MX2014012362A

MX2014012362A - Composición prebiótica y métodos de uso.

Info

Publication number: MX2014012362A
Application number: MX2014012362A
Authority: MX
Inventors: David S Newburg; Zhuoteng Yu
Original assignee: Trustees Boston College
Priority date: 2012-04-13
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2015-05-07
Also published as: JP2015512936A; CN104507483A; WO2013154725A1; EP2836218A1; EP2836218A4; US20150265661A1

Abstract

Se proporciona en la presente composiciones prebióticas que comprenden una combinación de oligosacáridos tales como oligosacáridos sialiados y oligosacáridos fusocilados, y usos de los mismos para estimular la proliferación de microbiota intestinal benéfica, por ejemplo, de bifidobacteria, y/o para reducir la abundancia de patógenos entéricos.

Description

COMPOSICIONES PREBIÓTICAS Y MÉTODOS DE USO ANTECEDENES DE LA INVENCIÓN El tracto digestivo de mamífero está típicamente colonizado por microorganismos, también llamados microbiota, que incluye tanto microorganismos benéficos como patogénicos. Las bacterias constituyen la mayoría de la comunidad de microbiota intestinal de mamífero. Por ejemplo, hasta 60% de la masa seca de heces humanas está comprendida de bacterias. Se cree que el intestino humano está colonizado por cientos de diferentes especies de microorganismos, con algunas especies que dominan típicamente las poblaciones de microbiota intestinal.

Se ha sugerido que la relación entre la microbiota intestinal y el organismo hospedero no es simplemente una coexistencia, sino más bien una relación simbiótica. Es decir, los microorganismos benéficos (por ejemplo, bifidofacterias) en la microbiota intestinal llevan a cabo funciones metabólicas benéficas al hospedero, tal como fermentación de los substratos energéticos, sin digerir, o no digeribles, modulan el sistema inmunitario hospedero, previenen el crecimiento de bacterias patogénicas y producen nutrientes que pueden ser captados por el hospedero (por ejemplo, biotina y vitamina K). Un desequilibrio en la microbiota intestinal, por ejemplo, una sub-representación de microorganismos benéficos o una sobreabundancia de microorganismos patogénicos, pueden conducir a enfermedad en el hospedero.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente descripción se basa en el descubrimiento de que ciertas combinaciones de oligosacáridos de sialilactosa y/o fucosilados mostraron efectos prebióticos inesperadamente altos. Por ejemplo, estas combinaciones promovieron el crecimiento de bacterias benéficas intestinales tales como bifidobacterias, en particular una variedad de cepas bifidobacterianas especificas encontradas en el tracto digestivo, y disminuyeron el pH durante la fermentación.

Por consiguiente, se describen en la presente composiciones prebióticas que comprenden combinaciones de oligosacáridos sialilados (por ejemplo, sialilactosa) y oligosacáridos fucosilados y usos de los mismos en promover el crecimiento de bacterias benéficas tales como bifidobacterias e/o inhiben el crecimiento de microorganismos patogénicos.

En un aspecto, la presente descripción proporciona una composición a prebiótica que consiste esencialmente de por lo menos una sialilactosa y por lo menos un oligosacárido fucosilado. La sialilactosa puede ser 3'-sialilactosa (3'-SL), 6'-sialilactosa (6'-SL), o una mezcla de las mismas (por ejemplo, en una relación que varia de 4:1 a 1:2), y el oligosacárido fucosilado puede comprender un residuo de al,2-fucosilo, al,3-fucosilo, y/o al,4-fucosilo . En algunas modalidades, el oligosacárido fucosilado es un oligosacárido neutro fucosilado. Ejemplos del oligosacárido fucosilado incluyen, pero no se limitan a, 2'-fucosilolactosa (2-FL), 3-fucosilolactosa (3-FL), lactodifucotetraosa (LDFT), o una mezcla de las misma (por ejemplo, una mezcla de: 2'-FL and 3-FL; una mezcla de 2'-FL and LDFT; una mezcla de 3-FL y LDFT; o una mezcla de 2'-FL, 3-FL, y LDFT). En un ejemplo, la composición cosiste esencialmente de una a mezcla de 3'-SL, 6'-SL, 2'-FL, 3-FL, y LDFT.

Si se desea, cualquiera de las composiciones prebióticas descritas en lo anterior pueden contener adicionalmente uh prebiótico, que puede ser una población de bifidobacterias, lactobacilos, Bacteriodes fragilis , Bacteriodes thetaiotaomicron, Enterococcus faecalis (cepas probióticas de los mismos), Staphylococcus epidermides, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, o bacterias relacionadas que tienen funciones similares. En algunas modalidades, la población de bifidobacterias es B. longum (por ejemplo, B. longum JCM7007, JCM7009, JCM7010, JCM7011, JCM1210, JCM1260, JC 1272, JCM11347, o ATCC15708), B. infantis (por ejemplo, B. infantis ATCC15697), o una mezcla de las misma.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para incrementar la proliferación de una bacteria benéfica, por ejemplo, bifidobacterias, con una composición prebiótica que comprende una sialilactosa y un oligosacárido fucosilado (por ejemplo, aquellos descritos en lo anterior) en una cantidad efectiva en incrementar la proliferación de la población de la bacteria benéfica (por ejemplo, una población de bifidobacterias). La sialilactosa puede ser 3'-sialilactosa (3'-SL), 6'-sialilactosa (6'-SL), o una mezcla de las mismas. El oligosacárido fucosilado puede comprender un residuo de al,2-fucosilo, al,3-fucosilo, y/o al,4-fucosilo. En algunas modalidades, el oligosacárido fucosilado es un oligosacárido neutro fucosilado. Ejemplos de oligosacáridos fucosilados incluyen, pero no se limitan a, 2’ -fucosilolactosa (2-FL), 3-fucosilolactosa (3-FL), lactodifucotetraosa (LDFT), o una mezcla de las mismas (por ejemplo, aquellos descritos en lo anterior).

El método que acaba de describirse se puede llevar a cabo ya sea in vi tro o in vivo. Por ejemplo, la etapa de contacto se puede llevar a cabo al administrar cualquiera de las composiciones prebióticas descritas en la presente a un sujeto en necesidad de tratamiento. En algunas modalidades, la composición prebiótica se administra oralmente al sujeto.

Un sujeto quien necesita ser tratado por una composición prebiótica como se describe en la presente puede ser un humano (por ejemplo, un bebé humano al como un bebé neonatal). En algunas modalidades, el sujeto (por ejemplo, un humano) está sufriendo de, o se sospecha de tener, o está en riesgo de una enfermedad asociada con una representación inadecuada de microorganismos benéficos o la presencia o sobreabundancia de bacterias patogénicas en el intestino. En otras modalidades, el sujeto está padeciendo de, se sospecha de tener, o está en riesgo de síndrome del intestino irritable o enfermedad inflamatoria espinal.

Si es necesario, la composición prebiótica se puede administrar a un sujeto como se describe en la presente en una cantidad efectiva para disminuir el pH en el microambiente de la bacteria benéfica (por ejemplo, una población de bifidobacterias tales como Bifidobacterium longum, Bifidobacterium inf antis , o una mezcla de las mismas). Alternativamente, la composición prebiótica se puede administrar al sujeto en una cantidad efectiva para disminuir la velocidad de proliferación de una bacteria patogénica (por ejemplo, Escherichia coli o Clostridium perfringens) . Las composiciones prebióticas que se utilizan en los métodos descritos en la presente pueden comprender además un prebiótico, por ejemplo, bifidobacterias tales como as B. longum, B. inf antis, o una mezcla de las mismas. En algunas modalidades, la población de bifidobacterias es B. longum JCM7007, JCM7009, JCM7010, JCM7011, JCM1210, JCM1260, JCM1272, JCM11347, ATCC15708, B. infantis ATCC15697, o una mezcla de las mismas.

También dentro del alcance de esta descripción son (i) las composiciones farmacéuticas para el uso en promover el crecimiento de bacterias benéficas en un sujeto, para tratar una enfermedad asociada con una representación inadecuada de microorganismos benéficos o la presencia o sobreabundancia de las bacterias patogénicas en el intestino, o para tratar el síndrome del intestino irritable o enfermedad inflamatoria intestinal, y (ii) uso de las composiciones farmacéuticas para la preparación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades mencionadas en lo anterior. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender cualquiera de las composiciones prebióticas descritas en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunos ejemplos, las composiciones prebióticas comprenden una combinación de oligosacáridos sialilados (por ejemplo, sialilactosa) y fucosilados como se describe en la presente y uno o más probióticos .

Los detalles de ciertas modalidades no limitantes, ejemplares de la invención se exponen en la siguiente descripción. Otras características o ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de las siguientes figuras y descripción detallada de diversos ejemplos, y también a partir de las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A y IB son un diagrama que muestra la variación de pH (Figura 1A) y concentración de lactato (Figura IB) en el medio de cultivo de fermentación en presencia o ausencia de oligosacáridos de leche humana (HMOS) o Fructo-oligosacáridos (FOS).

Las Figuras 2A, 2B y 2C son un diagrama que muestra la distribución de la microbiota en las muestras fecales en presencia de HMOS y FOS. El número de diferentes especies de bacterias en el cultivo de fermentación se complementan con o sin HMOS como se determina por qPCR. Figura 2A: bifidobacteria. Figura 2B: Clostridium perfringens. Figura 2C: E. coli .

Las Figuras 3A y 3B son un diagrama que muestra perfiles de consumo de oligosacáridos de leche humana de diferente microbiota fecal donadora, como se determina utilizando LC- MS.

Las Figuras 4A y 4B son una gráfica de barras que muestra los porcentajes de incremento del crecimiento (Figura 4A) y disminución de pH (Figura 4B) de diferentes bacterias con oligosacáridos fucosilados 2'-FL, 3-FL, LDFT, HMOS y el control positivo de fructooligosacáridos, FOS.

Las Figuras 5A y 5B son una gráfica de barras que muestra los porcentajes de incremento de crecimiento (Figura 5A) y disminución de pH (Figura 5B) de diferentes bacterias como se indica con el oligosacárido fucosilado 2'-FL, 3-FL, y/o LDFT; sialilactosa 3'-SL y/o b'-SL; una combinación de los mismos; HMOS; y FOS.

