KR20180134128A - 항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물 및 그 제조방법 - Google Patents
항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 파라플란타럼(Lactobacillus paraplantarum) 균주를 이용하여 꽃송이버섯을 발효시킨, 항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물을 개시한다. 본 발명의 꽃송이버섯 발효물의 제조방법은, (a) 꽃송이버섯을 물로 추출하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 추출된 추출물에 락토바실러스 파라플란타럼(Lactobacillus paraplantarum) 균주를 접종하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 균주 접종된 추출물을 발효시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 꽃송이버섯 발효물은 총 페놀 함량과 플라보노이드 함량이 높고 DPPH 라디칼 소거능이 높아 항산화 활성 효과가 우수하며 베타글루칸 함량이 높아 면역 증강 효과가 우수하다.
Description
본 발명은 항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 락토바실러스 파라플란타럼(Lactobacillus paraplantarum) 균주를 이용하여 발효된 꽃송이버섯 발효물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
꽃송이버섯(Sparassis crispa)은 담자균류 민주름버섯목 꽃송이버섯과의 버섯으로, 꽃송이버섯은 베타글루칸(β-glucan)을 다량 함유할 뿐만 아니라 베라트르산(veratric acid)과 같은 페놀계 화합물이 풍부한 것으로 알려져 있다. 베타글루칸은 비특이적 면역반응으로 정상세포의 면역체계를 활성화시켜 항암, 항바이러스, 항응고제, 항비만 등의 다양한 효능에 관여하고, 페놀산 계열의 성분들은 항산화, 항균, 항염증에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.
버섯에 포함된 베타글루칸과 같은 다당류는 인체 내의 소화 효소로는 분해되지 않고 또한 열수 추출할 경우 수율이 떨어지는데 이를 보완할 수 있는 기술 중 하나가 미생물을 이용한 발효이다. 발효는 미생물이 자신의 효소로 유기물을 분해 또는 변화시켜 특유한 최종산물을 만들어내는 것으로 면역증강, 항균, 항암 등의 효과를 보이는 생성물을 생산할 수 있다.
도 1에 꽃송이버섯 사진이 제시되어 있다. 꽃송이버섯은 크게 보아 상부에 물결 모양의 자실체와 그 자실체 하부에 기부(基部)로 이루어진다.
꽃송이버섯에서는 보통 자실체가 많이 사용되고 전체 꽃송이버섯에서 중량 기준으로 30~35% 정도를 차지하는 기부는 소각 등으로 폐기처분되는 경우가 많다.
꽃송이버섯의 기부에는 자실체보다 더 많은 양의 베타글루칸이 함유되어 있다는 연구결과도 알려져 있지만, 흔히 꽃송이버섯 재배방법(톱밥재배)을 통하여 나오는 꽃송이버섯 기부에는 톱밥이 박혀있어 기부의 활용에 어려움이 있다.
따라서 기존에 소각 처분되던 꽃송이버섯 기부를 활용할 수 있다면 꽃송이버섯 기부에 함유된 베타글루칸 등의 유효 물질을 이용하게 되는 잇점과 또한 쓰레기 발생을 줄여 환경오염을 줄일 수 있다는 잇점을 얻을 수 있다.
한국특허등록 제1275971에는 Lactobacillus casei 균주 등으로 발효된 꽃송이버섯 발효 추출물이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2015-144129호에는 Lactobacillus delbrueckii 균주 등으로 발효된 꽃송이버섯 발효물이 개시되어 있다. 그러나 상기한 선행 기술들은 항노화 및 피부주름 개선 효과만을 갖는 한계가 있었고 면역증진 효과는 기대하지 못하였다.
한편, 유용한 성분을 다량 함유한 꽃송이버섯을 동물에 사료첨가제 또는 생균제(probiotics)의 형태로 투여시 동물의 건강증진에도 기여할 것으로 기대된다. 특히 생균제는 함유된 미생물이 위산 및 답즙산에 대한 저항성을 가져 장까지 사멸하지 않고 도달하여야 생균제로서의 효용성을 발휘할 수 있다.
