WO2016036060A1 - 신규 세포막 투과 펩티드 및 생리활성 물질 전달체로서의 그의 용도 - Google Patents

신규 세포막 투과 펩티드 및 생리활성 물질 전달체로서의 그의 용도 Download PDF

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WO2016036060A1
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cell membrane
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seq
cell
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이주형
서창환
김주열
김상욱
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디오셀 주식회사
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    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
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    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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Definitions

  • the present invention is a novel peptide that penetrates the cell membrane of eukaryotic cells and penetrates the cell membrane through which various substances are difficult to be delivered into the cell, and thus plays a pivotal role in the cell membrane lysis of the melittin peptide.
  • a similar amino acid sequence was developed from the melittin peptide C-terminal amino acid sequence.
  • the developed peptides are peptides that act as a transporter that effectively delivers various bioactive substances through the cell membrane and into the cell.
  • the peptides are difficult to be transferred to the cell through the present invention, they are difficult to be used as useful materials for humans. It is expected to effectively deliver various bioactive substances in vivo and use them to develop and use products useful for humans such as pharmaceuticals, cosmetics and functional products.
  • the cell membrane of eukaryotic cells is composed of double lipid membranes to protect the substances inside the cell and control the influx of substances from the outside or the movement of the substances inside.
  • hydrophilic substances such as nucleic acids, which are active substances in vivo, and molecules having large and surface charges, such as proteins and peptides
  • hydrophilic substances such as nucleic acids, which are active substances in vivo
  • molecules having large and surface charges, such as proteins and peptides is almost impossible without organized and systematic mechanisms with specific substances such as receptors on the cell membrane surface.
  • a carrier capable of effectively delivering these hydrophilic or large substances into the cell could be used to develop new drugs or products useful for the myriad of undeveloped intracellular materials.
  • HIV-1 Human immunodeficiency virus, type 1
  • Tat protein could be introduced into mammalian cells
  • a number of new cell membrane penetrating peptides have been developed, namely peptides consisting of about 20 short amino acids that can penetrate cell membranes and transfer substances into cells, as protein delivery region PTDs or cell penetrating peptides CPPs.
  • PTDs include Tat-PTD found from HIV-1 Tat protein (Documents 2 and 3) (Tat_49-57, SEQ ID NO: RKKKRRQRRR), Antp derived from the Drosophila Antennapedia homeodomain protein (Antennapedia_43-58, SEQ ID NO: RQIKIWFQNRRMKWKKK) ), VP22 derived from the Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) VP22 protein (VP22_267-300, SEQ ID NO: DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE), and Poly-arginine (R9, RRRRRRRRR) developed from an artificial sequence.
  • a common feature of these is that cationic amino acids are composed of high proportions.
  • membrane transmembrane peptides mainly composed of hydrophobic peptides
  • MTS Membrane-Translocating Sequence
  • MTS consists of 16 amino acids derived from human FGF-4 protein and consists mainly of hydrophobic amino acids (SEQ ID NO: AAVALLPAVLLALLAP).
  • Hydrophobic peptides are known to have a mechanism for transmitting substances directly into the cytoplasm through the hydrophobic region inside the double lipid membrane constituting the cell membrane.
  • cell-penetrating peptides have been developed from various proteins of various species, and artificial membranes have been designed to develop cell-penetrating peptides.
  • PTD originates from the functional aspect that penetrates the cell membrane, and is mostly derived from materials that must function through the cell membrane, such as viruses or toxins.
  • PTDs derived from non-human species may cause safety issues, such as immune responses or toxicity, in the development of useful substances such as pharmaceuticals that will be applied to humans in the future.
  • Melittin (Gene ID: 406130) peptide is a major toxic peptide that accounts for more than 50% of Apitoxin constituents and is known to be toxic through strong hemolysis. More specifically, the mechanism of action is known to first bind to polysaccharide or phosphorylation site of the cell membrane surface and then penetrate the cell membrane double lipid membrane to penetrate the N-terminal hydrophobic peptide to form a hole and lyse the cell. It also binds with Phospholipase A2 protein, inhibiting transport pumps such as Na + -K + -ATPase and H + -K + -ATPase, increasing the cellular penetration of ions such as Na + and Ca2 +.
  • LayN peptide amino acid sequence was derived from the amino acid sequence of a human protein called Layilin.
  • Layilin protein is a membrane protein that functions as a hyaluronic acid receptor. It consists of extracellular domain, transmembrane region (SEQ ID NO: 5), and cytoplasmic domain from the N-terminus.
  • the LayN peptide was identified as the most ideal sequence in which the serine was substituted with 259 cysteine from 10 amino acids (SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NOs: 257 to 266 derived from Layilin protein (SEQ ID NO: 1).
  • the present invention provides a variety of biologically active substances that can function inside the cell to penetrate the cell membrane to be delivered to the inside of the cell is difficult to deliver the use of the difficult to develop and difficult to solve the problem of delivering these biologically active substances into the cell It is an object of the present invention to provide novel cell membrane penetrating peptides.
  • the cell membrane-penetrating peptide developed through the present invention is derived from the amino acid sequence constituting the human protein is expected to ensure higher safety in the development of useful substances, such as pharmaceuticals, cosmetics for humans in the future.
  • the inventors have developed a novel cell permeable peptide sequence by searching for amino acid sequences of peptides having the ability to penetrate cell membranes.
  • the problem solving means for this invention is as follows.
  • Melittin peptides are the major peptides, accounting for at least 50% of the Apitoxin components.
  • Melittin is a peptide consisting of 26 amino acids in which 20 amino acids from the N-terminus are mainly hydrophobic amino acids and 6 C-terminal amino acids are hydrophilic amino acids.
  • Melittin is known to be toxic through hemolytic action by breaking down the cell membrane of red blood cells. It is known that the main mechanism of action is that alpha-helix peptide penetrates the double lipid membrane and forms a hole to lyse cells after binding to polysaccharide or phosphorylation site on the cell membrane surface.
  • the present inventors noted the ability to penetrate the double lipid membrane by binding to the cell membrane, aside from other mechanisms of melittin. Similar sequences were searched from the amino acid sequences of human proteins using 12 amino acids, including 6 C-terminal amino acids, which play the most important role in the hemolytic function of melittin peptides.
  • Example 1 the National Center for Biotechnology Information, USA, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (Basic Local Alignment Search Tool) BLAST (67% or more) matched as described in Example 1. More than 100 similar amino acid sequences were obtained, and several candidate sequences were obtained from the content and arrangement of the cationic amino acids arginine, lysine and anionic amino acids aspartic acid and glutamic acid. Among them, the peptide sequence having the best cell membrane permeability was finally identified.
  • the final cell membrane penetrating peptide was obtained from 10 amino acid sequences consisting of amino acid sequences 257 to 266 of Layilin (Gene ID: 143903) protein, known as hyaluronic acid receptor, and obtained 259 cysteine to prevent dimer formation between peptide molecules.
  • the final cell membrane penetrating peptide sequence was determined in the form of serine substitution and named LayN peptide (SEQ ID NO: 1).
  • LayN peptide where X1 is a form consisting of cysteine, a circular sequence of Layilin protein amino acid sequence, amino acid serine substituted therein, and alanine without functional groups on the side, and amino acids X2 to X6 are represented by arginine and Cationic amino acids composed of lysine, amino acids of X7 to X8 is a sequence composed of anionic amino acid forms such as glutamic acid, aspartic acid, glutamine, asparagine.
  • LayN cell membrane-penetrating peptides can be used as peptides that mimic the function of melittin by binding to the transmembrane region (amino acids 236-256) of Layilin protein.
