DE69919518T2

DE69919518T2 - Lactobacillus-stamm

Info

Publication number: DE69919518T2
Application number: DE69919518T
Authority: DE
Inventors: Grahn Eva HAKANSSON; Ulla Forsgren-Brusk; Rolf Andersson; E. Stig HOLM; Stellan Hakansson
Original assignee: SCA Hygiene Products AB
Current assignee: Essity Hygiene and Health AB
Priority date: 1998-03-06
Filing date: 1999-03-05
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2019-03-06
Also published as: SE519648C2; JP2002505099A; TNSN99033A1; SK13262000A3; NZ506156A; BR9908437A; SE9801951L; JP4267822B2; SE9801951D0; WO1999045099A1; EP1060240B1; EP1060240A1; AU2864899A; US6761885B1; AU754042B2; DE69919518D1; CO4830476A1; ES2228018T3; PL342759A1; ATE274051T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Lactobacillusstamm, der wertvolle pharmazeutische Eigenschaften aufweist. Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung und Produkte für die persönliche Pflege, welche diesen Stamm umfassen, und ferner die Verwendung des Stamms zur Verhinderung von urogenitalen Infektionen.
Technischer Hintergrund
(Die Offenbarung aller in der folgenden Beschreibung zitierten Dokumente wird durch Bezugnahme inkorporiert.)
Die übliche Bakterienflora im Urogenitalbereich wird von einem komplexen Ökosystem aufgebaut, das mehr als 50 unterschiedliche Bakterienspezies umfaßt (Hill et al., Scand. J. Urol. Nephrol. 1984; 86 (Suppl.): 23-29). Die normale Flora wird durch Bakterien dominiert, die zur Gattung Lactobacillus (LB) gehören, wobei es sich um gram-positive Stäbchen handelt, die an die Umgebung in der Vagina einer fruchtbaren Frau adaptiert sind. Diese Bakterien tragen auch zu dem spezifischen Milieu und dem ökologischen Gleichgewicht in der Vagina bei.
Abgesehen von dem komplexen Wechselwirkungsmuster der vielfältigen Bakterienflora der Vagina und des Rests des urogenitalen Bereichs, ist es notwendig, Änderungen der physikalischen Bedingungen zu berücksichtigen, die das Bakterienwachstum und Adhäsionseigenschaften beeinflussen können. Einige LVS-Stämme inhibieren das Wachstum von möglicherweise pathogenen Bakterien durch verschiedene Mechanismen. Der Metabolismus der LB führt zur Bildung von organischen Säuren, vor allem Milchsäure und Essigsäure, welche zu dem geringen pH der Vaginalflüssigkeit beitragen, der für manche andere Spezies ungünstig ist. LB können auch lösliche Substanzen produzieren, die das Wachstum von potentiell pathogenen Bakterien und Hefen direkt inhibieren. Sie können ferner Wasserstoffperoxid produzieren, der für Bakterien toxisch ist, denen es an dem Enzym Katalase fehlt, beispielsweise gram-negativen anaeroben Stäbchen und Enterobacteriacae. Diese inhibierenden Eigenschaften können erheblich zwischen den einzelnen LB-Stämmen variieren (Hooton et al., JAMA 1990; 265: 64-69).
Die Schwäche des natürlichen Verteidigungssystems gibt potentiell pathogenen Mikroorganismen die Möglichkeit, klinische Infektionen zu verursachen, beispielsweise in Verbindung mit Medikation, schlechter persönlicher Pflege oder Verschiebungen in der Mikroflora der Haut oder der Schleimmembrane. Die normale Flora der Vagina wird durch LB dominiert und der umgebende pH ist weniger als 4,5. Hefen und Enterobakterien sind selten oder fehlen vollständig (Redondo-Lopez et al., Rev. Inf. Dis. 1987; 12: 856-872). Verschiebungen der vaginalen Bakterienflora kann man in Verbindung mit unterschiedlichen pathogenen Bedingungen finden. Bei Frauen, die an wiederaufbrechenden Harntraktinfektionen leiden, kommt es zu einer erhöhten Menge an Enterobakterien in der Vagina und der Harnröhrenöffnung, und diese weisen ferner eine an Lactobacilli abgereicherte Harnflora auf (Marrie et al., J. Clin. Microbiol. 1976; 8: 67-72). Es ist auch bekannt, daß die Häufigkeit von Infektionen in Verbindung mit der Antibiotikabehandlung von anderen Infektionen zunimmt (Stamey, Rev. Inf. Dis. 1987: 9 (Suppl. 2): 195-208; Reid et al., Curr. Opin. Inf. Dis. 1991: 4: 37-41). Darüber hinaus wurde gezeigt, daß Kinder, die eine Vorgeschichte mit häufigen Episoden von Antibiotikabehandlungen hinter sich haben, dafür empfänglicher sind, Harntraktinfektionen einzufangen (Märild et al., Ped. Inf. Dis. 1990; 22: 43-47).
Bei der bakteriellen Vaginosis verringert sich die LB-Menge und erhöht sich der pH. Es gibt auch eine Dominanz von Bacterioides-Spezies, Gardnerella vaginalis und Mobiluncus (Redondo-Lopez, siehe oben). Vaginisis, die in Verbindung mit einer erhöhten Enterobakterienmenge auftritt, ist oft ein greifbares Problem in Verbindung mit einer Antibiotikabehandlung. Die übliche orale Verabreichung von Penicillin führt zu der Anreichung der Substanz in der Vaginalflüssigkeit (Sjöberg et al., Obstet. Gynecol. 1990; 75: 18-21), gefolgt von einer Besiedlung durch Enterobakterien und Hefe (Sjöberg et al., Gynecol. Obstet. Invest. 1992; 33: 42-46). Untersuchungen bei Affen (Macaca fascicularis) haben offenbart, daß die vaginale Verabreichung von Amoxicillin die Fähigkeit der normalen Bakterienflora verschlechtert, die Besiedlung von für den Harntrakt pathogenen E. coli zu inhibieren (Herthelius et al., Infektion 1988; 16: 263-266).
Während der Schwangerschaft kann die Zusammensetzung der Vaginalflora die Sterblichkeit des Fötus und Kinds beeinflussen. Das Auftreten von Gruppe B Streptococci (GBS) in der Fäkal- und Vaginalflora ist üblich (bei bis zu 30 aller schwangeren Frauen). Diese Bakterien stellen normalerweise keine Bedrohung für die Gesundheit der Frau dar. GBS können jedoch ernsthafte Infektionen beim neugeborenen Kind verursachen. In diesen Fällen werden die Bakterien vertikal von der Mutter zum Kind vor oder in Verbindung mit der Geburt übertragen. Andere Bakterien können ebenfalls auf diese Weise übertragen werden und Infektionen beim Kind verursachen. Ferner besteht eine enge Verbindung zwischen bakterieller Vaginosis und Frühgeburt (Martius et al., Arch. Gynecol. Obstet. 1990; 247: 1-13). Die Mechanismen hinter diesen Phänomen sind nicht bekannt. Es wurde gezeigt, daß eine Verschiebung der vaginalen Flora in Richtung auf eine Dominanz von gram-negativen Spezies die Menge des Enzyms Phospholipase A2 erhöht, was wiederum die Prostaglandinsynthese ausgehend von Arachidonsäure auslöst (Bejar et al., Obstet. Gynecol. 1981; 57: 479-482). Die Vaginosisflora produziert ferner große Menge an Endotoxin (Sjöberg et al., Obstet. Gynecol. 1991; 77: 265-266), welches die endogene Prostaglandinsynthese induzieren kann (Romero et al., Obstet. Gynecol. 1989; 73: 31-34), die möglicherweise durch Interleukine vermittelt wird.
Die theoretisch positiven Eigenschaften von LB haben ihren Gebrauch in kommerziellen Präparaten motiviert mit der Absicht, die Vaginalflora zu ergänzen und zu kräftigen. Der Erfolg war unterschiedlich und oft enthalten die verfügbare Präparate erhebliche geringere LB-Zahlen als das, was angegeben wird. Einige Präparate waren auch kontaminiert (Hughes et al., Obstet. Gynecol. 1990; 75(2): 244-248). Um die normale Bakterienflora im Urogenitalbereich durch die Zugabe von LB zu ergänzen und zu verbessern, ist es notwendig, den zu verwendenden Bakterienstamm sorgfältig auszuwählen. Ein für diesen Zweck geeigneter LB-Stamm sollte die folgenden Kriterien erfüllen:

