CN116199641B - 一种环状γ-聚谷氨酸及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种环γ‑聚谷氨酸及其制备方法与应用。本发明的方法先利用γ‑谷氨酰转肽酶将大分子直链聚谷氨酸降解为不同分子量的小分子，然后利用固相合成法得到相应的环状γ‑聚谷氨酸。本发明环γ‑聚谷氨酸的制备方法方法简单、成本低，所得环状γ‑聚谷氨酸具有包埋作用的双重美白、缓释抗氧化新应用。

Description

一种环状γ-聚谷氨酸及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种环状γ-聚谷氨酸及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
γ-聚谷氨酸是由D-型或L-型谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基缩合形成γ-酰胺键的一种氨基酸聚合物，属于聚酰胺类化合物，其主链上含有大量游离羧基，可以发生交联、螯合、衍生化等反应，具有较强的水溶性、生物相容性和生物降解性。γ-聚谷氨酸的降解产物为谷氨酸对人和环境无毒且可食用，因此γ-聚谷氨酸在生物医药、食品工业、农业、化妆品及日化领域具有良好的应用前景。
目前应用较为广泛的是直链γ-聚谷氨酸，存在以下缺点：①分子量较大，在1×102～8×103kDa，粘度较大，流动性较差；②属于直链肽，分子构象受直链的柔曲性影响较大，与其他分子结合的强度较低；③聚合物内部有较多酰胺键，易被机体内的羧肽酶、氨肽酶等切割、降解。相比之下，环状分子没有游离的N端和C端，对于氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低，较线性肽更为稳定；且环状分子通常具有明确的限制性构象，能够与受体更好地契合。因此环状分子展现出更丰富的功能多样性和应用前景。
关于环状γ-聚谷氨酸的制备有文献报道。例如：中国专利文献CN108610274A公开了一种从水母刺丝囊提取液分离得到环γ-聚谷氨酸系列小分子的方法，先从水母触手组织中获得刺丝囊提取液，滤液过HiTrap Desalting柱进行初步分离，再用HPLC反相C18柱进一步纯化，收集洗脱时间12-20min之间一系列洗脱峰，即得到一系列环γ-聚谷氨酸系列小分子，但其方法繁琐，提取成本高，产量低，受制于原料来源限制，较难工业化生产。另外，目前发展起来的通过氨基酸侧链与树脂结合合成环肽的策略引起了人们的关注，该方法为将线性多肽挂在树脂上，主链羧基用烯丙基保护，逐步接肽完成后脱去N端和C端保护基，加入缩合剂得到连在树脂上的环合产物，之后从树脂上切下环肽，脱去其他侧链保护基。但是方法需要逐步接肽，反应路线长，步骤繁琐，成本较高。
酪氨酸酶的催化作用是体内黑色素合成的关键，因此抑制体内黑色素合成的重要方法是抑制酪氨酸酶活性，减少L-酪氨酸转化为多巴醌。与大分子相比，小分子聚谷氨酸通过改善皮肤水分状态和减少皮肤水分流失表现出更好的保湿功效，更适合作为抗酪氨酸酶和抗黑素生成剂，具有更好的皮肤渗透性(Liu X，Liu F，etal：Poly-γ-glutamate fromBacillus subtilis inhibits tyrosinase activity and melanogenesis.ApplMicrobiol Biotechnol(2013)97:9801–9809.)。但是，目前应用较为广泛的是不同分子量的直链聚谷氨酸，且分子量大都在10kDa以上。
因此，开发一种方法简单、成本低的制备环状γ-聚谷氨酸的方法，具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种环状γ-聚谷氨酸及其制备方法与应用。本发明的方法先利用γ-谷氨酰转肽酶将大分子直链聚谷氨酸降解为不同分子量的小分子，然后利用固相合成法得到相应的环状γ-聚谷氨酸。本发明环γ-聚谷氨酸的制备方法方法简单、成本低，所得环状γ-聚谷氨酸具有包埋作用的双重美白、缓释抗氧化新应用。
本发明的技术方案如下：
一种环状γ-聚谷氨酸的制备方法，包括步骤如下：
(1)调节γ-聚谷氨酸溶液的pH为7.5-9.5，之后加入γ-谷氨酰转肽酶，进行酶解；之后经灭酶、浓缩、醇沉、干燥，得到寡聚γ-聚谷氨酸；
(2)在1,4-二氧六环和硫酸体系中，由寡聚γ-聚谷氨酸与异丁烯反应进行末端羧基的保护，之后使侧链羧基成盐；再加入9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc-Osu)的1,4-二氧六环溶液，对氨基端进行保护，得到Fmoc-(Glu)n-OtBu，其中，4≤n≤12，且n为整数；
