KR20070044279A - 모발 성장을 촉진하는 펩티드 및 이를 이용한 화장품 - Google Patents

모발 성장을 촉진하는 펩티드 및 이를 이용한 화장품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사람 티모신 베타-4(Tβ-4)로부터 유래한 Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln(KLKKTETQ)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 모발 성장을 촉진하는 펩티드를 제공한다.
본 발명에 의한 펩티드의 경우, 천연의 Tβ-4와 동일한 기능을 나타내면서도, Tβ-4 보다 온도, 산, 알칼리 등에 안정성을 나타낼 뿐만 아니라, 장기보존성 등도 뛰어나게 된다. 따라서, 이를 화장품 등의 용도에 적용할 경우, 우수한 모발 성장효과를 얻을 수 있게 된다.
티모신 베타-4, 모발 성장, 펩티드, 고상 펩티드 합성법, 안정성

Description

모발 성장을 촉진하는 펩티드 및 이를 이용한 화장품{PEPTIDE FOR STIMULATING HAIR GROWTH AND COSMETICS USING IT}
도 1은 티모신 베타-4의 가상적인 2차 구조 및 본 발명에 의한 펩티드로 선정된 부위를 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 의한 펩티드의 합성과정을 나타내는 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의하여 제조된 아세틸 옥타펩티드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의하여 제조된 옥타펩티드를 질량분석기를 이용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의하여 제조된 아세틸 옥타펩티드의 생리활성도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의하여 제조된 아세틸 옥타펩티드의 안정성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의하여 제조된 아세틸 옥타펩티드의 두발 성장 촉진 효과를 보여주는 사진이다.
본 발명은 모발 성장을 촉진하는 펩티드 및 이를 이용한 화장품에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 사람 티모신 베타-4(Tβ-4, Thymosin beta-4)로부터 유래한 펩티드 및 그것을 이용한 화장품에 관한 것이다.
모발은 모낭의 성장과정에 따라 여러 성장 인자들에 의해 복잡하게 조절되는 소기관이다. 모낭의 분화과정 및 이와 관계된 모주기(hair cycle)는 모발이 성장하는 단계인 성장기(Anagen), 모발의 소멸이 연결되는 퇴화기(Catagen), 성장 정지기인 휴지기(Telogen) 및 신규 모발이 발생하여 성장하는 발생기로 나눌 수 있다(Paus, R., et. Al and Cotsarelis, G. (1999) The biology of hair follicles. N. Engl . J. Med . 341, 491~497 참조).
생장기/성장기(Anagen stage)는 모발이 성장하는 단계로 이는 다시 2단계로 나뉘어진다. 즉, 모발이 모구(hair bulb)로부터 모낭(hair follicle)으로 나가려고 모발을 생성하는 단계와 딱딱한 케라틴이 모낭 안에서 만들어지는 단계이며, 퇴화기까지 자가성장을 계속한다. 성장기의 모발의 수명은 3∼6년이며 전체 모발(10∼15만개)의 80∼90%를 차지하고 성장단계에서 두발은 한 달에 1∼1.5cm 정도 자란다.
퇴화기(Catagen stage)는 성장기가 끝나고, 모발의 형태를 유지하면서 대사과정이 느려지는 시기로서 이때 모발은 천천히 성장한다. 또한, 이 단계에서는 케 라틴을 만들어 내지는 않는다. 퇴화기의 수명은 1∼1.5개월이며 전체 모발의 1%를 차지한다. 모구부가 수축하여 모유두로 나눠지며 모낭에 둘러싸여 위쪽으로 올라간다. 이때 세포분열은 정지하고 있다.
휴지기(Talogen stage)는 　모유두가 위축되고 모낭은 차츰 수축되며 모근은 위쪽으로 밀려 올라가 빠진다(모근부는 위쪽에 올라와 있고, 모낭의 깊이는 1/3로 되어 있다). 모발이 없어지는 시기로 다음 성장기 단계가 시작될 때까지의 수명은 3∼4개월, 전체 모발의 4∼14%에 해당(분만 후 30∼40%)되며 이 시기의 모발은 강한 빗질이나 자극만으로도 쉽게　빠진다.
마지막으로 발생기는 성장기 초에는 모낭에 둘러싸여 있던 모구부가 모유두와 결합하여 새로운 모발을 성장시킨다. 다음으로 새로운 모발은 휴지기에 들어간 오래된 모발을 위로 밀어 올려서 자연 탈모시킨다.