장어의 경우, 양식화가 진행되고 있는 가운데 고밀도, 속성장으로 양식하게 됨에 따라 양식 장어의 질병에 대한 면역력이 약화되고 있다. 따라서 양식 장어의 면역력 증진을 위한 면역증강물질의 개발이 시급히 요구되고 있으나 현재까지 이에 대한 연구가 미흡한 상황이다.
이에, 본 발명의 발명자는 락토바실러스 파라플란타럼 균주를 이용하여 꽃송이버섯을 발효시킨 발효물이 항산화 활성 및 면역 활성이 우수함을 확인하고, 또한 이를 동물의 사료첨가제(특히, 생균제)로 사용시 그 효용성을 높일 수 있음을 확인하고 본 발명에 이르렀다.
본 발명의 목적은 항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 꽃송이버섯 발효물을 포함하는 사료첨가제를 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 락토바실러스 파라플란타럼(Lactobacillus paraplantarum) 균주를 이용하여 꽃송이버섯을 발효시킨, 항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 꽃송이버섯은 꽃송이버섯의 자실체나 기부 단독 또는 이들의 혼합일 수 있다.
상기한 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
(a) 꽃송이버섯을 물로 추출하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 추출된 추출물에 락토바실러스 파라플란타럼(Lactobacillus paraplantarum) 균주를 접종하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 균주 접종된 추출물을 발효시키는 단계를 포함하는 항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 (c) 단계에서 발효는 33 내지 38℃에서 1 내지 5일 동안 실시하는 것일 수 있다.
상기한 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기한 항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물을 함유하는 사료첨가제를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 꽃송이버섯 발효물이 화장품, 건강보조식품 또는 약학조성물에 포함되어 사용될 수 있다.
본 발명의 꽃송이버섯 발효물은 총 페놀 함량과 플라보노이드 함량이 높고 DPPH 라디칼 소거능이 높아 항산화 활성 효과가 우수하다.
본 발명의 꽃송이버섯 발효물은 베타글루칸 함량이 높아 면역 증강 효과가 우수하다.
본 발명의 꽃송이버섯 발효물은 내산성 및 내답증성이 우수하고 대장균과 같은 유해균에 대한 항균 활성이 있는 락토바실러스 파라플란타럼 균주를 이용하여 발효됨으로써, 동물(가축, 어류 등)에 투여 시 상기 균주가 위와 소화관을 거쳐 장까지 생존하여 장내 유해 미생물을 억제하고 병원성 미생물 감염을 예방할 수 있는 등의 동물 면역을 증강시키는 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하면 기존에 소각 처분되던 꽃송이버섯 기부의 활용이 가능함으로써 원가를 절감할 수 있을 뿐만 아니라 쓰레기 발생을 줄여 환경오염을 방지할 수 있다.
본 발명의 꽃송이버섯 발효물은 화장품 조성물, 건강보조식품 조성물 또는 약학 조성물에 포함되어 사용될 수 있다.
도 1은 꽃송이버섯의 이미지를 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명에서 최종 선발된 락토바실러스 파라플란타럼(Lactobacillus paraplantarum) 균주의 염기서열을 나타내는 도이다.
도 3은 본 발명에서 최종 선발된 락토바실러스 파라플란타럼 균주의 16S rRNA 염기서열 분석에 따른 계통발생 분석도이다.
도 4는 본 발명의 꽃송이버섯 발효물의 총 페놀 함량을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 꽃송이버섯 발효물의 플라보노이드 함량을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 꽃송이버섯 발효물의 DPPH 라디칼 소거 활성도(DPPH radical scavenging activity)를 나타내는 그래프이다.
도 7은 장어 사육 실험 기간 동안 수조의 pH 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 장어 사육 실험 기간 동안 수조의 온도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 장어 치어의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 10은 장어 치어 혈청의 라이소자임 용균 활성(Lysozyme activity)을 나타내는 그래프이다.
도 11은 장어 치어의 혈청으로 처리 시 대장균 생균수를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명에서 최종 선발된 락토바실러스 파라플란타럼(Lactobacillus paraplantarum) 균주의 염기서열을 나타내는 도이다.