(3)将Fmoc-(Glu)n-OtBu与固相合成树脂在偶联剂的存在下，进行偶联反应，经洗涤，得到Fmoc-(Glu)n-(固相合成树脂)-OtBu；之后依次脱除叔丁基、Fmoc保护基，得到NH2-(Glu)n-(固相合成树脂)-OH；
(4)将所得NH2-(Glu)n-(固相合成树脂)-OH在环化偶联剂的存在下，进行酰胺缩合环化，得到肽树脂；之后裂解固相合成树脂，得到环状γ-聚谷氨酸。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述γ-聚谷氨酸的分子量为100kDa；所述γ-聚谷氨酸溶液的浓度为1-20g/L。
根据本发明优选的，步骤(1)中使用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.5-9.5。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述γ-谷氨酰转肽酶的酶活力为10-15U/mL；所述γ-谷氨酰转肽酶的加入体积与γ-聚谷氨酸的质量之比为3-5mL:10g。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述酶解的温度为25-45℃；所述酶解的时间为3-6h。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述灭酶步骤为：将酶解所得酶解液在55-70℃保持30-60min，进行酶的灭活。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述浓缩步骤为：将灭酶所得溶液用0.2-0.5μm的滤膜过滤，所得滤液用截留分子量为500-1600Da的超滤膜进行超滤，得到除蛋白的料液，最后用孔径为1nm的纳滤膜对料液进行浓缩，浓缩至料液的固含量为20-30％，得到浓缩液。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述醇沉步骤为：向浓缩所得浓缩液中加入浓缩液质量0.5-2％的氯化钠，搅拌至溶解，使用1mol/L盐酸溶液调节体系pH至3.0-5.0，之后加入浓缩液体积2-4倍的乙醇，析出沉淀，过滤后收集沉淀；所述干燥为将醇沉所得沉淀在40-60℃下真空干燥4-8h，得到寡聚γ-聚谷氨酸。
根据本发明，步骤(1)中所得寡聚γ-聚谷氨酸的结构式如下式I所示：
式I中，4≤n≤12，且n为整数。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述1,4-二氧六环的体积与寡聚γ-聚谷氨酸的质量之比为1-2mL:1g；所述浓硫酸的质量分数为98％，所述浓硫酸的体积与寡聚γ-聚谷氨酸的质量之比为0.1-0.2mL:1g。
根据本发明，步骤(2)中所述异丁烯的加入量直至寡聚γ-聚谷氨酸中末端羧基反应完全；所述末端羧基的保护在0-5℃下进行。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述侧链羧基成盐步骤为：将末端羧基保护后所得反应液降温至0℃，加入质量分数为20％的NaOH溶液调节pH为7，之后加入0.1mol/L的Na2CO3溶液调节pH为9-10，之后搅拌至体系pH不再变化，即完成侧链羧基成盐。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc-Osu)的1,4-二氧六环溶液的浓度为0.4-0.8g/mL；所述9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯与寡聚γ-聚谷氨酸的摩尔比为1-1.1:1；所述9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc-Osu)的1,4-二氧六环溶液在0-5℃下滴加入体系中，滴加时间为10-20min；之后氨基端进行保护步骤在室温下进行。