  • the amino acids of the cell membrane-penetrating peptides developed are L- and D-forms. Both amino acids can be used and the forward and reverse sequences of the amino acid sequence will retain cell membrane permeability.
  • the cell membrane penetrating peptide used in the Example was confirmed by using the LayN peptide of SEQ ID NO: 1 and confirmed the efficacy of delivering protein and nucleic acid (siRNA) into the cell as a cargo (Cargo) through the Example.
  • the toxicity of the peptide was confirmed in various human cell lines, and it was confirmed by performing at a peptide concentration of 1.5 ⁇ M or less without any problem in cytotoxicity.
  • Cell penetrating peptides developed through the present invention binds to the cargo material and acts as a carrier for delivering the material into the cell, so the binding cargo material can be used without particular limitations such as proteins, nucleic acids, compounds, minerals, and cargo material. It aims to be delivered inside the cell by a cell penetrating peptide without reaction with other carriers or cell membrane receptors in vivo.
  • the peptide developed through the present development is a cell membrane-penetrating peptide derived from the amino acid sequence constituting the human protein, which will ensure safety in the development of useful products and technologies to be applied to humans in the future.
  • FIG. 1 is an experimental data comparing the intracellular permeability of the cell permeation peptide LayN with the cell permeability efficacy of the R9 peptide using flow cytometry (FACS), where A is the untreated group, B is the R9 peptide, and C is the LayN peptide treatment group. .
  • Figure 2 is an experimental data confirming the cell permeability according to the concentration of cell permeation peptide LayN in HEK293 cells, the adherent cells using a flow cytometer, A is a non-peptide group, B is a 0.2 ⁇ M concentration peptide, C is a 1.0 ⁇ M concentration peptide treatment It's a military.
  • A is a peptide-free group
  • B is a 0.2 ⁇ M concentration peptide
  • C is a 1.0 ⁇ M concentration peptide It's a treatment group.
  • FIG. 4 is a photograph confirming the protein delivery efficiency by X-gal staining as an experiment confirming that the beta-galactosidase protein is bound to the cell-permeable peptide LayN in a bound form.
  • Figure A is a schematic diagram of the beta-galactosidase fusion protein structure bound to the LayN peptide, which is bound to His-Tag (H6), LayN peptide, and beta-galactosidase for purification from the N-terminus.
  • Figure B shows the H6-LayN- ⁇ -Gal fusion protein prepared above as introduced into human embryonic kidney HEK293 cells at a concentration of 0.1 to 1.5 ⁇ M and confirmed the delivery efficiency of the protein through X-gal staining.
  • FIG. 5 is a data confirming that the expression of the LacZ gene is inhibited in the human embryonic kidney cell line HEK293 cells transformed with the pcDNA3.1 / LacZ vector by binding the membrane transmembrane peptide LayN and LacZ siRNA by electrostatic attraction.
  • Figure A is a schematic of the binding of LayN peptide dimer (LayN-D) and siRNA by electrostatic attraction.
  • Figure B shows the degree of binding according to the N / P ratio of the siRNA and LayN peptide dimers on the agarose gel. The first column is the DNA size ladder and the second column is the negative control treated with siRNA only. The band on the gel indicates the size and relative amount of unbound free siRNA.
  • the third to sixth columns are data when the N / P ratios are mixed at 2.0, 1.0, 0.5, and 0.1, respectively.
  • the amount of siRNA was used fixed at 50 nM.
  • Figure D shows the beta-galactosidase assay and quantifies and plots C.
  • Figure 6 is a data confirming the different toxicity of the cell membrane penetrating peptide LayN in different cells.
  • the cytotoxicity of LayN peptide was confirmed in human embryonic kidney cell line HEK293 cells, human cervical cancer cell line HeLa cells, human acute lymphoid leukemia cell line Jurkat T cells, and human keratinocyte cell line HaCaT cells, respectively. Each cell was incubated for 16 hours by dispensing 1 x 10 4 cells in a 96-well plate, and then treated with LayN peptide at concentrations of 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, and 2.0 ⁇ M, followed by 3 additional hours of WST. Absorbance was measured and analyzed at 420-480 nm using the -1 reagent.
  • Figure 7 is a schematic diagram of the mechanism by which the newly developed cell membrane penetrating peptides permeate the cell membrane by binding to the cargo (Cargo) material.
  • Path A is a mechanism that is delivered to the cell through endocytosis after adsorption on the cell membrane surface
  • Path B is a schematic diagram of the mechanism that is directly transferred to the cytoplasm after the adsorption to the cell membrane.
  • DNA Deoxyribonucleic acid
  • RNA Ribonucleic acid
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • Example 1 An effective cell penetrating peptide sequence was searched using BLAST search.
  • NCBI National Center for Biotechnology
  • the final LayN peptide was obtained from 10 amino acid sequences between 257 and 266 of the Layilin (Gene ID: 143903) protein, known as the hyaluronic acid receptor, and substituted cysteine 259 with serine to prevent dimer formation between peptide molecules.
  • the final LayN peptide sequence was confirmed in form.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • PBS phosphate buffer solution
  • Samples were synthesized using a peptide having a fluorescent substance FITC (Fluorescein isothiocyanate) attached to the N-terminus of each of the LayN peptide and the control R9 peptide (SEQ ID NO: 8), and treated with cells at 1.0 ⁇ M concentration.
  • the prepared samples were treated with the cells, reacted for 3 hours, and the cells were harvested.
  • Cell harvest was trypsin-EDTA (Trypsin-EDTA), removed from the culture dish, washed three times with 15U / mL Heparin solution and finally suspended in phosphate buffer solution using a flow cytometer FACSCalibur (BD) I checked my delivery.
  • FITC Fluorescein isothiocyanate
  • the intracellular delivery efficiency (C) of the LayN peptide was confirmed to show a much higher intracellular delivery efficiency compared to the control group R9 peptide (B).
  • HEK293 cells which are representative adherent cells
  • Jurkat T cells which are representative acute lymphocytic leukemia cell lines. Confirmed.
  • the cells were incubated for 24 hours in a 5% carbon dioxide incubator. After removing the medium and washed twice with phosphate buffer solution, the prepared samples were treated in the medium in which fetal serum was removed. Intracellular delivery was confirmed by treating the LayN peptide with FITC conjugated to N-terminal at a concentration of 0.2 and 1.0 ⁇ M and incubating for 3 hours. Samples were processed in the same manner as used in Example 2 and analyzed using a flow cytometer.
  • intracellular delivery efficiency was increased according to the concentration of LayN peptide in HEK293 cells.
  • intracellular delivery efficiency was increased according to the concentration in Jurkat T cells.
  • Example 4 Protein delivery was confirmed inside cells using beta-galactosidase assay.
  • a gene sequence for expressing the LayN peptide and the beta-galactosidase protein in the pET28c vector was introduced to produce a fusion protein in which the beta-galactosidase protein is bound to the cell permeable peptide LayN (SEQ ID NO: 1).
  • SEQ ID NO: 1 the cell permeable peptide LayN
  • His-Taq (H6) sequence was prepared in the form introduced at the N-terminus, and the structure of the resulting fusion protein was H6-LayN- ⁇ -Gal from the N-terminus as shown in FIG. Form.
  • LayN- ⁇ -Gal expression vector was introduced into BL21 (DE3) pLysS Escherichia coli cell line to produce a transformed cell line and then expressed the protein.
  • a brief method for protein production and purification is as follows.
  • Transformed BL21 (DE3) pLysS Escherichia coli cells were inoculated in 5ml LB (Luria-Bertani) medium containing the antibiotic Kanamycin and cultured at 37 ° C. and 250 rpm.
  • LB Lia-Bertani
  • O.D. Optical Density
  • 500ml LB medium containing the antibiotic Kanamycin under the same conditions.