Las Figuras 6A y 6B son una gráfica de barras que muestra porcentajes de incremento de crecimiento (Figura 6A) y disminución de pH (Figura 6B) de diferentes bacterias como se indica con el oligosacárido fucosilado 2'-FL, 3-FL, y/o LDFT; sialilactosa 3'-SL y/o 6'-SL; una combinación de los mismos; HMOS; y FOS.

La Figura 7 es una gráfica que muestra estructuras de sialilactosas ejemplares y oligosacáridos fucosilados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los glicanos dietéticos que son indigestos por los animales se pueden utilizar por las bacterias benéficas, promoviendo de esta manera una colonización de la microbiota intestinal, particularmente la colonización de las bacterias benéficas, que es importante para la salud. La colonización intestinal es el establecimiento o mantenimiento de una población de microorganismos vivos dentro del tracto digestivo de un organismo hospedero. Puede ser la colonización del tracto digestivo completo asi como colonización parcial, por ejemplo, de solamente una subsección del intestino (por ejemplo, o los intestinos delgados, de los intestinos gruesos, o del estómago). En los mamíferos, la colonización intestinal comienza en el nacimiento y lactancia materna se asocia frecuentemente con una microbiota típica rica en bacterias benéficas, tales como Bifidobacterias. Esto indica que ciertos componentes en la leche poseen efecto prebióticos.

Las bacterias benéficas o microbiota benéfica son microorganismos (por ejemplo, bacteria, hongos, protozoarios), también conocidos como probióticos, confieren efectos benéficos al organismo hospedero cuando se colonizan en el intestino de un organismo hospedero. Por ejemplo, metabolizan un ingrediente alimenticio que no es digerible al organismo hospedero, modulan el sistema inmunitario hospedero en una manera no patogénica, previenen el crecimiento de bacterias patogénicas y/o producen nutrientes que pueden ser captados por el hospedero (por ejemplo, biotina y vitamina K). Las bacterias benéficas incluyen, pero no se limitan a bifidobacterias, lactobacilli, Bacteriodes fragilis, Bacteriodes thetaiotaomicron, Enterococcus faecalis (cepas probióticas de E. faecalis) , Staphylococcus epidermides, Enterobacter aerogenes , y Enterobacter cloacae.

Las bacterias patogénicas se refieren a cualquier bacteria que puede provocar y/o provocar una enfermedad o afección en un sujeto. En algunas modalidades, el término incluye bacterias patogénicas que colonizan el intestino de un sujeto. En algunas modalidades, el término incluye material que es patogénico si está presente o sobreabundante en el intestino de un sujeto. Bacterias patogénicas ejemplares incluyen, pero no se limitan a Escherichia colí, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis (cepas virulentas de E. faecalis) , y Enterococcus faecium.

La presente descripción se basa, por lo menos parcialmente, en el descubrimiento de que los oligosacáridos e leche humana (HMOS), particularmente los oligosacáridos fucosilados y sialilactosa descritos en la presente, pueden actuar como prebióticos que sirven como una fuente de energía y nutrientes para las bacterias deseadas para que colonicen el intestino del bebe. Los prebióticos son ingredientes alimenticios, por ejemplo, oligosacáridos, que no son digeribles por un sujeto (por ejemplo, por un mamífero tal como un humano), y que estimula el crecimiento de la actividad de una o más bacterias benéficas (por ejemplo, bifidobacterias) en el sistema digestivo e/o inhiben el crecimiento o actividad de una o más bacterias patogénicas en el sistema digestivo. Un prebiótico puede estimular selectivamente el crecimiento y/o actividad de uno o un número limitado de bacterias en el tracto digestivo del sujeto.

Por consiguiente, se describen en la presente composiciones prebióticas que comprenden combinaciones de oligosacárido sialilados (por ejemplo, sialilactosa) y oligosacáridos fucosilados y usos de los mismos para promover el crecimiento/actividad de bacterias benéficas e/o inhibir el crecimiento y/o actividad de bacterias patogénicas. Composiciones Prebióticas Las composiciones prebióticas descritas en la presente comprenden una composición de oligosacáridos (por ejemplo, aquellos encontrados en la leche tales como oligosacáridos sialilados y oligosacáridos fucosilados) que poseen actividades prebióticas. Estas composiciones son por lo tanto útiles (ya sea in vivo o in vitro) , por ejemplo, para promover una o más bacterias intestinales benéficas (por ejemplo, bifidobacterias, incluyendo las cepas especificas descritas en el ejemplo posterior) en un sujeto, que puede ser un humano tal como un bebé neonatal humano, e inhibir el crecimiento de una o más bacterias patogénicas.

En algunas modalidades, una composición prebiótica descrita en la presente consiste esencialmente de por lo menos uno de oligosacárido sialilado (por ejemplo, sialilactosa) y por lo menos un oligosacárido fucosilado. Tal composición prebiótica comprende los ingredientes activos especificados, por ejemplo, los oligosacáridos especificados, asi como otros agentes que no afectan materialmente las características básicas y novedosas de la composición. Los ingredientes activos especificados pueden ser los agentes prebióticos principales en la composición. En algunos ejemplos, lo ingrediente activos especificados (por ejemplo, los prebióticos de oligosacárido especificados) constituyen por lo menos aproximadamente 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% de la composición respectiva en peso. En otros ejemplos, los prebióticos de oligosacárido especificados constituyen por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% del contenido de azúcar total en la composición en peso. En un ejemplo, los oligosacáridos especificados son los únicos prebióticos en la composición.

Los oligosacáridos son moléculas poliméricas que comprenden dos o más monómero de sacárido. Un oligosacárido puede contener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más monómeros de sacáridos.

Los oligosacárido sialilados son moléculas de oligosacárido que contienen una o más porciones de ácido siálico. Oligosacárido sialilados ejemplares incluyen 3'-SL y 6'SL. Ver Figura 7. La composición prebiótica puede contener 3'-sialilactosa (3'-SL), 6'-sialilactosa (6'-SL), o ambas. Cuando la composición prebiótica descrita en la presente contiene una mezcla de 3'-SL y 6'-SL, la relación de entre 3'-SL y 6'SL (por ejemplo, peso/peso, volumen/volumen, mol/mol) puede estar dentro del intervalo de 10:1 - 1:10, por ejemplo, 5:1- 1:5, 4:1-1:2, o 2:1 - 1:2. En algunos ejemplos, la relación entre 3'-SL y 6'-SL es de aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:6, aproximadamente 1:7, aproximadamente 1:8, aproximadamente 1:9, aproximadamente 1:10, aproximadamente 1:10, aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:30, aproximadamente 1:40, aproximadamente 1:50, aproximadamente 1:60, aproximadamente 1:70, aproximadamente 1:80, aproximadamente 1:90, aproximadamente 1:100, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 6:1, aproximadamente 7:1, aproximadamente 8:1, aproximadamente 9:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 30:1, aproximadamente 40:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 60:1, aproximadamente 70:1, aproximadamente 80:1, aproximadamente 90:1, o aproximadamente 100:1. En otros ejemplos, la relación entre 3'-SL and b'-SL puede estar dentro del intervalo de 1000:1 - 1:1000, por ejemplo, 100:1 -10:1, 10:1 - 1:1, 10:1 - 5:1, 1:100 - 1:10, 1:10 - 1:1, 1:10 - 1:5.

Los oligosacáridos fucosilados son moléculas de oligosacárido que comprenden uno o más monómeros de fucosa, que pueden estar en la al,2-, al,3-, o al,4-linkage. En algunos ejemplos, los oligosacáridos fucosilados contenidos en las composiciones probióticas descritas en la presente son oligosacáridos, neutros que no contienen porciones ácidas o básicas en pH fisiológico. Tales oligosacáridos fucosilados incluyen, pero no se limitan a, 2'-fucosilolactosa (2-FL), 3-fucosilolactosa (3-FL), y lactodifucotetraosa (LDFT). Ver la Figura 7. Las composiciones prebióticas descritas en la presente pueden contener 2'-FL, 3-FL, LDFT, o cualquier combinación de las mismas. En un ejemplo, la composición contiene 3'-SL, 6'-SL, 2'-FL, 3-FL, y LDFT.

En algunas modalidades, la composición prebiótica contiene oligosacárido(s) sialilado y oligosacárido (s) fucosilado en una relación que varia de 100:1 - 1:100, por ejemplo, 20:1-1:20, 10:1-1:10, 5:1- 1:5, 4:1-1:2, o 2:1 1:2.

Una composición prebiótica descrita en la presente puede contener uno o más oligosacáridos prebióticos (por ejemplo, un oligosacárido sialilado al como 3'-SL o 6'-SL; u oligosacárido fucosilado tal como 2'-FL, 3-FL, o LDFT), que constituye aproximadamente 0.2-98% (por ejemplo, por lo menos 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 75%, o 80%) de la composición total (por ejemplo, como en peso de ingredientes sólidos por peso de materia seca, o por volumen de solvente en el caso de una formulación liquida.

Cuando es necesario, cualquiera de las composiciones prebióticas descritas en la presente pueden comprender adicionalmente un probiótico (por ejemplo, bifidobacterias, también referidas como lactobacillus bif idus) , es decir, una población de microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren en beneficio para la salud al hospedero. Las bifidobacterias probióticas son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en la téenica, y las bifidobacterias ejemplares útiles de acuerdo con los aspectos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, B. longum and B. infantis (ver, por ejemplo, Schell y colaboradores, The genome sequence of Bifidobacterium longum reflecte its adapta tion to the human gastrointestinal tract.

Proc Nati Acad Sci U S A 2002, 99 (22):14422-7; Fukuda y colaboradores, Bifidobactería can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature 2011, 469, 543-547; y Whorwell y colaboradores, Efficacy of an encapsula ted probiotic Bifidobacterium infantis 35624 in women with irritable bowel syndrome. American Journal of Gastroenterology Jul 2006; 101(7):1581- 90, los contenidos completos de cada una de las cuales se incorpora a manera de referencia en la presente). Las cepas de bifidobacterias ejemplares útiles de acuerdo con algunos aspectos de esta invención incluyen, pero no se limitan cepas de B. longum JCM7007, JCM7009, JCM7010, JCM7011, JCM1210, JCM1260, JCM1272, JCM11347, y ATCC15708, y cepa B . infantis ATCC15697. Los probióticos adicionales útiles de acuerdo con los aspectos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, Bacillus coagulans, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Saccharomyces boulardii, Lactobacillus rhamnosus, y Lactobacillus plantarum .