根据本发明优选的，步骤(2)中，对氨基端进行保护后，还包括后处理步骤，具体后处理步骤如下：将氨基端进行保护后所得反应液过滤，所得滤液用乙醚萃取，之后将所得水相降温至0-5℃，向水相中加入2mol/L稀盐酸溶液调节pH值为5.5，之后用乙酸乙酯萃取，用水洗涤有机相，将有机相进行干燥，除去溶剂得到粗品；将所得粗品使用二氯甲烷和石油醚进行重结晶，得到Fmoc-(Glu)n-OtBu，二氯甲烷与石油醚的体积比为1:1。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述Fmoc-(Glu)n-OtBu的(Glu)n为由n个谷氨酸组成的缩合而成肽链，n与寡聚γ-聚谷氨酸中n相同，即，4≤n≤12，且n为整数。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述固相合成树脂是Wang树脂或2-氯树脂；所述固相合成树脂使用前经溶胀处理，具体处理步骤为：称取固相合成树脂，加入圆底烧瓶中，再加入DMF，在40℃下浸泡30min，使树脂充分溶胀以活化待用，所述固相合成树脂的质量与DMF的体积比为0.5g:10mL。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述偶联剂为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或1-羟基苯并三唑(HOBt)；所述偶联剂与Fmoc-(Glu)n-OtBu的摩尔比为1-1.1:1。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述偶联的条件为：在35-45℃下搅拌反应3-4h；所述洗涤步骤如下：将反应液过滤，所得固体用二氯甲烷和DMF交替依次洗涤2-5次，之后加入无水甲醇收缩2次，每次5min，得到Fmoc-(Glu)n-(固相合成树脂)-OtBu，之后放入真空干燥器中待用。
根据本发明优选的，步骤(3)中脱除叔丁基、Fmoc保护基的方法为本领域现有技术；优选的，脱除叔丁基的方法为：将Fmoc-(Glu)n-(固相合成树脂)-OtBu加入TFA-DCM混合溶液中，室温下反应2h，同时加入三乙基硅烷作为正离子清除剂，所述TFA-DCM混合溶液中TFA和DCM体积比为1:1-2；得到Fmoc-(Glu)n-(固相合成树脂)-OH；优选的，脱除Fmoc保护基的方法为：将脱除叔丁基所得Fmoc-(Glu)n-(固相合成树脂)-OH加入体积分数为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，脱除Fmoc保护基，之后用DMF洗涤2-3次，干燥，得到NH2-(Glu)n-(固相合成树脂)-OH；用茚三酮溶液检测氨基端是否脱保护。
根据本发明优选的，步骤(4)中所述环化偶联剂为主环化偶联剂和辅环化偶联剂的组合，所述主环化偶联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N,N'-羰基二咪唑(CDI)中的一种；所述辅环化偶联剂为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)中的至少一种；所述主环化偶联剂与NH2-(Glu)n-(固相合成树脂)-OH的摩尔比为1-1.1:1，所述辅环化偶联剂与NH2-(Glu)n-(固相合成树脂)-OH的摩尔比为1-1.1:1。
根据本发明优选的，步骤(4)中所述酰胺缩合环化的时间为2-4h；反应完成后，将所得反应液过滤，所得固体用二氯甲烷和DMF交替依次洗涤3-5次，之后在50℃下干燥2-3h，得到肽树脂。
根据本发明优选的，步骤(4)中固相合成树脂的裂解步骤为：将酰胺缩合环化所得肽树脂加入裂解液中，在0-5℃下搅拌20-30min，之后升至室温，继续搅拌2-3h；过滤除去树脂，用三氟乙酸洗涤树脂，之后除去三氟乙酸，向剩余溶液中加入2-4倍体积的乙醇，析出沉淀，过滤，在40-60℃下干燥4-8h，即得环状γ-聚谷氨酸；进一步优选的，所述裂解液为三氟乙酸、三异丙基硅烷和水的混合液，混合液中三氟乙酸、三异丙基硅烷、水的体积比为90-95:2.5-5:2.5-5。
一种环状γ-聚谷氨酸采用上述制备方法制备得到。
根据本发明，上述环状γ-聚谷氨酸在制备缓释保湿、美白、抗氧化化妆品中的应用。
本发明的技术特点及有益效果如下：
1、本发明通过加入特定的γ-谷氨酰转肽酶，调控酶解时间得到不同分子量的直链聚谷氨酸，通过环化反应直接得到不同分子量的环状γ-聚谷氨酸。本发明的合成方法制备环状γ-聚谷氨酸，成本低，产量高，原料来源广泛，适合大规模工业化生产。
2、与直链分子相比，环状分子没有游离的N端和C端，对于氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低，较线性肽更为稳定。本发明所得环状γ-聚谷氨酸通过改善皮肤水分状态和减少皮肤水分流失表现出更好的保湿功效，更适合作为抗酪氨酸酶和抗黑素生成剂，具有更好的皮肤渗透性，并且所得环状γ-聚谷氨酸具有一定的包埋作用，可以对维生素C等易被氧化的活性成分进行包埋掩蔽，发挥双重保湿、美白，缓释抗氧化作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。