  • O.D. at 600 nm wavelength.
  • 1 mM IPTG Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside
  • the cells were harvested using a centrifuge, and then lysed (Lysis buffer: 6M urea, 20 mM Tris-HCl, pH8.0, 500 mM NaCl) was added, and the cells were disrupted using an ultrasonic grinder. A centrifuge is used to obtain only the solution portion containing the protein, followed by purification.
  • Lysis buffer 6M urea, 20 mM Tris-HCl, pH8.0, 500 mM NaCl
  • the desired protein was obtained from the solution containing the protein using a HisTrap affinity column, and then replaced with a protein storage solution containing 10% glycerol using a Sephadex G-25 column and stored at -80 degrees Celsius.
  • the introduction of the target protein by LayN peptide into the cell tended to increase with the concentration.
  • the protein using the control peptide A10 rather than the cell permeable peptide the protein was delivered into the cell even at a high concentration of 1.5 ⁇ M. Almost could not be confirmed.
  • N negative charge
  • P positive charge
  • SiRNA binding was confirmed with LayN-D peptide on an agarose gel.
  • the binding of the LayN-D peptide and siRNA was confirmed, and in order to confirm the ideal binding ratio, the binding according to the mixing ratio was confirmed on the agarose gel as shown in Fig. 5-B.
  • the siRNA and LayN-D peptides were fixed in an amount of siRNA to change the N / P ratio, and the LayN-D amount was mixed at 0.5, 1.0, 2.0, and 5.0 times the siRNA concentration according to the N / P ratio.
  • electrophoresis on 1.5% agarose gel was confirmed by staining with EtBr. Experimental results showed the most ideal binding efficiency at the N / P ratio of 1.0 to 2.0.
  • a vector containing a LacZ gene expressing beta-galactosidase was transformed into human embryonic kidney cell line HEK293 cells to transfer LacZ siRNA into the cell using LayN-D peptides to inhibit the expression of beta-galactosidase. Inhibitory experiments confirmed the efficacy of siRNA delivery.
  • Poly-D-Lysine 3 x a human embryonic kidney cell line HEK293 cells in the treated 24-well culture dishes 10 after frequency division by four by using a 10% fetal calf serum and antibiotics, DMEM medium supplemented with Penicillin / streptomycin is added to 37 ° C, 5 Incubated for 18 hours in the incubator at% carbon dioxide concentration. The medium was removed, washed with phosphate buffer solution, and further cultured for 6 hours in a medium without serum.
  • the pcDNA3.1 / LacZ vector which is a LacZ expression vector
  • the pcDNA3.1 vector used as a control was respectively introduced into cells and transformed by incubating for 4 hours.
  • the LayN-D peptide and siRNA complexes were introduced into cells.
  • Transformed HEK293 cells were mixed with LayN-D peptide and LacZ siRNA at several N / P ratios and treated with the cells.
  • the treated samples were: 1. transgenic negative control, 2. 50 nM siRNA negative control, 3. siRNA / Lipofectamine positive control, 4.
  • N / P (siRNA / LayN-D) 1.0, 5.
  • N / P (siRNA / LayN-D) 0.5 sample group was prepared and used. Each sample was treated with cells, incubated for 3 hours, the medium was exchanged with DMEM medium containing 10% fetal calf serum, and further cultured for 48 hours before harvesting cells.
  • RIPA solution after cell harvest 50 mM Tris-HCl, pH7.4, 1% Np-40, 0.5% Na-deoxycholate, 0.1% SDS, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM PMSF, 0.5 ⁇ g / ml Leupeptin, 0.5 ⁇ g / ml Aprotinin, 1 mg / ml Pepstatin, 0.2 mM Na 3 VO 4 ) was used to lyse cells and centrifuged to obtain supernatant containing protein. After treating the same amount of 1 x ⁇ -gal dye solution was reacted for 10 minutes at 37 degrees Celsius and the absorbance was measured at 590nm to prepare a graph (Fig. 5-C, D).
  • siRNA and LayN-D peptides showed a similar or better result than siRNA delivery efficiency by Lipofectamine treatment as a positive control when treated with N / P ratio 1: 2 (0.5). These results confirmed the intracellular nucleic acid delivery effect by LayN peptide.
  • LayN peptide In order to confirm the cytotoxicity of LayN peptide itself, the cytotoxicity of LayN peptide was confirmed in various human cell lines such as human cervical cancer cell line HeLa, human embryonic kidney cell line HEK293, human keratinocyte cell line HaCaT, and acute lymphocytic leukocyte cell line Jurkat T.
  • human cervical cancer cell line HeLa human embryonic kidney cell line HEK293, human keratinocyte cell line HaCaT, and acute lymphocytic leukocyte cell line Jurkat T.
  • LayN peptide was further cultured for 3 hours after treatment in the concentration range of 0.05 to 2.0 ⁇ M as shown in FIG. 6, and the absorbance was measured at 420 to 480 nm using the WST-1 reagent (Roche), a cell proliferation confirmation reagent.
  • cytotoxicity in each cell line was about 10% cytotoxic up to about 1.0 ⁇ M, and cytotoxicity of about 20% was confirmed at 1.5 ⁇ M. Based on this result, the examples for the present invention were treated with LayN peptide concentration of 1.5 ⁇ M concentration or less.

Abstract

본 발명은 진핵세포의 세포막을 투과하여 세포 안으로 전달되기 어려운 물질들을 다양한 결합을 통해 진핵세포 내부로 전달시켜 줄 수 있는 세포막을 투과하는 새로운 펩티드들에 대한 발명으로 인간 유래 아미노산 서열에서 탐색 된 펩티드로서 세포막을 투과하여 세포 내로 다양한 생리활성 물질들을 효과적으로 전달시킬 수 있는 펩티드 전달체에 대한 발명이다. 탐색을 통해 발견한 세포막 투과 펩티드를 단백질 및 핵산과 결합시켜 세포 내부로 전달되는 효능을 확인하였으며 이는 기존의 세포 투과 펩티드 R9 펩티드보다 우수한 효능을 갖는 것으로 확인되었다. 본 발명을 통해 세포 내부로 전달이 어려워 활용되지 못했던 다양한 생리활성 물질들을 이용한 의약품, 화장품 및 기능성 제품 등에 대한 개발 및 이용에 크게 도움이 될 것으로 기대한다.

Description

신규 세포막 투과 펩티드 및 생리활성 물질 전달체로서의 그의 용도
본 발명은 진핵세포의 세포막을 투과하여 세포 안으로 전달되기 어려운 물질들을 다양한 결합을 통해 세포 내부로 전달시켜 줄 수 있는 세포막을 투과하는 새로운 펩티드에 대한 발명으로 멜리틴 펩티드의 세포막 용해작용에 중추적 역할을 하는 멜리틴 펩티드 C-말단 아미노산 서열로부터 유사한 아미노산 서열을 인간 단백질의 아미노산 서열로부터 탐색하여 개발되었다. 개발된 펩티드들은 세포막을 투과하여 세포 내부로 다양한 생리활성 물질들을 효과적으로 전달시켜주는 전달체로서의 역할을 하는 펩티드로서 본 발명을 통해 세포 내부로 전달이 어려워 사람에게 유용한 물질로서 활용되지 못하고 개발에 어려움을 겪었던 다양한 생리활성 물질들을 효과적으로 생체 내에 전달하고 이를 이용하여 의약품, 화장품 및 기능성 제품 등 사람에 유용한 제품의 개발 및 이용에 크게 도움이 될 것으로 기대한다.