하지만, 이와 같은 모주기는 매번 동일하게 반복되고 있는 것은 아니다. 병, 유전, 체질, 연령 등 모든 상황에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면 휴지기에 들어간 채로 발생기를 맞이한다든가, 성장기를 맞았지만 경모까지는 이르지 못한다든가, 유연한 경모인 상태로 퇴화기가 되는 등의 여러 가지 상황이 있을 수 있다.
또한, 사회가 복잡 다양화되어 감에 따라 환경오염, 스트레스, 각종 화학물질 등과 같이, 인간의 탈모를 일으킬 수 있는 요인도 점차 증가해 가고 있는 추세이며, 이로 인해, 탈모로 고통받고 있는 사람들도 증가하는 추세이다.
하지만, 현재까지 뚜렷하게 탈모를 방지할 수 있다거나, 혹은 탈모된 모발의 성장을 촉진시킬 수 있는 물질들의 개발이 미진한 상황이다. 따라서, 모발 성장을 촉진시킬 수 있는 물질 등의 개발이 절실히 요청되고 있다.
한편, 티모신 베타-4(Tβ-4, Thymosin beta-4)는 1981년 소의 흉선으로부터 발견되었다. Tβ-4는 44개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 분자량은 4.982 kDa 이며, 이론적인 등전점은 5.1로서 약산성을 띠는 단백질이다. Tβ-4에는 글루타민산과 리신 잔기 등 극성을 띤 아미노산이 많이 존재하며, 음성 전하를 띠는 아스파르트산과 글루타민산이 모두 11개, 리신과 아르기닌산 잔기가 모두 9개 존재한다. 도 1은 Tβ-4의 가상적인 2차 구조를 표현한 것으로 2개의 나선구조가 내재 되어 있다.
이와 같은 Tβ-4는 세포의 이동과 분화의 조절자로서 중요한 기능을 수행하며, 상처의 회복과 신생혈관생성에 관여하는 것으로 알려져 있다(Frohm, M., Gunne, H., Bergman, A. C., Agerberth, B., Bergman, T., Boman, A., Liden, S., Jornvall, H., and Boman, H. G. (1996) Biochemical and antibacterial analysis of human wound and blister fluid. Eur . J. Biochem . 237, 86.92 참조).
아울러 최근에는 Tβ-4가 모발의 성장과정에도 밀접하게 영향을 미친다는 연구들이 발표되고 있다.
하지만, 이러한 Tβ-4의 경우, 천연 단백질의 형태로 그대로 이용할 경우에 생물학적으로 매우 불안정하고, 물리화학적으로도 불균질하여 치료효과가 감소되는 경우가 있으며, 또한 피부 내 투과율도 비교적 저조하다는 문제점이 있었다.
따라서, Tβ-4의 안정성, 투과율 등을 높일 수 있는 방법이 절실히 요청되고 있는 상황이다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 사람 티모신 베타-4(Tβ-4, Thymosin beta-4)와 동일한 기능을 할 수 있는 사람 Tβ-4 유래의 펩티드를 검색하고, 이 펩티드의 N-말단 및 C-말단을 변형 설계함으로써, 열, 산, 알칼리 등의 물리화학적 인자에 대한 안정성이 증가된 펩티드를 제공하는 것에 그 목적이 있다.
본 발명은 또한, 상기 펩티드를 화장품의 용도에 적용하는 것에 그 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 사람 티모신 베타-4(Tβ-4)로부터 유래한 Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln(KLKKTETQ)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 모발 성장을 촉진하는 펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 펩티드를 포함하는 화장품을 제공한다.
이하에서, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
우선, 본 발명은 사람 티모신 베타-4(Tβ-4)로부터 유래한 Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln (KLKKTETQ)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 모발 성장을 촉진하는 펩티드를 제공한다.
이때, 상기 아미노산 서열은 Tβ-4의 엑틴 부착 부위 내에 존재하는 것이 바람직하다.
이와 같은 펩티드의 제조방법으로는 특별한 제한은 없다고 할 것이나, 그 중에서도 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 고상 펩티드 합성법(SPPS; Solid phase Peptide Synthesis)을 이용하여 통상적인 Fmoc 방법으로 합성하는 것이 바람직하다.
즉, 본 발명에서는 천연의 Tβ-4의 엑틴 부착부위로 알려진 특정 부위를 선정하여 고상 펩티드 합성 기술을 이용하여 펩티드를 합성한다.
이에 나아가, 상기 펩티드를 생체내의 단백질 절단효소들로부터의 공격을 방지하고 안정성을 증가시키기 위해 아미노 말단 및 카르복시 말단을 변형하거나 여러 유기단으로 보호한다.