1. Der LB-Stamm sollte große Mengen an löslichen Substanzen mit einer wachstumsinhibierenden Kapazität gegenüber Enterobakterien, Streptokokken der Gruppe B, Staphylokokken und Hefe produzieren.
2. Der LB-Stamm sollte dazu in der Lage sein, auf die Haut und die Schleimhautoberflächen des Urogenitalbereichs übertragen zu werden.
3. Der LB-Stamm sollte in der Lage sein, an den Epitheloberflächen im Urogenitalbereich zu haften.
4. Der LB-Stamm sollte in der Lage sein, eine Lagerung über einen längeren Zeitraum auszuhalten, und es muß möglich sein, den Stamm in unterschiedlichen Präparatarten zu induzieren.
5. Der LB-Stamm sollte in der Lage sein, seine Lebensfähigkeit und Eigenschaften in einem Artikel oder einem Präparat beim Gebrauch aufrechtzuerhalten.
6. Der LB-Stamm sollte nicht gegenüber spermiziden Präparaten, die Nonoxynol-9 enthalten, empfindlich sein.
7. Der LB-Stamm sollte aus dem Urogenitaltrakt einer Frau isoliert sein.
8. Der LB-Stamm sollte die Existenz der menschlichen urogenitalen LB-Flora erlauben.

