WO2016035918A1 - 신규한 융합체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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WO2016035918A1
WO2016035918A1 PCT/KR2014/008796 KR2014008796W WO2016035918A1 WO 2016035918 A1 WO2016035918 A1 WO 2016035918A1 KR 2014008796 W KR2014008796 W KR 2014008796W WO 2016035918 A1 WO2016035918 A1 WO 2016035918A1
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cpp
cre
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isomer
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PCT/KR2014/008796
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권혁만
허성
김윤희
류수경
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한국외국어대학교 연구산학협력단
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • the present invention relates to novel fusions and methods for their preparation.
  • Protein transport is a safer and more effective alternative to gene transport in altering gene expression in cells and inducing genome modification. While gene transport by plasmid DNA transfection or viral transduction inevitably leads to genetic modification problems, it is unlikely that the gene will be modified by proteins delivered directly to the cell. Moreover, proteins degrade in the cell after a certain time, which makes protein transport more suitable for the application of cell therapy.
  • CPPs Cell-penetrating peptides
  • arginine-rich CPPs are short basic peptides that are rich in arginine and lysine residues.
  • the guanidinium group of arginine plays a central role in the cell penetrating activity of arginine-rich CPP, and in fact, the arginine homooligomer (7-12 arginine) is more effective than the native arginine-rich CPP such as Tat48-60. to be.
  • Arginine-rich CPPs were found to have higher cell penetration activity than amphiphilic CPPs. Arginine-rich CPP also does not cause membrane leakage even at low micromolar ( ⁇ M) concentrations, which are very effective for cell uptake. Given this low toxicity and high efficiency, arginine-rich CPPs are preferred as protein transporters.
  • polyarginine fusion proteins of Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc are used to reprogram somatic cells into pluripotent stem cells (iPSCs) and TAT-Pdx1, TAT-Ngn3 and TAT-MafA are pancreatic ⁇ - It is used to promote cell differentiation.
  • R7-CARM1 is used to regulate the differentiation potential of human mesenchymal stem cells.
  • Arginine-rich CPP proteins are produced in E, coli as recombinant fusion proteins.
  • fusion of arginine-rich CPPs to proteins dramatically reduces the solubility of the proteins, and when overexpressed in E, coli they generally enter the inclusion body. Therefore, in order to produce an active arginine-rich CPP protein, it is required to undergo protein denaturation and protein regeneration by protein denaturation inducers.
  • the yield of production techniques for converting to active proteins by protein denaturation and regeneration is very low, and as a result, this process limits production yields to very low levels for the production of active arginine-rich CPP proteins from E, coli. It acts as a bottleneck factor.
  • Expressed protein ligation (hereinafter referred to as EPL) is a semisynthetic technique that conjugates synthetic peptides containing N-terminal cysteines with the C-terminal thioesters of the protein through natural chemical ligation reactions. to be.
  • the C-terminal thioester of the protein is produced by thiol degradation of recombinant intein-fusion proteins expressed in E, coli.
  • EPL has orthogonal activity, produces original peptide bonds, and can obtain high yields in neutral pH and aqueous buffer solutions at low temperatures, resulting in an excellent ligation method for introducing synthetic peptides into recombinant proteins. Can be.
  • EPL is used to insert non-natural amino acids or fluorophores into proteins or to induce post-translational modification of proteins. Since EPL uses recombinant proteins expressed in E. coli that are not fused with arginine-rich CPP proteins, there is no problem of reduced protein solubility due to arginine-rich CPP fusion.
  • the present invention solves the above problems, and the object of the present invention as devised by the necessity of the above is to provide a fusion and improved method of cell permeability compared to the conventional.
  • the present invention comprises the steps of a) preparing a fusion partner protein and a mini-intetra fusion; b) providing a method for producing a fusion partner protein and CPP comprising the step of reacting the fusion with a cell permeation peptide (CPP) to produce a fusion of the fusion partner protein and CPP.
  • CPP cell permeation peptide
  • the fusion partner protein is preferably, but not limited to, Cre protein, transcription factor, CRISPR-associated protein 9, or single domain antibody.
  • the Cre protein has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the mini-intein preferably has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • One or more substitutions in the sequence All mutants that cause mutations, such as deletions, and the like to achieve the desired effect of the present invention are included in the scope of the present invention.
  • the CPP is a L -isomer cysteine or D -isomer cysteine at the N-terminus and L -isomer amino acid, D -isomer amino acid, or a combination of L -isomer amino acid and D -isomer amino acid It is preferably a polypeptide consisting of, but is not limited thereto.
  • the CPP is a polyarginine polypeptide consisting of 6 to 15 arginine, TAT, penetratin (Penetratin), protein transduction domain (protein transduction domain) 4, protein drug reduction domain 5, FHV Coat- (35-49), BMV Gag- (7-25), HTLV-II Rex- (4-16), SynB1, SynB3, polypeptide consisting of a combination of arginine and lysine, and polyguanidine peptoy CPP is preferably selected from the group consisting of polyguanidine peptoid, but is not limited thereto.
  • the CPP is preferably a polypeptide with or without a non-natural amino acid, fluorescent element, or biotin inserted into the polypeptide, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a fusion of a fusion partner protein and a polyarginine polypeptide prepared by the method of the present invention.
  • the fusion partner protein is preferably a Cre protein, a transcription factor, CRISPR-associated protein 9 (Cas9), or a single domain antibody (single domain antibody or nanobody), but is not limited thereto.
  • the Cre protein has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the mini-intein mini-intein
  • the mini-intein preferably has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or more in these sequences
  • All mutants that cause mutations such as substitution deletions and achieve the effect to be achieved in the present invention are also included in the scope of the present invention.
  • the present invention also provides a composition for cell permeation comprising the fusion of the present invention.
  • CPPs chemically synthesized polyarginine cell-penetrating peptides
  • EPL protein ligation
  • Cre-thioester was prepared from the Cre-intein-His protein by intein mediated cleavage reaction.
  • 2-mercaptoethanesulfonate (MESNA) used as a thiol catalyst was prepared by directly producing Cre-R9, a ligation product from Cre-intein-His, by performing a one-pot two-step reaction in one reactor. Minimizing the potential impact of) on protein activity.
  • the Cre-R9 protein (ssCre-R9) prepared by the EPL semisynthetic technique was recombinant fusion protein from E. coli. Recombinant activity was shown to be superior to TAT-Cre or Cre-R11 produced in form.
  • D-amino acids or non-natural amino acids can be conjugated to recombinant proteins.
  • Cre protein (ssCre-dR9) to which poly-D-arginine CPP is conjugated was prepared by EPL technique.
  • Poly-D-arginine peptides have a higher protein delivery capacity than poly-L-arginine peptides, and in the present invention, ssCre-dR9 was found to have higher activity than ssCre-R9 in efficiency of intracellular delivery. From this result, it was confirmed that poly-D-arginine CPP is more efficient than poly-L-arginine CPP in the process of delivering a large protein into cells.
  • Biotin binds to avidin with high specificity and affinity, and is used as a device for imaging cells.