즉, 상기 펩티드의 C-말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없다고 할 것이나, 그 중에서도 특히, 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH2)로 변형되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 펩티드의 N-말단은 안정성을 증가시키기 위해서 보호될 수 있는 형태라면 특별한 제한은 없다고 할 것이나, 그 중에서도 특히, 아세틸(Acetyl)기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐(Fmoc)기, 포르밀(Formyl)기, 팔미토일(Palmitoyl)기, 미리스틸(Myristyl)기 및 스테아릴(Stearyl)기로 이루어진 군에서 선택되는 기로 보호되는 것이 바람직하다.
상기와 같은 펩티드의 경우, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, Tβ-4와 동일한 생리활성도를 나타내었다. 또한, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이 본 발명에 의한 펩티드의 경우, Tβ-4에 비하여 매우 안정성이 증가 되었으며, 나아가, 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 대조군에 비하여 약 25-30%의 모발 성장 촉진 효과를 얻을 수 있었다.
상기와 같은 펩티드의 경우, 의약품, 의약외품, 화장품 등 다양한 분야에 적용될 수 있다고 할 것이나, 그 중에서도 화장품의 용도에 적용됨이 바람직하다. 이와 같은 화장품은 특별한 제한은 없다고 할 것이나, 상기 펩티드가 모발 성장 효과를 나타내므로, 모발용 화장품에 적용되는 것이 특히 바람직하다. 이와 같은 화장품의 제조방법은 일반적인 화장품의 제조방법과 동일하다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명의 권리범위를 한정하는 것은 아니고 단지 예시로서 제시된 것이다.
< 실시예 >
< 합성예 1> Fmoc - Lys ( Boc )-Leu- Lys ( Boc )- Lys ( Boc )- Thr ( tBu )- Glu ( tBu )-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL-resin의 합성
클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin;CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드 (MC) 10ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름아마이드(DMF) 10ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Gln(trt)-OH 200mmole, 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM에 녹여 10분간 반응시킨 후, 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine) / DMF) 10ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 DMF로 2회, MC로 1회, 다시 DMF로 3분씩 1회 세척하여 Gln-(trt)-CTL Resin을 제조하였다. 새로운 반응기에 10ml의 DMF용액을 넣고 Fmoc-Thr(tBu)-OH 200mmole, HoBt 200mmole, Bop 200mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrine Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 20% 피페리딘/DMF 용액으로 상기와 같이 동일하게 탈보호 반응시켜 Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL Resin을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 즉, 도 1과 같이 선정된 아미 노산 서열에 의거하여 Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH 순으로 연쇄 반응시켰다. 만들어진 펩티딜 레진은 DMF, MC, 메탄올로 각각 3번을 세척하고 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P2O5하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조하여 Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL-resin을 제조하였다.
< 합성예 2> Fmoc - Lys ( Boc )-Leu- Lys ( Boc )- Lys ( Boc )- Thr ( tBu )- Glu ( tBu )-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide Resin의 합성
Fmoc-Rink amide 레진(Nova biochem Cat No. 01-64-0013) 1.42 g(1 mmole)을 정확히 측량하여 반응용기에 넣고, 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고, 디메틸포름아마이드(DMF)를 10 ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 20% 피페리딘/DMF 용액 10 ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 20% 피페리딘/DMF 용액을 넣고, 다시 10분간 반응을 유지한 후, 용액을 제거하고 DMF로 2회, MC로 1회, 다시 DMF로 3분씩 1회 세척하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF용액을 넣고 Fmoc-Gln(trt)-OH 2 mmole, HoBt 2 mmole, Bop 2 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 4 mmole의 DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣고, 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용 기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하며 반응시켰다. 반응액을 제거하고, DMF용액으로 3회 5분씩 교반하여 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트 (Nihydrine Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 20% 피페리딘/DMF 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Gln(trt)-Rink Amide Resin을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 즉, 도 1과 같이 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH 순으로 연쇄 반응시켰다. 만들어진 펩티딜 레진은 DMF, MC, 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P2O5하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조하여 Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL-resin을 제조하였다.
< 실시예 1> Fmoc - Octapeptide ( Fmoc - Lys -Leu- Lys - Lys - Thr - Glu - Thr - Gln -OH)의 합성
상기 합성예 1에서 제조된 Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL-resin을 TFA : TIS : 물 (95:2.5:2.5)로 구성된 용액으로 1시간 반응시킨 후, 필터하여 레진을 걸러내고, 레진을 소량의 TFA용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증 류하고 충분 량의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전물을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 질소 분위기하에서 충분히 건조하여 정제 전 Fmoc-옥타펩티드(Fmoc-KLKKTETQ)를 1.1g 합성하였다(수율 91.9%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 1198.5(이론값 : 1197.4)를 얻을 수 있었다.
