BR112013028709B1 - uso de pelo cepas bacterianas capazes de metabolizar oxalatos, composição alimentícia, produto suplementar, dispositivo médico ou composição farmacêutica compreendendo as mesmas - Google Patents

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Abstract

CEPAS BACTERIANAS CAPAZES DE METABOLIZAR OXALATOS. A presente invenção refere-se a uma seleção de cepas de bactérias lácticas e bifidobactérias provenientes do intestino humano capazes de metabolizar oxalatos. Além disso, a presente invenção refere-se a uma composição alimentícia ou a um produto suplementar ou a uma composição farmacêutica contendo as referidas cepas bacterianas.

Description

[001] A presente invenção refere-se a uma seleção de cepas debactérias lácticas e bifidobactérias provenientes do intestino humano capazes de metabolizar ácido oxálico e/ou sais do mesmo (oxalatos). Além disso, a presente invenção refere-se a uma composição alimentícia ou produto suplementar ou dispositivo médico ou composição farmacêutica contendo as referidas cepas bacterianas.
[002] Oxalato (sal de ácido oxálico) é um composto ubíquo noreino vegetal, amplamente presente em todas as dietas humanas. A ingestão diária varia de 70 a 920 mg (média 495 mg ~ 5,6 mM), mas estes valores são facilmente ultrapassados nas dietas dos vegetarianos.
[003] O ácido oxálico (ácido dicarboxílico) é um dos compostos or-gânicos mais altamente oxidados e, portanto, age como um poderoso agente quelante para cátions, em particular o íon Ca2+. Por causa desta propriedade, os sais de ácido oxálico (oxalatos) são muito pouco usados nos processos catabólicos e na produção de energia. Além disso, o ácido oxálico é tóxico para a maioria dos seres vivos e particularmente para mamíferos.
[004] Por isso, o acúmulo de ácido oxálico e oxalatos no homempode desencadear e exacerbar uma série de condições patológicas, entre as quais podemos mencionar hiperoxaluria, urolitíase, insuficiência renal, cardiomiopatias e outras distúrbios cardíacos. Em particular, o ácido oxálico combina-se com cálcio para formar o oxalato de cálcio correspondente, um sal insolúvel que é responsável por mais de 70% dos cálculos renais diagnosticados. Além disso, o ácido oxálico é um poderoso agente inflamatório que afeta a mucosa intestinal. Portanto, a presença excessiva deste ácido no lúmen pode comprometer a função barreira natural do epitélio alterando sua permeabilidade e consequentemente provocando uma absorção aumentada de oxalato. Em particular, o cólon é o sítio principal de absorção de oxalato, com uma ingestão de 3-5% em condições fisiológicas normais. A redução do oxalato no lúmen intestinal poderia, portanto, contribuir para reduzir a absorção. Isto poderia então levar a uma redução na concentração de oxalatos no plasma e na urina, reduzindo assim sua periculosidade.
[005] Além disso, altos níveis de oxalatos no sangue podem levarà diverticulose ou diverticulite. Diverticulose, também conhecida como "doença diverticular”, é uma condição médica caracterizada por divertículos no cólon; estes são eversões da mucosa e submucosa do cólon através de áreas de relativa fraqueza da camada muscular na parede do cólon. Os divertículos são decididamente mais comuns no cólon sigmoide, que é uma porção do intestino caracterizada por uma pressão mais alta, um fator que facilita a formação de divertículos. Diverticulite é uma patologia do trato digestivo, caracterizada pela inflamação de um ou mais divertículos. A maioria dos casos de diverticulite ficam localizados no cólon (em particular no cólon descendente e sigmoide).
[006] Por conseguinte, é importante poder reduzir a quantidade deoxalatos no lúmen intestinal, plasma e urina de maneira a evitar as complicações relacionadas com altos valores de oxalatos, tais como, por exemplo, hiperoxaluria, urolitíase, insuficiência renal, cardiomiopatias e outros distúrbios cardíacos, cálculos renais, diverticulose e diverticulite.
[007] Em particular, é desejável poder reduzir os níveis de oxalatona urina de dois tipos de indivíduos: • Indivíduos hiperoxalúricos que não atendem a uma dieta com alto teor de oxalato. • Indivíduos normo-oxalúricos que atendem a uma dieta com alto teor de oxalato.
[008] A Requerente ofereceu uma resposta às necessidades men-cionadas acima depois de uma intensa atividade de pesquisa, ao final da qual ela identificou, a partir de um conjunto bastante vasto de cepas, uma seleção de cepas bacterianas pertencentes aos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium; as referidas cepas exibem uma capacidade acentuada para degradar quantitativamente oxalatos. As cepas selecionadas mostram capacidade para usar o oxalato como uma fonte de energia, removendo-o do ambiente no qual o referido oxalato deveria ser originalmente encontrado. Portanto, as cepas selecionadas são capazes de degradar oxalatos.