En algunas modalidades, la composición comprende un solo probiótico, por ejemplo, una sola especie o cepa de bacterias probióticas como se describe en la presente. En otras modalidades, la composición comprende una pluralidad de probióticos, por ejemplo, una mezcla de dos o más cepas o especies probióticas descritas en la presente o conocidas por aquellas personas de experiencia en el campo.

En algunas modalidades, el probiótico está comprendido en la composición en la forma de microorganismos vivos. En algunas modalidades, el probiótico está comprendido en la composición en la forma de microorganismos que activamente crecen y/o se dividen. En algunas modalidades, el prebiótico está comprendido en la composición en una forma latente, tal como una espora o una endoespora.

Metodos para Utilizar Composiciones Prebióticas para Promover el Crecimiento de Bacterias Benéficas Dada la actividad prebiótica de cualquiera de las composiciones descritas en la presente, tales composiciones se pueden utilizar para promover el crecimiento y/o actividad de una o más bacterias benéficas ya sea in vitro o in vivo. Tales composiciones también se pueden utilizar para inhibir el crecimiento y/o actividad de una o más bacterias patogénicas in vi tro o in vivo.

En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente comprenden poner en contacto la microbiota benéfica (por ejemplo, una población de bifidobacterias) con una cantidad efectiva de cualquiera de las composiciones prebióticas descritas en la presente para incrementar la proliferación de la microbiota benéfica. La etapa de contacto se puede llevar a cabo in vi tro, por ejemplo, en una caja de cultivo. Alternativamente, esta etapa se puede llevar a cabo in vivo, por ejemplo, al administrar el prebiótico a un sujeto en necesidad del tratamiento.

El término "incrementar la proliferación de", como se utiliza en la presente en el contexto de la microbiota o microorganismos, por ejemplo, de microorganismos intestinales benéficos, tales como bifidobacterias, se refiere a incremento de la velocidad de proliferación celular y/o supervivencia celular de la microbiota o microorganismos respectivos. Por ejemplo, una composición prebiótica que incrementa la proliferación de microorganismos puede ser una composición que, cuando se pone en contacto con una población de microorganismo, da por resultado un incremento en las velocidades de división celular y/o tasas de supervivencia entre los microorganismos por al menos 20%, 40%, 60%, 80%, 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces, o 200 veces, como son comparados con las velocidades en ausencia de la composición.

Similarmente, el término "disminuir la proliferación de" o "inhibir el crecimiento de" como se utiliza en la presente en el contexto de microorganismos patogénicos, por ejemplo, de bacterias intestinales patogénicas, se refiere al disminuir la velocidad de proliferación celular y/o supervivencia celular de los microorganismos respectivos. Por ejemplo, una composición prebiótica que incrementa la proliferación de los microorganismos benéficos también puede ser una composición que disminuye la proliferación de los microorganismos patogénicos por al menos 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95%, como es comparado con las velocidades en ausencia de la composición. La composición puede ejercer un efecto anti-proliferativo directo en los microorganismos patogénicos. Alternativamente, el efecto anti-proliferativo puede ser un efecto secundario de la composición. Un efecto secundario ejemplar podría ser que la captación y metabolización de la composición con la microbiota intestinal beneficiaría de por resultado un cambio en el microambiente intestinal que no es favorable para el crecimiento y proliferación de los microorganismos patogénicos. Por ejemplo, En algunas modalidades, la captación y metabolización de una composición prebiótica descrita en la presente por la microbiota intestinal benéfica, por ejemplo, por bifidobacterias, da por resultado un cambio en el pH de microambiente de la microbiota hacia un pH ácido, que es desfavorable a la proliferación y/o supervivencia de ciertas bacterias patogénicas.

En un ejemplo, una composición prebiótica se administra a un sujeto en necesidad de la misma en una cantidad efectiva para incrementar la proliferación de un microorganismo benéfico en el intestino del sujeto por al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 1 vez, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, o al menos aproximadamente 5 veces. La cantidad de la composición puede ser efectiva en promover el crecimiento y/o actividad de una o más bacterias benéficas, por ejemplo, una población de bifidobacterias, lactobacilos, Bacteriodes fragilis, Bacteriodes thetaiotaomicron, Enterococcus faecalis (cepas probióticas de E. faecalis) , Staphylococcus epidermides, Enterobacter aerogenes, o Enterobacter cloacae. En algunas modalidades, la población de bifidobacterias es B. longum (por ejemplo , B. longum JCM7007, JCM7009, JCM7010, JCM7011, JCM1210, JCM1260, JCM1272, JCM11347, o ATCC15708), B. infantis (por ejemplo , B. infantis ATCC15697), o una mezcla de las mismas.

Alternativamente, la composición prebiótica se puede administrar al sujeto en una cantidad efectiva para disminuir la velocidad de proliferación de una bacteria patogénica (por ejemplo, Escherichia coli o Clostridium perfringens) . En algunas modalidades, la composición prebiótica se administra al sujeto en una cantidad efectiva para inhibir la velocidad de proliferación de la bacteria patogénica por al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99%.

El método descrito en la presente puede comprender además monitorear la proliferación del microorganismo benéfico en el sujeto, por ejemplo, por exámenes fecales. Los métodos para monitorear la microbiota y evaluar la proliferación de los microorganismos benéficos específicos en el intestino de un sujeto son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo, y métodos no limitantes, ejemplares se describen en Moro y colaboradores, Dosage-related bifidogenic effects of Galacto- and fructoolígosaccharides in formula fed term infants. Journal of pediatric Gastroenterology and Nutrition34:291-295 2002, and Campbell y colaboradores, Selected indigestible oligosacáridos affect large bowel mass, cecal and fecal short-chain fatty acids, pH and micro flora in rats. J. Nutr 127:130-136 1997; los contenidos completos de ambas de las cuales se incorporan en la presente a manera de referencia. Los métodos adicionales adecuados para monitorear el efecto de una composición prebiótica en la microbiota de un sujeto de acuerdo con algunos aspectos de esta invención son conocidos o serán evidentes para aquellas personas de experiencia en el campo, y la invención no se limita en este aspecto.

En aún otro ejemplo, una composición prebiótica descrita en la presente se administra a un sujeto en una cantidad efectiva para disminuir el pH en microambiente de las bifidobacterias. El microambiente puede ser un hábitat o medio ambiente pequeño o relativamente pequeño, por ejemplo, el intestino de un sujeto o una parte del mismo. Un microambiente puede estar, por lo menos parcialmente, aislado de medios ambientes circundantes, por ejemplo, por una barrera física. En algunas modalidades, un microambiente abarca una célula bacteriana o población de células y sus alrededores inmediatos, que se pueden afectar inmediatamente por la presencia de la célula bacteriana o células o el metabolismo de las células.

Los métodos para determinar la velocidad de proliferación de los microorganismos intestinales benéficos, bacterias patogénicas, y el pH de un microambiente, por ejemplo, dentro del substrato intestinal de un sujeto, son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo. Tales métodos incluyen típicamente evaluar la microbiótica intestinal, o el substrato intestinal de sujeto antes de que comience la restricción de la composición prebiótica y monitorear la microbiota intestinal, o el substrato intestinal del sujeto durante y/o después de la administración de la composición prebiótica. Algunos de tales métodos se describen en la presente, y métodos adicionales serán evidentes para aquellos artífices expertos. Para una descripción de algunos métodos no limitantes, ejemplares ver, por ejemplo, Moro y colaboradores, Dosage-related bifidogenic effects of Galacto- and fructooligosaccharides in formula fed term infants. Journal of pediatric Gastroenterology and Nutrition3 :291-295 2002, y Campbell y colaboradores, Selected indigestible oligosacáridos affect large bowel mass, cecal and fecal short-chain fatty acids, pH and microflora in rats. J. Nutr 127:130-136 1997; los contenidos de ambas de las cuales se incorpora en la presente a manera de referencia. Se apreciará que la presente invención no se limita en este aspecto.

En otro ejemplo, una composición prebiótica se administra a un sujeto en una cantidad efectiva para incrementar la abundancia de un microorganismo benéfico, por ejemplo, de una bifidobacteria, en el intestino del sujeto por lo menos 2 veces, por lo menos por lo menos 5 veces, por lo menos 10 veces, por lo menos 20 veces, por lo menos 50 veces, por lo menos 100 veces, por lo menos 500 veces, por lo menos 1000 veces, o por lo menos 1000 veces, como es comparado con la abundancia de microorganismo benéfico en el inicio de la administración. Tal tratamiento puede durar durante un periodo de tiempo adecuado hasta que se logre el resultado deseado. Antes del tratamiento, el sujeto puede tener un nivel no detectadle del microorganismo benéfico en su intestino. Al sujeto se le puede administrar con una composición prebiótica, que contiene de manera preferente por lo menos un probiótico, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para la que el microorganismo benéfico colonice el intestino del sujeto.

En todavía otro ejemplo, una composición prebiótica se administra a un sujeto en una cantidad y durante un período de tiempo efectivo para disminuir la abundancia de un microorganismo patogénico, por ejemplo, de un patógeno entérico, tal como C. perfringens, en el intestino del sujeto por lo menos 2 veces, por lo menos 5 veces, por lo menos 10 veces, por lo menos 20 veces, por lo menos 50 veces, por lo menos 100 veces, por lo menos 500 veces, por lo menos 1000 veces, o por lo menos 1000 veces, como es comparado con la abundancia del microorganismo patogénico en el inicio de la administración. El sujeto se puede tratar durante un período de tiempo adecuado con una cantidad efectiva de la composición tal que, después del tratamiento, la abundancia del microorganismo patogénico está por debajo de un nivel medible.