< 실시예 2> Ac- Octapeptide (Ac- Lys -Leu- Lys - Lys - Thr - Glu - Thr - Gln -OH)의 합성 및 정제
상기 합성예 1에서 제조된 Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL-resin을 DMF로 충분히 부풀게 한 후 용액을 제거하고 20% 피페리딘/DMF 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 보호된 Fmoc을 제거하였다. 신규의 반응기에 무수초산 2 ml, HoBt 610 mg, Bop 1.77 g을 넣고 1.56 ml의 DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣어 충분히 교반하였다. 레진반응기에 미리 혼합한 무수초산 용액을 투입하고 30분간 반응을 유지하였다. DMF, MC, 메탄올의 순서로 세 번씩 세척한 후 완전히 건조시켰다. 둥근 바닥 플라스크에 완전히 건조시킨 펩티딜 레진을 넣었다. 미리 조제한 탈루용액[트리플로로화 초산 (Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5 %, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ml을 넣고, 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 동안 반응을 유지하였다. 필터를 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였 다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 아세틸 옥타펩티드(Ac-KTKKTETQ)를 0.93g 합성하였다(수율 : 91.4 %).
정제 전 펩티드는 대용량 고성능 액상 크로마토그래피를 이용해 분취하였으며 주 펩티드만 모아 증류하여 아세트나이트릴을 제거한 후 동결건조를 통해 정제된 합성 펩티드 0.72g을 얻을 수 있었다. 최종 결과물인 펩티드는 고성능 액상 크로마토그래피를 이용하여 분석하였을 때(도 3), 96%의 순도를 보였으며 최종 수율은 70.9%로 매우 우수한 결과를 보여 주었다. 아울러 주 피크 부위를 선정해 분자량측정기로 측정하였을 때 1,018.0(이론적 계산시 : 1017.2)를 얻어 원하는 펩티드인 Ac-KLKKTETQ가 효과적으로 잘 합성된 것을 확인할 수 있었다.(도 4)
< 실시예 3> Formyl - Octapeptide ( Formyl - Lys -Leu- Lys - Lys - Thr - Glu - Thr - Gln -OH)의 합성
합성예 1에 의하여 제조된 Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL-resin를 DMF로 충분히 부풀게 한 후 용액을 제거하고 20% 피페리딘/DMF 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후, 잘 세척하여 보호된 Fmoc을 제거하였다. 신규의 반응기에 무수초산 2 ml, HoBt 610 mg, Bop 1.77 g을 넣은 후, 1.56 ml의 DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣어 교반을 충분히 하였다. 레진반응기에 미리 혼합한 무수초산 용액을 투입하고, 30분간 반응을 유지하였다. DMF, MC, 메탄올의 순서로 세 번씩 세척한 뒤 완전히 건조시켰다. 둥근 바닥 플라스크에 완전히 건조시킨 펩티딜 레진을 넣었다. 미리 조제한 탈루용액[트리플로로 아세트 산 (Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ml을 넣고, 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 동안 반응을 유지하였다. 필터를 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전의 포르밀 옥타펩티드(Formyl-KTKKTETQ)를 0.88 g 합성하였다(수율 87.7%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 1003.6(이론값 : 1003.2)를 얻을 수 있었다.
< 실시예 4> Palmitoyl -Octapeptide( Palmitoyl - Lys -Leu- Lys - Lys - Thr - Glu - Thr -Gln-OH)의 합성
합성예 1에 의하여 제조된 Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL-resin을 DMF로 충분히 부풀게 한 후, 용액을 제거하고 20% 피페리딘/DMF 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 보호된 Fmoc을 제거하였다. 팔미토일 클로라이드 1.5 mmol을 DMF 5 ml에 녹인 후 부풀린 레진이 있는 반응용기에 넣고 DIPEA 1.56 ml를 넣은 후 35℃에서 1시간 동안 반응을 유지하였다. DMF 30ml로 3회, DCM 30ml로 4회 세척하고, 질소 분위기하에서 건조한 후, 오산화인(P2O5)을 이용하여, 감압상태에서 건조하여 곁가지가 팔미토일기로 보호된 옥타펩티드를 제조하였다. 둥근 바닥 플라스크에 완전히 건조시킨 펩티딜 레 진을 1g 넣었다. 미리 조제한 탈루용액[트리플로로화 초산 (Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5 %, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ml을 넣고, 상온에서 가끔 흔들어주며 1시간 동안 반응을 유지하였다. 필터를 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 분위기 하에서 충분히 건조하여 정제 전의 팔미토일 옥타펩티드(Palmitoyl-KLKKTETQ)를 1.4g 합성하였다(수율 113.9%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 1230.2(이론값 : 1229.6)를 얻을 수 있었다.