  • poly-D-arginine CPP and biotin conjugated Cre protein (ssCre-dR9-biotin) was prepared by the EPL technique.
  • ssCre-dR9-biotin showed similar cell permeability as ssCre-dR9.
  • ssCre-dR9-biotin-induced cells were imaged by fluorescence staining using avidin-FITC.
  • Cre-intein-His protein was expressed in E. coli and purified by Ni-agarose column chromatography.
  • the reaction was performed at 4 ° C. and a minimum concentration of MESNA was selected to carry out the intein-mediated cleavage reaction.
  • the intein-mediated cleavage reaction was optimized with 50 mM MESNA for 24 hours at 4 ° C. Under these conditions, more than 95% of Cre-intein-His protein was cleaved into Cre and intein-His (FIG. 1).
  • the irreversibility of this final amide formation reaction is one-pot two-step in one reactor, which produces the final ligation product in high yield while the intein-mediated cleavage reaction and the natural chemical ligation reaction proceed in one reactor. Enable progress.
  • intein-His protein, MESNA and CGSGG-R9 were removed from the final ligation product by Ni-NTA column chromatography and gel filtration chromatography.
  • 84% of Cre was conjugated with Cre-R9, and the final yield of Cre-R9 was greater than 2 mg from 20 mg Cre-intein-His protein.
  • the final Cre-R9 product produced from EPL as semisynthetic Cre-R9 (ssCre-R9).
  • Cre protein still retains activity even after conjugation of the R9 peptide by expressed protein ligation.
  • Control Cre protein was generated by intein-mediated cleavage using DTT instead of MESNA.
  • Cre enzyme activity was analyzed by measuring the extent to which circular Km r was released by site-specific recombination of Cre from linearized pGEM-T with floxed-Km r inserted (FIG. 2). Both control Cre and ssCre-R9 were analyzed. Maximum activity at was observed at 80 ng. This result indicates that the conjugation of Cre and CGSGG-R9 by EPL does not impair the enzyme activity of Cre.
  • ssCre-R9 transported to cells was also fast, and 58% of the cells were positive for ⁇ -gal staining when treated with 60 ⁇ g / ml ssCre-R9 for 1 hour (FIGS. 5 and 6). Up to 160 ⁇ g / ml showed no cytotoxicity.
  • the ratio of Cre conjugated to ssCre-R9 used as a sample was 84%.
  • the EC50 of ssCre-R9 is 34 ⁇ g / ml (0.85 ⁇ M).
  • TAT-Cre and Cre-R11 purified from recombinant fusion proteins from E. coli are commercially available and the cell permeation efficiencies of TAT-Cre and Cre-R11 were compared directly with ssCre-R9 under the same conditions.
  • EC50 of TAT-Cre was measured at 42 ⁇ g / ml (1.02 ⁇ M), and the cell permeation efficiency of Cre-R11 was very low and EC50 could not be measured.
  • D -isomer R9 peptides labeled with fluorescence detectors have a Km value five times lower than L -isomers in cellular uptake.
  • the cellular uptake mechanism of CPP varies widely depending on the size and nature of the carrier, and it is still unknown whether D -isomer polyarginine CPP works better than L -isomer polyarginine CPP in the transport of large proteins. It was not strictly confirmed.
  • ssCre-dR9 was produced with similar purity and yield as ssCre-R9.
  • the EC50 app of ssCre-dR9 was 34 ⁇ g / ml and the EC50 app of ssCre-R9 was 40 ⁇ g / ml.
  • the ratio of Cre conjugated to R9 or dR9 in ssCre-R9 and ssCre-dR9 used as a sample in the present invention is 84%
  • EC50 of ssCre-R9 is 34 ⁇ g / ml (0.85 ⁇ M)
  • ssCre-dR9 EC 50 is 29 ⁇ g / ml (0.73 ⁇ M).
  • the difference in Km between the two isomeric R9 peptides is a result of measuring the fluorescence of the peptides absorbed into the cells by FACS after treatment of the peptides with the cells at 3 ° C. for 240 seconds, followed by cell membranes. Peptides transported into the cytoplasm from peptides located at or captured by the endosome cannot be distinguished.
  • D-isomer R9 peptide and L-isomers R9 of the Km value the difference between the peptide size and ssCre-R9 and ssCre-dR9 between the EC50 value differences This may explain the inconsistency in size.
  • a Cre fusion conjugated with D -isomer R9 peptide having a cell-permeability greater than 10% at EC50 values was produced.
  • the guanidium group of arginine-rich CPP forms bimodal coordination bonds with the lipid constituents of the negatively charged membrane and creates negative Gaussian membrane curvature, which transiently and dynamically changes the phase of the membrane structure into the mesh phase. Induce. CPP repositions to the inner surface of the membrane via a position change that adapts during phase transition.
  • engineering of membrane curvature may be a way to promote cellular uptake of CPPs.
  • Epsin N-terminal peptide 1-18 (EpN 18), which induces positive curvature, promotes site transfer of R8 peptides into cells.
  • Epsin N-terminal peptide 1-18 which induces positive curvature
  • EpN18 was co-treated with cells treated with ssCre-R9 or ssCre-dR9 at a concentration of 40 ⁇ g / ml near the EC50 app , EpN18 dose-dependently increased ⁇ -gal staining positive cells. Promoting effects of EpN18 began to be observed at 10 ⁇ M and 94% of ⁇ -gal staining positive cells were treated with 40 ⁇ g / ml ssCre-dR9 and 80 ⁇ M EpN18 simultaneously.
  • EpN18 The promoting effect of EpN18 was also observed in cells treated with suboptimal concentrations of ssCre-R9 and ssCre-dR9 (20 ⁇ g / ml). In this case, however, the promoting effect of EpN18 was only apparent at higher concentrations such as 40 and 80 ⁇ M. Since EpN18 is not toxic to cells, EpN18 may be useful as a promoter for cell types with poor protein transduction.
  • Imaging of cells transduced with therapeutic cell permeation proteins is useful for evaluating therapeutic effects. Since the fluorescent element can be easily inserted into a polypeptide synthesized by chemical techniques, cell-permeable proteins labeled with the fluorescent element can be prepared by a semi-synthetic EPL method.
  • the present inventors synthesized a polypeptide consisting of dR9 and biotin and conjugated to Cre by EPL method to produce ssCre-dR9-biotin fusion.
  • ssCre-dR9-biotin was produced with similar purity and yield as ssCre-dR9.
  • the EC 50 of ssCre-dR9-biotin was measured at 40 ⁇ g / ml, similar to the cell permeability of ssCre-dR9.
  • the cells were treated with ssCre-dR9-biotin for 5 hours, and the cells were stained with avidin-FITC and observed under confocal fluorescence microscopy. Fluorescence was not observed in control cells, while ssCre-dR9-biotin-treated cells were clearly observed in the cytoplasm and nucleus.
  • the use of polypeptides incorporating near-infrared fluorescent elements, such as Cy7, in place of biotin in EPL is expected to produce cell-permeable proteins capable of in vivo non-invasive imaging.