Un sujeto en necesidad del tratamiento descrito en la presente puede ser un sujeto que padece de, se sospecha de tener, o está en riesgo de una enfermedad asociada con una sub-representación de microorganismos benéficos o la presencia o sobre abundancia de bacterias patogénicas en el intestino. Tal sujeto puede mostrar un síntoma clínico que indica la sub-representación de los microorganismos benéficos o la presencia o sobre abundancia de bacterias patogénicas en el intestino del sujeto. Alternativamente, el sujeto puede estar en riesgo de contraer una enfermedad asociada con una sub-representación de microorganismos benéficos o la presencia o sobre abundancia de bacterias patogénicas en el intestino del sujeto. Por ejemplo, en algunas modalidades, el sujeto es un sujeto con un historial de tales enfermedades. Las sub-representación de los microorganismos benéficos o la presencia o una sobre abundancia de bacterias patogénicas y/o bacterias benéficas en la microbiota intestina se pueden examinar en un sujeto candidato para determinar si el tratamiento es necesario.

El sujeto también puede ser un sujeto que sufre, se sospecha de tener, o está en riesgo de una enfermedad de trato digestivo, tal como síndrome del intestino irritable o enfermedad inflamatoria intestinal.

El término "sujeto", como se utiliza en la presente, se refiere a un mamífero, por ejemplo, un primate, un primate no humano, un humano, un perro, un gato, oveja, una cabra, una vaca, un caballo, un cerdo, un ratón, una rata, o un cobayo, un animal doméstico, un animal silvestre, animal de granja o un animal de laboratorio. En algunos ejemplos, el sujeto es un bebé, por ejemplo, un bebé neonatal. En otros ejemplos, el sujeto es un adolescente o un adulto. Otras etapas de desarrollo, por ejemplo etapas prenatales y perinatales también se incluyen en algunas modalidades.

Un sujeto sospechoso de tener, o en riesgo de una enfermedad se refiere a un sujeto que tiene un nivel elevado de sospecha de la presencia de la enfermedad o un nivel elevado de riesgo de contraer la enfermedad, como es comparado con un nivel promedio de sospecha de un nivel de riesgo promedio. Por ejemplo, un sujeto que manifiesta síntomas clínicos de una enfermedad específica tiene un nivel elevado de sospecha de la presencia de la enfermedad, aun en ausencia de una diagnosis clínica objetivo. Por otro ejemplo, el sujeto puede estar predispuesto a contraer una enfermedad específica, por ejemplo, debido a la constitución genética del sujeto, o debido a la exposición a patógenos ambientales, o debido a la presencia de factores de riesgo conductales, tales como dieta u otros hábitos conductuales.

El método descrito en la presente puede comprender además evaluar la microbiota intestinal del sujeto antes de que se inicie la administración de la composición prebiótica. Alternativamente, o además, el método puede comprender monitorear la microbiota intestinal del sujeto durante y/o después de la administración de la composición prebiótica. Si no existe incremento en la proliferación de un microorganismo benéfico, por ejemplo, bifidobacterias, se detecta en el sujeto después de aproximadamente de un periodo adecuado, por ejemplo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, o aproximadamente 1 mes después de que ha iniciado la administración, entonces la dosificación de la composición prebiótica se puede incrementar. Si un cambio benéfico en la microbiota intestinal del sujeto se detecta, por ejemplo, un incremento en la proliferación de un microorganismo benéfico, entonces la dosificación de la composición prebiótica se puede disminuir o la administración se puede eliminar por completo.

En algunas modalidades, una composición prebiótica descrita en la presente se administra a un sujeto para tratar una enfermedad o trastorno en el sujeto, tal como síndrome del intestino irritable o enfermedad inflamatoria intestinal, o una enfermedad asociada con la presencia o un sobre abundancia de microorganismos patogénicos en el intestino del sujeto (por ejemplo, diarrea, infección gastrointestinal, enterocolitis necrotizante, enfermedad de Crohn, o diverticulitis). El término "tratar" como se utiliza en la presente se refiere a la aplicación o administración de una composición que incluye uno o más agentes activos a un sujeto en quien tiene cualquiera de las enfermedades descritas en la presente, un síntoma de la enfermedad, o una predisposición hacia la enfermedad, con el propósito de curar, sanar, aliviar, recuperar, alterar, remediar, mejorar, o afectar la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad.

Por ejemplo, en algunas modalidades, un composición prebiótica como se describe en la presente se administra a un sujeto que se presenta con por lo menos un síntoma clínicamente manifiesto de síndrome del intestino irritable o enfermedad inflamatoria intestinal, y que tiene una sobre abundancia de una bacteria patogénica, por ejemplo, Clostridium perfringens , en su intestino. En algunas modalidades, se lleva a cabo un examen fecal en el inicio del tratamiento con la composición prebiótica, y los exámenes fecales subsecuentes se llevan a cabo después de 1 semana y después de 4 semanas de tratamiento, y los conteos de células de las bacterias patogénicas se comparan con aquellos observados en el examen inicial para monitorear la efectividad del programa del tratamiento. Si después de una semana no se detecta reducción significativa en el número de Clostridiu perfringens, se incrementa la dosificación de la composición prebiótica.

El método descrito en la presente se puede aplicar a un sujeto que se ha sometido a está sometiéndose a otro tratamiento, por ejemplo, tratamiento con antibióticos. En algunas modalidades, la administración de la composición prebiótica se inicia inmediatamente después de que ha terminado el programa de tratamiento con antibióticos. En otras modalidades, la administración de la composición prebiótica se inicia aproximadamente un día, aproximadamente dos días, aproximadamente tres días, aproximadamente cuatro dias, aproximadamente 5 dias, aproximadamente 6 dias aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, o aproximadamente a mes después de que ha terminado el programa del tratamiento con antibióticos. En algunas modalidades, una composición prebiótica se administra a un sujeto concurrentemente con un tratamiento con antibióticos. En algunas de tales modalidades, la administración se continúa más allá del punto final del tratamiento con antibióticos.

En algunas modalidades, se proporciona un método en el cual una composición prebiótica como se proporciona en la presente se administra a un sujeto en necesidad de o en una etapa de colonización intestinal con microbiota. Las composiciones prebióticas que comprenden un probiótico, por ejemplo, una población bifidobacterina viva, se adaptan particularmente para la administración a tales sujetos, que incluyen bebés neonatales, y sujetos quienes se han sometido a un tratamiento que ha creado un desequilibrio en o ha erradicado la mayor parte o toda la microbiota del sujeto, tal como un tratamiento con antibióticos orales.

Formulaciones , Vías de Administración , y Dosificación Las composiciones prebióticas descritas en la presente se pueden formular y administrar en cualquier forma adecuada conocida por aquellas personas expertas en el campo. Para la administración enteral, las composiciones prebióticas de la invención se pueden formular en preparaciones en formas sólidas, semi-sólidas, en gel, o líquidas tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, soluciones, depositarios, geles e inyecciones. Las composiciones adecuadas para la administración oral se pueden presentar como unidades discretas, tales como cápsulas, comprimidos, pastillas, que contienen cada uno una cantidad predeterminada de un agente activo. Otras composiciones incluyen suspensiones en líquidos acuosos o líquidos no acuosos tales como un jarabe, elixir, geles o emulsiones.

En algunas modalidades, una composición descrita en la presente se administra a un sujeto a través de una vía enteral, por ejemplo, oralmente en la forma de un polvo, bebida en polvo, líquido, cápsula, o pastilla. En algunas modalidades, una composición prebiótica se administra a u sujeto en una sola dosis, mientras que en otras modalidades, múltiples dosis se administran durante un cierto período de tiempo. Por ejemplo, en algunas modalidades, una composición prebiótica como se describe en la presente se administra en 1, 2, 3, 4, o 5 dosis al día, de manera preferente una dosis al día. En algunas modalidades, la administración se continúa durante un período de aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, o aproximadamente 1 año. En algunas modalidades, la administración se continúa hasta que un síntoma clínico en el sujeto se mejore. En algunas modalidades, la administración se continúa hasta que un microorganismo benéfico, por ejemplo, bifidobacterias, se detecté en la microbiota intestinal del sujeto, o un incremento en los números de células de los microorganismos benéficos se detecté en la microbiota intestinal del sujeto.

Se debe entender que, en algunas modalidades, diferentes componentes de una composición prebiótica descrita en la presente se administran a través de la misma via, por ejemplo, oralmente, mientras que en otras modalidades, diferentes componentes de una composición prebiótica se pueden administrar a través de vías diferentes. Por ejemplo, en algunas modalidades, los oligosacáridos prebióticos se pueden administrar a través de una via parenteral, mientras que un probiótico se puede administrar a través de una via enteral diferente. En algunas modalidades, una composición como se proporciona en la presente se formula como una composición de estado sólido, que comprende uno o más de los componentes en la forma de un polvo, gránulos, pelotillas, pastillas o en una forma cristalina. En algunas modalidades, tal composición de estado sólido comprende una mezcla de dos o más oligosacáridos en forma sólida. Las composiciones adecuadas para la administración oral se pueden presentar como unidades discretas, tales como cápsulas, comprimidos, trociscos, que contienen cada uno una cantidad predeterminada de un agente activo. Otras composiciones incluyen suspensiones en líquidos acuosos o líquidos no acuosos tales como jarabe, elixir o una emulsión.

Para la administración oral, un agente se puede formular fácilmente al combinarlo con portador farmacéuticamente aceptable bien conocidos en el campo. Tales portadores permiten que un agente de la invención se formule como comprimidos, pastillas, grajeas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, y similares, para la ingestión oral por un sujeto que se trata. Las preparaciones farmacéuticas para el uso oral se pueden obtener como excipientes sólidos, opcionalmente moliendo una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de agregar auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grajeas. Los excipientes adecuados con, en particular, rellenadores tales como azucares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma de tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, agentes desintegrantes se pueden agregar, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio. Opcionalmente las formulaciones orales también se pueden formular en soluciones salinas o soluciones amortiguadoras para neutralizar condiciones acidas internas o se pueden administrar sin ninguno de los portadores.

Los núcleos de grajeas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este propósito, las soluciones de azúcar concentradas se pueden utilizar, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Colorantes o pigmentos se pueden agregar a los comprimidos o recubrimientos de grajeas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.