진핵세포의 세포막은 이중 지질막으로 이루어져 세포 내부 물질을 보호하고 외부로부터 물질의 유입이나 내부 물질의 이동을 제어하는 단위체이다. 특히나 생체 내 활성물질인 핵산과 같은 친수성 물질이나 단백질, 펩티드와 같은 크기가 크고 표면 전하를 갖는 분자들의 세포 내 유입은 세포막 표면의 수용체와 같은 특정 물질과의 조직화되고 체계적인 기전이 아니고서는 거의 불가능한 것으로 알려져 있다. 이와 같은 이유로 최근까지 개발되고 있는 약물의 거의 대부분은 세포 내부 물질이 아닌 세포 표면에 있는 물질들을 대상으로 개발되고 있으며, 따라서 세포 내부로 이런 친수성 물질이나 크기가 큰 물질들을 효과적으로 전달시켜 줄 수 있는 전달체가 개발된다면 아직 미개발된 무수히 많은 세포 내 물질들을 대상으로 유용한 신규 약물이나 제품을 개발할 수 있을 것이다.
세포 내부에서 기능을 하는 무수히 많은 물질들이 결핍이나 변형으로 인해 제 기능을 못하는데서 비롯된 질환을 치료하는 가장 쉬운 접근 방법은 부족하고 변형된 생체 물질을 새로이 보충해 주는 것이다. 하지만 세포막이라는 장벽으로 인해 크기가 큰 생체 분자들을 세포 내부로 전달하는데 한계를 보임에 따라 세포 내부로 물질을 전달할 수 있는 전달체 개발에 대한 욕구가 오래전부터 있어왔다. 이런 배경을 기반으로 개발된 세포막 투과 펩티드가 단백질도입영역 PTD(Protein transduction domain) 또는 세포투과 펩티드 CPPs (Cell-penetrating peptides) 이다.
1988년 HIV-1(Human immunodeficiency virus, type 1) Tat 단백질이 포유류 세포에 도입될 수 있다는 최초의 보고가 있고나서 물질을 세포 내부로 전달하는 전달체에 대한 연구가 활발하게 진행되었다(문헌 1). 이후 세포막을 투과하여 세포 내부로 물질을 전달할 수 있는 20개 내외의 짧은 아미노산으로 이루어진 펩티드들을 단백질전달영역 PTD 또는 세포 투과 펩티드 CPPs로 명명하여 수많은 새로운 세포막 투과 펩티드들이 개발되었다. 대표적인 PTD로는 HIV-1 Tat 단백질로부터 발견된 Tat-PTD(문헌 2, 3)(Tat_49-57, 서열: RKKKRRQRRR), 초파리 Antennapedia homeodomain 단백질로부터 유래된 Antp(문헌 4)(Antennapedia_43-58, 서열: RQIKIWFQNRRMKWKK), HSV-1(Herpes simplex virus type 1) VP22 단백질로부터 유래 된 VP22 (문헌 5)(VP22_267-300, 서열: DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE), 인공 서열로부터 개발된 Poly-arginine(R9, RRRRRRRRR) 등이 있는데 이들 펩티드들의 공통적인 특징은 양이온성 아미노산이 높은 비율로 구성된다는 것이다.
이와는 다르게 주로 소수성 펩티드로 구성된 세포막 투과 펩티드도 개발되었는데 대표적인 것이 MTS(문헌 6)(Membrane-Translocating Sequence)이다. MTS는 인간 FGF-4 단백질로부터 유래 된 16 개의 아미노산으로 이루어져 있으며 주로 소수성 아미노산으로 구성되어 있다(서열: AAVALLPAVLLALLAP). 소수성 펩티드는 세포막을 구성하는 이중 지질막 내부의 소수성 영역을 투과하여 물질을 세포질로 직접 전달하는 기전을 갖는 것으로 알려져 있다. 이 외에도 다양한 생물종의 다양한 단백질로부터 세포 투과 펩티드가 개발되고 있으며 인공 서열을 디자인하여 세포막 투과 펩티드를 개발하기도 하였다. 이렇게 개발된 수많은 종류의 세포막 투과 펩티드들의 효능을 이용하여 단백질, 핵산, 화합물, 금속 등 다양한 물질들을 세포 내부로 전달시켜 유용한 물질을 개발하기 위한 연구가 계속 되고 있다. 하지만 아직까지 작용기전이 명확하지 않으며 세포 내부로 전달된 후의 전달체와 카고 물질의 운명에 대해서는 많은 연구가 필요하며, 세포막 투과 펩티드들을 이용한 의약품 개발은 성공적으로 이루어지지 않고 있다.
PTD는 세포막을 투과하는 기능적 측면에서 출발하여 주로 바이러스나 톡신 (toxin)과 같은 필수적으로 세포막을 투과하여 기능을 발휘해야만 하는 물질로부터 유래 되어 개발된 것이 대부분이다. 하지만 인간이 아닌 다른 생물종으로부터 유래 된 PTD는 향 후 사람에게 생체 내에 적용될 의약품과 같은 유용한 물질 개발에 있어 면역 반응이나 독성 등 안전성에 문제를 야기할 수도 있다.
멜리틴 (Melittin, Gene ID : 406130) 펩티드는 벌 독 (Apitoxin) 구성물의 50% 이상을 차지하는 주된 독성 펩티드로서 강한 용혈작용을 통해 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 좀 더 구체적인 작용기전은 먼저 세포막 표면의 다당체나 인산화 부위에 결합한 후 세포막 이중 지질막을 N-말단 소수성 펩티드 부분이 침투하여 구멍을 형성하고 세포를 용해하는 것으로 알려져 있다. 또한 Phospholipase A2 단백질과 결합하여 Na+-K+-ATPase 와 H+-K+-ATPase 같은 수송 펌프를 저해하여 Na+ 와 Ca2+ 같은 이온의 세포 내 침투를 증가시킨다.
멜리틴을 이용한 연구는 주로 멜리틴의 독성 작용을 이용하여 특정 세포를 표적화하여 사멸시키는 기능으로 연구되어 왔다. Soman N.R. 등은 암세포를 표적화 할 수 있는 Perfluorocarbon 나노입자에 멜리틴을 결합하여 암세포를 표적화 하여 사멸시키는 연구를 하였다(문헌 7).
멜리틴의 세포막 용해 기능을 이용하여 유전자 전달체로서의 연구도 최근 몇 년간 활발히 진행되었다. Schellinger J.G. 등은 HPMA (N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide)에 poly-lysine 과 멜리틴 펩티드를 결합하여 유전자 전달체로 이용한 연구를 하였다 (문헌 8). 이 연구에서 멜리틴은 세포막에 구멍을 뚫어 유전자 전달 효율을 높이는 목적으로 사용되었다. 미국 특허 출원된 US20120165393 A1 특허는 Asialoglycoprotein 수용체에 대한 리간드와 멜리틴이 결합된 융합 단백질을 siRNA 전달체로 이용하는 발명으로서, 이 발명에서 멜리틴은 siRNA 와 결합하여 세포막을 투과하는 용도로 이용되었다(문헌 9).
본 발명을 통해 멜리틴 펩티드 C-말단의 친수성 아미노산 서열을 포함한 12 개의 아미노산 서열(서열번호 3)로부터 유사한 서열을 인간 단백질 아미노산 서열에서 탐색하여 최종적으로 가장 이상적인 LayN 펩티드를 개발하였다. LayN 펩티드 아미노산 서열은 Layilin 이라는 인간 단백질의 아미노산 서열로부터 유래 되었다.
Layilin 단백질은 히알루론산 수용체의 기능을 하는 세포막 단백질로서 N-말단으로부터 세포외영역, 막관통영역 (서열번호 5), 세포질영역으로 구성되어있다. LayN 펩티드는 Layilin 단백질로부터 유래 된 아미노산 서열 257 번 내지 266 번의 10 개의 아미노산 (서열번호 2) 으로부터 259 번 시스테인을 세린으로 치환한 형태가 가장 이상적인 서열로 확인되었다 (서열번호 1).