  • the novel fusion and production method thereof have overcome the production yield problem of the existing method, and provide a semi-synthetic protein having better cell permeation activity than the existing method, and at the same time, the cell imaging ability, etc. It has the effect of making cell-permeable proteins with sophisticated properties.
  • 1 is a diagram showing the semisynthesis of Cre-R9 by EPL.
  • Figure 2 shows the activity of Cre-R9 after EPL.
  • FIG. 3-4 depict protein transduction of semisynthetic Cre-R9 and Cre-dR9.
  • Figure 3 shows that Cre-mediated recombination with floxed STOP cassette induces LacZ expression in human TE671 (LoxP-LacZ) cells.
  • Figure 4 shows the results of confirming the percentage of LacZ-expressing cells by X-gal staining when exposed to various concentrations of the factor.
  • FIG. 7 and 8 are diagrams showing the improvement of transduction of ssCre-R9 and ssCre-dR9 by EpN18.
  • FIG. 7 is a graph showing the results when Cre is 20 ⁇ g / ml
  • FIG. 8 is a Cre when 40 ⁇ g / ml.
  • CGSGG-R9 [NH2-Cys-Gly-Ser-Gly-Gly- (Arg) 9-amide]
  • CGSGG-dR9 [NH2-Cys-Gly-Ser-Gly-Gly-D (Arg) 9-amide]
  • EpN18 And dR9-biotin [NH2-Cys-Gly-Ser-Gly-Gly-D (Arg) 9-Gly-Lys (biotin) -amide] were synthesized and provided by Peptron Inc. Peptides were purified by high pressure liquid chromatography to a purity of at least 90% and confirmed by mass spectrometry.
  • Cre recombinase cDNA is obtained by continuous amplification from pBS185CMV-Cre (Addgene), where 5-GAG CAT ATG TCC AAT TTA CTG ACC GTA CAC-3 (SEQ ID NO: 3) as a forward primer and 5- as a reverse primer GTA CTC GAG ATC GCC ATC TTC CAG GAC-3 (SEQ ID NO: 4) and 5-GCG TGC TCT TCC GCA GTA CTC GAG ATC GCC ATC-3 (SEQ ID NO: 5) were used.
  • the amplified cDNA was inserted into Nde I and Sap I of the pTWIN_His vector (Jena Bioscience) for Cre-intein-His fused with Cre, mini-intein (from Mycobacterium Xenopi gyrase A, Mxe GyrA) and 6x His-tag. Create an expression plasmid. Leu-Glu-Tyr is inserted between Cre and intein to promote intein-mediated cleavage. PTWIN_Cre plasmid encoding Cre-intein-His fusion protein was modified with E.
  • E. coli was harvested by centrifugation, resuspended in lysis buffer (20 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH8.0) and treated on ice for 30 minutes with 1 mg / ml lysozyme. After solubilization. The soluble supernatant is collected by 10,000 ⁇ g centrifugation and mixed with Ni-NTA resin (Qiagen) at 4 ° C. for 1 hour.
  • Cre-intein-His protein is extracted from the resin in elution buffer (50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH8.0). Fractions containing Cre-intein-His protein were combined and dialyzed overnight at 4 ° C. against cleavage buffer (50 mM NaH 2 PO 4 , 250 mM NaCl, pH8.0).
  • Cre-intein-His protein in cleavage buffer 50 mM NaH 2 PO 4 , 250 mM NaCl, pH 8.0
  • 50 mM mercaptoethanesulfonate 24 mM at 24 ° C. for 24 hours with 10 molar excess of CGSGG-R9 or CGSGG-dR9.
  • MESNA MESNA
  • Cre-R9 was treated with DTT (Dithiothreitol) to achieve a final concentration of 10 mM, incubated for 30 minutes on ice, and then concentrated at 4 ° C using Pierce concentrator 9K (Thermo).
  • MESNA and peptide remained unreacted from Cre-R9 by spin column packed with Sephadex G25 Fine resin (GE Healthcare) equilibrated with storage buffer (50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 8.0) Remove it.
  • TE671 (LoxP-LacZ) cells were purchased from Allele Biotech. Cells were cultured in a 5% wet CO 2 culture environment in Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal calf serum, 100 U / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium
  • TE671 (LoxP-LacZ) cells were plated in 24-well plates at 7 ⁇ 10 3 cells / well. After 1 day, cells were washed once with OPTI-MEM (Gibco) and incubated for 5 hours in 300 ⁇ l of OPTI-MEM containing Cre protein. The medium was replaced with DMEM containing 10% fetal bovine serum and the cells were then further incubated for 43 hours. Recombination at the LoxP site by Cre protein was determined by LacZ enzyme analysis.
  • TAT-Cre and Cre-R11 purified from recombinant fusion proteins were purchased from EMD Millipore and LD Biopharma.
  • Cre protein was added to 50 ⁇ l of reaction buffer containing 50 ⁇ g of linearized pGEM-T (floxed-Km r ) (50 mM Tris-HCl, 33 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , pH 7.5) and at 37 ° C. for 1 hour. Incubated. Cre was heat-inactivated by incubation at 70 ° C. for 10 minutes. After separating the DNA from the protein by phenol extraction and ethanol precipitation, the DNA was analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • Human TE671 cells cultured on gelatin-covered cover glass are incubated for 5 hours in OPTI-MEM containing 80 ⁇ g / ml Cre protein. The cells are washed three times with PBS, and then fixed at room temperature for 30 minutes with 3.7% (v / v) paraformaldehyde. The cells are treated with avidin-FITC, anti avidin-biotin antibody, and avidin-FITC for 30 minutes at room temperature. Cover glass was attached to a microscope slide with 90% glycerol and 0.1% o-phenylenediamine solution dissolved in PBS and observed under confocal microscope.

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Abstract

본 발명은 신규한 융합체 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의해 기존 단백질보다 좋은 세포투과 활성을 갖는 반합성 단백질을 얻을 수 있고 이에 따라 세포 이미징 능력 등 더 정교한 성질을 가지는 세포투과 단백질을 만들 수 있는 효과가 있다.

Description

신규한 융합체 및 이의 제조 방법
본 발명은 신규한 융합체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
단백질 수송은 세포의 유전자 발현을 변화시키고 게놈 수정을 유도함에 있어서 유전자 수송에 비해 더 안전하고 효과적인 대안이라고 할 수 있다. 플라스미드 DNA 트랜스팩션 또는 바이러스성 형질도입에 의한 유전자 수송은 유전자 변형 문제를 필연적으로 유발하는 반면에 세포로 직접 전달되는 단백질에 의해서는 유전자가 변형될 가능성은 거의 없다. 더욱이 단백질은 세포에서 특정 시간 후에 분해되는데 이러한 성질 때문에 세포 치료의 적용에 있어 단백질 수송이 더 적합하다.