Las preparaciones farmacéuticas que se pueden utilizar incluyen cápsulas duras preparadas de gelatina, así como cápsulas selladas blandas preparadas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos en mezcla con el rellenador tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden agregar estabilizantes. Las microesferas formuladas para administración oral también se pueden utilizar. Tales microesferas han sido bien definidas en la téenica. Todas las formulaciones para la administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para tal administración.

En algunas modalidades, una composición prebiótica que comprende dos o más componentes, por ejemplo, dos o más oligosacáridos prebióticos o un oligosacárido prebiótico y un probiótico, como se describe en la presente, se pueden formular como una combinación, o mezcla, de todos los componentes, por ejemplo, una mezcla de todos los oligosacáridos y/o o probiótico(s), por ejemplo, en la forma de un sólido, liquido, polvo, gel, u otra forma descrita en la presente. En algunas modalidades, una composición prebiótica que comprende dos o más oligosacáridos prebióticos se pueden formular y/o administrar como agentes individuales o compuestos separadamente, o como una mezcla de cualquier sub-combinación y en o más componentes adicionales separados. Se debe apreciar que los agentes prebióticos de una composición descrita en la presente se pueden administrar al mismo tiempo, contemporáneamente, o durante un curso del tratamiento. Por consiguiente, en algunas modalidades, una preparación combinada de dos o más oligosacáridos prebióticos descritos en la presente se puede proporcionar para uso simultáneo, separado o secuencial en la terapia como se describe en la presente.

En algunas modalidades, las relaciones fijas de oligosacáridos prebióticos y/o probióticos descritos en la presente, se administran, por ejemplo en una formulación sólida o liquida que contiene todos los oligosacáridos y probióticos, si los hay, en una relación específica o al combinar los oligosacáridos individuales y/o probióticos para dar por resultado una cierta relación. Las relaciones se pueden basar, por ejemplo, en peso, volumen, y/o actividad biológica del agente prebiótico o probiótico especifico o una combinación de los mismos.

Algunos aspectos de esta invención proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un agente prebiótico y/o probiótico descrito en la presente. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con algunos ejemplos de esta invención comprenden una cantidad efectiva de un agente prebiótico y/o probiótico como se describe en la presente, ya sea en forma sólida o disuelta y dispersada en un portador farmacéuticamente aceptable. De manera preferente, las composiciones farmacéuticas son estériles, o, donde se incluyen prebióticos, comprenden una población aislada del probiótico (s) que está libre de cualquier microorganismo patógeno o agentes que causan inflamación. Las frases "farmacéutica" o "farmacológicamente aceptables" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen generalmente una reacción adversa, o alérgica cuando se administra a un animal tal, por ejemplo, un humano, con se ha apropiado. Por otra parte, para la administración animal (por ejemplo, humano), se entenderá que las preparaciones deben cumplir con la esterilidad, pirogenicidad, estándares de seguridad y purezas generales como es requerido por la Oficina de FDA de Estándares Biológicos.

El término "sales farmacéuticamente aceptables" en este aspecto se refiere a las sales de adición base relativamente no toxicas, inorgánicas y orgánicas de agentes de las presente invención. Estas sales pueden ser preparadas del mismo modo in situ en el vehículo de administración o el proceso de preparación de la forma de dosificación, o al hacer reaccionar separadamente un agente prebiótico purificado de la invención con un ácido orgánico o inorgánico adecuado, y aislar la sal formada de esta manera durante la purificación subsecuente. Las sales representativas incluyen el bromuro, cloruro, sulfato, bisulfato, fosfato, fosfonato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptanoato, lactobionato, y sales de laurilsulfonato y similares. Ver, por ejemplo, Berge y colaboradores (1977) J.

Pharm. Sci.66:1-19.

En otros casos, los agentes de la presente invención pueden contener uno o más grupos funcionales ácidos y, de esta manera, son capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" en estos casos se refiere a las sales de adición de base inorgánica y orgánica, relativamente no tóxicas de agentes de la presente invención. Estas sales se pueden preparar in situ en el vehículo de administración o el proceso de fabricación de la forma de dosificación, o al hacer reaccionar separadamente el compuesto purificado en su forma ácida libre con una base adecuada, tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión de metal farmacéuticamente aceptable, con amoniaco, o con una amina primaria, secundaria o terciaria farmacéuticamente aceptable. Las sales alcalinas o alcalinotérreas representativas incluyen las sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio y similares. Las aminas orgánicas representativas útiles para la formación de las sales de adición base incluyen etilamina, diatilamina, etilendiamina, etanolamina, etanolamina, piperícina y similares. Ver, por ejemplo, Berge y colaboradores (1977) J. Pharm. Sci.66:1-19.

En modalidades donde una composición prebiótica está en una forma líquida, un portador puede ser un solvente o medio de dispersión que comprende pero no se limita a, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, etc.), lípidos (por ejemplo, triglicéridos, aceites vegetables, liposomas) y combinaciones de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina; por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido por la dispersión en los portadores tales como, por ejemplo poliol líquido o lípidos; mediante el uso de surfactantes tales, tales como, por ejemplo, hidroxipropilcelulosa; o combinaciones de los mismos. En muchos casos, será aconsejable incluir un agente isotónico, tal como, por ejemplo, azucares, cloruro de sodio y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, las formulaciones de la invención se administran en soluciones líquidas farmacéuticamente aceptables, que pueden contener rutinariamente concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes amortiguadores, conservadores, portadores compatibles, adyuvantes, y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos.

Como se utiliza en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, surfactantes, antioxidantes, conservadores, (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes anti-fúngicos) agentes isotónicos, agentes de retado de absorción, sales, conservadores, fármacos, estabilizantes de fármaco, geles, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, tintes tales como materiales y combinaciones de los mismos, como sería conocido por una persona de experiencia en el campo (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), incorporada en la presente a manera de referencia). Excepto en la medida de cualquier portador convencional sea incompatible con el ingrediente activo, su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas se contempla. Una composición puede comprender diferentes tipos de portadores de pendiendo de si se va a administrar en forma sólida, líquida, o aerosol, y si necesita ser estéril.

En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 0.1% de un compuesto prebiótico y/o probiótico, o una mezcla de tales compuestos. En otras modalidades, el compuesto prebiótico y/o probiótico, o la mezcla de tales compuestos puede comprender entre aproximadamente 2% a aproximadamente 75% en peso/peso o peso/volumen de la composición, o entre aproximadamente 25% a aproximadamente 60%, o hasta 99% de la composición, por ejemplo, y cualquier intervalo derivable de los mismos.

Los agentes prebióticos de la invención se pueden derivar en varias formas. Como se utiliza en la presente "derivados" de los agentes proporcionados en la presente incluyen sales (por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables), complejos, ásteres, tal como ésteres hidrolizables in vivo, ácidos libres o bases, formas polimórficas de los compuestos, solvatos (por ejemplo, hidratos), pro-fármacos, socios de acoplamiento y grupos protectores. Por "pro-fármacos" se propone por ejemplo cualquier compuesto que se convierta in vivo en un compuesto biológicamente activo, por ejemplo, por el pasaje a través del medio ambiente estomacal.

En algunas modalidades, un composición prebiótica puede comprender un antioxidante para retardar la oxidación de uno o más componente, adicionalmente, la acción de los microorganismos no deseados se puede controlar o prevenir por conservadores tales como agentes antibacterianos y anti-fúngicos, incluyendo, pero no limitado a parabenos metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal o combinaciones de los mismos.

Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, rellenadores, sales, soluciones amortiguadoras, estabilizantes, solubilizantes y otros materiales que son bien conocidos en el campo. Los portadores farmacéuticamente aceptables ejemplares para los péptidos en particular se describen en la Patente de E.U.A. No. 5,211,657. Tales preparaciones pueden contener rutinariamente sal, agentes amortiguadores, conservadores, portadores compatibles y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Cuando se utilizan en la medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables, pero no se pueden utilizar sales no farmacéuticamente aceptables convenientemente para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas si no se excluyen del alcance de la invención. Tales sales farmacológica y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, aquellas preparadas de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico, y similares. También, las sales farmacéuticamente aceptables se pueden preparar como sales de metal alcalino o alcalinotérreo, tales como sales de sodio, potasio o calcio.

Las formulaciones terapéuticas útiles en la invención se pueden preparar para almacenamiento al mezclar una gente que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A.

Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes, o estabilizantes aceptables no son tóxicos a los recipientes en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tal como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butil bencílico; alquil parabenos tal como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de peso molecular bajo (menor que aproximadamente 10 residuos); proteínas, tal como albúmina en suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hídrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; azucares tal como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tal como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteínas); y/o surfactantes no iónicos tal como TWEEN TM, PLURONICS TM o polietilenglicol (PEG).

Las dosificaciones de los oligosacáridos prebióticos, probióticos, y composiciones descritas en la presente dependerán de la situación clínica específica. Los factores que incluyen en la dosificación actual son, por ejemplo, el escenario clínico, por ejemplo el tipo de enfermedad y la etapa de enfermedad diagnosticada en un sujeto, la edad, el peso, sexo y condición de salud general de un sujeto etc. Como una directriz general, una composición prebiótica descrita en la presente se puede administrar dentro del intervalo de 0.1-1000 mg (ingrediente activo total)/kg(peso corporal del sujeto)/día. En algunas modalidades, la composición prebiótica se puede administrar dentro del intervalo de 1-300 mg/kg/día. En algunas modalidades, la composición prebiótica se puede administrar dentro del intervalo de 5-20mg/kg/día. En algunas modalidades, la composición prebiótica se puede administrar en una dosificación de aproximadamente 5mg/kg/día. En algunas modalidades, la composición prebiótica se puede administrar en una dosificación de aproximadamente 10mg/kg/día. En algunas modalidades, la composición prebiótica se puede administrar en una dosificación de aproximadamente 20mg/kg/día.

