JP2022526485A - スルフォロブス細胞培養物からの古細菌型脂質を含む組成物を製造する方法 - Google Patents
スルフォロブス細胞培養物からの古細菌型脂質を含む組成物を製造する方法 Download PDFInfo
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Abstract
(1)スルフォロブス細胞培養物を75℃~85℃の温度及び1時間当たり0.025~0.035の増殖速度で増殖させ、古細菌培養物から古細菌型脂質を抽出して経口遅延治療のための使用のための組成物を得ること、又は
(2)スルフォロブス細胞培養物を75℃~85℃の温度及び1時間当たり0.005~0.015の増殖速度で増殖させ、古細菌培養物から古細菌型脂質を抽出して経口急速治療のための使用のための組成物を得ること、
を含む、スルフォロブス細胞培養物からの古細菌型脂質を含む組成物を製造する方法を提供する。本発明は、また、前記方法により得ることができる組成物を提供する。
Description
1)アーキアソームは複雑な環境(複雑な培地及び制御されない振とうフラスコ培養)において産生され、したがって非常に不均一であること、
2)アーキアソームは、規制ガイドライン(Quality by Design)と矛盾することに、定義された条件下で製造することができないこと、
3)古細菌の脂質組成を制御できないこと、
4)アーキアソームは、安価に(cost-efficiently)大量に製造することができないこと。
(1)スルフォロブス細胞培養物を75℃~85℃の温度及び1時間当たり0.025~0.035の増殖速度で増殖させ、古細菌培養物から古細菌型脂質を抽出して経口遅延治療のための使用のための組成物を得ること、又は
(2)スルフォロブス細胞培養物を75℃~85℃の温度及び1時間当たり0.005~0.015の増殖速度で増殖させ、古細菌培養物から古細菌型脂質を抽出して経口急速治療のための使用のための組成物を得ること、
を含む、スルフォロブス細胞培養物からの古細菌型脂質を含む組成物を製造する方法を提供する。
●保存安定性:アーキアソームは飽和したフィタニル鎖を含んでおり、そのため空気により酸化されない。結果として、アーキアソームは何らの変化なしに、室温においてクロロホルム/メタノール中で何年も保存することができる。
●熱安定性:従来のリポソームと比べたときの例えばSulfolobus acidocaldariusから作製されたアーキアソームの熱安定性は、35℃~40℃で透過性となりその積み荷を失う従来のリポソームとは異なり、アーキアソームはそれよりもずっと高い温度でも漏出性とはならなかったということを示した。熱適応性反応として配置(deposit)される古細菌型脂質中の環状構造は密な膜充填及び減少した膜流動性をもたらす。この高い熱安定性は、脂質ベジクルのインビボ適用に極めて重要な要件であるオートクレーブ処理による滅菌を可能にする。対照的に、従来のリポソームを熱滅菌すると凝集、加水分解、漏出を生じ、そのために滅菌リポソームの作製は厄介な試みとなる。
●pH安定性:インビトロのアッセイは、アーキアソームが酸性pHにおいて従来のリポソームよりも安定であることを明らかにした:pH3.0での21日間の保存の後、リポソームはその積み荷の最大60%を失ったが、アーキアソームは30%を失ったに過ぎなかった。
●リパーゼに対する安定性:胃腸管内のリパーゼはリポソームの重度の加水分解を引き起こし、その結果、カプセルに格納された積み荷の急速な放出が起こる。先の研究では、従来のリポソームがホスホリパーゼA2に4時間曝されたときに従来のリポソームは積み荷の最大100%を失ったことが示されたが、アーキアソームが失ったのは20%未満であった。
●胆汁塩の存在下での安定性:アーキアソームは模擬的なヒト胆汁中での37℃90分間のインキュベーション中にその積み荷の全てを保持することが示された。この時間は、胃内における脂質ベジクルの平均滞留時間よりも長い。
●リパーゼ及び胆汁塩の複合効果に対する安定性:胃腸管内で、脂質ベジクルはリパーゼと胆汁塩の両方に遭遇し、これらは脂質ベジクルの安定性に影響を与える。従来のリポソームは模擬的なヒト胆汁中の膵臓リパーゼの存在下でインキュベートされた場合、30分後において既にその積み荷の100%を失うが、リパーゼ及び胆汁塩はアーキアソームに対しては相乗効果を示さない。
●安全性、安定性、バイオアベイラビリティ、費用効率