[009] A matéria da presente invenção refere-se a uma cepa bacte-riana pertencente aos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium e com capacidade para degradar oxalatos, como divulgado na reivindicação independente em anexo.
[0010] A matéria da presente invenção também se refere a umacomposição alimentícia ou produto suplementar ou dispositivo médico ou composição farmacêutica contendo as referidas cepas bacterianas, como divulgado na reivindicação independente em anexo.
[0011] Modalidades preferidas da presente invenção serão ilustra-das na descrição detalhada que se segue.
[0012] A Figura 1 mostra uma comparação entre o cromatogramapara um meio de cultura contendo 5 mM de oxalato antes (A) e depois (B) de purificação SPE.
[0013] A Figura 2 mostra cromatograma para um meio de culturacontendo 5 mM de oxalato (referência positiva).
[0014] A Figura 3 mostra cromatograma para a cepa bacteriana B.breve BR03 DSM 16604.
[0015] A Figura 4 mostra cromatograma para a cepa bacteriana L.paracasei spp. paracasei LPC09 DSM 24243.
[0016] A Figura 5 mostra curvas de acidificação (valor do pH) obtidas em função do tempo (T= 0, 3, 6, 8 e 10 horas) quando a cepa L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243 foi cultivada em um meio de cultura MRS sem açúcar (fonte de carbono), ao qual outras fontes de carbono (fibras) foram respectivamente adicionadas.
[0017] A Requerente desenvolveu um método capaz de identificare quantificar a capacidade de degradação de oxalato de culturas de cepas pertencentes aos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium.
[0018] A Requerente descobriu as cepas bacterianas a seguir pos-suem uma capacidade demonstrada para usar oxalatos como uma fonte de energia: (i) L. paracasei spp. paracasei LPC 09, depositada pela empresa Probiotical SpA of Novara (Itália) em 23.11.2010, com depósito número DSM 24243. (ii) L. gasseri LGS 01, depositada pela empresa Probiotical SpA of Novara (Itália) em 24.05.2006, com depósito número DSM 18299. (iii) L. gasseri LGS 02, depositada pela empresa Probiotical SpA of Novara (Itália) em 24.05.2006, com depósito número DSM 18300. (iv) L. acidophilus LA 07, depositada pela empresa Probiotical SpA of Novara (Itália) em 23.11.2010, com depósito número DSM 24303. (v) L. acidophilus LA 02, depositada pela empresa Probiotical SpA of Novara (Itália) em 06.08.2008, com depósito número DSM 21717. (vi) L. plantarum LP 01, depositada pela empresa Mofin Srl of Novara (Itália) junto à Instituição Depositária BCCM-LMG (Bélgica) em 16.10.2001, com depósito número LMG-P-21021, (vii) L. reuteri LRE 03, depositada pela empresa Probiotical SpA of Novara (Itália) em 05.08.2010, com depósito número DSM23879. (viii) L. reuteri LRE 02, depositada pela empresa Probiotical SpA of Novara (Itália) em 05.08.2010, com depósito número DSM 23878. (ix) B. breve BR 03, depositada pela empresa Probiotical SpA of Novara (Itália) em 16.07.2004, com depósito número DSM 16604. (x) B. longum BL 03, depositada pela empresa Probiotical SpA of Novara (Itália) em 20.07.2004, com depósito número DSM 16603. (xi) L. rhamnosus GG, ATCC 53103, disponível na coleção pública ATCC. (xii) L. reuteri LRE 04, depositada pela empresa Probiotical SpA of Novara (Itália) em 05.08.2010, com depósito número DSM 23880. (xiii) L. rhamnosus LR 06, depositada pela empresa Probiotical SpA of Novara (Itália) em 14.11.2008, com depósito número DSM 21981. (xiv) B. lactis BA 05, depositada pela empresa Probiotical SpA of Novara (Itália) em 15.06.2006, com depósito número DSM 18352. (xv) L. casei spp. rhamnosus LR 04, depositada pela empresa Probiotical SpA of Novara (Itália) em 20.07.2004, com depósito número DSM 16605.
[0019] Em uma modalidade preferida, a composição compreendeou, alternativamente, consiste em pelo menos uma cepa selecionada dentre aquelas descritas acima nos itens (i) a (xv); de preferência as cepas são selecionadas dentre aquelas descritas acima nos itens (i) a (viii).