단백질이 비극성 세포막을 통과할 수 없기 때문에, 단백질 수송은 일반적으로 단백질 수송 운반체를 필요로 한다. 세포-투과 펩타이드(Cell-penetrating peptides, 이하 CPP라 한다.)는 리포좀 및 다른 캡슐화 기술과 구별되는 가장 유망한 단백질 수송 운반체로, CPP는 거대분자에 부착되었을 때 막 투과성이 낮은 거대분자의 세포 흡수를 가능하게 하는 짧은 길이의 펩타이드이다. Tat48-60이 HIV-1 Tat 단백질의 세포 침투를 가능하게 하여 HIV-1 특이 표적 유전자를 활성화시킨다는 것이 처음 발견된 이래로 Penetratin 및 Transportan을 포함하는 여러 CPP의 존재가 보고되었다.
CPP는 2종류가 있는데, 아르기닌-풍부 CPP 및 양친매성(amphipathic) CPP로 나뉜다. 아르기닌-풍부 CPP는 길이가 짧은 염기성 펩타이드로, 아르기닌 및 라이신 잔기를 풍부하게 포함하고 있다. 아르기닌의 구아니디늄(guanidinium) 그룹은 아르기닌-풍부 CPP의 세포 침투 활성에 있어서 중심적 역할을 하며, 사실상 아르기닌의 호모올리고머(7-12 아르기닌)가 Tat48-60 같은 천연의 아르기닌-풍부 CPP보다 더 효과적이다.
CPP 두 종류의 펩타이드 서열의 특징이 다른 것은 두 종류 CPP 각각의 위치 전이 메커니즘이 똑같지 않다는 것을 시사한다. 아르기닌-풍부 CPP는 세포 침투 활성이 양친매성 CPP보다 더 높은 것으로 조사되었다. 또한 아르기닌-풍부 CPP는 세포 흡수에 있어 매우 효과적인 저(底) 마이크로몰(μM) 농도에서도 막 누출을 유발하지 않는다. 이러한 낮은 독성과 높은 효율성을 고려해볼 때, 아르기닌-풍부 CPP가 단백질 수송 운반체로써 더 선호되고 있다. 예를 들어, Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 폴리아르기닌 융합 단백질은 체세포를 만능유도줄기세포(iPSCs)로 재프로그래밍하기 위하여 사용되며 TAT-Pdx1, TAT-Ngn3 및 TAT-MafA는 췌장 β-세포 분화를 촉진하기 위해 사용된다. R7-CARM1은 인간 간엽 줄기 세포의 분화 잠재능을 조절하기 위해 사용된다.
아르기닌-풍부 CPP 단백질은 재조합 융합 단백질로서 E,coli에서 생산된다. 그러나 아르기닌-풍부 CPP를 단백질에 융합시키면 단백질의 용해도를 급격하게 감소시키고, E,coli에서 과발현되면 그들은 일반적으로 봉입체(inclusion body)로 들어간다. 따라서 활성 아르기닌-풍부 CPP 단백질을 생산하기 위해서는 단백질 변성 유도물질에 의한 단백질 변성과 단백질 재생과정을 거쳐야한다. 그러나 단백질 변성 및 재생과정으로 활성 단백질로 전환하는 생산 기법의 수율은 매우 낮으며, 그 결과 이 과정은 E,coli로부터 활성 아르기닌-풍부 CPP 단백질을 생산하는 기법에 있어서 생산 수율을 매우 낮은 수준으로 제한하는 병목 요인으로 작동한다.
발현 단백질 라이게이션(Expressed protein ligation, 이하 EPL이라 함)은 자연적 화학 라이게이션(native chemical ligation) 반응을 통하여 N-말단 시스테인을 포함하는 합성 펩타이드를 단백질의 C-말단 티오에스터와 컨주게이트하는 반합성 기술이다. 단백질의 C-말단 티오에스터는 E,coli에서 발현되는 재조합 intein-융합 단백질의 티올분해에 의해 생산된다. EPL은 수직(orthogonal)적 활성을 지니고, 원래의 펩티드 결합을 생산하며, 저온에서 중성 pH 및 수용성 완충용액 내에서 높은 수율을 획득할 수 있어, 합성 펩타이드를 재조합 단백질에 도입하는 우수한 라이게이션 방법이 될 수 있다. EPL은 비천연 아미노산 또는 형광소자(fluorophores)를 단백질에 삽입하거나 단백질의 해독후수식(post-translational modification)을 유도하기 위해 사용된다. EPL에서는 아르기닌-풍부 CPP 단백질이 융합되어 있지 않은 E.coli에서 발현된 재조합 단백질을 사용하기 때문에, 아르기닌-풍부 CPP 융합에 기인하는 단백질 용해도 감소 문제점이 발생하지 않는다.
[선행기술문헌]
국제공개공보 WO 2009/149956호
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 기존에 비해 세포 투과성이 향상된 융합체 및 이를 제조하는 방법을 제공함에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a) 융합파트너 단백질과 미니-인테인 융합체를 제조하는 단계; b) 상기 융합체를 세포투과 펩타이드(CPP)와 반응시켜서 융합파트너 단백질과 CPP의 융합체를 제조하는 단계를 포함하는 융합파트너 단백질과 CPP의 융합체 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 융합파트너 단백질은 Cre 단백질, 전사인자,CRISPR-관련 단백질(associated protein) 9, 또는 단일 도메인 항체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 Cre 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고, 상기 미니-인테인(mini-intein)은 서열번호2의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 상기 서열 중에 하나 이상의 치환, 결손 등 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 CPP는 N-말단에 L-이성체 시스테인 또는 D-이성체 시스테인이 위치하고 L-이성체 아미노산, D-이성체 아미노산, 또는 L-이성체 아미노산과 D-이성체 아미노산의 조합으로 구성된 폴리펩타이드인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 CPP는 6개로부터 15개의 아르기닌으로 구성된 폴리아르기닌 폴리펩타이드, TAT, 페네트라틴(Penetratin), 단백질 트랜스덕션 도메인(protein transduction domain) 4, 단백질 드린스덕션 도메인 5, FHV Coat-(35-49), BMV Gag-(7-25), HTLV-II Rex-(4-16), SynB1, SynB3, 아르기닌과 라이신의 조합으로 구성된 폴리펩타이드, 및 폴리구아니딘 펩토이드(polyguanidine peptoid)로 구성된 군으로부터 선택된 CPP인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 CPP는 폴리펩타이드에 비천연아미노산, 형광소자, 또는 비오틴이 삽입되어 있거나 삽입되어 있지 않은 폴리펩타이드인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 융합파트너 단백질과 폴리아르기닌 폴리펩타이드의 융합체를 제공한다.
본 발명의 구현예에 있어서, 상기 융합파트너 단백질은 Cre 단백질, 전사인자, CRISPR-associated protein 9 (Cas9), 또는 단일 도메인 항체(single domain antibody 또는 nanobody)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 Cre 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고, 상기 미니-인테인(mini-intein)은 서열번호2의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이들 서열에 하나 이상의 치환 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명에서 달성하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 융합체를 포함하는 세포 투과용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 화학적으로 합성한 폴리아르기닌(polyarginine) 세포투과 펩타이드(cell-penetrating peptides, CPPs)를 재조합 Cre 재조합효소(Cre recombinase)에 발현 단백질 라이게이션(expressed protein ligation, 이하 EPL이라 함) 기법으로 접합하여 세포투과성 Cre 재조합효소를 제조하였다. EPL은 N-말단 시스테인을 지닌 합성 펩타이드를 단백질의 C-말단 thioester에 자연적 화학 라이게이션(native chemical ligation) 반응으로 접합하는 반합성 기법이다.