도 3은 본 발명에서 최종 선발된 락토바실러스 파라플란타럼 균주의 16S rRNA 염기서열 분석에 따른 계통발생 분석도이다.
도 4는 본 발명의 꽃송이버섯 발효물의 총 페놀 함량을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 꽃송이버섯 발효물의 플라보노이드 함량을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 꽃송이버섯 발효물의 DPPH 라디칼 소거 활성도(DPPH radical scavenging activity)를 나타내는 그래프이다.
도 7은 장어 사육 실험 기간 동안 수조의 pH 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 장어 사육 실험 기간 동안 수조의 온도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 장어 치어의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 10은 장어 치어 혈청의 라이소자임 용균 활성(Lysozyme activity)을 나타내는 그래프이다.
도 11은 장어 치어의 혈청으로 처리 시 대장균 생균수를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 일 실시형태는 항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물로, 락토바실러스 파라플란타럼(Lactobacillus paraplantarum) 균주를 이용하여 꽃송이버섯을 발효시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 꽃송이버섯은 꽃송이버섯의 자실체나 기부 단독, 또는 이들이 혼합되어 사용될 수 있다.
상기 꽃송이버섯 기부는 수확한 꽃송이버섯에서 자실체와 분리하는 과정을 거쳐 수득된다. 상기 꽃송이버섯이 톱밥재배 방법으로 수확된 경우에, 상기 자실체와 분리된 기부는 건식분쇄기로 톱밥을 제거하는 전처리 과정을 거친 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 꽃송이버섯은 분말 형태가 바람직하게 사용된다.
상기 락토바실러스 파라플란타럼 균주는 식물에서 유래된 유산균으로, 내산성과 내담즙성을 가지고 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)와 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 등의 유해균에 항균 활성을 가지는 것으로 알려져 있다.
유해균에 대한 항균 활성은 락토바실러스 파라플란타럼 균주에 의해 생성되는 박테리오신(bacteriocin)에 의한 것으로, 박테리오신이란 박테리아에 의해 생산되는 단백질 또는 단백질과 탄수화물의 복합체로 구성되어 있는 항균성 단백질로 알려져 있다.
락토바실러스 파라플란타럼 균주의 높은 내산성과 내담즙성은 EPS(exopolysaccharide)의 합성에 기인한 것으로 알려져 있다. EPS는 유산균의 발효과정에서 합성되는 물질로, EPS의 합성은 유산균이 유해 환경 조건에서 살아남을 수 있도록 도움을 주는 역할을 한다.
본 발명에 있어서, 상기 락토바실러스 파라플란타럼 균주는 발효식품에서 분리된 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 락토바실러스 파라플란타럼 균주는 Lactobacillus paraplantarum KNU25 또는 Lactobacillus paraplantarum AJ306297일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태는 항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물 제조방법에 관한 것으로,
(a) 꽃송이버섯을 물로 추출하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 추출된 추출물에 락토바실러스 파라플란타럼(Lactobacillus paraplantarum) 균주를 접종하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 균주 접종된 추출물을 발효시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명의 항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물 제조방법을 자세하게 설명한다.
본 발명의 꽃송이버섯 발효물 제조방법을 설명하는데 있어, 앞서 설명된 항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물과 동일하게 적용되는 것은 그 설명을 생략하는 것으로 한다.
우선, 꽃송이버섯을 물로 추출한다((a) 단계). 꽃송이버섯과 물의 비율은 중량기준으로 1 : 10 ~ 60이 바람직하다. 이때 꽃송이버섯은 분말 형태인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 꽃송이버섯은 자실체나 기부 단독, 또는 이들이 혼합되어 사용될 수 있고, 기부가 바람직하게 사용된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 (a) 단계에서 추출은 100 내지 150℃에서 5 내지 40분 동안 실시하는 것이 바람직하다. 추출은 내열내압성 용기에서 실시하는 것이 바람직하다. 추출온도가 100℃ 미만이면 꽃송이버섯 함유 유효성분의 추출 효율이 떨어지는 문제점이 있고, 150℃를 초과하면 추가되는 잇점없이 비경제적인 문제점이 있다. 또한 추출시간이 5분 미만이면 꽃송이버섯 함유 유효성분의 추출 효율이 떨어지는 문제점이 있고, 40분을 초과하면 추가되는 잇점없이 비경제적인 문제점이 있다. 보다 바람직하게는 115 내지 130℃에서 10 내지 20분 동안 추출 실시하는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 추출된 추출물을 상온으로 식힌 후 다음 단계를 진행하는 것이 바람직하다. 상기 상온은 15~30℃가 바람직하고, 보다 더 바람직한 온도는 20~25℃이다.