[0020] No contexto da presente invenção, “cepa bacteriana” significa as células vivas e/ou mortas e/ou partes, componentes/derivados e/ou enzimas das mesmas.
[0021] As cepas bacterianas selecionadas pertencem ao gêneroLactobacillustêm capacidade para degradar e usar oxalato como uma fonte de energia em uma quantidade superior a 50%. Vantajosamente, a referida capacidade é superior a 60%. Vantajosamente, a referida capacidadeé superior a 70%.
[0022] As cepas bacterianas selecionadas pertencem à espécieLactobacillus paracasei. Uma cepa preferida é a L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243.
[0023] As cepas bacterianas selecionadas pertencem à espécieLactobacillus gasseri. Diversas cepas preferidas são selecionadas do grupo que compreende ou, alternativamente, consiste em L. gasseri LGS 01 DSM 18299 e L. gasseri LGS 02 DSM 18300.
[0024] As cepas bacterianas selecionadas pertencem à espécieLactobacillus acidophilus. Diversas cepas preferidas são selecionadas do grupo que compreende ou, alternativamente, consiste em L. acidophilus LA02 DSM 21717 e L. acidophilus LA 07 DSM 24303.
[0025] Uma composição de acordo com a presente invenção com-preende pelo menos uma cepa bacteriana, para uso no tratamento de hiperoxaluria, urolitíase, insuficiência renal, cardiopatias, cálculos renais, diverticulose e diverticulite.
[0026] A composição pode ser uma composição alimentícia ou pro-duto suplementar ou dispositivo médico ou composição farmacêutica.
[0027] A composição para uso no tratamento de hiperoxaluria, uro-litíase, insuficiência renal, cardiopatias, cálculos renais, diverticulose e diverticulite compreende ou, alternativamente, consiste em pelo menos duas cepas selecionadas dentre aquelas descritas acima nos itens (i) a (xv), de preferência as cepas são selecionadas dentre aquelas descritas acima nos itens (i) a (viii).
[0028] A composição para uso no tratamento de hiperoxaluria, uro-litíase, insuficiência renal, cardiopatias, cálculos renais, diverticulose e diverticulite compreende ou, alternativamente, consiste em pelo menos duas cepas selecionadas dentre aquelas descritas acima nos itens (i) a (v).
[0029] A composição para uso no tratamento de hiperoxaluria, uro-litíase, insuficiência renal, cardiopatias, cálculos renais, diverticulose e diverticulite compreende ou, alternativamente, consiste em: (a) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 -DSM 24243; ou (b) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 -DSM 24243 e L. gasseri LGS 01 -DSM 18299; ou (c) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 -DSM 24243 e L. gasseri LGS 02 -DSM 18300; ou (d) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 -DSM 24243, L. gasseri LGS 01 -DSM 18299 e L. gasseri LGS 02 -DSM 18300; ou (e) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 -DSM 24243, L. gasseri LGS 01 -DSM 18299, L. gasseri LGS 02 -DSM 18300 and L. acidophilus LA 07 -DSM 24303; ou (f) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 -DSM 24243, L. gasseri LGS 01 -DSM 18299, L. gasseri LGS 02 -DSM 18300 e L. acidophilus LA 02 -DSM 21717; ou (g) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 -DSM 24243, L. gasseri LGS 01 -DSM 18299, L. gasseri LGS 02 -DSM 18300, L. acidophilus LA 07 -DSM 24303 e L. acidophilus LA 02 -DSM 21717.
[0030] Todas as composições descritas acima, e particularmente ascomposições (a) a (g) listadas acima, podem compreender ainda frutooligossacarídeos (FOS) e/ou inulina. Fruto-oligossacarídeos (FOS) e/ou inulina são incluídos em uma quantidade compreendida entre 1 e 30% em peso, em relação ao peso da composição, de preferência entre 3 e 15%, ainda mais preferivelmente entre 5 e 10% em peso.