Cre-intein-His 단백질로부터 인테인(intein)에 의해 매개되는 절단 반응으로 Cre-thioester를 제조하였다. 또한 한 반응기에서 두 반응(one-pot two-step reaction)을 수행하여 Cre-intein-His으로 부터 접합 산물(ligation product)인 Cre-R9을 직접 제조함으로써 thiol 촉매재로 사용된 2-mercaptoethanesulfonate (MESNA)이 단백질 활성에 미칠 수 있는 잠재적인 영향을 최소화하였다. 세포에 Cre 단백질을 처리한 후 세포 내로 도입된 Cre에 의해 작동되는 재조합 산물을 측정하는 분석기법을 수행한 결과, EPL 반합성 기법으로 제조된 Cre-R9 단백질(ssCre-R9)이 대장균으로부터 재조합 융합 단백질 형태로 생산된 TAT-Cre 또는 Cre-R11 보다 우수한 재조합 활성을 세포에서 보여주었다. EPL 기법을 사용하면 D-아미노산이나 비천연 아미노산들을 재조합 단백질에 접합시킬 수 있다.
본 발명에서는 폴리-D-아르기닌 CPP이 접합되어 있는 Cre 단백질(ssCre-dR9)을 EPL 기법으로 제조하였다. 폴리-D-아르기닌 펩타이드가 폴리-L-아르기닌 펩타이드 보다 단백질 전달능이 높다는 연구 결과가 있었으며, 본 발명에서는 세포 내로 전달되는 효율에 있어 ssCre-dR9이 ssCre-R9 보다 활성이 높은 것으로 측정되었다. 이 결과로부터 크기가 큰 단백질을 세포 내로 전달하는 과정에서도 폴리-D-아르기닌 CPP가 폴리-L-아르기닌 CPP 보다 효율이 높음을 확인할 수 있었다. 비오틴은 이비딘(avidin)과 높은 특이성과 친화력으로 결합하여, 세포를 이미징하기 위한 소자로 사용된다. 본 발명에서는 폴리-D-아르기닌 CPP와 비오틴(biotin)이 접합되어 있는 Cre 단백질(ssCre-dR9-biotin)을 EPL 기법으로 제조하였다. ssCre-dR9-biotin은 ssCre-dR9과 유사한 세포 투과력을 보여주었다. 그리고 아비딘-FITC를 사용한 형광염색기법으로 ssCre-dR9-biotin이 도입된 세포를 이미징하였다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
Cre-intein-His 단백질은 E.coli에서 발현하여 Ni-아가로스 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 본 발명자들은 MESNA를 사용한 intein-매개 분열에 의해 Cre-티오에스터를 만든 후에 자연형 화학적 라이게이션(native chemical ligation)에 의해 CGSGG-R9 또는 CGSGG-dR9와 Cre-티오에스터를 접합하였다. 본 발명자들은 Cre 활성에 대한 MESNA의 잠재적인 부작용을 최소화하기 위해서 intein-매개 분열 반응과 자연형 화학적 라이게이션 반응 조건을 최적화하였다. 첫째, 반응은 4℃에서 수행하였으며 intein-매개 분열 반응을 수행하는 최소 농도의 MESNA를 선정하였다. intein-매개 분열 반응은 50mM MESNA로 4℃에서 24시간 동안 반응하는 조건으로 최적화되었다. 이 조건 하에서, 95% 이상의 Cre-intein-His 단백질은 Cre와 intein-His로 분열되었다.(도 1)
두 번째로, 본 발명자들은 Cre-intein-His 단백질을 Cre-R9 라이게이션 산물로 직접 변환하기 위한 한 반응기에서 두 반응(one-pot two-step)을 고안하였다. 티올(thiol) 시약에 의한 intein-매개 분열 반응은 가역반응이며, 펩타이드의 N-말단 시스테인의 티올 그룹과 Cre-티오에스터 간의 트랜스티오에스터화 (transthioesterification) 반응도 가역 반응이다. 반면에, 라이게이션 부위에서 아미드 결합을 생성하는 자발적으로 일어나는 분자 내 S→N 아실 이동, 즉 자연형 화학적 라이게이션의 마지막 반응은 비가역반응이다. 이러한 마지막 아미드 형성 반응의 비가역성은 intein-매개 분열 반응과 자연형 화학적 라이게이션 반응이 한 반응기에서 진행됨과 동시에 최종 라이게이션 산물을 고수율로 생산하는 한 반응기에서 두 반응(one-pot two-step) 진행을 가능하게 한다. 본 발명자들은 한 반응기에서 두 반응 EPL을 pH 8.0, 4℃에서 24시간 동안 2 mg/ml의 Cre-intein-His, Cre-intein-His에 비해 10배 과량의 CGSGG-R9 그리고 50 mM MESNA, 50mM NaH2PO4, 250mM NaCl 존재 하에 수행하였다.
마지막으로, intein-His 단백질, MESNA 및 CGSGG-R9는 Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피에 의해 최종 라이게이션 산물로부터 제거되었다. 일반적으로, 84%의 Cre는 Cre-R9으로 컨주게이션되며, Cre-R9의 최종 수율은 20mg Cre-intein-His 단백질로부터 2mg을 상회하였다. 본 발명자들은 EPL로부터 생산된 최종 Cre-R9 산물을 반합성 Cre-R9(ssCre-R9)로 이름붙였다.
본 발명자들은 발현된 단백질 라이게이션에 의한 R9 펩타이드의 컨주게이션 이후에도 Cre 단백질이 활성을 여전히 유지하는지 여부에 대해 확인하였다. 대조군 Cre 단백질은 MESNA 대신 DTT를 사용한 intein-매개 분열에 의해 생성하였다.
floxed-Kmr이 삽입된 선형화된 pGEM-T로부터 원형 Kmr이 Cre의 부위-특정 재조합에 의하여 방출되는 정도를 측정하여 Cre 효소 활성을 분석하였다.(도 2) 대조군 Cre와 ssCre-R9 둘 다에서 최대 활성은 80ng에서 관찰되었다. 이 결과는 EPL에 의한 Cre와 CGSGG-R9의 컨주게이션은 Cre의 효소 활성을 손상시키지 않음을 나타낸다.