La cantidad absoluta de una composición prebiótica administrada dependerá de una variedad de factores incluyendo cualquier tratamiento concurrente, el número de dosis, la longitud del programa de tratamiento, y los parámetros del paciente individual incluyen la edad, condición física, salud, tamaño y peso. Estos son factores bien conocidos por aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo que se pueden evaluar y utilizar para determinar una dosificación apropiada o régimen de dosificación con no más de experimentación de rutina. En algunas modalidades, se prefiere que una dosis máxima se utilice, es decir, la dosis no tóxica, segura más alta de acuerdo con el juicio médico convincente. En algunas modalidades, se prefiere utilizar la dosis más alta que no se asocie con ninguna o cualquiera de las reacciones secundarias graves en el sujeto. En algunas modalidades, se prefiere utilizar la dosis mínima que proporcione un resultado clínico deseado, por ejemplo, una acidificación de un microambiente intestinal, una disminución en la abundancia de microorganismos patogénicos del intestino, un incremento en la abundancia de la microbiota benéfica en el intestino, y/o una mejora de un síntoma asociado con una sobreabundancia de microorganismos patogénicos en el intestino.

Múltiples dosis de composición prebiótica como se describe en la presente también se contemplan en algunas modalidades. En algunos casos, una composición prebiótica de la invención se administra con otro medicamento, por ejemplo, un medicamento que inhibe el crecimiento de microorganismos patogénicos en el intestino. En algunas tales modalidades, una dosificación sub-terapéutica de ya sea la composición prebiótica o del otro medicamento, o una dosificación sub terapéutica de ambos, se utiliza en el tratamiento de un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la presencia o una sobreabundancia de bacterias patogénicas en el intestino. Una "dosis sub-terapéutica" como se utiliza en la presente se refiere a una dosificación, que es menor que la dosificación que produciría un resultado terapéutico en el sujeto si se administra en ausencia del otro agente o agentes. De esta manera, la dosis sub-terapéutica de un agente es una que no produciría el resultado terapéutico deseado en el sujeto en presencia de la administración de los agentes de la invención. Las dosis terapéuticas de muchos agentes que están en uso clínico son bien conocidas en el campo de la medicina, y las dosis terapéuticas adicionales se pueden determinar por aquellas personas de experiencia sin experimentación indebida. Las dosificaciones terapéuticas se han descrito extensivamente en referencias tales como Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., 1990; así como muchas otras referencias médicas basadas como la profesión médica como guía para el tratamiento de enfermedades y trastornos.

En algunas modalidades, una composición prebiótica proporciona en la presente se administra al sujeto que experimenta o se sospecha que experimenta a un sintomas relacionado con un desequilibrio en la microbiota intestinal, por ejemplo, la presencia o sobreabundancia de bacterias patogénicas en el intestino del sujeto. En algunas modalidades, los agentes prebióticos y/o probióticos activos, o composiciones, proporcionados en la presente se administran en una cantidad suficiente para prevenir, reducir, o aminorar por lo menos un síntoma clínico que experimenta el sujeto.

Las estrategias de la liberación sostenida también se pueden emplear en los métodos descritos en la presente. Algunos de tales métodos utilizan polímeros para llevar a cabo una vibración sostenida de un agente de una composición. Las matrices poliméricas tanto no biodegradables como biodegradables se pueden utilizar para administrar una composición prebiótica de la invención al sujeto. Tales polímeros pueden ser polímeros naturales o sintéticos. El polímero se selecciona basado en el período de tiempo durante el cual la liberación se desea, generalmente en el orden de algunas horas. En algunas modalidades, se utiliza un polímero que se descompone lentamente en el intestino, liberado de esta manera la composición prebiótica a través tiempo. El polímero está opcionalmente en la forma de un hidrogel que puede absorber hasta aproximadamente 90% de su peso en agua y además, opcionalmente se retícula con iones multivalentes u otros polímeros. Los polímeros sintéticos ejemplares que se pueden utilizar para formar el sistema de administración biodegradable incluyen: poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquilenglicoles, óxidos de polialquileno, polialquilentereftalatos, alcoholes polivinílíeos, éteres polivinílíeos, ásteres polivinílíeos, haluros de poli-vinilo, polivinilpirrolidona, poliglicólidos, polisiloxanos, poliuretanos y copolímeros de los mismos, alquilcelulosa, hidroxialquil-celulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitro-celulosas, polímeros de ásteres acrílicos y metacrílíeos, metil-celulosa, etil-celulosa, hidroxipropil-celulosa, hidroxi-propil- etil-celulosa, hidroxibutil-metil-celulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, butirato de acetato de celulosa, ftalato de acetato de celulosa, carboxietilcelulosa, triacetato de celulosa, sal de sodio de sulfato de celulosa, poli(metil-metacrilato), poli(etil-metacrilato), poli(butilmetacrilato), poli (isobutil-metacrilato) poli (hexilmetacrilato), poli (isodecil-metacrilato) poli (lauril-metacrilato), poli (fenil-metacrilato), poli (metil-acrilato), poli (isopropil-acrilato), poli (isobutil-acrilato), poli (octadecil-acrilato), polietileno, polipropileno, poli (etilenglicol), poli (óxido de etileno), poli (etilentereftalato), poli(alcoholes vinilicos), acetato de polivinilo, cloruro de polivinilo, poliestireno y polivinilpirrolidona. Ejemplos de polímeros no biodegradables incluyen acetato de etilenvinilo, ácido poli(met)acrílico, poliamidas, copolímeros y mezclas de los mismos. Ejemplos de polímeros biodegradables incluyen polímeros sintéticos tales como polímeros de ácido láctico y ácido glicólico, polianhídridos, poli(orto)ésteres, poliuretanos, poli(ácido bútico), poli(ácido valérico), y poli (lacturo-cocaprolactona), y polímeros naturales tales como alginato y otros polisacáridos incluyen dextrano y celulosa, colágeno, derivados químicos de los mismos (sustituciones, adiciones de grupos químicos, por ejemplo, alquilo, alquileno, hidroxilaciones, oxidaciones, y otras modificaciones preparadas rutinariamente por aquellas personas expertas en el campo), albúmina y otras proteínas hidrofílicas, proteínas y otras prolaminas y proteínas hidrofóbicas, copolímeros y mezclas de los mismos. En general, estos materiales se degradan ya sea por hidrólisis enzimática o exposición al agua in vivo, por erosión superficial o volumen.

Varios métodos se describen en la presente para administrar a un sujeto con una composición para el tratamiento de una enfermedad o afección. Se va a entender que en cada tal aspecto de la invención, la invención incluye específicamente, también, la composición prebiótica para el uso en el tratamiento o prevención de esa enfermedad o afección, así como el uso del compuesto para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de esa enfermedad o afección.

La vía, frecuencia, dosificación, y marco de tiempo de administración pueden variar dependiendo de la afección identificada en el sujeto. Por ejemplo, una administración individual de los agentes y composiciones descritas en la presente puede ser suficiente para reducir, prevenir, o mejorar una afección aguda en el sujeto, mientras que en múltiples dosis, alargadas durante un período de tiempo, se puede indicar en un sujeto que experimenta una enfermedad o afección crónica, tal como enfermedad inflamatoria intestinal crónica.

En algunas modalidades, la administración puede continuar hasta un punto final deseado, por ejemplo, un cierto pH intestinal, o un número o presencia de microbiota benéfica, o ausencia o abundancia disminuida de microorganismos patogénicos en el intestino, o se haya alcanzado una mejora o reversión de un síntoma clínico. En otras modalidades, por ejemplo, en modalidades profilácticas, una composición prebiótica se puede administrar durante un tiempo especificado y la administración se puede concluir sin alcanzar un punto final especifico.

Sin elaboración adicional, se cree que una persona experta en el campo puede, basado en la descripción anterior, hacer y utilizar la presente invención en toda su extensión. Las siguientes modalidades especificas, por lo tanto se van a considerar como simplemente ilustrativas, y no limitantes del resto de la descripción de ninguna manera en lo absoluto. Todas las publicaciones citadas en la presente se incorporan a manera de referencia para los propósitos o contenido referido en la presente.

EJEMPLOS MATERIALES y MÉTODOS Fermentación in vi tro Bacterias fecales se cultivaron en un medio basal sin carbohidratos de acuerdo con los métodos de Hughes (Hughes SA, S.P., Gibson GR, McCleary BV, Rastall RA. 2008). Este medio contuvo por litro: 2 g de peptona, 2 g de extracto de levadura, 0.1 g de NaCl, 0.04 g de K2HPO4, 0.01 g de MgS04*7H20, 0.01 g de CaC12»6H20, 2 g de NaHCCh, 0.005 g de haemina (Sigma-Aldridge), 0.5 g de L-cisteina HCl, 0.5 g de sales biliares, 2 mL de Tween 80, 10 ml de vitamina K, y 4 mL de 0.025% (p/v) de solución de resazurina. Los métodos de cultivo anaeróbicos fueron aquellos de Bryant (Bryant, M.P. 1972) utilizando tubos de cultivo Hungate, sellados con septos de caucho de butilo y mantenidos anaeróbicamente utilizando CO2 sin 02.

Muestras fecales recientes se recolectaron de bebés sanos, quienes no hablan recibido antibióticos o pre/probióticos durante los 6 meses previos y no tuvieron historial reciente del trastorno gastrointestinal. Las heces humanas recientemente obtenidas se homogenizaron en una licuadora durante 60 s en solución saluda anaeróbica estéril amortiguada con fosfato (1:10 heces a solución salina), y se filtraron a través de una capa doble de estopilla estéril. Para lograr una concentración final de 5 g/L de glicano de prueba en 1% de suspensión fecal, el glicano se disolvió parcialmente en 9 mL de medio durante 1 h seguido por la adición de 1 mL de 10% de suspensión fecal. Todos los tubos se incubaron a 37°C. El fluido del cultivo se tomó para análisis después de 48 h, un tiempo que los inventores habían determinado parea ser de varias horas en la fase estacionaria máxima para las poblaciones tratadas con HMOS y de control negativo. Todos los experimentos se llevaron a cabo en triplicado. Las muestras se almacenaron a -20°C hasta la terminación de los análisis.