[0031] A matéria da presente invenção refere-se a uma cepa bacte-riana pertencente à espécie Lactobacillus paracasei ou Lactobacillus gasseri e que é capaz de degradar ácido oxálico e/ou sais do mesmo em uma quantidade superior a 60%. A referida cepa é capaz de degradarácido oxálico e/ou sais do mesmo em uma quantidade superior a 70%. A referida cepa pertencente à espécie Lactobacillus paracaseié L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243. A referida cepa pertencenteà espécie Lactobacillus gasserié selecionada do grupo que compreende a cepa L. gasseri LGS 01 DSM 18299 e a cepa L. gasseri LGS 02 DSM 18300. A referida cepa pertencente à espécie Lactobacillus gasserié selecionada do grupo que consiste na cepa L. gasseri LGS 01 DSM 18299 e a cepa L. gasseri LGS 02 DSM 18300. A matéria da presente invenção refere-se a uma composição alimentícia ou produto suplementar ou dispositivo médico ou composição farmacêutica compreendendo uma composição bacteriana; a referida composição bacteriana compreende pelo menos uma cepa bacteriana descrita acima, para uso no tratamento preventivo e curativo de hiperoxaluria, urolitíase, insuficiência renal, cardiopatias, cálculos renais, diverticulose e diverticulite. A referida composição bacteriana compreende a cepa L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243. A referida composição bacteriana compreende a cepa L. gasseri LGS 01 DSM 18299 e a cepa L. gasseri LGS 02 DSM 18300. A referida composição bacteriana compreende ainda a cepa L. acidophilus LA02 DSM 21717 e a cepa L. acidophilus LA 07 DSM 24303. A referida composição bacteriana consiste em L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243, L. acidophilus LA02 DSM 21717 e/ou L. acidophilus LA 07 DSM 24303. A referida composição compreende ainda fruto-oligossacarídeos e/ou inulina.
Parte Experimental 1. Cepas bacterianas analisadas
[0032] Cerca de 70 cepas pertencentes ao gênero Bifidobacterium e Lactobacillus foram estudadas; elas são provenientes da coleção interna de cepas da empresa Probiotical SpA of Novara e de coleções internacionais tais como, por exemplo, a DSMZ Alemanha, ou foram encontradas na literatura. As cepas selecionadas estão mostradas na Tabela 1, que mostra a percentagem de degradação de oxalato pelas cepas bacterianas testadas. A experiência foi conduzida usando-se um meio de cultura contendo oxalato de amônio a 5 mM. Tabela 1
Figure img0001
[0033] As cepas bacterianas (i) a (v), (vii) a (x) e (xii) a (xv) listadasna Tabela 1 foram depositadas pela empresa Probiotical SpA of Novara (Itália). A cepa (vi) foi depositada pela empresa Mofin Srl of Novara (Itália). A cepa (xi) encontra-se disponível na coleção ATCC. Todas as cepas encontram-se disponíveis e acessíveis ao público nas condições estipuladas pelo Tratado de Budapeste.
2.Condições de cultura adotadas
[0034] A preparação das cepas a serem submetidas à análise con-sistiu em uma série de três subculturas sequenciais no caldo MRS (+1% de cys-HCl, condições anaeróbicas, para os bifídeos) incubadas a 37 °C até que o crescimento adequado fosse atingido. Esta estratégia de cultura permite completar a ativação da cepa. As cepas foram subsequentemente inoculadas com a mesma percentagem de inóculo (2%) em um meio experimental, especificamente concebido para garantir crescimento máximo de lactobacilos e bifidobactérias, suplementado com oxalato de amônio 5mM (quantidade igual à ingestão diária média de ácido oxálico). As culturas preparadas dessa maneira foram incubadas por 24 horas a 37oC.
[0035] Ao final do período de incubação, as culturas em caldo foramcentrifugadas e o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de 0,22 μm. Injeção em HPLC das amostras revelou um perfil cromatográfico obscuro. Em particular, o pico cromatográfico de ácido oxálico pareceu sobrepor-se ao pico de glicose presente nas amostras. Para contornar o problema mencionado, as amostras foram purificadas usando-se colunas de SPE (extração em fase sólida) específicas para ácidos orgânicos. O protocolo para purificação por colunas SPE exigiu uma etapa de otimização para obtenção do melhor rendimento final. Em particular, diferentes reagentes foram usados na etapa de condicionamento na coluna e na eluição final do analito. Esta purificação em fase sólida torna possível obter um pico cromatográfico distintamente mais nítido do ácido oxálico, como pode ser visto na Figura 1 A-B. O protocolo usado foi o seguinte: Tipo de coluna SPE: Phenomenex Strata-XA Ativação: 1 ml de metanol Condicionamento: 2 ml de formiato de sódio a 20 mM Carga de amostra: amostra de 1 ml Lavagem das impurezas: 1 ml de acetato de amônio a 25 mM + 1 ml de metanol Eluição: 2x500 μl de HCl a 1 M + 2x500 μl de HCl a 3 M
4. Análise por HPLC
[0036] A quantidade de oxalato degradado por cada cepa individualfoi analisado por HPLC, calculando-se a diferença entre a concentração de oxalato presente no meio de cultura (5 mM) em T0 (antes da fermentação) e a concentração residual depois do crescimento do micro-organismo. Os resultados da cepa individual estão expressos como percentagens, considerando a concentração de oxalato em T0 igual a 100. Por exemplo, o resultado da cepa L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243, igual a cerca de 70%, indica que esta última é capaz de usar uma quantidade de oxalato igual a cerca de 3,5 mM de oxalato (70% de 5 mM). O protocolo de HPLC usado foi o seguinte: Tipo de coluna: Phenomenex Hydro-RP 250 x 4,6 mm Tipo de detector: UV-Vis com leitura a 220 nm Taxa de fluxo de eluição: 0,7 ml/min Volume de injeção: 20 μl Temperatura da coluna: 30°C Tipo de eluição: isocrática Fase móvel: fosfato de potássio 20 mM pH 2,0
[0037] As cepas bacterianas pertencentes ao gênero Lactobacillusque mostraram uma alta atividade de degradação contra ácido oxálico são aquelas indicadas acima por (i) a (v).