세포 투과 Cre 단백질을 만들기 위한 반합성 방법을 개발하는 데 있어 주요 쟁점 중 하나는 반합성 과정 도중에 세포-투과 Cre 단백질의 기능이 유지되는지 여부이다. 인간 TE671(LoxP-LacZ) 세포에는 게놈 내에 loxP-STOP-loxP LacZ 리포터 유전자가 삽입되어 있으며, 이들은 Cre 단백질의 세포적 흡수(cellular uptake), 준세포 지역화(subcellular localization) 및 핵에서의 효소 활성 평가를 가능하게 한다. 이 시스템에서 점수를 획득하기 위해, 외인성 Cre단백질이 세포 내로 들어가고, 핵으로 위치를 옮기며 두 개의 loxP 위치에서 재조합에 의해 STOP 서열을 제거하는 것이 필요하다. 대조군 Cre(R9-CPP 마이너스)로 처리될 때, β-gal 염색 양성 세포가 거의 관찰되지 않는다.(도 3 및 4) 반면에, ssCre-R9의 처리는 용량 의존적으로 β-gal 염색 양성 세포 수를 증가시킨다. EC50app 값은 40㎍/ml (1.0 μM) 로 측정되었다. 실제로 80 ㎍/ml에서는 100%의 세포가 β-gal 염색에 양성을 보인다.
ssCre-R9는 세포로의 수송 또한 빠르며, 60㎍/ml ssCre-R9을 1시간 동안 처리하였을 때 58%의 세포가 β-gal 염색에 양성 반응을 보였다.(도 5 및 6) ssCre-R9는 160㎍/ml까지는 세포 독성을 나타내지 않았다.
본 발명에서 시료로 사용된 ssCre-R9에서 R9으로 컨주게이션된 Cre의 비율은 84%였으며, 이를 고려하면 ssCre-R9의 EC50은 34㎍/ml(0.85μM)이다. E.coli로부터 재조합 융합 단백질로 정제된 TAT-Cre와 Cre-R11은 상업적으로 이용 가능하며, TAT-Cre와 Cre-R11의 세포투과 효율을 동일한 조건에서 ssCre-R9과 직접 비교하였다. TAT-Cre의 EC50은 42㎍/ml(1.02μM)로 측정되었으며, Cre-R11의 세포투과 효율은 매우 낮아 EC50을 측정하지 못하였다. 이러한 결과는 ssCre-R9가 재조합 TAT-Cre 또는 Cre-R11 융합 단백질보다 세포 내 수송에 유의미하게 더 효과적임을 나타낸다.
형광 탐지자로 표지된 D-이성체 R9 펩타이드는 세포적 흡수에 있어서 L-이성체보다 Km 값이 5배 더 낮다. 그러나, CPP의 세포 흡수 기전은 운반화물의 크기 및 성질에 따라 매우 다양하며, 크기가 큰 단백질의 수송에 있어서 D-이성체 폴리아르기닌 CPP가 L-이성체 폴리아르기닌 CPP에 비해 더 잘 작용하는지에 대해서는 아직 엄밀하게 확인되지 않았다. 본 발명자들은 EPL로 D-이성질체 R9 펩타이드가 Cre에 접합되어 있는 융합체(ssCre-dR9)를 생산하였다. ssCre-dR9은 ssCre-R9와 비슷한 순도와 수율로 생산되었다. ssCre-R9와 ssCre-dR9의 세포 투과 능력을 비교하기 위해서, 본 발명자들은 ssCre-R9와 ssCre-dR9를 인간 TE671(loxP-LacZ)에 처리했으며, 세포 투과된 Cre 단백질에 의한 재조합 이벤트를 점수로 매겼다(도 3 및 4). 20㎍/ml 이하의 농도에서는 ssCre-R9 및 ssCre-dR9는 동등하게 효과적이지 않았다. 그러나 β-gal 염색 양성 세포의 처리 단백질에 대한 용량 의존적 증가의 기울기는 ssCre-dR9가 ssCre-R9보다 가파르게 관찰되었다. 그 결과 ssCre-dR9의 EC50app는 34㎍/ml로 그리고 ssCre-R9의 EC50app는 40㎍/ml로 측정되었다. 본 발명에서 시료로 사용된 ssCre-R9과 ssCre-dR9에서 R9 또는 dR9으로 컨주게이션된 Cre의 비율이 각각 84%임을 고려하면 ssCre-R9의 EC50은 34㎍/ml(0.85μM) 그리고 ssCre-dR9의 EC50은 29㎍/ml (0.73μM)이다.
본 발명자들은 D-이성체 R9 펩타이드와 L-이성체 R9 펩타이드 간 Km의 차이처럼 현저하게 크지는 않지만 ssCre-dR9의 EC50가 한결같이 ssCre-R9의 EC50에 비해 10% 이상 낮음을 발견했다. 두 가지 이성체 R9 펩타이드 간 Km의 차이는 펩타이드를 3℃에서 240초 동안 세포에 처리한 후, 세포에 트립신을 처리한 다음 세포내로 흡수된 펩타이드의 형광을 FACS로 측정한 결과이며, 이 방법은 세포막에 위치하거나 엔도좀에 의해 잡히는 펩타이드로부터 세포질로 수송되는 펩타이드를 구별할 수 없다. 따라서 운반화물의 크기 및 성질 뿐 아니라 세포-투과 활성에 대한 분석 방법의 차이는 D-이성체 R9 펩타이드와 L-이성체 R9 펩타이드 간 Km 값 차이의 크기와 ssCre-R9과 ssCre-dR9 간 EC50 값 차이의 크기에서 나타난 불일치를 설명할 수 있을 것이다. 결론적으로 EC50 값에서 세포-투과 능력이 10%이상 높은 D-이성체 R9 펩타이드가 접합된 Cre 융합체를 생산하였다.
아르기닌이 풍부한 CPP의 구아니듐 그룹은 음전하로 대전된 막의 지질 구성물과 이좌 배위 결합을 형성하고 음성 고시안(Gaussian) 막 만곡(curvature)을 만드는데, 이는 막 구조를 mesh phase로 일시적이고 역동적인 위상 변화를 유도한다. CPP는 상 전이 동안에 적응하는 위치 변화를 거쳐 막의 내부 표면으로 위치가 변한다. 그래서, 막 만곡의 엔지니어링이 CPPs의 세포적 흡수를 촉진하는 방안이 될 수 있다. 특히, 양성 만곡을 유도하는 Epsin N-말단 펩티드 1-18(EpN 18)은 R8 펩타이드의 세포 내로의 위치 전이를 촉진한다. 그러나 크기가 큰 단백질 운반화물을 전달하는 CPP의 세포 투과 능력에 대한 막 만곡의 영향은 아직 밝혀지지 않았다.
본 발명자들은 ssCre-R9와 ssCre-dR9를 인간 TE671(LoxP-LacZ) 세포에 EpN18의 존재 하에 처리하였으며 세포 내로 전달된 Cre 단백질에 의한 재조합 이벤트를 측정하였다. EC50app 근처 농도인 40㎍/ml로 ssCre-R9 또는 ssCre-dR9를 처리한 세포에 EpN18를 같이 처리한 경우, EpN18은 β-gal 염색 양성 세포를 용량의존적으로 증가시켰다. EpN18의 촉진 효과는 10μM에서 관찰되기 시작했으며, 40㎍/ml ssCre-dR9과 80μM EpN18를 동시에 처리한 경우 β-gal 염색 양성 세포는 94%에 달했다. EpN18의 촉진 효과는 ssCre-R9 및 ssCre-dR9의 차선 농도(20㎍/ml)로 처리된 세포에서 또한 관찰되었다. 그러나 이 경우에, EpN18의 촉진 효과는 40 및 80μM 같은 더 높은 농도에서만 확실히 나타났다. EpN18이 세포에 독성이 없기 때문에, EpN18은 단백질 형질도입이 잘 되지 않는 세포 유형에 대한 촉진제로 유용할 수 있다.