●人体に対する毒性学的影響が無いこと
●非病的な炎症反応の誘導
●先天性免疫系と獲得免疫系との間のクロストークの促進
●液性抗体反応の強化及びT細胞媒介性応答の誘導
●環の数が異なるカルドアーキオール(複数)を用いることができる。
●短鎖脂質と長鎖脂質との混合物は、形成されるアーキアソームの安定性への影響を保証する。
●どちらの脂質も標的化薬物送達における使用のためのリンカーによる効率的な修飾(例えば、抗体フラグメント、アプタマー等の連結(attachment))のための官能基を十分な数、頭部基(head groups)に有している。
●頭部基が構造及び化学的性質において異なるため、この改変は、2つの脂質クラスのうちの一方に対して選択的に行うことができる。
別の態様によれば、本発明は、本発明に係る方法により得ることができる古細菌型脂質を含む組成物にも関する。これらの「テイラーメイド」アーキアソーム組成物は新規であり、患者に送達されるべき薬物をパッケージングするのに、特にヒトにおける治療的又は予防的使用のために適していることが既知である薬物を送達するのに高い有用性を有する。
図2は、増殖速度に応じた脂質パターンの組成を示す。
図3は、プロセスモードに応じた脂質パターンの組成を示す。
図4は、スルフォロブス アシドカルダリウスの主要な脂質の構造を示す。
図5は、増殖温度がシクロペンタン環の数に及ぼす影響を示す。
図6は、68℃で増殖させたバイオマスサンプルのスペクトルデータを示す。
図7は、75℃で増殖させたバイオマスサンプルのスペクトルデータを示す。
図8は、82℃で増殖させたバイオマスサンプルのスペクトルデータを示す。
図9は、0.010h-1の増殖速度で増殖させたバイオマスサンプルのスペクトルデータを示す。
図10は、0.020h-1の増殖速度で増殖させたバイオマスサンプルのスペクトルデータを示す。
図11は、0.034h-1の増殖速度で増殖させたバイオマスサンプルのスペクトルデータを示す。
図12は、フェドバッチモードで増殖させたバイオマスサンプルのスペクトルデータを示す。
図13は、連続モードで増殖させたバイオマスサンプルのスペクトルデータを示す。
本発明は、上流プロセスにおけるプロセスパラメータを変動させることにより定義され調整可能な組成を有するスルフォロブス アシドカルダリウスにおける独特の脂質パターンの製造のための技術を記載する。
本実施例は、上流プロセスの間における重要なプロセスパラメータ、例えば温度、増殖速度、プロセスモード、を変動させることにより、生物スルフォロブス アシドカルダリウスが異なる脂質パターン(別個の脂質フラクション同士の比率)を産み出したことを示す。したがって、結果として異なる脂質組成物を下流プロセシングの後に収穫することができる。脂質パターンは広範な数の重要プロセスパラメータ(温度、増殖速度、プロセスモード、圧力、浸透圧、培地組成、溶存酸素含有量等)により影響を受け得るため、パターンの非常に特異的な調整が可能である。
培養物は、制御されたバイオリアクター環境内において限定培地上で増殖させた。
温度は、それぞれの温度について3世代時間の期間68/75/82℃に設定し、その後にバイオマスサンプルを取得した。5つの主要な脂質フラクションの相対的な存在量をMALD-MS(陽イオンモード;Na+の添加無し)により決定した。結果は図1及び図5~8に示す。
増殖速度は、それぞれの増殖速度について3世代時間の期間0.010/0.020/0.034h-1に設定し、その後にバイオマスサンプルを取得した。5つの主要な脂質フラクションの相対的な存在量をMALD-MS(陽イオンモード;Na+の添加無し)により決定した。結果は図2、9、10及び11に示す。
培養は、それぞれのプロセスモードについて3世代時間の期間、異なるプロセスモード(フェドバッチモード及び連続モード)で行い、その後にバイオマスサンプルを取得した。5つの主要な脂質フラクションの相対的な存在量をMALD-MS(陽イオンモード;Na+の添加無し)により決定した。結果は図3、12、及び13に示す。
2.1 上流:スルフォロブス アシドカルダリウス DSM639のバイオリアクターでの培養
テーラーメイド古細菌型脂質を産生するために、S. acidocaldariusを連続プロセスモードで培養し、3世代時間以上にわたり一定のプロセス条件を確保した。連続フェーズの前に、バッチ及びフェドバッチフェーズをバイオマスの増量のために行った。以下の段落中の量(volumes)は例示的なものであって、必要に応じてスケールアップ又はスケールダウンすることができる。