참고 문헌
1. Frankel A.D., Pabo C.O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 1988 23;55(6):1189-93.
2. Fawell S., Seery J., Daikh Y., Moore C., Chen L.L., Pepinsky B., Barsoum J. Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 18;91(2):664-8.
3. US 5804604 A (Biogen Inc.) 1995. 5. 25
4. Derossi D., Joliot A.H., Chassaing G., Prochiantz A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 1994 8;269(14):10444-50.
5. Elliott G., O'Hare P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 1997 24;88(2):223-33.
6. US 5807746 A (Vanderbilt University) 1994. 6. 13
7. Soman N.R., Baldwin S.L., Hu G., Marsh J.N., Lanza G.M., Heuser J.E., Arbeit J.M., Wickline S.A., Schlesinger P.H. Molecularly targeted nanocarriers deliver the cytolytic peptide melittin specifically to tumor cells in mice, reducing tumor growth. J. Clin. Invest. 2009 119(9):2830-42.
8. Schellinger J.G., Pahang J.A., Johnson R.N., Chu D.S., Sellers D.L., Maris D.O., Convertine A.J., Stayton P.S., Horner P.J., Pun S.H. Melittin-grafted HPMA-oligolysine based copolymers for gene delivery. Biomaterials 2013 34(9):2318-26.
9. US 20120165393 A1 (Arrowhead Madison Inc.) 2011. 12. 15
본 발명은 세포 내부에서 작용하여 기능을 발휘할 수 있는 다양한 생리활성 물질들이 세포막을 투과하여 세포 내부로 전달이 어려워 활용도가 떨어지고 개발이 어려운 문제를 해결하기 위해 이런 생리활성 물질들을 세포 내부로 전달시켜 줄 수 있는 신규 세포막 투과 펩티드들을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명을 통해 개발된 세포막 투과 펩티드는 인간 단백질을 구성하는 아미노산 서열로부터 유래 되어 향후 사람을 대상으로 하는 의약품, 화장품 등의 유용한 물질 개발에 있어 보다 높은 안전성을 담보할 것으로 기대된다.
본 발명자들은 세포막을 투과하는 효능을 갖는 펩티드의 아미노산 서열 탐색을 통하여 신규의 세포 투과성 펩티드 서열을 개발하였다. 본 발명을 위한 과제 해결 수단은 아래와 같다.
멜리틴 펩티드는 벌 독 (Apitoxin) 성분의 50% 이상을 차지하는 주된 펩티드이다. 멜리틴은 26 개의 아미노산으로 구성된 펩티드로서 N-말단으로부터 20 개 아미노산은 주로 소수성 아미노산으로, C-말단 6개 아미노산은 친수성 아미노산으로 구성되어 있다. 멜리틴은 적혈구 세포의 세포막을 파괴하여 용혈작용을 통해 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 주된 작용 기전은 세포막 표면의 다당체나 인산화 부위에 결합 후 알파-나선구조 펩티드가 이중 지질막에 침투되어 구멍을 형성해 세포를 용해시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 멜리틴의 다른 기전은 차치하고 세포막에 결합하여 이중 지질막을 침투하는 기능에 주목하였다. 멜리틴 펩티드의 용혈기능에 가장 중요한 역할을 하는 C-말단 6 개 아미노산을 포함한 12 개의 아미노산을 이용하여 인간 단백질의 아미노산 서열로부터 유사한 서열을 탐색하였다.
실시예 1에 기술 한 것 처럼 NCBI(National Center for Biotechnology Information, USA, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 탐색을 통해 67% 이상의 일치성을 보이는 유사 아미노산 서열 100 개 이상을 얻었고 이들 후보 물질 중에서 양이온성 아미노산인 아르기닌, 리신 과 음이온성 아미노산인 아스파르산, 글루타민산의 함량과 배열 형태를 통해 몇 가지 후보 서열을 얻어내었다. 그 중 세포막 투과 효능이 가장 좋은 펩티드의 서열을 최종 확인하였다.
최종 얻어진 세포막 투과 펩티드는 탐색 결과 히알루론산 수용체로 알려진 Layilin (Gene ID : 143903) 단백질의 아미노산 서열 257 번 내지 266 번으로 이루어진 10 개의 아미노산 서열로부터 얻어졌으며 펩티드 분자 간 이합체 형성을 막기 위해 259 번 시스테인을 세린으로 치환시킨 형태로 최종 세포막 투과 펩티드 서열을 확정하여 LayN 펩티드 (서열번호 1) 로 명명하였다.
LayN 펩티드의 아미노산 서열로부터 아래와 같은 세포 투과 펩티드의 서열식을 작성하였다.
서열식 : W-I-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (서열번호 4)
위 서열식은 LayN 펩티드의 기본 구조를 따르고 있으며 여기서 X1 은 Layilin 단백질 아미노산 서열의 원형 서열인 시스테인과 이를 치환시킨 아미노산 세린 및 곁가지에 작용기가 없는 알라닌으로 구성된 형태가 가능하며 X2 내지 X6의 아미노산은 아르기닌과 리신으로 구성된 양이온성 아미노산, X7 내지 X8의 아미노산은 글루타민산, 아스파르산, 글루타민, 아스파라진 등 음이온성 아미노산 형태로 구성된 서열이다.
LayN 세포막 투과 펩티드는 Layilin 단백질의 막관통영역 (아미노산 236 번 내지 256 번) 과 결합하여 멜리틴의 기능을 모방한 펩티드로 이용할 수 있으며 개발된 세포막 투과 펩티드들의 아미노산은 L-형태와 D-형태의 아미노산 모두 사용이 가능하고 아미노산 서열의 정방향 및 역방향 서열도 세포막 투과 효능을 보유할 것이다.
실시예에 사용된 세포막 투과 펩티드는 서열번호 1의 LayN 펩티드를 이용하여 확인하였으며 실시예를 통해 카고 (Cargo) 물질로서 단백질과 핵산 (siRNA) 을 세포 내부로 전달하는 효능을 확인할 수 있었다. 또한 여러 가지 인간 세포주에서 펩티드의 독성을 확인하였으며 세포 독성에 문제가 없는 1.5μM 이하의 펩티드 농도에서 실시하여 확인하였다.
본 발명을 통해 개발된 세포 투과 펩티드는 카고 물질과 결합하여 그 물질을 세포 내부로 전달하는 전달체로서의 역할을 하므로 결합하는 카고 물질은 단백질, 핵산, 화합물, 광물 등 특별한 제한 없이 사용이 가능하며 카고 물질이 생체 내 다른 운반체나 세포막 수용체와의 반응 없이 세포 투과 펩티드에 의해 세포 내부로 전달되는 것을 목적으로 한다.
본 발명을 통해 개발된 신규 세포막 투과 펩티드를 이용하여 세포 내부에서만 역할을 할 수 있고 기능을 갖는 유용한 생리활성 물질들을 세포 내부로 효과적으로 전달하여 세포 내부로의 전달 방법 부재로 개발되지 못했던 수많은 유용한 물질들에 대한 개발이 가능할 것이다. 또한 본 개발을 통해 개발된 펩티드는 인간 단백질을 구성하는 아미노산 서열로부터 유래 된 세포막 투과 펩티드로서 향후 사람에게 적용될 유용한 제품과 기술 개발에 있어 안전성을 담보할 것이다.