치료용 세포투과 단백질로 형질도입된 세포의 이미징은 치료 효과를 평가하는데 유용하다. 형광소자는 화학적 기법으로 합성된 폴리펩타이드에 쉽게 삽입할 수 있으므로, 형광소자로 표지된 세포투과 단백질은 반합성 EPL 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명자들은 dR9과 비오틴(biotin)으로 구성된 폴리펩타이드를 합성하여 EPL 방법으로 Cre에 접합시켜 ssCre-dR9-biotin 융합체를 생산하였다.
ssCre-dR9-biotin은 ssCre-dR9과 비슷한 순도와 수율로 생산되었다.
ssCre-dR9-biotin의 EC50은 40㎍/ml으로 측정되어 ssCre-dR9의 세포투과 능력과 유사하였다. 세포 내로 전달된 ssCre-dR9-biotin을 이미징하기 위하여 ssCre-dR9-biotin을 세포에 5시간 처리한 후, 세포를 아비딘-FITC(avidin-FITC)로 염색하여 공초점 형광 현미경으로 관찰하였다. 대조군 세포에서는 형광염색이 관찰되지 않는 반면 ssCre-dR9-biotin을 처리한 세포에서 세포질과 핵에서 형광염색이 확실히 관찰된다. 비오틴 대신 Cy7과 같은 근적외선(near-infrared) 형광소자가 삽입된 폴리펩타이드를 EPL에 사용한다면 in vivo 비침윤성 이미징이 가능한 세포투과 단백질 생산이 가능할 것으로 기대된다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 신규한 융합체 및 이의 제조 방법을 통해 기존 방법의 생산 수율 문제를 극복하였으며 기존의 방법보다 더 좋은 세포투과 활성을 갖는 반합성 단백질을 제공함과 동시에 세포 이미징 능력 등 더 정교한 성질을 가지는 세포투과 단백질을 만들 수 있는 효과가 있다.
도 1은 EPL에 의한 Cre-R9의 반합성을 나타낸 그림.
도 2는 EPL 이후 Cre-R9 의 활성을 나타낸 그림.
도 3-4는 반합성 Cre-R9 및 Cre-dR9의 단백질 형질도입을 나타낸 그림. 도 3은 floxed STOP 카세트와의 Cre-매개 재조합이 인간 TE671(LoxP-LacZ) 세포에서 LacZ 발현을 유도함을 나타낸 그림. 도 4는 다양한 농도의 인자에 노출 시 LacZ-발현 세포의 퍼센티지를 X-gal 염색에 의해 확인한 결과를 나타낸 그림.
도 5 및 6은 인간 TE671(LoxP-LacZ) 세포에서 1시간의 외인성 ssCre-R9와 배양이 Cre-매개 재조합에 충분함을 나타낸 그림.
도 7 및 8은 EpN18에 의한 ssCre-R9 및 ssCre-dR9의 형질도입의 향상을 나타내는 그림. 도 7은 Cre가 20㎍/ml인 경우, 도 8은 Cre가 40㎍/ml인 경우의 결과를 나타낸 그림.
도 9는 형질도입된 ssCre-dR9-biotin을 avidin-FITC로 형광염색하여 공초점 형광현미경으로 관찰한 그림.
이하 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1. 펩타이드(Peptides)
CGSGG-R9[NH2-Cys-Gly-Ser-Gly-Gly-(Arg)9-amide], CGSGG-dR9 [NH2-Cys-Gly-Ser-Gly-Gly-D(Arg)9-amide], EpN18 및 dR9-biotin [NH2-Cys-Gly-Ser-Gly-Gly-D(Arg)9-Gly-Lys(biotin)-amide]는 Peptron Inc.에 의해 합성되고 제공되었다. 펩타이드는 고압력 액체크로마토그래피에 의해 순도 90% 이상으로 정제되었고, 질량 분석에 의해 확인하였다.
실시예 2. Cre-intein 융합 단백질의 준비
Cre 재조합효소 cDNA는 pBS185CMV-Cre (Addgene)로부터 연속적인 증폭에 의해 얻어지는데, 이 때 포워드 프라이머로 5-GAG CAT ATG TCC AAT TTA CTG ACC GTA CAC-3(서열번호 3), 리버스 프라이머로 5-GTA CTC GAG ATC GCC ATC TTC CAG GAC-3(서열번호 4) 및 5-GCG TGC TCT TCC GCA GTA CTC GAG ATC GCC ATC-3(서열번호 5)를 사용하였다. 증폭된 cDNA는 pTWIN_His 벡터(Jena Bioscience)의 Nde I 및 Sap I으로 삽입되어 Cre, mini-intein(Mycobacterium Xenopi gyrase A, Mxe GyrA 유래)과 6x His-tag이 융합되어 있는 Cre-intein-His에 대한 발현 플라스미드를 만든다. Leu-Glu-Tyr은 Cre와 intein 사이로 삽입되어 intein-매개 분열을 촉진시킨다. Cre-intein-His 융합 단백질을 코딩하는 pTWIN_Cre 플라스미드는 E.coli BL21(DE3)으로 변형되고 Cre-intein-His는 1mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)에 의해 3시간 동안 37℃에서 처리되는 것에 의해 유도된다. E.coli는 원심분리에 의해 수확되며, 용해 완충용액(20mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM 이미다졸, pH8.0)에 의해 재현탁되고, 1mg/ml 라이소자임으로 30분 간 얼음 위에서 처리된 후 초음파 처리에 의해 용해된다. 용해가능한 상층액은 10,000 x g 원심분리에 의해 수집되고 4℃에서 1시간 동안 Ni-NTA 수지(Qiagen)과 함께 혼합된다. 수지 슬러리는 컬럼에 팩킹된 후 컬럼 부피의 5배 되는 세척 완충용액(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 50mM 이미다졸, pH8.0)으로 세척한다. Cre-intein-His 단백질은 용리 완충용액(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸, pH8.0)으로 수지로부터 추출된다. Cre-intein-His 단백질을 포함하는 분획은 결합되고 분열 완충용액(50mM NaH2PO4, 250mM NaCl, pH8.0)에 대해 4℃에서 밤새 투석된다.