이어, 상기 추출된 추출물에 락토바실러스 파라플란타럼 균주를 접종한다((b) 단계).
이어, 상기 (b) 단계에서 균주 접종된 추출물을 발효시킨다((c) 단계).
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 (c) 단계에서 발효는 33 내지 38℃에서 1 내지 5일 동안 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물은 화장품, 건강보조식품, 또는 약학 조성물 제조에 유효성분으로 포함되어 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태는 상기한 꽃송이버섯 발효물을 함유하는 사료첨가제에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시형태는 상기한 꽃송이버섯 발효물을 함유하는 생균제에 관한 것이다.
본 발명의 사료첨가제 또는 생균제는 상기 유효 성분 외에 통상적인 약학적 담체 및 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 사료첨가제 또는 생균제는 가축용 또는 어류용 사료첨가제일 수 있다.
상기 가축은 개, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 토끼 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 어류는 장어, 잉어, 송어, 은어, 넙치, 조피볼락, 가물치 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 장어는 뱀장어, 꼼장어, 갯장어, 붕장어, 실뱀장어 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명의 꽃송이버섯 발효물 제조방법을 보다 자세하게 설명한다.
<실시예 1> 꽃송이버섯 발효에 적합한 미생물 선발
1-1. 발효식품으로부터 균주 분리
총 8종(배추김치, 갓김치, 동치미, 총각김치, 열무김치, 피클, 매실액, 요구르트)의 발효식품을 수집원으로 사용하였다. 상기 발효식품으로부터 미생물을 분리하기 위해 각 시료 1 g에 펩톤수 5 mL를 현탁하고 5분간 교반하였다. 그 후 현탁액을 10배 희석법을 활용하여 순차적으로 희석하고 nutrient agar 평판배지에 도말(塗抹)하고 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양된 미생물 중 분리가 가능한 single colony를 분리하여 배양하였다. 여러 colony들과 다른 양상을 띠는 colony들을 분리하여 MRS agar 배지에 접종하고 37℃에서 48시간 동안 배양하여 1차 분리 선발(27종)하였다.
1-2. 내산성 및 내담즙성 균주 선발
상기 1차 선발된 균주들의 위산에 대한 저항성을 확인하기 위하여 pH 2.5로 조정한 MRS broth에 상기 1차 선발된 균주들을 각각 1% 접종하고 37℃에서 48시간 배양한 후 균 생존율을 확인하였다. 담즙에 대한 저항성을 확인하기 위하여 Oxgall (Difco, Sparks, MD, USA) 0.3% (w/v)를 첨가하여 제조한 담즙성 배지에 상기 1차 선발된 균주들을 각각 1% 접종하고 37℃에서 48시간 배양하여 균 생존율을 확인하였다. 상기 위산 및 담즙성 배지에서 균 생존율이 우수한 균주를 2차로 선발하였다.
1-3. 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균 활성
TSB(trypticase soy broth) 배지에 1%의 Agar를 첨가하고 오토클레이브(autoclave)에서 멸균한 후(105℃, 15 min) 페트리접시(petridish)에 분주하여 응고하였다. 그 후 활성화된 E. coli 배양액에 100 μL씩 분주하여 배양하였다(37℃, 24 h). 각각의 disk paper에 상기 2차 선발 균주가 활성화된 액체배지를 적시고 이를 E. coli가 배양된 평판배지에 넣고 배양한(37℃, 48 h) 후 disk paper의 clear zone 직경(mm)을 비교하여 E. coli에 대한 항균 활성을 평가하였다.