式1: 一般的質量バランス
ci 化合物iの濃度[g/L]
VR リアクターの容積[L]
ri 成分iの反応速度[g/L/h]
右辺(定項(constant terms))を0と設定して、以下のように書き直す。
F0 フェドバッチの初期フィード速度[g/h]
μ 比増殖速度[h-1]
x0 初期バイオマス濃度[g/L]
V0 リアクターの開始体積[L]
s0 フィードの基質濃度[g/L]
YX/S バイオマス収率[g/g]
式4:フェドバッチフェーズの間のフィード速度の計算
連続フェーズの間、希釈率(D)の値は所望の増殖速度と同じに設定し(D=μ)、これにより希釈率は添加された酸ストリーム及びフィードの合計として計算した。既知の作動容積(working volume)(VR)を用いて、フィード速度(Fconti)をFconti=D×VRで計算した(ブロスの密度は1kg/Lと仮定した)。
14,000g15分の遠心分離により細胞を収穫した。上清を捨てた後、さらなる処理のために細胞ペレットを-20℃で保存した。1サンプルあたり100mL培養ブロスからの細胞ペレット(収穫時の乾燥細胞重量を表1に示す)を解凍し、10mLの氷冷酢酸アンモニウムバッファー(155mM)中に再懸濁した。氷/水浴されているガラスビーカー内で、超音波処理(パルス間に30秒の休息を挟みながら1分を6回)により懸濁液を破砕(homogenise)した。破砕(homogenisation)の後に、OD600が1.5になるように氷冷酢酸アンモニウムバッファー(155mM)でサンプルを希釈した。氷冷の2:1CHCl3/メタノール混合物3.3部を希釈された破砕物(homogenate)1部に加え、得られた混合物を1,400rpm、4℃で30分ボルテックスした。このサンプルを相分離のために遠心分離した(2分、1,000g、4℃)。有機相をガラスバイアルに回収し、サンプルを室温でN2を用いて乾燥するまで蒸発させた。この脂質をさらなる分析のために-20℃で保存した。
乾燥された脂質フラクションを、1:3CHCl3/メタノール混合物中に再構成した。これらのフラクションを、すぐに、MALDIマトリックスとしての2-4-,6-トリヒドロキシアセトフェノン(THAP)を用いたMALDIサンプル調製に用いた(ナトリウム付加物イオンの促進のための塩化ナトリウムの添加無し又は有りで、おおよそ15mgTHAP/mL)。最後に、384-ウェルプレートステンレス鋼MALDIターゲット上に付与(deposition)するためマトリックス及び分析物溶液を1:1で混合した。使用した質量分析機は、高エネルギーCID実験用の接地された(grounded)ガスコリジョンセルを装着した島津MALDI7090 TOF/RTOFタンデム飛行時間質量分析計であった(ELAB=20keV、コリジョンガス:ヘリウム)。タンデム質量分析実験の前に、サンプルを、陽イオン及び陰イオン反射TOF-MSで測定した。m/z3600までの質量較正を可能とする島津から供給されている市販のペプチド混合物を用いて質量較正を行った。陽イオンモードでは、塩ドープに依存して、主に、被分析分子の[M+Na]+及び[M+2Na-H]+付加物イオンが検出された。ほとんどの脂質はホスホイノシトール頭部基(head group)を含んでいた。全ての被分析物が、高エネルギーCID TOF/RTOF-MSにより特性決定された。対照的に、陰イオンモードでは、ホスホイノシトール含有脂質だけを検出した(中性脂質は検出しなかった)が、これは[M-H]-イオンも高エネルギーCID TOF/RTOF-MSにより特性決定されたからである。現在に至るまで、全ての帯電脂質被分析物がホスホイノシトール極性頭部基(head group)を含んでいる。この混合物中にさらに存在し得るより割合が低い(minor)脂質は、HPTLC分析及びマイクロ調製抽出の後に、MALDI分析により分析できる。
1. 古細菌細胞培養物を制御された条件で増殖させること、及び古細菌培養物から古細菌型脂質を抽出して古細菌型脂質を含む組成物を得ること、を含む、古細菌細胞培養物からの古細菌型脂質を含む組成物を製造する方法。
2. 前記制御された条件が、pH、増殖速度、温度、及びプロセスモードから選択される、実施形態1に記載の方法。