同时下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂、材料和设备，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
一种5元环状γ-聚谷氨酸的制备方法，包括步骤如下：
(1)向5L烧杯中加入1L纯化水，边搅拌边缓慢加入10g分子量为100kDa的γ-聚谷氨酸，搅拌至完全溶解，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为8.5，调节温度为37℃，然后加入γ-谷氨酰转肽酶(酶活力为10U/mL)4mL，保温酶解反应5h；将所得酶解液在70℃保温30min灭酶，之后用0.45μm的滤膜过滤，然后所得滤液用截留分子量为600-700Da的超滤膜进行超滤除去大分子蛋白类物质，收集透过液，得到除蛋白的料液；接着用孔径为1nm的纳滤膜对料液进行浓缩，浓缩至料液固含量为25％，得到浓缩液；向浓缩液中缓慢加入浓缩液质量1％的氯化钠，搅拌至完全溶解，用1mol/L盐酸溶液调节体系pH至4.0，加入浓缩液3倍体积的乙醇进行沉淀，收集沉淀，然后用乙醇洗涤3次，在50℃下真空干燥6h，得5元线性γ-聚谷氨酸，其结构式如下式I-1所示：
(2)树脂的活化：秤取Wang树脂(Sigma，货号：17095)0.5g，加入圆底烧瓶中，再加入10mL DMF，在40℃下浸泡30min，使树脂充分溶胀以活化待用。
(3)氨基端和末端羧基的保护：在250mL三口烧瓶中依次加入1,4-二氧六环50mL、步骤(1)所得5元线性γ-聚谷氨酸28.3g，然后在搅拌和0-5℃的低温下滴加质量分数为98％的浓硫酸4mL，在5℃下，通入异丁烯，TLC检测(展开剂：甲醇：乙酸乙醋＝1:1；显色剂：茚三酮)直至5元线性γ-聚谷氨酸中末端羧基反应完全；将上述反应液用冰水浴降温至0℃，加入质量分数为20％的NaOH溶液调节pH＝7，再加入0.1mol/L的Na2CO3溶液调节pH至9.5，继续搅拌30min至pH值没有变化。在0-5℃下，向已经调节好pH值的反应液中滴加含有9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc-Osu，15g)的1,4-二氧六环溶液(25mL)，滴加时间为15min，滴加完后，撤除冷却，升至室温，搅拌反应，直至5元线性γ-聚谷氨酸中氨基端反应完全(检测方法：TLC，展开剂：纯乙酸乙酯，紫外灯显色，茚三酮显色)；之后抽滤，滤液用乙醚萃取，将分液所得水相降温至0-5℃，向水相中加入稀盐酸溶液(2mol/L)调节pH值为5.5，之后用乙酸乙酯萃取后，用水洗涤分液所得有机相，向有机相中加入无水硫酸镁进行干燥，旋蒸除去溶剂，冷却得到白色粗品；将所得粗品使用二氯甲烷和石油醚进行重结晶，得到Fmoc-(Glu)5-OtBu，重结晶过程为：加入与粗品质量等体积的二氯甲烷溶解，再加入与二氯甲烷等体积的石油醚，4℃冷藏析晶1h，过滤，用无水乙醇洗涤3次，50℃下干燥2h，得到Fmoc-(Glu)5-OtBu。
(4)Fmoc-(Glu)5-OtBu与Wang树脂的连接：称取偶联剂HBTU 0.5g，Fmoc-(Glu)5-OtBu 1.2g，依次加入步骤(2)溶胀好Wang树脂中，在40℃下搅拌3h；反应完成后，将反应液过滤，用二氯甲烷和DMF交替各洗涤树脂3次，每次加入15mL无水甲醇收缩树脂2次，每次5min，抽干，得到Fmoc-(Glu)5-(固相合成树脂)-OtBu，放入真空干燥器中待用。
(5)叔丁基的脱除：将步骤(4)中得到的Fmoc-(Glu)5-(固相合成树脂)-OtBu加入体积比为1:1的TFA-DCM混合溶液(15mL)中，室温下反应2h，同时加入0.1g三乙基硅烷作为正离子清除剂，过滤，得到Fmoc-(Glu)5-(固相合成树脂)-OH。
(6)Fmoc的脱除：将步骤(5)得到Fmoc-(Glu)5-(固相合成树脂)-OH加入20mL体积分数为20％的哌啶的DMF溶液中，室温下反应10min，再加入10mL体积分数为20％的哌啶的DMF溶液，继续反应20min；将所得反应液过滤去除溶液，用DMF洗涤两次，洗掉残留的哌啶，在50℃下干燥2h，得到NH2-(Glu)5-(固相合成树脂)-OH。用茚三酮检测氨基端是否已经脱保护：将反应液液过滤去除溶剂，所得固体用DMF洗涤两次，洗掉残留的哌啶，然后取少量的反应物于试管中，加入少量6％的茚三酮溶液，在沸水中水浴5min，观察是否变色，结果变成蓝紫色，说明氨基酸的氨基端已经脱保护。