< 실시예 5 내지 6> Stearyl -Octapeptide( Stearyl - Lys -Leu- Lys - Lys - Thr - Glu -
Thr - Gln -OH) 및 Myristyl -Octapeptide( Myristyl - Lys -Leu- Lys - Lys - Thr - Glu -
Thr - Gln -OH)의 합성
합성예 1에 의하여 제조된 Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL-resin을 두 개의 배취 반응기에 각각 넣고, DMF로 충분히 부풀게 한 후 용액을 제거하고 20% 피페리딘/DMF 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 보호된 Fmoc을 제거하였다. 용기에 각각 미리스틸(Myristyl)-클로라이드 1.5 mmol(미리스틸 옥타펩티드의 경우)과 스테아릴(Stearyl)-클로라이드 1.5 mmol(스테아릴 옥타펩티드의 경우)을 DMF 5 ml에 녹인 후 부풀린 각 배취(Batch)의 레진을 각 반응용기에 넣고 DIPEA 1.56 ml를 넣은 후 35℃에서 1시간 동 안 반응을 유지하였다. DMF 30ml로 3회, DCM 30ml로 4회 세척한 뒤 질소 분위기 하에서 건조하였다. 오산화인(P2O5)을 이용하여, 감압상태에서 건조하여 곁가지가 각각 미리스틸기 및 스테아릴기로 보호된 옥타펩티드를 제조하였다. 둥근 바닥 플라스크에 완전히 건조시킨 펩티딜 레진을 1g 넣었다. 미리 조제한 탈루용액[트리플로로화 초산 (Trifluroacetic acid) 81.5%, 증류수 5 %, 티오아니졸(Thioanisole) 5%, 페놀(Phenol) 5%, EDT 2.5%, TIS 1%] 10 ml을 넣고, 상온에서 가끔 흔들어주며 1시간 동안 반응을 유지하였다. 필터를 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고, 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전의 미리스틸 옥타펩티드(Myristyl-KLKKTETQ) 1.01g(수율 84.1%)과 스테아릴 옥타펩티드(Stearyl-KLKKTETQ) 1.1g(수율 87.5%)을 합성하였다. 분자량 측정기를 이용하여 측정시 미리스틸 옥타펩티드의 경우 1202.4(이론값 : 1201.5)를, 스테아릴 옥타펩티드의 경우 1258.5(이론값: 1257.7)을 얻을 수 있었다.
< 실시예 7> Fmoc - Octapeptide ( Fmoc - Lys -Leu- Lys - Lys - Thr - Glu - Thr - Gln - NH 2 )의 합성
상기 합성예 2에서 제조된 Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)- Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide-resin을 TFA : TIS : 물(95:2.5:2.5)로 구성된 용액으로 1시간 반응시킨 후, 필터하여 레진을 걸러내고, 레진을 소량의 TFA용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 충분 량의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전물을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 질소 분위기하에서 충분히 건조하여 정제 전 Fmoc-옥타펩티드(Fmoc-KLKKTETQ-NH2)를 0.98g 합성하였다(수율 81.9%). 분자량 측정기를 이용하여 측정 시 1,196.9 (이론값 : 1,196.4)를 얻을 수 있었다.
< 실시예 8> Ac- Octapeptide (Ac- Lys -Leu- Lys - Lys - Thr - Glu - Thr - Gln - NH 2 )의 합성
상기 합성예 2에서 제조된 Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide-resin을 DMF로 충분히 부풀게 한 후 용액을 제거하고 20% 피페리딘/DMF 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 보호된 Fmoc을 제거하였다. 신규의 반응기에 무수초산 2 ml, HoBt 610 mg, Bop 1.77 g을 넣고 1.56 ml의 DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣어 충분히 교반하였다. 레진반응기에 미리 혼합한 무수초산 용액을 투입하고 30분간 반응을 유지하였다. DMF, MC, 메탄올의 순서로 세 번씩 세척한 후 완전히 건조시켰다. 둥근 바닥 플라스크에 완전히 건조시킨 펩티딜 레진을 넣었다. 미리 조제한 탈루용액[트리플로로화 초산 (Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5 %, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ml을 넣고, 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 동안 반응을 유지하였다. 필터를 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 아세틸 옥타펩티드(Ac-KTKKTETQ-NH2)를 0.87g 합성하였다(수율 : 85.6 %).