실시예 3. Intein-매개 분열 및 Cre-티오에스터와 폴리아르기닌 폴리펩타이드와의 라이게이션(ligation)
Cre-티오에스터를 생성하기 위한 intein-매개 분열 및 Cre-티오에스터와 폴리아르기닌 폴리펩타이드의 라이게이션은 동시에 진행된다. 분열 완충용액(50mM NaH2PO4, 250mM NaCl, pH 8.0) 내의 Cre-intein-His 단백질은 10 molar 과량의 CGSGG-R9 또는 CGSGG-dR9와 함께 4℃에서 24시간 동안 50mM 머캅토에탄술포네이트(MESNA) 존재 하에서 배양된다. Cre-intein-His와 intein-His 단백질로부터 Cre-R9를 분리하기 위해서, 반응 혼합액은 용해 완충액으로 평형이 이루어진 Ni-NTA 컬럼에 로딩되었으며 통과액 분획은 결합되었다. Cre-R9는 최종 농도가 10mM이 되도록 DTT(Dithiothreitol)로 처리되어 얼음 위에서 30분간 배양한 후 Pierce concentrator 9K(Thermo)를 사용하여 4℃에서 농축하였다. 저장 완충용액(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 1mM DTT, pH 8.0)으로 평형을 맞춘 Sephadex G25 Fine 수지(GE Healthcare)로 패킹된 스핀 컬럼에 의해 Cre-R9로부터 반응하지 않고 남아있는 MESNA 및 펩타이드를 제거한다.
실시예 4. 세포 배양
인간 TE671(LoxP-LacZ) 세포는 Allele Biotech로부터 구입하였다. 세포는 10% 우태아혈청, 100U/ml 페니실린 G, 100μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM)에서 5% 습한 CO2 배양 환경에서 배양시켰다.
실시예 5. 단백질 형질도입 분석
Cre-R9 내재화 및 재조합 속도를 측정하기 위하여, 인간 TE671(LoxP-LacZ) 세포는 7x103 세포/웰로 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 1일 후에, 세포는 OPTI-MEM(Gibco)로 한 번 세척하였고, Cre 단백질을 포함하는 OPTI-MEM 300㎕에서 5시간 동안 배양시켰다. 배지는 10% 우태아혈청을 함유하는 DMEM으로 교체되었으며 그 다음 세포는 43시간 동안 더 배양시켰다. Cre 단백질에 의한 LoxP 부위에서의 재조합은 LacZ 효소 분석에 의해 측정하였다. 세포는 차가운 PBS로 두 번 세척한 후에 고정 용액(1% 포름알데히드, PBS에 녹인 0.2% 글루타랄데히드)으로 실온에서 5분간 고정시켰다. 세포는 PBS로 3번 세척한 후 X-gal 염색 용액(4mM K-페로시아나이드, 4mM K-페리시아나이드, 2mM 염화마그네슘, PBS에 녹인 0.4mg/ml X-gal) 300㎕와 함께 밤새 37℃에서 배양하였다.
재조합 융합 단백질로 정제된 TAT-Cre와 Cre-R11은 EMD Millipore와 LD Biopharma에서 구매하였다.
실시예 6. 인 비트로 Cre 활성 분석
0.3㎍의 선형화된 pGEM-T(floxed-Kmr)을 함유하는 반응 완충용액(50mM Tris-HCl, 33mM NaCl, 10mM MgCl2, pH 7.5) 50㎕에 Cre 단백질을 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. Cre는 10분간 70℃에서 배양에 의해 열-불활성화시켰다. 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의해 단백질로부터 DNA를 분리한 후에, DNA는 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다.
실시예 7. 형광 이미징
젤라틴으로 피복된 커버 유리 위에 배양된 인간 TE671세포를 80 μg/ml Cre 단백질을 포함하는 OPTI-MEM에서 5시간 동안 배양한다. 세포를 PBS로 세 번 세척한 후 상온에서 3.7% (v/v) 파라포름알데히드로 30분간 고정한다. 세포를 avidin-FITC, 항 avidin-biotin 항체, avidin-FITC로 상온에서 30분간 차례로 처리한다. PBS로 녹인 90% 글리세롤, 0.1% o-phenylenediamine 용액으로 커버 유리를 현미경 슬라이드에 부착한 후 공초점 현미경으로 관찰한다.

Claims (12)

  1. a) 융합파트너 단백질과 미니-인테인 융합체를 제조하는 단계; 및
    b) 상기 융합체를 세포투과 펩타이드(CPP)와 반응시켜서 융합파트너 단백질과 CPP의 융합체를 제조하는 단계를 포함하는 융합파트너 단백질과 CPP의 융합체 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 융합파트너 단백질은 Cre 단백질, 전사인자,CRISPR-관련 단백질(associated protein) 9, 또는 단일 도메인 항체인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Cre 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고, 상기 미니-인테인(mini-intein)은 서열번호2의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 CPP는 N-말단에 L-이성체 시스테인 또는 D-이성체 시스테인이 위치하고 L-이성체 아미노산, D-이성체 아미노산, 또는 L-이성체 아미노산과 D-이성체 아미노산의 조합으로 구성된 폴리펩타이드를 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 CPP는 6개로부터 15개의 아르기닌으로 구성된 폴리아르기닌 폴리펩타이드, TAT, 페네트라틴(Penetratin), 단백질 트랜스덕션 도메인(protein transduction domain) 4, 단백질 드린스덕션 도메인 5, FHV Coat-(35-49), BMV Gag-(7-25), HTLV-II Rex-(4-16), SynB1, SynB3, 아르기닌과 라이신의 조합으로 구성된 폴리펩타이드, 및 폴리구아니딘 펩토이드(polyguanidine peptoid)로 구성된 군으로부터 선택된 CPP인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 CPP는 폴리펩타이드에 비천연아미노산, 형광소자, 또는 비오틴이 삽입되어 있거나 삽입되어 있지 않은 폴리펩타이드를 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항의 제조방법에 의하여 제조된 융합파트너 단백질과 CPP의 융합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 융합파트너 단백질은 Cre 단백질, 전사인자,CRISPR-관련 단백질(associated protein) 9, 또는 단일 도메인 항체인 것을 특징으로 하는 융합체.
  9. 제7항에 있어서, 상기 CPP는 N-말단에 L-이성체 시스테인 또는 D-이성체 시스테인이 위치하고 L-이성체 아미노산, D-이성체 아미노산, 또는 L-이성체 아미노산과 D-이성체 아미노산의 조합으로 구성된 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 CPP는 6개로부터 15개의 아르기닌으로 구성된 폴리아르기닌 폴리펩타이드, TAT, 페네트라틴(Penetratin), 단백질 트랜스덕션 도메인(protein transduction domain) 4, 단백질 드린스덕션 도메인 5, FHV Coat-(35-49), BMV Gag-(7-25), HTLV-II Rex-(4-16), SynB1, SynB3, 아르기닌과 라이신의 조합으로 구성된 폴리펩타이드, 및 폴리구아니딘 펩토이드(polyguanidine peptoid)로 구성된 군으로부터 선택된 CPP인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 상기 CPP는 폴리펩타이드에 비천연아미노산, 형광소자, 또는 비오틴이 삽입되어 있거나 삽입되어 있지 않은 폴리펩타이드를 특징으로 하는 조성물.
  12. 제7항의 융합체를 포함하는 세포 투과용 조성물.
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