1-4. 선발 균주 동정(identification)
내산성, 내담즙성 및 대장균 항균 활성의 결과를 종합하였을 때 가장 효율이 우수한 5-2 균주를 최종 선발하고, 최종 선발된 균주의 16S ribosomal RNA sequencing을 다음과 같은 방법으로 수행하였다: 선발 균주의 chromosomal DNA을 Wizard genomic DNA purification kit(Promega, Madison, USA)를 이용해 분리한 후 16S rRNA sequencing에 사용하는 universal primer인 27F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하여 MyCycler Thermal Cycler system을 이용해 PCR 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel and PCR clean-up system(Promega, Madison, USA)을 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing kits(Applied Biosystems Co., Waltham, USA)를 사용하여 ABI PRISM 3730XL Analyzer(96 capillary type)를 통해 염기서열을 분석하였다. 분석 결과는 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 ribosomal DNA sequence와 비교하였으며, sequence의 상동성은 Clustal X 와 Mega 2 program을 이용하여 비교 분석하였다.
도 2에 본 발명의 최종 선발 균주의 염기서열이 제시되어 있고, 도 3에 본 발명의 최종 선발 균주의 16S rRNA 염기서열 분석에 따른 계통발생 분석도가 제시되어 있다. 미생물 동정 결과, 최종 선발 균주 5-2는 락토바실러스 파라플란타럼(Lactobacillus paraplantarum)과 99% 유사성을 보인 것으로 확인되었다. 도 3에서 스케일바(scale bar)는 0.002% 뉴클레오타이드(nucleotide) 차이를 나타낸다.
<실시예 2> 꽃송이버섯 발효물 제조
2-1. 균주 준비
실시예 1에서 최종 선발된 락토바실러스 파라플란타럼 균주를 MRS 배지에 접종한 후 37℃에서 48시간 동안 전배양시켜 스타터 균주를 준비하였다.
2-2. 꽃송이버섯 발효물 제조
꽃송이버섯은 백아산 꽃송이버섯 영농조합법인(Hwasun, Korea)에서 생물 상태로 구입한 것을 사용하였다. 상기 꽃송이버섯을 자실체와 기부로 구분하였다. 열풍건조기를 사용하여 상기 꽃송이버섯의 기부를 60℃에서 24시간 동안 건조시킨 후 분쇄기로 분쇄하여 분말 형태로 만들었다. 제조된 꽃송이버섯 기부 분말에 중량 기준으로 20배의 물을 넣고 오토클레이브(121℃, 15분)에서 추출하였다. 추출된 추출물을 상온으로 식힌 후, 상기에서 전배양된 락토바실러스 파라플란타럼 균주를 1%(v/v) 접종하여 37℃ 인큐베이터에서 48시간 동안 발효시켜 꽃송이버섯 발효물을 제조하였다.
<비교예>
실시예 2에서 제조된 꽃송이버섯 기부 분말에 중량 기준으로 20배의 물을 넣고 오토클레이브(121℃, 15분)에서 추출하여 꽃송이버섯 추출물을 제조하였다.