3. 前記古細菌細胞培養物が、S. acidocaldarius、M. hungatei、M. voltae、M. concilii、M. smithii、M. espanolae、T. acidophilum、M. mazei、M. espanole、T. acidophilum、H. salinarum、M. smithii、M. stadtmanae、H. halobium、H. morrhuae、M. jannaschii、S. islandicus、S. solfataricus、S. shibatae、S. tokodaii、S. Metallicus、M. sedula、H. hispanica、及び H.volcaniiの培養物である、実施形態1又は2に記載の方法。
4. 55℃~90℃、好ましくは70℃~85℃、特には75℃~85℃の温度で前記古細菌培養物を増殖させることを含む、実施形態1~3のうちいずれか1つに記載の方法。
5. 1時間あたり0.025~0.035、特には1時間あたり0.027~0.033の増殖速度、又は1時間あたり0.005~0.015、特には1時間あたり0.007~0.013の増殖速度で前記古細菌培養物を増殖させることを含む、実施形態1~4のうちいずれか1つに記載の方法。
6. 2~4のpH、好ましくは2.5~3.5のpHで前記古細菌培養物を増殖させることを含む、実施形態1~5のうちいずれか1つに記載の方法。
7. 連続モードで前記古細菌培養物を増殖させることを含む、実施形態1~6のうちいずれか1つに記載の方法。
8. バッチモード、特にフェドバッチモードで古細菌培養物を増殖させることを含む、実施形態1~6のうちいずれか1つに記載の方法。
9. 前記古細菌型脂質が、細胞及び/又は破砕された(homogenised)細胞を含む水相を有機相に抽出すること、好ましくはクロロホルム/メタノール有機相に抽出すること、及び前記有機相を前記水相から相分離することによって得られる、実施形態1~8のうちいずれか1つに記載の方法。
10. 前記細胞を培養後に破砕(homogenise)する、好ましくはホモジェナイゼーション、特に高圧ホモジェナイゼーション、又は超音波処理により破砕する、実施形態1~9のうちいずれか1つに記載の方法。
11. (1)スルフォロブス細胞培養物を75℃~85℃の温度及び1時間当たり0.025~0.035の増殖速度で増殖させ、古細菌培養物から古細菌型脂質を抽出して経口遅延治療のための使用のための組成物を得ること、又は
(2)スルフォロブス細胞培養物を75℃~85℃の温度及び1時間当たり0.005~0.015の増殖速度で増殖させ、古細菌培養物から古細菌型脂質を抽出して経口急速治療のための使用のための組成物を得ること、
を含む、スルフォロブス細胞培養物からの古細菌型脂質を含む組成物を製造する方法。
12. 前記スルフォロブス細胞培養物が、スルフォロブス アシドカルダリウス細胞の培養物である、実施例1~11のうちいずれか1つに記載の方法。
13. 経口遅延治療に使用するための前記組成物は、ジヘキソース-カルドアーキオール(2Hex-Cal)のフォスファチジルイノシトール-アーキオール(PI-Arc)に対する比が1:5~1:7、特に1:5.5~1:6.5である、実施形態1~12のうちいずれか1つに記載の方法。
14. 経口急速治療に使用するための前記組成物は、ジヘキソース-カルドアーキオール(2Hex-Cal)のフォスファチジルイノシトール-アーキオール(PI-Arc)に対する比が1:2~1:4、特に1:2.5~1:3.5である、実施形態1~12のうちいずれか1つに記載の方法。
15. 前記細胞を培養後に破砕(homogenise)する、好ましくはホモジェナイゼーション、特に高圧ホモジェナイゼーション、又は超音波処理により破砕する、実施形態1~14のうちいずれか1つに記載の方法。
16. 破砕された(homogenised)細胞をバッファーと、好ましくは酢酸アンモニウムバッファーと、特には、100~200mMの酢酸アンモニウムを含む酢酸アンモニウムバッファーと混合する、実施形態15に記載の方法。
17. 前記古細菌型脂質が、細胞及び/又は破砕された(homogenised)細胞を含む水相を有機相に抽出すること、好ましくはクロロホルム/メタノール有機相に抽出すること、及び前記有機相を前記水相から相分離することによって得られる、実施形態1~16のうちいずれか1つに記載の方法。