정제 전 펩티드는 대용량 고성능 액상 크로마토그래피를 이용해 분취하였으며 주 펩티드만 모아 증류하여 아세트나이트릴을 제거한 후 동결건조를 통해 정제된 합성 펩티드 0.72g을 얻을 수 있었다. 최종 결과물인 펩티드는 고성능 액상 크로마토그래피를 이용하여 분석하였을 때, 96%의 순도를 보였으며 최종 수율은 70.9%로 매우 우수한 결과를 보여 주었다. 아울러 주 피크 부위를 선정해 분자량측정기로 측정하였을 때 1,016.9(이론적 계산시 : 1016.2)를 얻어 원하는 펩티드인 Ac-KLKKTETQ가 효과적으로 잘 합성된 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 9> Formyl -Octapeptide( Formyl - Lys -Leu- Lys - Lys - Thr - Glu - Thr - Gln -NH 2 )의 합성
상기 합성예 2에서 제조된 Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)- Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide-resin을 DMF로 충분히 부풀게 한 후 용액 을 제거하고 20% 피페리딘/DMF 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후, 잘 세척하여 보호된 Fmoc을 제거하였다. 신규의 반응기에 무수초산 2 ml, HoBt 610 mg, Bop 1.77 g을 넣은 후, 1.56 ml의 DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣어 교반을 충분히 하였다. 레진반응기에 미리 혼합한 무수초산 용액을 투입하고, 30분간 반응을 유지하였다. DMF, MC, 메탄올의 순서로 세 번씩 세척한 뒤 완전히 건조시켰다. 둥근 바닥 플라스크에 완전히 건조시킨 펩티딜 레진을 넣었다. 미리 조제한 탈루용액[트리플로로 아세트산(Trifluoroacetic acid) 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ml을 넣고, 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 동안 반응을 유지하였다. 필터를 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전의 포르밀 옥타펩티드(Formyl-KTKKTETQ-NH2)를 0.89 g 합성하였다(수율 88.8%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 1002.8(이론값 : 1002.2)를 얻을 수 있었다.
< 실시예 10> Palmitoyl -Octapeptide( Palmitoyl - Lys -Leu- Lys - Lys - Thr - Glu -Thr-Gln-NH 2 )의 합성
상기 합성예 2에서 제조된 Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide-resin을 DMF로 충분히 부풀게 한 후, 용액 을 제거하고 20% 피페리딘/DMF 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 보호된 Fmoc을 제거하였다. 팔미토일 클로라이드 1.5 mmol을 DMF 5 ml에 녹인 후 부풀린 레진이 있는 반응용기에 넣고 DIPEA 1.56 ml를 넣은 후 35℃에서 1시간 동안 반응을 유지하였다. DMF 30ml로 3회, DCM 30ml로 4회 세척하고, 질소 분위기하에서 건조한 후, 오산화인(P2O5)을 이용하여, 감압상태에서 건조하여 곁가지가 팔미토일기로 보호된 옥타펩티드를 제조하였다. 둥근 바닥 플라스크에 완전히 건조시킨 펩티딜 레진을 1g 넣었다. 미리 조제한 탈루용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5 %, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ml을 넣고, 상온에서 가끔 흔들어주며 1시간 동안 반응을 유지하였다. 필터를 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 분위기 하에서 충분히 건조하여 정제 전의 팔미토일 옥타펩티드(Palmitoyl-KLKKTETQ-NH2)를 1.3g 합성하였다(수율 105.8%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 1,229.4(이론값 : 1228.6)를 얻을 수 있었다.