(7)首尾环化：称取EDCI 0.2g(1mmol)、HBTU 0.4g(1mmol)、NH2-(Glu)5-(固相合成树脂)-OH 0.7g(1mmol)，在室温下搅拌2h，进行环化，之后将所得反应液过滤，所得固体用二氯甲烷和DMF交替各洗涤5次，之后在50℃下干燥2h，得到肽树脂。反应过程用用茚三酮检测：取反应液过滤，所得固体，用二氯甲烷和DMF交替依次洗涤，所得固体于试管中，加入少量6％的茚三酮溶液，在沸水中水浴5min，观察是否变色，结果为无色，说明氨基酸的氨基端已经完全反应。
(8)肽树脂裂解：将肽树脂置于茄形瓶中，0-5℃冰浴条件下加入30mL现配置的裂解液(三氟乙酸：三异丙基硅烷：水的体积比为90:5:5)，搅拌30min，之后升至室温，室温下继续搅拌反应2h；反应完成后，反应液经G4砂芯漏斗过滤除去树脂，10mL三氟乙酸洗涤，减压蒸馏除去三氟乙酸，向剩余溶液中加入其3倍体积的乙醇进行沉淀，过滤收集沉淀，然后用乙醇洗涤3次，在50℃真空干燥6h，得5元环状γ-聚谷氨酸。
对本实施例制备得到的环状γ-聚谷氨酸进行含量的测定，具体方法如下：
(1)高效液相色谱：Waters 2489。
(2)色谱条件：色谱柱：4.6*150mm,kromasil C18-5；检测器：紫外检测器；检测波长：214nm；流动相A：含0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B：含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：20uL；梯度运行表如下表所示：
时间(min) 流动相A 流动相B
0.01 95 5
25 30 70
45 95 5
(3)γ-聚谷氨酸标准溶液：称取γ-聚谷氨酸标准品(纯度≥99％)适量，用流动相A-流动相B(95:5)溶解，配置成1.0mg/mL，用0.22μm滤膜过滤。
(4)样品处理：称取实施例1中样品适量，用流动相A-流动相B(95:5)溶解，配置成1.0mg/mL，用0.22μm滤膜过滤。
(5)含量测定：将γ-聚谷氨酸标准溶液和样品溶液注入液相色谱仪中，记录峰面积，得到环状γ-聚谷氨酸含量为97.29％。
实施例2
一种6元环状γ-聚谷氨酸的制备方法，包括步骤如下：
(1)向5L烧杯中加入1L纯化水，边搅拌边缓慢加入10g分子量为100kDa的γ-聚谷氨酸，搅拌至完全溶解，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为8.5，调节温度为37℃，然后加入γ-谷氨酰转肽酶(酶活力为10U/mL)4mL，保温酶解反应5h；将所得酶解液在70℃保温30min灭酶，之后用0.45μm滤膜过滤，然后所得滤液用截留分子量为700-800Da的超滤膜进行超滤除去大分子蛋白类物质，收集透过液，得到除蛋白的料液；接着用孔径为1nm的纳滤膜对料液进行浓缩，浓缩至料液固含量为25％，得到浓缩液；向浓缩液中缓慢加入浓缩液质量1％的氯化钠，搅拌至完全溶解，用1mol/L盐酸调节体系pH至4.0，加入浓缩液3倍体积的乙醇沉淀，收集沉淀，然后用乙醇洗涤3次，在50℃下真空干燥6h，得6元线性γ-聚谷氨酸，其结构式如下式I-2所示：
(2)树脂的活化：秤取Wang树脂(Sigma，货号：17095)0.5g，加入圆底烧瓶中，再加入10mL DMF，在40℃下浸泡30min，使树脂充分溶胀以活化待用。
(3)氨基端和末端羧基上保护：在250mL三口烧瓶中依次加入1,4-二氧六环50mL、步骤(1)所得6元线性γ-聚谷氨酸30g，然后在搅拌和0-5℃的低温下滴加质量分数为98％浓硫酸4mL，在5℃下，通入异丁烯，TLC检测(展开剂：甲醇：乙酸乙醋＝1:1；显色剂：茚三酮)直至6元线性γ-聚谷氨酸中末端羧基反应完全；将上述反应液用冰水浴降温至0℃，加入质量分数为20％NaOH溶液调节pH＝7，再加入0.1mol/L的Na2CO3溶液调节pH至9.5，继续搅拌30min至pH值没有变化。在0-5℃下，向已经调节好pH值的反应液中滴加含有9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc-Osu，15g)的1,4-二氧六环溶液(25mL)，滴加时间为15min，滴加完后，撤除冷却，升至室温，搅拌反应，直至6元线性γ-聚谷氨酸中氨基端反应完全(检测方法：TLC，展开剂：纯乙酸乙酯，紫外灯显色，茚三酮显色)；之后抽滤，滤液用乙醚萃取，将分液所得水相降温至0-5℃，向水相中加入稀盐酸溶液(2mol/L)调节pH值为5.5，之后用乙酸乙酯萃取，用水洗涤所得有机相，向有机相中加入无水硫酸镁进行干燥，旋蒸除去溶剂，得到白色粗品；将所得粗品使用二氯甲烷和石油醚进行重结晶，得到Fmoc-(Glu)5-OtBu，重结晶过程为：加入与粗品质量等体积的二氯甲烷溶解，再加入与二氯甲烷等体积的石油醚，4℃冷藏析晶1h，过滤，用无水乙醇洗涤3次，50℃下干燥2h，得到Fmoc-(Glu)6-OtBu。
