品学的有効量、及び(b)化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物は、皮膚状態の改善のためのものであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 前記皮膚状態の改善は、シワの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、脱毛の防止または毛髪成長の促進、アトピー疾患の治療、皮膚保湿の改善、シミの除去またはニキビの治療であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
- 前記皮膚状態の改善は、シワの改善または毛髪成長の促進であることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
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