<실험예 1> 꽃송이버섯 발효물의 품질 특성
1-1. 베타글루칸 함량 측정
실시예에서 제조된 꽃송이버섯 발효물과 비교예에서 제조된 꽃송이버섯 추출물의 베타글루칸 함량 측정은 megazyme kit(mushroom and yeast β-glucan assay procedure kit)를 사용하여 측정하였다. 총 글루칸(Total glucan) 함량을 측정하기 위하여, 건조된 시료 100 mg에 37% HCl 1.5 mL를 넣고 30℃ 물중탕에서 45분간 교반한 후, 3차 증류수 10 mL를 가하고 100℃ 물중탕에서 다시 2시간 동안 교반하고, 위 반응액을 상온에서 2 N KOH 10 mL를 가하여 혼합한 후 0.2 M sodium acetate buffer(pH 5.0)를 가하여 100 mL로 정용하였다. 이 후 정용한 시료는 원심분리(1,500 g, 10 min)하여 상층액을 얻고, 얻은 상층액 0.1 mL에 exo-1,3-β-glucanase 20 U/mL와 β-glucosidase 4 U/mL 혼합 용액 0.1 mL를 첨가한 후 40℃ 물중탕에서 60분간 반응하였다. 위 반응액에 글루코스 산화효소/과산화효소(glucose oxidase/peroxidase, GOPOD) 시약 3 mL를 넣고 20분간 반응 후 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
알파글루칸(α-glucan) 함량을 측정하기 위하여, 시료 100 mg에 2 N KOH 2 mL를 넣고 얼음물중탕에서 20분간 교반하였다. 상기 반응액에 1.2 M sodium acetate buffer(pH 3.8) 8 mL를 넣고 amyloglucosidase 1630 U/mL와 invertase 500 U/mL 용액을 0.2 mL 가하여 40℃ 물중탕에서 30분간 교반한 후 원심분리(1,500 g, 10 min)하여 상등액을 얻었다. 상기 상등액 0.1 mL에 0.2 M sodium acetate buffer(pH 5.0) 0.1 mL와 GOPOD 시약 3 mL를 넣고 40℃에서 20분간 반응 후 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
표준물질인 글루코스 용액을 GOPOD 시약과 반응시킨 반응액의 흡광도를 이용하여, 상기 측정된 총 글루칸과 알파글루칸의 흡광도로부터 총 글루칸 및 알파글루칸 함량을 계산하여 구하였다. 베타글루칸 함량은 총 글루칸 함량에서 알파글루칸 함량을 빼준 값으로 계산하였다.
실시예의 꽃송이버섯 발효물의 베타글루칸 함량은 25.7 g/100 g, 비교예의 꽃송이버섯 추출물의 베타글루칸 함량은 23.7 g/100 g을 나타내어 락토바실러스 파라플란타럼 균주로 발효한 후에 베타글루칸 함량이 증가하였음을 확인할 수 있었다.
1-2. 총 페놀 함량 측정
꽃송이버섯 추출물 시료(실시예의 발효물 or 비교예의 추출물) 0.5 mL에 증류수 4.5 mL와 Folin-Ciocalteu's phenol reagent 0.5 mL를 넣고 5분간 반응시킨 뒤 7% Na2CO3 5 mL와 증류수 4 mL를 첨가하였다. 그 후 상온에서 90분간 반응시킨 뒤 UV spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 750 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였고 표준곡선은 갈산(gallic acid)을 이용하여 작성하였다(y=0.003x+0.0925, r2=0.9988).
도 4에 도시되어 있는 바와 같이, 발효 0시간(비교예)의 경우 총 페놀 함량이 177.57 ppm, 발효 48시간(실시예)의 경우 198.57 ppm의 결과를 보여, 락토바실러스 파라플란타럼 균주로 발효시킨 꽃송이버섯 발효물의 총 페놀 함량이 꽃송이버섯 추출물보다 높음을 확인하였다. 이는 락토바실러스 파라플란타럼 균주에 의한 발효 과정 중 생성된 대사산물의 영향으로 사료된다.
1-3. 플라보노이드 함량 측정
시료 1 mL에 증류수 4 mL와 5% NaNO2 0.3 mL를 넣고 6분간 반응시켰다. 그 후 1N NaOH 2 mL와 증류수 2.4 mL를 넣고 510 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였고, (+)-카데킨(catechin)을 이용하여 표준곡선을 작성하였다(y=0.0031x+0.027, r2=0.9966).
도 5에 도시되어 있는 바와 같이, 발효 0시간(비교예)의 경우 플라보노이드 함량이 1.93 ppm, 발효 48시간(실시예)의 경우 10.64 ppm의 결과를 보여, 락토바실러스 파라플란타럼 균주로 발효시킨 꽃송이버섯 발효물의 플라보노이드 함량이 꽃송이버섯 추출물보다 높음을 확인하였다.
1-4. DPPH 라디칼 소거 활성도 측정
시료 0.4 mL에 0.4 mM DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 용액 1.6 mL를 가하여 10분간 방치한 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기의 식으로 DPPH 라디칼 소거 활성도를 산출하였다.