(4)Fmoc-(Glu)6-OtBu与Wang树脂的连接：称取偶联剂HBTU 0.5g，Fmoc-(Glu)6-OtBu 1.8g，依次加入步骤(2)溶胀好Wang树脂中，在40℃下低速搅拌3h；反应完成后，将反应液过滤，用二氯甲烷和DMF交替各洗涤树脂3次，每次加入15mL无水甲醇收缩树脂2次，每次5min，抽干，得到Fmoc-(Glu)6-(固相合成树脂)-OtBu，放入真空干燥器中待用。
(5)叔丁基的脱除：将步骤(4)中得到的Fmoc-(Glu)6-(固相合成树脂)-OtBu加入体积比为1:1的TFA-DCM混合溶液(15mL)中，室温下反应2h，同时加入0.1g三乙基硅烷作为正离子清除剂，过滤，得到Fmoc-(Glu)6-(固相合成树脂)-OH。
(6)Fmoc的脱除：将步骤(5)得到Fmoc-(Glu)6-(固相合成树脂)-OH加入20mL体积分数为20％的哌啶的DMF溶液中，室温下反应10min，再加入10mL体积分数为20％的哌啶的DMF溶液，继续反应20min；将所得反应液过滤去除溶液，用DMF洗涤两次，洗掉残留的哌啶，在50℃下干燥2h，得到NH2-(Glu)6-(固相合成树脂)-OH。用茚三酮检测氨基端是否已经脱保护：将反应液液过滤去除溶剂，所得固体用DMF洗涤两次，洗掉残留的哌啶，然后取少量的反应物于试管中，加入少量6％的茚三酮溶液，在沸水中水浴5min，观察是否变色，结果变成蓝紫色，说明氨基酸的氨基端已经脱保护。
(7)首尾环化：称取EDCI 0.2g(1mmol)、HBTU 0.4g(1mmol)、NH2-(Glu)6-(固相合成树脂)-OH 1.0g(1mmol)，在室温下低速搅拌2h，进行环化，之后将所得反应液过滤，所得固体用二氯甲烷和DMF交替各洗涤5次，之后在50℃下干燥2h，得到肽树脂。反应过程用用茚三酮检测：取反应液过滤，所得固体，用二氯甲烷和DMF交替依次洗涤，所得固体于试管中，加入少量6％的茚三酮溶液，在沸水中水浴5min，观察是否变色，结果为无色，说明氨基酸的氨基端已经完全反应。
(8)肽树脂裂解：将肽树脂置于茄形瓶中，0-5℃冰浴条件下加入30mL现配置的裂解液(三氟乙酸：三异丙基硅烷：水的体积比为90:5:5)，搅拌30min，之后升至室温，室温下继续搅拌反应2h；反应完成后，反应液经G4砂芯漏斗过滤除去树脂，10mL三氟乙酸洗涤，减压蒸馏除去三氟乙酸，向剩余溶液中加入其3倍体积的乙醇沉淀，过滤收集沉淀，然后用乙醇洗涤3次，50℃真空干燥6h，得6元环状γ-聚谷氨酸。
试验例1
实施例1环状γ-聚谷氨酸对B16细胞内酪氨酸酶活性的抑制作用
取对数生长期B16细胞接种于96孔板上，密度为1×104个/孔，每孔接种100μL；置于37℃、5％的CO2的培养箱中培养24h，使细胞完全贴壁。移去培养基，PBS清洗，依次加入空白培养基、培养基稀释的质量分数2％刺梨原液、培养基稀释的质量分数2％玫瑰精油、培养基稀释的质量分数为2％直链γ-聚谷氨酸、培养基稀释的质量分数为2％环状γ-聚谷氨酸，37℃培养箱中孵育24h，移去培养基，PBS清洗。在每个孔内，加入100μL含1％体积分数的Triton X-100的溶液，封口膜密封酶标板，-80℃冰箱放置60min，然后将培养板取出，室温放置使细胞融化裂解，培养板37℃预热1h，在每个孔内加入10μL的1mg/mL的L-酪氨酸溶液，用酶标仪测定各孔于475nm处的吸光值，细胞内的酪氨酸酶活性抑制率按下列公式计算：
对B16细胞内酪氨酸酶活性的抑制率如下表1所示：
表1对B16细胞内酪氨酸酶活性的抑制率
由结果可知，环状γ-聚谷氨酸对酪氨酸酶活性抑制率高于刺梨原液、直链γ-聚谷氨酸和玫瑰精油，表明受试组中的环状γ-聚谷氨酸对于酪氨酸酶的活性具有一定的抑制作用，从而进一步说明环状γ-聚谷氨酸可通过抑制酪氨酸酶活性来减少皮肤的色素沉着，发挥美白作用。
试验例2
实施例1环状γ-聚谷氨酸对豚鼠皮肤黑色素沉着的抑制作用