Se preparó un medio basal sin carbohidratos ZMB1 de acuerdo con Zhang y colaboradores (Zhang G, M.D., Block DE. 2009) que estudió el crecimiento de cepas de bacterias en presencia de oligosacáridos neutros. Las cepas de bacterias (Tabla 1) se obtuvieron de la Recolección Japonesa de Microorganismos (RIKEN BioResource Center, Japón), la Recolección de Tipo Americano (Manassas, VA). El medio clostridial reforzado (RCM) se utilizó para el crecimiento de las Bifidobacterias y C.perfringens. El LB se utilizó para el E. coli en crecimiento. Los cultivos de semillas de todas las bacterias se incubaron durante la noche y la densidad óptica 600 nm alcanzó 0.5, mientras que fueron necesarios 2 días e incubación para c.perfringens. Todas las bacterias se desarrollaron en condiciones anaeróbicas a 37°C, utilizado una cámara anaeróbica (DG250 Anaerobic Workstation, Don Whitlcy Scientific Limited, West Yorkshire, RU). 2'-FL (2 g/L) (Glycosyn, Inc. EUA), 3-FL (2 g/L) (Glycosyn, Inc. EUA), LDFT (1 g/L) (Glycosyn, Inc. EUA), y su combinación o HMOS se utilizaron como la fuente de carbono sola. Todos los materiales de prueba se disolvieron durante una hora en el medio antes de la inoculación con 10% (v/v) de cultivo de bacterias como en lo anterior. El ZMB1 que contiene los materiales de prueba anteriores se inoculó con el cultivo de bacterias, siguiendo como el tratamiento. El ZMBl que no contiene substrato también se inoculó con el cultivo de bacterias, para servir como control. El ZMBl que contiene FOS (2 g/L) también se inoculó con el cultivo de bacterias, para servir como control positivo. Todos los tubos se incubaron a 37°C. El fluido de cultivo se tomó a 48 horas. El crecimiento se midió por densidad óptica (OD=600 nm) en una placa de microtitulo.

Determinación de los niveles de pH y lactato El pH del medio del cultivo se registró después de 48 horas de fermentación bacteriana utilizando un medidor de pH (Corning, pH meter 240, EUA). La concentración de lactato en el medio se determinó utilizando un kit de ensayo de lactato (kit no.K607 -100; BioVision Inc., CA, EUA). Todos los experimentos se llevaron a cabo en triplicado.

Análisis de poblaciones microbianas mediante PCR en tiempo real Una fracción de los cultivos de fermentación (2 mL) se centrifugaron a 12, 000 x g durante 30 minutos. Después del ADN se extrajo de los cultivos siguiendo el método de Zhu y colaboradores (Zhu, W.Y., Williams, B.A., y colaboradores 2003). La PCR en tiempo real se utilizó para determinar el ADN bacteriano presente al final del cultivo de fermentación. Para este propósito, se utilizó una serie de pares de cebadores específicos de género de acuerdo con Collado y colaboradores (Collado, M.C., S. Delgado, A, Maldonado, and J. M. Rodríguez.2009) (Tabla 1) Tabla 1 Cebadores de Oligonucleótidos utilizados en este estudio Especie Cebadores Temp.de la secuencia (5'-3') Recocido Referencia bacteriana (’C) objetivo Bifidobacterium g-Bifid-F CTCCTGGAAACGGGTGG (SEQ ID 50 (Matsuki,,_ i NO :1) colaboradores, 2002) g-Bifid-R GGTGTTCTTCCCGATATCTACA (SEQ ID NO:2) C.perfringens Clp-F ATGCAAGTCGAGCGA(G/T)G (SEQ ID 55 (Rinttilá, 1 NO:3) colaboradores, 2004) Clp-R TATGCGGTATTAATCT(C/T)CCTTT (SEQ ID NO :4) E. coli UidA784F GTGTGATATCTACCCGCTTCG C (SEQ ID 56 (Frahm,_ g NO :5) colaboradores, 2003) UidA866R AGAACGCTTTGTGGTTAATCAGGA (SEQ ID NO :6) La amplificación y detección por PCR se llevó a cabo utilizando el sistema de detección por PCR en tiempo real (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) de acuerdo con los métodos de Collado y colaboradores (Collado, M.C., S. Delgado, A. Maldonado, and J. M. Rodríguez. 2009). Cada mezcla de reacción (25 pL) se compuso de iQ™ SYBR* Green Supermix (Bio-Rad Laboratories), 1 mL de cada uno de los cebadores específicos en una concentración de 0.25 pM y 1 pL de ADN de plantilla. Los productos fluorescentes se detectaron en la última etapa de cada ciclo. Un análisis de curva de fusión se hizo después de la amplificación para distinguir el producto de PCR objetivo del producto de PCR no objetivo. Las curvas estándares fueron ocho diluciones de 10 veces de ADN bacteriano extraído de cultivos puros de entre 2 a 9 unidades formadoras de colonias logio (CFUs) de cada una de las siguientes especies representativas seleccionadas: Bifidobacterium infantis S12 ATCC 15697, Clostridum perfringens ATCC13124, Escherichia coli H10407 ATCC 35401. Determinación del consumo de cada oligosacárido Las muestras se descongelaron y se centrifugaron a 4000 x g durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante transparente (0.5 mL) se trató con 0.25 mL de una solución acuosa resiente de borohidruro de sodio (0.5 M). Después de mezclado vigoroso, la mezcla de reducción se mantuvo durante la noche a 4°C luego se trató con 0.25 mL de ácido acético (0.5 M). En una pipetas Serológica (5 c 0.5 cm), desde la parte inferior, se empacaron lana de vidrio, arena, 0.6 g (3 meq) de resina de intercambio catiónico AG50W-X8 tratada (BioRad), 0.9 g (3 meq) de resina de intercambio aniónico AG1-X8 (forma de acetato, BioRad, Hercules CA), y celita. La resina de intercambio catiónico AG50W-X8 (forma de hidrógeno, BioRad, Hercules CA) se trató mediante piridina 1 M, 1 hx 3 veces, dando por resultado la forma de piridinio, la columna anterior se activó con 0.5 mL de agua, seguido por las muestras reducidas (1 mL) aplicadas a la columna. El tubo de muestras se en juagó con agua (0.5 mL), y la columna de resina se lavó con 18 mL adicionales de agua. Los eluatos fueron oligosacáridos neutros, seguido por congelación con hielo seco en etanol antes de la liofilización. Los oligosacáridos neutros en las muestras se analizaron por una HPLC Agilent (serie 1200) con un espectrómetro de masas de triple cuadropolo (6460), equipado con una columna de grafito poroso (3 mm, 100 x 2.1 mm, Hypercarb, Thermo Scientific, Waltham, MA) ajusta para 25°C. Los métodos se validaron por oligosacáridos auténticos de GlycoSeparations (Moscú, Rusia) (Newburg, D.S.2001).

Análisis Estadístico Los datos expresan como media ± SEM. La significancia estadística de las diferencias entre los grupos se determinó por una ANOVA de un factor. Cuando las diferencias se encontraron, la prueba t de Student se utilizó para comparaciones en pares; P £ 0.05 se consideró significativo. RESULTADOS Variación de pH y lactato en el cultivo de fermentación Los glicanos de leche humana afectan la colonización directamente, al seleccionar las bacterias para utilizar estos glicanos únicos, e indirectamente, cuando se fermentaron a lactato y ácido graso de cadena corta, haciendo lo intestinos ácidos y estimulando el crecimiento de algunas bacterias mientras que inhibe la colonización por muchos organismos patogénicos. El pH y lactato en los cultivos de fermentación se detectaron para determinar si el HMOS se fermentó por la microbiota fecal. La Figura 1 mostró que el pH en los grupos complementados con HMOS fueron significativamente más bajos que aquellos en el control no complementado y el control positivo complementado con FOS (P<0.05). Y las concentraciones de lactato en los grupos complementados con HMOS fueron significativamente más altos que en el control (P<0.05).s Cambios de la población bacteriana Para determinar si la presencia de HMOS puede alterar la distribución de la microbiota intestinal, las cantidades relativas de microorganismos se determinaron en presencia de HMOS y FOS. Las cantidades relativas de especies bacterianas en las muestras fecales donadoras se caracterizaron por la PCR en tiempo real en presencia de HMOS y FOS. La Figura 2 mostró que HMOS incrementó el número de Bifidobacterias , mientras que los números de E. coli y C .perfringens disminuyeron.

Consumo de cada oligosacárido Para determinar las estructuras de HMOS especificas consumidas por las especies bacterianas fecales, los sobrenadantes del cultivo fecal se recuperaron después de la fermentación, y el HMOS se purificó, se redujo, se perfiló por LC-MASS como se describe previamente por Newburg (Newburg, D.S. 2001). Los oligosacáridos neutros principales (incluyendo 2'-FL, 3-FL y LDFT) se monitorearon. Figura 3. El consumo promedio de 2'-FL y LDFT para toda la microbiota fecal donadoras fueron más de 90%, mientras que para 3-FL, el consumo es de aproximadamente 53%. Estos datos indican que 2'-FL y LDFT se metabolizaron por las bacterias fecales mientras que 3-FL parece que es más resistencia al catabolismo por estos organismos ya que se descubrió que se cataboliza por un organismo que está solamente presente en pequeños números.

Efecto de HMOS y combinaciones de oligosacárido en el crecimiento de diferentes cepas bacterianas Diez Bifidobacterias diferentes utilizadas en este estudio (ver Tabla 2 a continuación) podrían utilizar 2'-FL, 3-FL, LDFT, una combinación de los mismos, 3'-SL, b'-SL, una combinación de 3'-SL y 6'-SL, y una combinación de todos estos oligosacáridos fucosilados y sialilactosas como una fuente de carbono primaria en concentraciones indicadas en las Figuras 4 y 5.

La Figura 4 mostró que todos los oligosacáridos fucosilados, 2'-FL, 3-FL, LDFT, y HMOS podrían incrementar significativamente el crecimiento de la Bífídobacteria sp. y disminuir el pH en el cultivo. Para E. coli y C .perfringens , no existe incremento significativo en su crecimiento y disminución en el pH. La combinación de los tres oligosacáridos fucosilados individuales tiene un efecto acumulativo en el crecimiento incrementado y pH disminuido por consiguiente. Y el efecto es equivalente al HMOS total. Estos datos sugieren que los oligosacáridos neutros se pueden utilizar como una fuente de carbono por estos organismos prebióticos e inhiben el crecimiento de los organismos patogénicos.