도 6에 도시되어 있는 바와 같이, 발효 0시간(비교예)의 경우 DPPH 라디칼 소거 활성도가 65.13%, 발효 48시간(실시예)의 경우 81.25%의 결과를 보여, 락토바실러스 파라플란타럼 균주로 발효시킨 꽃송이버섯 발효물의 DPPH 라디칼 소거능이 꽃송이버섯 추출물보다 높음을 확인하였다. 본 결과는 꽃송이버섯 기부 추출물도 항산화 효과를 보이지만, 락토바실러스 파라플란타럼 균주를 이용하여 발효를 진행하면 항산화 효과가 증진됨을 보인다.
<실험예 2> 동물 실험을 통한 꽃송이버섯 발효물의 면역증강 효과
2-1. 실험 방법
(1) 장어 사육
시험어로 장어 치어를 사용하였고, 장어 치어는 중량 10 g 내외의 삐꼴라 품종을 사용하였다. 수조(지름 2 m, 1,900 L)당 1,000 마리 내외의 장어를 2주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
사료는 시판 뱀장어 성만사료(단백질 48% 이상, 지방 5% 이상)를 1일 2회 급이하였으며 사료 공급량은 어체중 대비 5%였다. 사료첨가제로서 실시예 2에서 제조된 꽃송이버섯 발효물 또는 비교예에서 제조된 꽃송이버섯 추출물이 사용되었고, 사료첨가제는 사료 100 중량부에 대하여 1 중량부의 비율로 혼합되어 사용되었다.
실험군을 다음과 같이 분리하였다: 사료첨가제를 급이하지 않은 대조군(control), 비교예에서 제조된 사료첨가제를 공급한 실험군 A, 실시예 2에서 제조된 사료첨가제를 공급한 실험군 B. 사료, 또는 사료첨가제가 혼합된 사료를 각 군별로 6주간 급이하였다.
사육수는 순환여과식으로 1일 24회 회전하였으며, 용존산소량(dissolved oxygen, DO)은 8~10 ppm, 수온은 28℃ 내외로 유지하였다.
면역실험에 사용될 혈청은 2주 간격으로 6주까지 채취하였고, 치어의 성장률과 폐사율, 수조 환경 등은 1일마다 기록하였다.
(2) 장어의 혈청 채취
장어 혈청 채취를 위해 각각의 실험수조에서 7마리씩 임의적으로 포획하였고, 포획한 장어는 얼음물에 10분간 방치하여 냉각마취시켰다. 상기 마취된 장어의 꼬리지느러미에서 2 cm 떨어진 곳을 절단하여 혈청을 EP tube에 채취하였다. 1시간 동안 방치한 후 원심분리(10,000 rpm, 10 min)하여 상등액을 얻었다. 그 후 4배의 0.005 M PBS(phosphate buffered saline)를 넣어 희석하고 -20℃에서 보관하였다.
(3) 장어 치어의 혈청 살균능
장어 치어의 혈청 살균능의 변화 정도를 알기 위해 Escherichia coli ATCC 25922를 TSA(Tryptic soy agar) 배지에서 37℃, 24시간 동안 배양하여 준비하였다. 준비된 E. coli는 멸균 생리식염수를 이용하여 1 ug/mL로 맞춘 후 혈청 희석액과 1:1로 혼합하였으며, 이 혼합액을 25℃로 교반 배양기에서 반응시키면서 0, 1, 3, 6시간 경과할 때마다 단계 희석하여 생균수를 계수하였다.
2-2. 실험 결과
(1) 장어의 양식 환경
수조의 pH는 시간이 지남에 따라 점차 감소하는 경향성을 나타내어 31일 차에 가장 낮은 pH값을 보였고 이후 증가하는 패턴을 보였다. 이러한 pH 변화의 원인은 치어의 분변에서 기인한 것으로 위장에서 흡수되지 않은 탄수화물이 치어의 장내 세균에 의해 발효가 되고 이의 분변이 산성을 띠기 때문이다. 치어의 경우 수조 환경 변화에 매우 민감한데 pH의 급격한 변화는 치어의 생존율에 많은 영향을 미칠 수 있다. 본 실험에서 수조의 pH는 6.7±0.3으로 치어의 생육 환경에 적합한 pH가 유지되었다(도 7). 실험수조의 온도는 28.4±1.1℃로 장어 양식의 적정온도로 유지되었다(도 8).