将70只白色雌性豚鼠随机分为正常组、对照组、阳性组1、阳性组2、阳性组3、实验组1和实验组2，每组10只。对照组、阳性组1、阳性组2、阳性组3、实验组1和实验组2采用UVB照射诱导皮肤产生色素沉着。4周后，对豚鼠实验区黑素颗粒染色法(Masson-Fontana)和黑色素细胞染色法(Imokawa)下的黑素颗粒合成情况及黑色素细胞数量进行评价，其结果如表2所示。
表2小鼠各组干预方法
实验结果显示，阳性组1、阳性组2、阳性组3中2％的抗坏血酸磷酸酯钠、γ-聚谷氨酸(Mr约为80kDa)和γ-聚谷氨酸(Mr约为660kDa)均可使皮肤组织黑色素细胞及含黑色素颗粒的细胞数较对照组明显减少(P<0.05)；实验组1和实验组2中的环状γ-聚谷氨酸均可使皮肤组织黑色素细胞及含黑色素颗粒的细胞数较对照组明显减少(P<0.05)，环状γ-聚谷氨酸可使皮肤组织黑色素细胞及含黑色素颗粒的细胞数减少作用大于阳性对照组。
试验例3
实施例1环状γ-聚谷氨酸对维生素C的包埋作用。
以壳聚糖(CS)和环状γ-聚谷氨酸(γ-PGA)作为壁材，以维生素C作为活性物质进行纳米微囊化。在室温搅拌下，将20mL、2g/L的环状γ-PGA用微量注射泵按照5mL/h的速率滴加到0.2g/L的CS醋酸缓冲液(100mL，pH＝3.0)中，继续搅拌8h，透析除去未结合的小分子聚合物，得到γ-PGA-CS纳米载体。然后将20mL维生素C水溶液(1g/L)按照8mL/h的速率注入纳米载体中，搅拌过夜，将溶液冷冻干燥后得到维生素C纳米微囊。
取上述维生素C纳米溶液和维生素C水溶液各60mL，分别无菌装入3只30mL样品瓶中(每只装20mL)，加盖置于37℃培养箱内加速氧化。放置1个月后，维生素C纳米粒溶液呈浅黄色，而维生素C水溶液颜色变成黄棕色；维生素C在水溶液和纳米粒溶液中的残留率分别为5.5％和65.9％。由以上实验结果可以看出，环状γ-聚谷氨酸对维生素C具有包埋作用，二者组合可以发挥双重保湿、美白，缓释抗氧化作用。

Claims (9)

1.一种环状γ-聚谷氨酸的制备方法，包括步骤如下：
（1）调节γ-聚谷氨酸溶液的pH为7.5-9.5，之后加入γ-谷氨酰转肽酶，进行酶解；之后经灭酶、浓缩、醇沉、干燥，得到寡聚γ-聚谷氨酸；
（2）在1,4-二氧六环和硫酸体系中，由寡聚γ-聚谷氨酸与异丁烯反应进行末端羧基的保护，之后使侧链羧基成盐；再加入9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯的1,4-二氧六环溶液，对氨基端进行保护，得到Fmoc-(Glu)n-OtBu，其中，(Glu)n为由n个谷氨酸组成的缩合而成肽链，4≤n≤12，且n为整数；
（3）将Fmoc-(Glu)n-OtBu与固相合成树脂在偶联剂的存在下，进行偶联反应，经洗涤，得到Fmoc-(Glu)n-(固相合成树脂)-OtBu；之后依次脱除叔丁基、Fmoc保护基，得到NH2-(Glu)n-(固相合成树脂)-OH；
（4）将所得NH2-(Glu)n-(固相合成树脂)-OH在环化偶联剂的存在下，进行酰胺缩合环化，得到肽树脂；之后裂解固相合成树脂，得到环状γ-聚谷氨酸。
2.根据权利要求1所述环状γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述γ-聚谷氨酸的分子量为100kDa；所述γ-聚谷氨酸溶液的浓度为1-20g/L，使用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.5-9.5；
步骤（1）中所述γ-谷氨酰转肽酶的酶活力为10-15U/mL；所述γ-谷氨酰转肽酶的加入体积与γ-聚谷氨酸的质量之比为3-5mL:10g；所述酶解的温度为25-45℃；所述酶解的时间为3-6h。
3.根据权利要求1所述环状γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述灭酶步骤为：将酶解所得酶解液在55-70℃保持30-60min，进行酶的灭活；
所述浓缩步骤为：将灭酶所得溶液用0.2-0.5μm的滤膜过滤，所得滤液用截留分子量为500-1600Da的超滤膜进行超滤，得到除蛋白的料液，最后用孔径为1nm的纳滤膜对料液进行浓缩，浓缩至料液的固含量为20-30%，得到浓缩液；
所述醇沉步骤为：向浓缩所得浓缩液中加入浓缩液质量0.5-2%的氯化钠，搅拌至溶解，使用1mol/L盐酸溶液调节体系pH至3.0-5.0，之后加入浓缩液体积2-4倍的乙醇，析出沉淀，过滤后收集沉淀；所述干燥为将醇沉所得沉淀在40-60℃下真空干燥4-8h，得到寡聚γ-聚谷氨酸。