18. 前記有機相を蒸発させることにより、好ましくは前記有機相を乾燥状態に蒸発することにより、前記古細菌型脂質を得る、実施形態17に記載の方法。
19. 得られた前記古細菌型脂質は医薬的に活性な薬物と組み合わせられ、また好ましくは医薬的に許容可能なキャリアと組み合わせられ、古細菌型脂質及び前記医薬的に活性な薬物を含む組成物を得る、実施形態1~18のうちいずれか1つに記載の方法。
20. 前記古細菌型脂質を超臨界流体抽出、特に超臨界CO2による抽出、により得る、実施形態1~19のうちいずれか1つに記載の方法。
21. 実施形態1~20のうちいずれか1つに記載の方法により得ることができる、古細菌型脂質を含む組成物。
22. ジヘキソース-カルドアーキオール(2Hex-Cal)のフォスファチジルイノシトール-アーキオール(PI-Arc)に対する比が1:5~1:7又は1:2~1:4である、古細菌型脂質を含む組成物、好ましくは実施形態21に記載の組成物。
23. 薬物、好ましくはヒトでの医薬使用のための薬物、特には、製品を医薬品として上市するための欧州連合又は米国で発せられた承認の対象である薬物をさらに含む、実施形態21又は22に記載の組成物。
24. アーキアソームが5%w/w以上、好ましくは10%w/w以上のPI-Arc、及び50%w/w以上の2Hex-Calを含む、実施形態21~23のうちいずれか1つに記載の組成物(%w/wは、全脂質に対する%w/w)。
25. アーキアソームが、患者に投与すべき薬物として、抗原、経口薬、ワクチン、抗酸化剤、ウイルス様粒子、核酸、特にDNA、RNA、pDNA、抗生物質、ポリペプチド、又はタンパク質を含む、実施形態21~24のうちいずれか1つに記載の組成物。
26. アーキアソームが、経口、経粘膜、又は経皮での投与のためのものである、実施形態21~25のうちいずれか1つに記載の組成物。
27. 製品を医薬品として上市するための欧州連合又は米国で発せられた承認の対象であるリポソーム組成物において、リポソームを実施形態1~20のうちいずれか1つに記載の方法により提供されるアーキアソームに置き換えた、実施形態21~26のうちいずれか1つに記載の組成物。
Claims (24)
- (1)スルフォロブス細胞培養物を75℃~85℃の温度及び1時間当たり0.025~0.035の増殖速度で増殖させ、古細菌培養物から古細菌型脂質を抽出して経口遅延治療のための使用のための組成物を得ること、又は
(2)スルフォロブス細胞培養物を75℃~85℃の温度及び1時間当たり0.005~0.015の増殖速度で増殖させ、古細菌培養物から古細菌型脂質を抽出して経口急速治療のための使用のための組成物を得ること、
を含む、スルフォロブス細胞培養物からの古細菌型脂質を含む組成物を製造する方法。 - 前記スルフォロブス細胞培養物が、スルフォロブス アシドカルダリウス細胞の培養物である、請求項1に記載の方法。
- 経口遅延治療に使用するための前記組成物は、ジヘキソース-カルドアーキオール(2Hex-Cal)のフォスファチジルイノシトール-アーキオール(PI-Arc)に対する比が1:5~1:7、特に1:5.5~1:6.5である、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 急速遅延治療に使用するための前記組成物は、ジヘキソース-カルドアーキオール(2Hex-Cal)のフォスファチジルイノシトール-アーキオール(PI-Arc)に対する比が1:2~1:4、特に1:2.5~1:3.5である、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記細胞を培養後に破砕(homogenise)する、好ましくはホモジェナイゼーション、特に高圧ホモジェナイゼーション、又は超音波処理により破砕する、請求項1~4のうちいずれか一項に記載の方法。
- 破砕された(homogenised)前記細胞をバッファーと、好ましくは酢酸アンモニウムバッファーと、特には、100~200mMの酢酸アンモニウムを含む酢酸アンモニウムバッファーと混合する、請求項5に記載の方法。
- 前記古細菌型脂質が、細胞及び/又は破砕された(homogenised)細胞を含む水相を有機相に抽出すること、好ましくはクロロホルム/メタノール有機相に抽出すること、及び前記有機相を前記水相から相分離することによって得られる、請求項1~6のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機相を蒸発させることにより、好ましくは前記有機相を乾燥状態に蒸発することにより、前記古細菌型脂質を得る、請求項7に記載の方法。