도 1은 유세포 분석기 (FACS)를 이용하여 세포투과 펩티드 LayN의 세포 내 투과도를 R9 펩티드의 세포 투과도 효능과 비교한 실험 자료로서 A는 무 처리군, B는 R9 펩티드, C는 LayN 펩티드 처리군이다.
도 2는 유세포 분석기를 이용하여 유착세포인 HEK293 세포에서 세포투과 펩티드 LayN의 농도에 따른 세포 투과도를 확인한 실험 자료로서 A는 펩티드 무 처리군, B는 0.2μM 농도 펩티드, C는 1.0μM 농도 펩티드 처리군 이다.
도 3은 유세포 분석기를 이용하여 부유세포인 Jurkat T 세포에서 세포투과 펩티드 LayN의 농도에 따른 세포 투과도를 확인한 실험 자료로서 A는 펩티드 무 처리군, B는 0.2μM 농도 펩티드, C는 1.0μM 농도 펩티드 처리군 이다.
도 4는 세포 투과성 펩티드 LayN에 베타-갈락토시다제 단백질이 결합 된 형태로 세포 내부로 전달된 것을 확인하는 실험으로 X-gal 염색에 의해 단백질 전달 효율을 확인한 사진이다. 그림 A는 LayN 펩티드에 결합된 베타-갈락토시다제 융합 단백질 구조에 대한 모식도로서 N-말단으로부터 정제를 위한 His-Tag (H6), LayN 펩티드, 베타-갈락토시다제 순으로 결합 되어있다. 그림 B는 위와 같이 제작된 H6-LayN-β-Gal 융합 단백질을 인간 배아신장 세포주 HEK293 세포에 0.1 내지 1.5μM 농도로 도입시킨 후 X-gal 염색을 통해 단백질의 전달 효능을 확인한 자료이다.
도 5는 세포막 투과 펩티드 LayN 과 LacZ siRNA를 정전기적 인력에 의해 결합시켜 pcDNA3.1/LacZ 벡터를 이용해 형질전환 시킨 인간 배아신장 세포주 HEK293 세포에서 LacZ 유전자의 발현이 저해 되는 것을 확인한 자료이다. 그림 A는 LayN 펩티드 이합체 (LayN-D) 와 siRNA가 정전기적 인력에 의해 결합되는 모식도이다. 그림 B는 siRNA 와 LayN 펩티드 이합체의 N/P 비에 따라 결합되는 정도를 아가로즈 겔 상에서 확인한 자료로서 제1열은 DNA 크기 표지자 (DNA size ladder), 제2열은 siRNA 만을 처리한 음성 대조군으로서 겔 상의 띠는 결합하지 않은 자유 siRNA의 크기와 상대적 양을 표시한다. 제3열 내지 제6열은 각각 N/P 비 2.0, 1.0, 0.5, 0.1 로 혼합시켰을 때의 자료이다. siRNA의 양은 50 nM로 고정하여 사용하였다. 그림 D는 베타-갈락토시다제 분석 자료이며 수치화하여 C에 도식하였다.
도 6은 세포막 투과 펩티드 LayN의 여러 가지 세포에서 농도에 다른 독성을 확인한 자료이다. 인간 배아신장 세포주 HEK293 세포, 인간 자궁경부암 세포주 HeLa 세포, 인간 급성 림프성 백혈병 세포주 Jurkat T 세포, 인간 각질형성 세포주 HaCaT 세포에서 각각 LayN 펩티드의 세포 독성을 확인하였다. 각각의 세포는 1 x 104 개의 세포를 96-well 플레이트에 분주하여 16 시간 동안 배양 후 LayN 펩티드를 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0μM 농도로 처리 후 3 시간 추가 배양 후 WST-1 시약을 이용하여 420 내지 480 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
도 7은 신규 개발된 세포막 투과 펩티드가 카고 (Cargo) 물질과 결합하여 세포막을 투과하는 기작에 대한 모식도이다. 경로 A는 세포막 표면에 흡착 후 내포 작용 (endocytosis)을 통해 세포 내부로 전달되는 기작이며, 경로 B는 세포막에 흡착 후 구멍을 뚫고 세포질로 직접 전달되는 기작에 대한 모식도이다.
* 도면 중 주요 부호에 대한 설명 *
DNA : Deoxyribonucleic acid
RNA : Ribonucleic acid
LNA : Locked Nucleic Acid
PNA : Peptide Nucleic Acid
FACS : 유세포 분석기 Fluorescence-activated cell sorting
PTD : 단백질도입영역 Protein transduction domain
CPPs : 세포 투과 펩티드 Cell-penetrating peptides
실시예 1. BLAST 탐색을 이용한 유효한 세포 투과 펩티드 서열 탐색하였다.
멜리틴 펩티드의 26개 아미노산 서열 중에서 세포막과의 반응에 결정적인 역할을 하는 C-말단부분의 8개 아미노산 서열을 이용하여 유사한 아미노산 서열을 인간 유래 단백질의 아미노산 서열에서 탐색하기 위해 NCBI(National Center for Biotechnology Information, USA, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 탐색을 하였으며 67% 이상의 일치성을 보이는 서열 100 개 이상을 얻을 수 있었다. 이들 후보 물질 중에서 양이온성 아미노산인 아르기닌, 리신 과 음이온성 아미노산인 아스파르산, 글루타민산의 함량과 배열 형태를 통해 몇 가지 후보 서열을 얻어내었고 그 중 세포 투과 효능이 가장 좋은 LayN 펩티드 서열을 최종 확인하였다.
최종 얻어진 LayN 펩티드는 탐색 결과 히알루론산 수용체로 알려진 Layilin (Gene ID : 143903) 단백질의 257 내지 266번 사이의 10개의 아미노산 서열로부터 얻어졌으며 펩티드 분자 간 이합체 형성을 막기 위해 259번 시스테인을 세린으로 치환시킨 형태로 최종 LayN 펩티드 서열을 확정하였다.
실시예 2. 유세포 분석기를 이용한 LayN 펩티드의 세포 내 투과도 확인하였다.
60mm 배양 접시에 인간 자궁경부암 세포주 HeLa 세포를 5.5 x 105개 되게 분주한 후 10% 우태혈청과 항생제 Penicillin/streptomycin 이 첨가된 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 배지를 이용하여 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 농도의 세포 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거 후 인산완충용액 (PBS)으로 두 차례 세척 후 우태혈청이 제거된 배지에 준비된 시료를 처리하였다. 시료는 LayN 펩티드와 대조군인 R9 펩티드 (서열번호 8) 각각의 N-말단에 형광물질인 FITC(Fluorescein isothiocyanate)가 붙어있는 펩티드를 합성하여 사용하였으며 각각 1.0μM 농도로 세포에 처리하였다. 준비된 시료를 세포에 처리하여 3시간 동안 반응시킨 후 세포를 수확하였다. 세포 수확은 트립신-EDTA (Trypsin-EDTA) 처리하여 배양 접시에서 떼어낸 후 15U/mL Heparin 용액을 이용하여 세 차례 세척 후 최종적으로 인산완충용액에 부유시켜 유세포 분석기 FACSCalibur (BD 社)를 이용하여 세포 내 전달 정도를 확인하였다.
도면 1에서 처럼 LayN 펩티드의 세포 내 전달 효율 (C)이 대조군인 R9 펩티드 (B)에 비해 훨씬 높은 세포 내 전달 효능을 보이는 것으로 확인할 수 있었다.
실시예 3. 유세포 분석기를 이용하여 부착세포 HEK293 세포와 부유세포 Jurkat T 세포에서 LayN 펩티드의 농도에 따른 세포 내 투과도 확인하였다.