4.根据权利要求1所述环状γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述1,4-二氧六环的体积与寡聚γ-聚谷氨酸的质量之比为1-2mL:1g；所述浓硫酸的质量分数为98%，所述浓硫酸的体积与寡聚γ-聚谷氨酸的质量之比为0.1-0.2mL:1g；
所述异丁烯的加入量直至寡聚γ-聚谷氨酸中末端羧基反应完全；所述末端羧基的保护在0-5℃下进行；
所述侧链羧基成盐步骤为：将末端羧基的保护后所得反应液降温至0℃，加入质量分数为20%的NaOH溶液调节pH为7，之后加入0.1mol/L的Na2CO3溶液调节pH为9~10，之后搅拌至体系pH不再变化，即完成侧链羧基成盐。
5.根据权利要求1所述环状γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯-的1,4-二氧六环溶液的浓度为0.4-0.8g/mL；所述9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯与寡聚γ-聚谷氨酸中氨基的摩尔比为1-1.1:1；所述9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯-的1,4-二氧六环溶液在0-5℃下滴加入体系中，滴加时间为10-20min；之后氨基端进行保护步骤在室温下进行；
步骤（2）中，对氨基端进行保护后，还包括后处理步骤，具体后处理步骤如下：将氨基端进行保护后所得反应液过滤，所得滤液用乙醚萃取，之后将所得水相降温至0-5℃，向水相中加入2mol/L稀盐酸溶液调节pH值为5.5，之后用乙酸乙酯萃取，用水洗涤有机相，将有机相进行干燥，除去溶剂得到粗品；将所得粗品使用二氯甲烷和石油醚进行重结晶，得到Fmoc-(Glu)n-OtBu，二氯甲烷与石油醚的体积比为1:1。
6.根据权利要求1所述环状γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述固相合成树脂是Wang树脂或2-氯树脂；所述固相合成树脂使用前经溶胀处理，具体处理步骤为：称取固相合成树脂，加入圆底烧瓶中，再加入DMF，在40℃下浸泡30 min，使树脂充分溶胀以活化待用，所述固相合成树脂的质量与DMF的体积比为0.5g:10mL；
所述偶联剂为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐或1-羟基苯并三唑；所述偶联剂与Fmoc-(Glu)n-OtBu的摩尔比为1-1.1:1；所述偶联的条件为：在35-45℃下搅拌反应3-4h；所述洗涤步骤如下：将反应液过滤，所得固体用二氯甲烷和DMF交替依次洗涤2-5次，之后加入无水甲醇收缩2次，每次5min，得到Fmoc-(Glu)n-(固相合成树脂)-OtBu。
7.根据权利要求1所述环状γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述环化偶联剂为主环化偶联剂和辅环化偶联剂的组合，所述主环化偶联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N,N'-羰基二咪唑中的一种；所述辅环化偶联剂为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐中的至少一种；所述主环化偶联剂与NH2-(Glu)n-(固相合成树脂)-OH的摩尔比为1-1.1:1，所述辅环化偶联剂与NH2-(Glu)n-(固相合成树脂)-OH的摩尔比为1-1.1:1；
所述酰胺缩合环化的时间为2-4h；反应完成后，将所得反应液过滤，所得固体用二氯甲烷和DMF交替依次洗涤3-5次，之后在50℃下干燥2-3h，得到肽树脂。
8.根据权利要求1所述环状γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，步骤（4）中固相合成树脂的裂解步骤为：将酰胺缩合环化所得肽树脂加入裂解液中，在0-5℃下搅拌20-30min，之后升至室温，继续搅拌2-3h；过滤除去树脂，用三氟乙酸洗涤树脂，之后除去三氟乙酸，向剩余溶液中加入2-4倍体积的乙醇，析出沉淀，过滤，在40-60℃下干燥4-8h，即得环状γ-聚谷氨酸。
9.根据权利要求8所述环状γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，所述裂解液为三氟乙酸、三异丙基硅烷和水的混合液，混合液中三氟乙酸、三异丙基硅烷、水的体积比为90-95:2.5-5:2.5-5。
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