(2) 장어 치어의 생존율
도 9에 장어 치어의 생존율을 나타내는 그래프가 도시되어 있다. 도 9에 도시되어 있는 바와 같이, 일반 사료를 급이한 대조군이 93.82%로 가장 낮은 생존율을 보였고, 꽃송이버섯 추출물을 급이한 실험군 A는 97.53%, 꽃송이버섯 발효물을 급이한 실험군 B는 96.91%의 생존율을 보여, 대조군에 비하여 실험군 A와 실험군 B 모두 증가하였음을 확인하였다.
(3) 장어 치어 혈청의 라이소자임 용균 활성(Lysozyme activity)
도 10에 장어 치어 혈청의 라이소자임 용균 활성을 나타내는 그래프가 제시되어 있다. 도 10에 도시되어 있는 바와 같이, 대조군의 라이소자임 용균 활성은 12.3 unit, 실험군 A는 15.6 unit, 실험군 B는 54.6 unit을 나타내었다. 실험군 B에서 가장 높은 라이소자임 용균 활성을 보인 것은 생균제로 첨가된 락토바실러스 파라플란타럼 균주에서 생성된 박테리오신에 의한 효과로 추정된다.
(4) 장어 치어의 혈청 살균능
도 11에 장어 치어의 혈청으로 처리 시 대장균 생균수를 나타내는 그래프가 제시되어 있다. 도 11에 도시되어 있는 바와 같이, 대조군의 경우 초기 E. coli 생균수는 5.06 log cfu/mL였고 점차 증가하여 24시간에는 7.20 log cfu/mL를 나타내었다. 실험군 A의 경우는 초기 5.69 log cfu/mL, 24시간에는 6.75 log cfu/mL를 나타내었다. 실험군 B의 경우는 초기 5.61 log cfu/mL, 24시간에는 7.11 log cfu/mL를 나타내었다. 따라서 실험군 A 및 실험군 B의 경우 대조군 대비 E. coli 생균수가 감소하여 장어 치어의 혈청 살균능이 우수함을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 구체예가 제시되어 있지만 본 발명이 상기에 한정되는 것은 아니며 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 다양하게 변형 가능하고 이러한 변형은 하기한 본 발명의 청구범위에 속한다 할 것이다.
Claims (5)
- 락토바실러스 파라플란타럼(Lactobacillus paraplantarum) 균주를 이용하여 꽃송이버섯을 발효시킨, 항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물.
- 제1항에 있어서,
상기 꽃송이버섯은 꽃송이버섯의 자실체나 기부 단독 또는 이들의 혼합인 것을 특징으로 하는 꽃송이버섯 발효물. - 제1항에 있어서,
상기 꽃송이버섯 발효물이 화장품, 건강보조식품 또는 약학조성물에 포함되어 사용되는 것을 특징으로 하는 꽃송이버섯 발효물. - (a) 꽃송이버섯을 물로 추출하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 추출된 추출물에 락토바실러스 파라플란타럼(Lactobacillus paraplantarum) 균주를 접종하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 균주 접종된 추출물을 발효시키는 단계를 포함하는 항산화 활성 및 면역 활성을 가지는 꽃송이버섯 발효물 제조방법. - 제1항의 꽃송이버섯 발효물을 함유하는 사료첨가제.
Priority Applications (1)
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| KR102180666B1 (ko) * | 2019-08-30 | 2020-11-20 | 주식회사 리더스코스메틱 | 애플민트, 유자 및 꽃송이버섯 복합 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물 |
| KR102182984B1 (ko) * | 2019-05-17 | 2020-11-25 | 농업회사법인 한국소셜파머스랩 주식회사 | 가축용 사료 첨가제 및 이의 제조 방법 |
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- 2017-06-08 KR KR1020170071618A patent/KR20180134128A/ko active Search and Examination
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