LayN 펩티드의 농도에 따른 세포 내 전달 효능과 여러 가지 세포에서의 전달 효율을 확인하기 위해 대표적인 부착세포인 인간 배아신장 세포주 HEK293 세포와 대표적인 부유세포인 인간 급성 림프성 백혈병 세포주 Jurkat T 세포에서 전달 효율을 확인하였다.
60mm 배양 접시에 5.5 x 105개의 HEK293 세포와 Jurkat T 세포를 각각 분주한 후 10% 우태혈청과 항생제 Penicillin/streptomycin이 첨가된 DMEM 배지와 RPMI-1640 배지를 각각의 세포주에 사용하여 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 농도의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거 후 인산완충용액으로 두 차례 세척한 후 우태혈청이 제거된 배지에 준비된 시료들을 처리하였다. N-말단에 형광물질인 FITC가 결합 된 LayN 펩티드를 0.2, 1.0μM 농도로 처리하고 3시간 동안 배양하여 세포 내 전달을 확인하였다. 실시예 2에서 사용된 방법과 같은 방법으로 시료를 처리하고 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다.
도 2에서 처럼 HEK293 세포에서 LayN 펩티드의 농도에 따라 세포 내 전달 효율이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 도면 3에서 처럼 Jurkat T 세포에서도 농도에 따라 세포 내 전달 효율이 증가하는 경향을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 베타-갈락토시다제 (β-galactosidase) 분석을 이용한 세포 내부로 단백질 전달 확인하였다.
LayN-β-galactosidase(LayN-β-Gal) 융합 단백질 제조
세포 투과성 펩티드 LayN (서열번호 1)에 카고 물질로서 베타-갈락토시다제 단백질이 결합 된 융합 단백질을 제작하기 위해 pET28c 벡터에 LayN 펩티드와 베타-갈락토시다제 단백질을 발현시키기 위한 유전자 서열을 도입하여 LayN-β-Gal 융합 단백질 발현용 벡터를 제작하였다. 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 His-Taq (H6) 서열이 N-말단에 도입된 형태로 제작되었으며 최종 생성되는 융합 단백질의 구조는 도면 4에서 처럼 N-말단으로부터 H6-LayN-β-Gal 형태이다.
LayN-β-Gal 발현용 벡터를 BL21(DE3) pLysS 대장균 세포주에 도입하여 형질전환된 세포주를 제작 한 후 단백질을 발현시켰다. 단백질 생산 및 정제를 위한 간략한 방법은 아래와 같다.
형질전환된 BL21(DE3) pLysS 대장균 세포를 항생제 Kanamycin 이 포함된 5ml LB (Luria-Bertani) 배지에 접종하여 섭씨 37도, 250rpm에서 1 차 배양하였다. 자외-가시광선 분광기를 이용하여 600nm 파장에서 O.D.(Optical Density) 0.6정도로 배양 후 항생제 Kanamycin 이 포함된 500ml LB 배지에 같은 조건으로 배양하였다. 600nm 파장에서 O.D. 0.7~0.8 정도로 배양 후 1mM IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 목적 단백질의 과대 발현을 유도하였다. 4시간 동안 배양 후 원심분리기를 이용하여 세포를 수확 후 용해 용액 (Lysis buffer : 6M urea, 20mM Tris-HCl, pH8.0, 500mM NaCl)을 첨가하여 초음파분쇄기를 사용하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리기를 이용하여 단백질이 포함된 용액 부분만을 얻어낸 후 정제 과정을 수행한다.
HisTrap 친화 컬럼을 이용하여 단백질이 포함된 용액으로부터 목적 단백질을 얻어낸 후 Sephadex G-25 컬럼을 이용하여 10% 글리세롤이 포함된 단백질 보관 용액으로 치환시켜 섭씨 -80도에 보관 후 사용하였다.
LayN-β-Gal 융합 단백질 세포 내 도입
Poly-D-Lysine 처리된 12-well 배양 접시에 인간 배아신장 세포주 HEK293 세포를 3 x 104개씩 분주 후 10% 우태혈청과 항생제 Penicillin/streptomycin 이 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 섭씨 37 도, 5% 이산화탄소 농도의 배양기에서 16시간 동안 배양하였다. 배지를 제거 후 인산완충용액으로 두 차례 세척 후 시료를 처리하였다. 시료는 무 처리군, 1.5μM 농도의 대조군, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5μM 농도의 LayN-β-Gal 단백질 처리군으로 준비하여 실험하였다. 대조군은 목적 단백질의 세포 내 전달용 펩티드인 LayN 펩티드를 A10 펩티드 (서열번호 7)로 치환시켜 제조 된 융합 단백질을 사용하였다 (A10-β-Gal).
시료 처리 후 3시간 동안 배양 후 인산완충용액으로 3회 세척하고 고정액 (2% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, PBS) 을 첨가하여 10분간 세포를 고정시켰다. 10 분 후에 고정액을 제거하고 인산완충용액으로 세척 후 X-gal 염색 용액을 첨가하여 섭씨 37도에서 30분간 반응시켰다. 염색 후에 인산완충용액으로 3번 세척 후 광학현미경과 CCD 카메라를 이용하여 염색 정도를 확인하였다.
실험 결과 도 4에서 처럼 LayN 펩티드에 의한 목적 단백질의 세포 내 도입은 농도에 따라 증가 되는 경향을 보였으며 세포 투과성 펩티드가 아닌 대조군 펩티드 A10을 이용한 단백질에서는 1.5μM의 높은 농도에서도 세포 내로 전달된 형태를 거의 확인 할 수 없었다. 이와 같은 결과를 통해 LayN 펩티드가 카고 단백질을 세포 내로 전달시켜 주는 것으로 확인할 수 있었다.
실시예 5. LayN 이합체의 siRNA 세포 내 전달 효율
LayN 펩티드에 의한 핵산의 세포 내 전달 효율을 확인하기 위해 LayN 펩티드를 단위체로 하는 연속되는 서열의 이합체 LayN-D를 합성하였다. 핵산인 siRNA의 음전하 (N)와 LayN-D 펩티드의 양전하 (P)를 정전기적 인력에 의해 결합시켜 세포 내부로 전달시켰다.(도 5-A) 혼합 비율은 음전하와 양전하의 비율인 N/P 비를 달리하여 혼합하여 전달 시료로 사용하였다.
아가로즈 겔 상에서 LayN-D 펩티드와 siRNA 결합 확인하였다.
먼저 LayN-D 펩티드와 siRNA의 결합 여부를 확인하고 이상적인 결합비를 확인하기 위해 도 5-B 와 같이 혼합비에 따른 결합 여부를 아가로즈 겔 상에서 확인하였다. siRNA 와 LayN-D 펩티드를 N/P 비에 변화를 주기위해 siRNA의 양을 고정하고 LayN-D의 양을 N/P 비율에 따라 siRNA 농도의 0.5, 1.0, 2.0, 5.0배로 혼합하여 실온에서 20분간 반응시킨 후 1.5% 아가로즈 겔 상에서 전기영동 한 후 EtBr로 염색하여 확인하였다. 실험 결과 N/P 비 1.0 내지 2.0에서 가장 이상적인 결합 효율을 보였다.
LacZ 유전자 형질전환 세포에서 LacZ siRNA 전달에 의한 발현 저해효능 확인
베타-갈락토시다제를 발현하는 LacZ 유전자를 포함하는 벡터를 인간 배아신장세포주 HEK293 세포에 형질전환하여 LacZ siRNA를 LayN-D 펩티드를 이용하여 세포 내부로 전달시켜 베타-갈락토시다제의 발현을 저해하는 실험을 통해 siRNA 전달 효능을 확인하였다.
pcDNA3.1/LacZ 벡터를 이용한 인간 배아신장 세포주 HEK293 세포의 형질전환
Poly-D-Lysine 처리된 24-well 배양 접시에 인간 배아신장 세포주 HEK293 세포를 3 x 104개 씩 분주 후 10% 우태혈청과 항생제 Penicillin/streptomycin 이 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 농도의 배양기에서 18시간 동안 배양하였다. 배지를 제거 후 인산완충용액으로 세척하고 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 6시간 동안 추가 배양하였다. Lipofectamine2000 (Life Technologies 社) 시약을 이용하여 LacZ 발현용 벡터인 pcDNA3.1/LacZ 벡터와 대조군 (mock)으로 사용된 pcDNA3.1 벡터를 각각 세포에 처리하여 도입시키고 4시간 배양하여 형질전환 시켰다.