Tabla 2 Cepas Bacterianas utilizadas en este Estudio Especies Origen Bifidobacteríum longum JCM 7007 Heces de bebé humano Bifidobacterium longum JCM 7009 Heces de bebé humano Bifidobacteríum longum JCM 7010 Heces de bebé humano Bifidobacterium longum JCM 7011 Heces de bebéhumano Bifidobacteríum longum JCM 1210 Heces de bebéhumano Bifidobacteríum longum JCM 1260 Heces de bebé humano Bifidobacterium longum JCM 1272 Heces de bebéhumano Bifidobacterium longum JCM 11347 Heces de bebé humano Bifidobacterium longum ATCC 15708 Heces de bebé humano Bifidobacterium infantis ATCC 15697 Heces de bebéhumano Clostridi um perfringens ATCC13124 n/a Escherichia coli W3110 Heces humanas En resumen, las combinaciones de los oligosacáridos fucosilados mostraron mayor actividad de la promoción del crecimiento de Bifidobacterias y disminución del pH en el microambiente de las bacterias que las individuales. Como se muestra en la Figura 4, la combinación de los tres oligosacáridos fucosilados sometidos a prueba mostraron una actividad igual o mayor en promover el crecimiento y/o disminuir el pH de ciertas cepas de Bifidobacterias como es comparado con el efecto prebiótico de los oligosacáridos totales de la leche humana sobre una base en peso. Estos oligosacáridos no estimularon el E coli y C perfringens, que no son mutualistas con los humanos.

Los oligosacáridos de sialilo, en combinación con otros oligosacáridos puros, mostraron actividad similar. Las sialilactosas tales como 3'-SL y 6'-SL solas mostraron efectos prebióticos en algunas cepas de Bifidobacterias. La Figura 5. Sorprendentemente, las combinaciones de estas dos sialilactosas con oligosacáridos fucosilados (2'-FL, 3-FL, y LDFT) mostraron actividades en la promoción del crecimiento y disminución de pH en niveles iguales a o mayores que aquellos de la mezcla de HMOS natural total. La actividad de disminución de pH se pronunció especialmente en las mezclas que contienen las sialilactosas; excedió en gran medida aquella de la mezcla de HMOS natural. Figura 5.

Los efectos de los oligosacáridos individuales y sus mezclas en el panel de patógenos y otros habitantes de la microbiota también se sometieron a prueba. Figura 6. FOS (5 g/L) se utilizó como un control positivo. Los resultados obtenidos de esta manera indican que algunas de las cepas bacterianas sometidas a prueba no utilizan estos oligosacáridos, algunos utilizan FOS también, pero muchos utilizan HMOS y la mezcla de los oligosacáridos. Figura 6. Los resultados también muestran los efectos de la mezcla en ciertas cepas bacterianas que son más altas que aquellas del HMOS en las mismas cepas.

En general, los estudios descritos en lo anterior mostraron que a través de la fermentación ín vitro, los números de bifidobacterias complementadas con HMOS, oligosacáridos fucosilados (2f-FL, 3-FL, LDFT, o una mezcla de las mismas), sialilactosa (3'-SL, 6'-SL, o una mezcla de las mismas), y una combinación de oligosacárido fucosilado y sialilactosa, fueron significativamente más altos que aquellas en el control. Al mismo tiempo, todas las combinaciones de oligosacárido sometidas a prueba y HMOS podrían estimular significativamente el crecimiento y disminución del pH en todos los diez cultivos de Bif idobacterias. Estos resultados sugieren que el prebiótico, efectos bifidogénicos de HMOS son específicos de estructura y pueden variar dependiendo de la composición de HMOS en la leche de diferentes individuos o el cambio durante el curso de la lactancia. La colonización incrementada por las bifidobacterias en bebés alimentados con leche materna pueden mejorar la formación a largo plazo subsecuente de un ecosistema microbiano estable al favorecer los anaerobios simbióticos y al inhibir la colonización por los patógenos entérico, protegiendo al bebé de la enfermedad.

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OTRAS MODALIDADES Todas las características descritas en esta especificación se pueden combinar en cualquier combinación.

Cada característica descrita en esta especificación se puede reemplazar por una característica alternativa que sirve al mismo, equivalente o similar propósito. De esta manera, a menos que se establezca expresamente de otra manera, cada característica descrita es solo un ejemplo de una serie genérica de equivalentes o características similares.

A partir de la descripción anterior, una persona experta en la téenica puede evaluar fácilmente las características esenciales de la presente invención, y sin apartarse del espíritu y alcance de la misma, puede hacer varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a varios usos y condiciones. De esta manera, otras modalidades también están dentro de las reivindicaciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una composición prebiótica, caracterizada porque consiste esencialmente de una sialilactosa y un oligosacárido fucosilado, en donde la sialilactosa es 3'-sialilactosa (3'-SL), 6'-sialilactosa (6'-SL), o una mezcla de las mismas, y en donde el oligosacárido fucosilado comprende un residuo de al,2-fucosilo, al,3-fucosilo, y/o al,4-fucosilo.

2. La composición prebiótica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la sialilactosa es una mezcla de 3'-SL y 6'-SL.

3. La composición prebiótica de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el oligosacárido fucosilado comprende un oligosacárido neutro fucosilado.

4. La composición prebiótica de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el oligosacárido fucosilado es 2'-fucosilolactosa (2-FL), 3-fucosilolactosa (3-FL), lactodifucotetraosa (LDFT), o una mezcla de las mismas.

5. La composición prebiótica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque el oligosacárido fucosilado es una combinación de: 2'-FL y 3-FL; 2'-FL y LDFT; 3-FL y LDFT; o 2'-FL, 3-FL, y LDFT.

6. La composición prebiótica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición consiste esencialmente una mezcla de 3'-SL, 6'-SL, 2'-FL, 3- FL, y LDFT.

7. La composición prebiótica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque la composición contiene además un prebiótico.

8. La composición prebiótica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el probiótico es una población de bifidobacterias, bifidobacterias, lactobacilos, Bacteriodes fragilis, Bacteriodes thetaiotaomicron, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermides, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, o una combinación de los mismos.

9. La composición prebiótica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la población de bifidobacterias es B. longum, B. inf antis, o una mezcla de las mismas.

10. La composición prebiótica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la población de bifidobacterias es B. longum JCM7007, JCM7009, JCM7010, JCM7011, JCM1210, JCM1260, JCM1272, JCM11347, ATCC15708, B. inf antis ATCC15697, o una mezcla de las mismas.

11. La composición prebiótica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque la composición comprende 3'-SL y 6'-SL en una relación que varía de 4:1 a 1:2.

12. Un método para incrementar la proliferación de bifidobacterias, el método caracterizado porque comprende poner en contacto una población de bifidobacterias con una composición prebiótica que comprende una sialilactosa y un oligosacárido fucosilado en una cantidad efectiva para incrementar la proliferación de la población de bifidobacterias.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la sialilactosa es 3'-sialilactosa (3'-SL), 6'-sialilactosa (6'-SL), o una mezcla de las mismas.

14. El método de conformidad con la reivindicación 11 o 12, caracterizado porque el oligosacárido fucosilado comprende un residuo de al,2-fucosilo, al,3-fucosilo, y/o al,-fucosilo .

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-14, caracterizado porque el oligosacárido fucosilado comprende un oligosacárido neutro fucosilado.

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-15, caracterizado porque el oligosacárido fucosilado es 2'-fucosilolactosa (2-FL), 3-fucosilolactosa (3—FL), lactodifucotetraose (LDFT), o una mezcla de las mismas.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-16, caracterizado porque la etapa de contacto se lleva a cabo in vitro.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-16, caracterizado porque la etapa de contacto comprende administrar la composición prebiótica a un sujeto en necesidad de la misma.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la composición prebiótica se administra oralmente al sujeto.

20. El método de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque el sujeto es un humano.

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-20, caracterizado porque el sujeto es un bebe.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el bebé es un bebé neonatal.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-22, caracterizado porque el sujeto es un sujeto que sufre de, se sospecha que tiene, o está en riesgo de una enfermedad asociada con una sub-representación de microorganismos benéficos o la presencia o sobreabundancia de bacterias patogénicas en el intestino.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-23, caracterizado porque el sujeto está sufriendo de, se sospecha que tiene, o está en riesgo de síndrome del intestino irritable o enfermedad inflamatoria intestinal.

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-24, caracterizado porque la composición prebiótica se administra al sujeto en una cantidad efectiva para disminuir el pH en el microambiente de las bifidobacterias.

26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-25, caracterizado porque la composición prebiótica se administra al sujeto en una cantidad efectiva para disminuir la velocidad de proliferación de una bacteria patogénica.

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-26, caracterizado porque la población de bifidobacterias comprende Bifidobacterium longum, Bifidobacterium inf antis , o una mezcla de las mismas.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la bacteria patogénica es Escherichia coli o Clostridium perfringens.

29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-28, caracterizado porque la composición prebiótica comprende además un prebiótico.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el prebiótico es una población de bifidobacterias, bifidobacterias, lactobacilos, Bacteriodes fragilis, Bacteriodes thetaiotaomicron, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermides, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae o una combinación de los mismos.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la población de bifidobacterias es B. longum, B. inf antis, o una mezcla de las mismas.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la población de bifidobacterias es B. longum JCM7007, JCM7009, JCM7010, JCM7011, JCM1210, JCM1260, JCM1272, JCM11347, ATCC15708, B . infantis ATCC15697, o una mezcla de las mismas.

33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-32, caracterizado porque la composición prebiótica comprende 3'-SL y 6'-SL en una relación que varia de 4:1 a 1:2.

34. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento de un trastorno gastrointestinal, la composición caracterizada porque comprende la composición prebiótica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11.

35. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el trastorno gastrointestinal se asocia con una representación inadecuada de microorganismos benéficos o una sobreabundancia de microorganismos patogénicos.

36. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 34 o 35, caracterizada porque el trastorno gastrointestinal es síndrome del intestino irritable o enfermedad inflamatoria intestinal.

37. Uso de la composición prebiótica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para preparar un medicamento para el uso de un tratamiento de un trastorno gastrointestinal.