A. Determinação das curvas de acidificação para a cepa L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243.
[0038] A cepa LPC09 foi reativada antes da experiência por meiode subcultura em MRS e incubada em condições anaeróbicas a 37°C. As etapas de reativação foram repetidas três vezes antes da experiência com incubação por uma noite. Ao final da terceira etapa de reativação, as células foram pelotizadas, lavadas com água estéril e ressuspendidas antes de serem inoculadas nos meios de cultura suplementados com fibra. Os meios usados foram meios à base de MRS sem açúcar(fontes de carbono), suplementados, respectivamente, com: Glicose (solução esterilizada por tratamento térmico, 121°C 15’), meio de controle. Fruto-oligossacarídeos FOS (solução esterilizada por filtração, filtro de 0,20 μl). GOS-Gl, Galacto-oligossacarídeos com glicose residual (solução esterilizada por filtração, filtro de 0,20 μl). GOS-Gal, Galacto-oligossacarídeos com galactose residual (solução esterilizada por filtração, filtro de 0,20 μl). XOS, xilo-oligossacarídeos (solução esterilizada por filtração, filtro de 0,20 μl). Larex, fibra de lariço (solução esterilizada por tratamento térmico, 121°C 15’). Inulina (solução esterilizada por tratamento térmico, 121°C 15’).
[0039] A concentração final de fontes de carbono para todos osmeios foi de 20 g/l.
[0040] Os meios preparados dessa maneira foram então inoculadoscom a cepa LPC09, a uma percentagem de 4%, e incubados a 37°C em condições anaeróbicas.
[0041] No tempo 0 e 3, 6, 8 e 10 horas, foram feitas medições dopH a fim de construir as curvas de acidificação mostradas no gráfico da Figura 5.
[0042] A Tabela 2 mostras as curvas de acidificação (valor de pH)obtidas em função do tempo (T= 0, 3, 6, 8 e 10 horas) quando a cepa L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243 foi colocada para crescer em um meio de cultura da maneira descrita acima. Tabela 2
Figure img0002
Figure img0003

Claims (9)

1. Uso de pelo menos uma cepa bacteriana selecionada do grupo que consiste na cepa L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243, a cepa L. gasseri LGS 01 DSM 18299 e a cepa L. gasseri LGS 02 DSM 18300, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição alimentícia ou produto suplementar ou dispositivo médico ou composição farmacêutica para a tratamento preventivo e/ou curativo da hiperoxalúria, urolitíase, insuficiência renal, cardiopatias, pedras nos rins, diverticulose e diverticulite.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a referida composição bacteriana compreender a cepa L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243.
3. Uso de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida composição bacteriana compreende a cepa L. gasseri LGS 01 DSM 18299 e a cepa L. gasseri LGS 02 DSM 18300.
4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-3, caracterizado por a referida composição bacteriana compreender ainda a cepa L. acidophilus LA02 DSM 21717 e a cepa L. acidophilus LA 07 DSM 24303.
5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 4, caracterizado pelo fato de que a referida composição bacteriana consiste em L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243, L. acidophilus LA02 DSM 21717 e L. acidophilus LA 07 DSM 24303.
6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-5, caracterizado pelo fato de que a referida composição compreende ainda frutooligossacarídeos e inulina.
7. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida composição bacteriana consiste na cepa L. paracasei spp.paracasei LPC 09LPC 09 DSM 24243.
8. Uso acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição alimentícia ou produto suplementar ou dispositivo médico ou composição farmacêutica consiste na cepa L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243.
9. Composição alimentícia ou produto suplementar ou dispositivomédico ou composição farmacêutica, caracterizada por compreender a cepa L. paracasei spp. paracasei LPC 09 com número de depósito DSM 24243.
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