LayN-D 펩티드와 siRNA 복합체의 세포 내 도입하였다.
형질전환된 HEK293 세포에 LayN-D 펩티드와 LacZ siRNA를 몇 가지 N/P 비로 혼합하여 세포에 처리하였다. 처리 시료는 도 5-C 내지 D에서 처럼 1. 형질전환 음성 대조군, 2. 50nM siRNA 음성 대조군, 3. siRNA/Lipofectamine 양성 대조군, 4. N/P (siRNA/LayN-D) = 1.0, 5. N/P (siRNA/LayN-D) = 0.5 시료군을 제조하여 사용하였다. 각각의 시료를 세포에 처리하여 3시간 동안 배양하고 10% 우태혈청이 첨가된 DMEM 배지로 배지를 교환 한 후 48시간 동안 추가로 배양한 후에 세포를 수확하였다.
베타-갈락토시다제 분석을 이용한 siRNA 전달에 다른 LacZ 발현 저해 효능
세포 수확 후 RIPA 용액(50mM Tris-HCl, pH7.4, 1% Np-40, 0.5% Na-deoxycholate, 0.1% SDS, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 50mM NaF, 1 mM PMSF, 0.5μg/ml Leupeptin, 0.5μg/ml Aprotinin, 1 mg/ml Pepstatin, 0.2mM Na3VO4)을 이용하여 세포를 용해시키고 원심분리 후 단백질이 포함된 상등액을 얻어내었다. 동량의 1 x β-gal 염색 용액을 처리 한 후 섭씨 37도에서 10분간 반응시키고 590nm에서 흡광도를 측정하여 그래프를 작성하였다 (도 5-C, D).
도 5-C, D에서 처럼 siRNA 와 LayN-D 펩티드를 N/P 비 1:2 (0.5) 처리했을 때 양성 대조군인 Lipofectamine 처리에 의한 siRNA 전달 효율과 유사하거나 좀 더 나은 결과를 보였다. 이와 같은 결과를 통해 LayN 펩티드에 의한 세포 내 핵산 전달 효능을 확인할 수 있었다.
실시예 6. WST-1 시약을 이용한 다양한 세포주에서 LayN 펩티드의 세포 독성
LayN 펩티드 자체의 세포 독성을 확인하기 위해 인간 자궁경부암 세포주 HeLa, 인간 배아신장 세포주 HEK293, 인간 각질형성 세포주 HaCaT, 급성 림프성 백혈구 세포주 Jurkat T 등 여러 가지 인간 세포주에서 LayN 펩티드의 세포 독성을 확인하였다.
96-well 배양 플라스크에 1 x 104개의 각각의 세포를 10% 우태혈청과 항생제 Penicillin/streptomycin 이 첨가된 DMEM과 RPMI-1640 배지를 각각 사용하여 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 농도의 배양기에서 16시간 동안 배양하였다. 배양 후 LayN 펩티드를 도 6에서 처럼 0.05 내지 2.0μM 농도 범위에서 처리 후 3시간 동안 추가 배양하고 세포 증식 확인 시약인 WST-1 시약 (Roche 社)을 이용하여 420~480 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 6에서 처럼 각각의 세포주에서 세포 독성은 1.0μM 정도까지는 10% 내외의 세포 독성을 보였으며 1.5μM 농도에서는 20% 내외의 세포 독성을 확인할 수 있었다. 이 결과를 토대로 본 발명을 위한 실시예 들은 1.5μM 농도 이하의 LayN 펩티드 농도로 처리하였다.

Claims (11)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 정방향 서열 또는 역방향 서열로 이루어진 펩티드 서열을 포함하는 세포막 투과성 펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 서열번호 1 내지 서열번호 2는 L-아미노산 또는 D-아미노산으로 이루어진 펩티드 서열을 포함하는 세포막 투과성 펩티드.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 서열번호 1 내지 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 정방향 서열 또는 역방향 서열로 이루어진 펩티드 서열을 포함하는 세포막 투과성 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 서열번호 5의 막관통영역 (Transmembrane domain) 펩티드가 결합 된 세포막 투과성 펩티드.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 서열번호 1 내지 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 정방향 서열 또는 역방향 서열로 이루어진 펩티드 서열을 포함하는 세포막 투과성 펩티드를 단위체로 하여 한 개 내지 여덟 개의 직렬 또는 병렬 중합체로 구성된 세포막 투과성 펩티드.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 DNA, RNA, LNA, PNA 등의 핵산 또는 성장인자, 사이토카인, 전사인자, 효소 등의 단백질 또는 탄수화물, 화합물, 광물 등을 서열번호 1 내지 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 정방향 서열 또는 역방향 서열을 포함하는 세포막 투과 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 화학적 공유결합 또는 비공유 결합으로 연결하거나 정전기적 인력 또는 물리적 결합으로 혼합하여 세포막 투과 펩티드에 결합 된 물질을 세포 내부로 전달하는 것을 포함하는 세포막 투과성 펩티드.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 서열번호 4로 표시되는 하기 서열식 W-I-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 에서 X1은 시스테인, 세린 또는 알라닌, X2 내지 X6 은 아르기닌 또는 리신, X7 내지 X8 은 글루타민산, 아스파르산, 글루타민 또는 아스파라진인 아미노산 서열의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 정방향 서열 또는 역방향 서열로 이루어진 펩티드 서열을 포함하는 세포막 투과성 펩티드.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 서열번호 4는 L-아미노산 또는 D-아미노산으로 이루어진 펩티드 서열을 포함하는 세포막 투과성 펩티드.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 정방향 서열 또는 역방향 서열로 이루어진 펩티드 서열을 포함하는 세포막 투과성 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 서열번호 5의 막관통영역(Transmembrane domain) 펩티드가 결합 된 세포막 투과성 펩티드.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 정방향 서열 또는 역방향 서열로 이루어진 펩티드 서열을 포함하는 세포막 투과성 펩티드를 단위체로 하여 한 개 내지 여덟 개의 직렬 또는 병렬 중합체로 구성된 세포막 투과성 펩티드.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 DNA, RNA, LNA, PNA 등의 핵산 또는 성장인자, 사이토카인, 전사인자, 효소 등의 단백질 또는 탄수화물, 화합물, 광물 등을 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 정방향 서열 또는 역방향 서열로 이루어진 세포막 투과 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 화학적 공유결합 또는 비공유 결합으로 연결되거나 정전기적 인력 또는 물리적 결합으로 혼합하여 세포막 투과 펩티드에 결합 된 물질들을 세포 내부로 전달하는 것을 포함하는 세포막 투과성 펩티드.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 신규 세포막 투과성 펩티드들과 NA, RNA, LNA, PNA 등의 핵산 또는 성장인자, 사이토카인, 전사인자, 효소 등의 단백질 또는 탄수화물, 화합물, 광물 등의 물질들을 결합하여 세포막을 투과해 세포 내부에서 작용하는 의약품, 화장품, 의약외품, 기능성 식품 등의 조성물로서 사용되는 것을 포함하는 세포막 투과성 펩티드.
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