- 得られた前記古細菌型脂質は医薬的に活性な薬物と組み合わせられ、また好ましくは医薬的に許容可能なキャリアと組み合わせられて、古細菌型脂質及び前記医薬的に活性な薬物を含む組成物を得る、請求項1~8のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記古細菌型脂質を超臨界流体抽出、好ましくは超臨界CO2による抽出、により得る、請求項1~9のうちいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~10のうちいずれか一項に記載の方法により得ることができる、古細菌型脂質を含む組成物。
- ジヘキソース-カルドアーキオール(2Hex-Cal)のフォスファチジルイノシトール-アーキオール(PI-Arc)に対する比が1:5~1:7又は1:2~1:4である、古細菌型脂質を含む組成物、好ましくは請求項11に記載の組成物。
- 薬物、好ましくはヒトでの医薬使用のための薬物、特には、製品を医薬品として上市するための欧州連合又は米国で発せられた承認の対象である薬物をさらに含む、請求項11又は請求項12に記載の組成物。
- アーキアソームが5%w/w以上、好ましくは10%w/w以上のPI-Arc、及び50%w/w以上の2Hex-Calを含む、請求項11~13のうちいずれか一項に記載の組成物(%w/wは、全脂質に対する%w/w)。
- 古細菌細胞培養物を制御された条件で増殖させること、及び古細菌培養物から古細菌型脂質を抽出して古細菌型脂質を含む組成物を得ること、を含む、古細菌細胞培養物からの古細菌型脂質を含む組成物を製造する方法。
- 前記制御された条件が、pH、増殖速度、温度、及びプロセスモードから選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記古細菌細胞培養物が、S. acidocaldarius、M. hungatei、M. voltae、M. concilii、M. smithii、M. espanolae、T. acidophilum、M. mazei、M. espanole、T. acidophilum、H. salinarum、M. smithii、M. stadtmanae、H. halobium、H. morrhuae、M. jannaschii、S. islandicus、S. solfataricus、S. shibatae、S. tokodaii、S. Metallicus、M. sedula、H. hispanica、及び H.volcaniiの培養物である、請求項15又は請求項16に記載の方法。
- 55℃~90℃、好ましくは70℃~85℃、特には75℃~85℃の温度で前記古細菌培養物を増殖させることを含む、請求項15~17のうちいずれか一項に記載の方法。
- 1時間あたり0.025~0.035、特には1時間あたり0.027~0.033の増殖速度、又は1時間あたり0.005~0.015、特には1時間あたり0.007~0.013の増殖速度で前記古細菌培養物を増殖させることを含む、請求項15~18のうちいずれか一項に記載の方法。
- 2~4のpH、好ましくは2.5~3.5のpHで前記古細菌培養物を増殖させることを含む、請求項15~19のうちいずれか一項に記載の方法。
- 連続モードで前記古細菌培養物を増殖させることを含む、請求項15~20のうちいずれか一項に記載の方法。
- バッチモード、特にフェドバッチモードで古細菌培養物を増殖させることを含む、請求項15~21のうちいずれか一項に記載の方法。
- 二相抽出、有機抽出、特にソックスレー、高圧若しくは高温抽出、イオン性液体抽出、又は超臨界流体抽出により古細菌型脂質を抽出することを含む、請求項15~22のうちいずれか一項に記載の方法。
- 水、ヘキサン、クロロホルム、アセトン、ジエチルエーテル、メタノール、エタノール、酢酸エチル、ジクロロメタン、MTBE、CO2、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる溶媒により古細菌型脂質を抽出することを含む、請求項15~23のうちいずれか一項に記載の方法。
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