< 실시예 11 내지 12> Stearyl -Octapeptide( Stearyl - Lys -Leu- Lys - Lys -
Thr - Glu - Thr - Gln - NH 2 ) 및 Myristyl -Octapeptide( Myristyl - Lys -Leu- Lys - Lys -
Thr - Glu - Thr - Gln - NH 2 )의 합성
상기 합성예 2에서 제조된 Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink amide-resin을 두 개의 배취 반응기에 각각 넣고, DMF로 충분히 부풀게 한 후 용액을 제거하고 20% 피페리딘/DMF 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 보호된 Fmoc을 제거하였다. 용기에 각각 미리스틸(Myristyl)-클로라이드 1.5mmol(미리스틸 옥타펩티드의 경우)과 스테아릴(Stearyl)-클로라이드 1.5 mmol(스테아릴 옥타펩티드의 경우)을 DMF 5 ml에 녹인 후 부풀린 각 배취(Batch)의 레진을 각 반응용기에 넣고 DIPEA 1.56 ml를 넣은 후 35℃에서 1시간 동안 반응을 유지하였다. DMF 30ml로 3회, DCM 30ml로 4회 세척한 뒤 질소 분위기 하에서 건조하였다. 오산화인(P2O5)을 이용하여, 감압상태에서 건조하여 곁가지가 각각 미리스틸기 및 스테아릴기로 보호된 옥타펩티드를 제조하였다. 둥근 바닥 플라스크에 완전히 건조시킨 펩티딜 레진을 1g 넣었다. 미리 조제한 탈루용액[트리플로로화 초산 (Trifluroacetic acid) 81.5%, 증류수 5 %, 티오아니졸(Thioanisole) 5%, 페놀(Phenol) 5%, EDT 2.5%, TIS 1%] 10 ml을 넣고, 상온에서 가끔 흔들어주며 1시간 동안 반응을 유지하였다. 필터를 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고, 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전의 미리스틸 옥타펩티드(Myristyl -KLKKTETQ-NH2) 0.98g(수율 81.6%)과 스테아릴 옥타펩티드(Stearyl-KLKKTETQ-NH2) 1.02g(수율 81.2%)을 합성하였다. 분자량 측정기를 이용하여 측정시 미리스틸 옥타펩티드의 경우 1201.4(이론값 : 1200.5)를, 스테아릴 옥타펩티드의 경우 1,257.2(이론값: 1,256.7)을 얻을 수 있었다.
< 시험예 1> 생리활성도 측정 실험
상기 실시예 2에서 제조 및 정제된 아세틸 옥타펩티드의 생리 활성도는 팔코 등의 방법(Falco, et al. (1988) Oncogene, 2, 573)을 참조하여 BALB/MK 각질세포주를 이용한 [3H]-thymidine의 흡수율로 측정하였다. BALB/MK 각질세포주를 250㎖ 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 100% FBS(Fetal Bovine Serum)가 함유된 Earle's minimal essential media (EMEM, Gibco, U.S.A.)에서 배양하였다. 배양된 BALB/MK 각질 세포주를 0.25% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 FBS가 함유되지 않은 EMEM 배양액에 다시 현탁한 후, 24웰 조직 배양용 평판에 각 웰당 2 x 10 4 세포/0.3㎖ 배양액이 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 7% CO2 조건 하에서 배양하였다. 상기 실시예 2에서 제조된 아세틸 옥타펩티드를 0.2% 소혈장알부민(bovine serum albumin)(w/v)이 함유된 EMEM 배양액으로 2ng/㎖ 농도로부터 두 배씩 연속적으로 희석하여 각 웰에 0.3㎖씩 첨가한 후 37℃, 7% CO2 조건하에서 6시간 더 배양하였다. 그 후, 각 웰에 0.5μCi의 [3H]-thymidine(Amersham, TRK 686, 68Ci/mmol)을 넣고 밤새 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 PBS(phosphate buffer saline)로 1회 세척하였다. 각 웰에 0.25% 트립신 용액 0.1㎖ 씩을 넣고 37℃에서 5분간 방치하여 세포들을 배양판에서 분리하였다. 10% FBS가 함유된 EMEM 배양액 0.5㎖씩을 각 웰에 첨가하고, 세포 포집기(12 well cell harvester, Milipore, U.S.A.)를 사용하여 세포를 유리섬유 필터에 부착시켰다. 필터를 1㎖의 증류수로 1회, 그리고 1㎖의 에탄올로 1회 세척한 후 60℃에서 30분간 방치하여 건조시켰다. 건조된 필터를 2㎖의 섬광칵테일(scintillation cocktail)과 함께 섬광 바이알(scintillation vial)에 넣고 30분간 상온에서 방치시킨 후, 섬광계수기(scintillation counter) (Beckman, U.S.A)로 세포 내에 흡수된 방사능 양을 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
측정 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의한 아세틸 옥타펩티드의 경우, 높은 생리활성도를 나타냄을 알 수 있었다.
< 시험예 2 > 안정성 실험
정제된 옥타펩티드의 안정성을 확인하기 위하여 10ug/ml이 되도록 옥타펩티드와 아세틸-옥타펩티드를 50mM Tris-HCl, pH 8.0 완충용액에 녹여 준비했다. 대조군으로서 1ug/ml의 농도로 대장균으로부터 생산된 재조합 티모신 베타-4를 동일 완충용액에 준비했다. 준비된 용액을 유리 바이알에 넣은 후 37℃에서 정치하였다. 37℃에 정치된 용액을 0, 1, 10, 25, 50, 75 그리고 100일째에 샘플링하여 BALB/MK 각질 세포주에 대한 [3H]-thymidine incorporation assay를 시행하여 남아있는 펩티 드와 재조합 티모신 베타-4의 활성을 측정하였다. 이때 0일의 샘플 활성을 100%로 기준하여 그 측정된 잔여 활성을 계산하여 도 6에 나타내었다.
도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 천연 Tβ-4의 경우 시간이 경과함에 따라 활성도가 급격히 감소됨을 알 수 있으나, 본 발명에 의한 옥타펩티드의 경우 활성도가 오랫동안 지속됨을 확인할 수 있었다.
< 시험예 3> 모발성장 효과 실험
8주령된 정상의 C3H/HeN 생쥐를 이발기와 제모제를 사용하여 등 부분의 털을 완벽히 제거하였다. 1일 후에 아세틸 옥타펩티드를 0.05%로 조제한 시료액을 마이크로플루다이저를 통과시켜 나노좀화 시킨 후 피부에 충분히 발라주고, 대조군으로서 공시료인 버퍼만으로 같은 처리를 한 시료를 피부에 충분히 발라 주었다. 25일 동안 같은 방법으로 발라주며, 등에 나는 발모 효과를 관찰하였다. 발모 효과를 관찰한 결과, 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 초기 발모의 시간적인 효과와 함께 털의 길이 및 개수 등을 환산하여 볼 때 대조군에 비하여 약 25-30% 증가 효과가 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 13 내지 15> 헤어 토너의 제조
상기 실시예 2에서 제조 및 정제된 아세틸 옥타펩티드를 포함하는 헤어 토너를 제조하였다. 하기와 같은 조성을 지닌 헤어 토너를 일반적인 헤어 토너의 제조방법과 동일한 방법을 사용하여 제조하였다.
원료 실시예 13 실시예 14 실시예 15
아세틸 옥타펩티드 0.005 0.005 0.005
유사세라마이드 0.05 0.2 0.48
히드록시에틸셀룰로오스 0.3 0.1 -
글리세릴모노스테아레이트 0.4 0.5 0.3
프로필렌글리콜 2.0 1.0 1.5
실리콘오일 0.5 1.0 0.5
세토스테아릴알코올 1.5 2.2 0.5
오렌지왁스 0.1 0.5 3.0
디스테아릴디메틸암모늄클로라이드 1.0 2.0 1.0
세틸트리메틸암모늄클로라이드 1.0 - 1.5
POE알킬에테르/스테아릴알콜 0.5 1.0 3.0
향료 적량 적량 적량
방부제 적량 적량 적량
정제수 잔량 잔량 잔량
합계 100 100 100
상기한 바와 같이, 본 발명에 의한 펩티드의 경우, 사람의 Tβ-4로부터 유래한 것으로서, 사람 Tβ-4와 동일한 기능을 가지며, 특히 모발의 성장을 촉진시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 펩티드의 경우, N-말단이 변형되고, C-말단이 보호되어 있으므로, 37℃ 온도에서 우수한 열안정성을 나타내며, 기타 산, 알칼리 등의 물리화학적 인자에 대한 생물학적 활성의 안정성을 나타내게 된다. 그리하여, 본 발명에 의한 펩티드의 경우, 장기 보존성이 뛰어나므로, 의약품, 의약외품, 화장품과 같은 생체 외 제형에 유리하게 적용될 수 있다.
나아가, 본 발명에 의한 펩티드의 경우, 크기가 작아 피부 내 투과율이 우수하므로, 이를 화장품에 적용하는 경우, 모발 성장 효과가 뛰어나게 된다.
<110> CAREGEN CO.,LTD <120> PEPTIDE FOR STIMULATING HAIR GROWTH AND COSMETICS USING IT <130> AJP05167 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> octapeptide having function of Tbeta-4 <400> 1 Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln 1 5

Claims (5)

  1. 사람 티모신 베타-4(Tβ-4)로부터 유래한 Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln (KLKKTETQ)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 모발 성장을 촉진하는 펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 아미노산 서열은 엑틴 부착 부위 내에 존재하는 것인 펩티드.
  3. 제 1 항에 있어서,
    C-말단이 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH2)로 변형된 펩티드.
  4. 제 1 항에 있어서,
    N-말단이 아세틸(Acetyl)기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐(Fmoc)기, 포르밀 (Formyl)기, 팔미토일(Palmitoyl)기, 미리스틸(Myristyl)기 및 스테아릴(Stearyl)기로 이루어진 군에서 선택되는 기로 보호된 펩티드.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 의한 펩티드를 포함하는 화장품.
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