Daher besteht ein Bedarf nach Stämmen, welche diese Anforderungen erfüllen.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein neuer Lactobacillus plantarum-Stamm, der als LB931 bezeichnet wird, wurde isoliert, der die oben angeführten Anforderungen erfüllt. Der Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen, Braunschweig, Deutschland hinterlegt. Ihm wurde die Zugangsnummer DSM11918 zugeteilt. Dementsprechend kann man LB931 zur Behandlung und/oder zum Vorbeugen von Urogenitalinfektionen verwenden. LB931 kann vorteilhafterweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen und in Produkten für die persönliche Pflege, wie Windeln und Damenbinden, enthalten sein.
Definitionen
Wie hier offenbart, bezieht sich der Ausdruck "LB" auf Bakterien der Gattung Lactobacillus.
Wie hier offenbart, bezieht sich der Ausdruck "Urogenitalbereich" auf das Perineum (Damm), die Harnröhre und die Vagina.
Wie hier offenbart, bezieht sich der Ausdruck "absorbierender Gegenstand" auf Produkte, die sich dazu eignen, Körperflüssigkeit zu absorbieren, wie Blut oder Urin. Beispiele für solche Artikel sind Produkte für die weibliche Hygiene, Inkontinenzschutz und Windeln.
Wie hier offenbart, bezieht sich der Ausdruck "GBS" auf Streptokokkus der Gruppe B.
Wie hier offenbart, bezieht sich der Ausdruck "Milchsäurebakterien" auf Bakterien, die Milchsäure produzieren, wie Bakterien, die zu den Gattungen Lactobacillus und Lactococcus gehören.
Mit dem Ausdruck "cfu" sind koloniebildende Einheiten ("colony-forming units") gemeint.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Stamm von Lactobacillus plantarum, der als LB931 (DSM11918) bezeichnet wird. Dieser Bakterienstamm ist wertvoll zum Verhindern und/oder Behandeln von urogenitalen Infektionen, da er das Wachstum einer großen Zahl von pathogenen Mikroorganismen inhibiert. Der Stamm ist haltbar und überlebt leicht lange Lagerungsperioden bei Raumtemperatur. Dementsprechend zeigen LB931-haltige Produkte eine lange Lagerbeständigkeit. Der Stamm kann leicht auf die menschliche Haut und das vaginale Epithel übertragen werden. LB931 ist resistent gegenüber therapeutischen Konzentrationen mancher antibiotischer Substanzen und spermaziden Verbindungen.
Die Inhibierungseigenschaften von LB931 sind untersucht worden. Beispiele für Bakterienspezies, die erfolgreich inhibiert wurden, sind Escherichia, Klebsiella, Proteus, Staphylococcus und Streptokokkus der Gruppe B. LB931 ist daher beim Verhindern und/oder Behandeln von Infektionen von Nutzen, die durch diese Mikroorganismen verursacht werden.
Wie zuvor angemerkt, stellt die vorliegende Erfindung auch eine Vielzahl von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verfügung, die sich vorzugsweise für die topische Verabreichung eignen, und die LB931 zusammen mit pharmazeutisch oder physiologisch annehmbaren Trägern, Vehikeln und/oder Verdünnungsmitteln umfassen. Im allgemeinen sollten solche Träger nicht-toxisch für den Einnehmenden bei den eingesetzten Dosen und Konzentrationen sein. Normalerweise beinhaltet die Herstellung solcher Zusammensetzungen die Kombination des therapeutischen Mittels mit Puffern, Verdickungsmitteln aus gelbildenden Mitteln, wie Glycerin, Polyethylenglycol etc.. Antioxidationsmittel, wie Ascorbinsäure, niedermolekulargewichtige (weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide, Proteine, Kohlenhydrate einschließlich von Glucose, Saccharose und Dextrinen, und andere Stabilisatoren und Vehikel können enthalten sein. Mögliche pharmazeutische Zusammensetzungen sind Salben, Cremes, flüssige Lösungen, Zäpfchen oder Kapseln.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch absorbierende Gegenstände, die LB931 umfassen. Ein solcher Gegenstand kann eine durchlässige äußere Lage, die in engem Kontakt mit der Haut des Trägers sein soll, eine vorzugsweise flüssigkeitsundurchlässige Rücklage, die beim Gebrauch vom Träger entfernt liegen soll, und eine zwischen der äußeren Lage und der Rücklage angeordnete absorbierende Struktur umfassen. In manchen Fällen kann eine zusätzliche Lage, beispielsweise in der Form einer Watte oder eines ähnlichen Materials, zwischen der äußeren Lage und der absorbierenden Struktur plaziert sein. Man kann die antagonistische Eigenschaften aufweisenden Mikroorganismen in unterschiedlichen Teilen des absorbierenden Gegenstands anordnen, beispielsweise in der äußeren Lage, in der absorbierenden Struktur des absorbierenden Gegenstands, zwischen zwei Schichten des absorbierenden Gegenstands, in einem lockeren Einlageprodukt in dem absorbierenden Gegenstand oder auf andere Weise.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der beigefügten Figuren näher beschrieben, in denen:
1 ein Diagramm ist, das die Stabilität von gefriergetrockneten LB931 bei Raumtemperatur (+22°C) und bei +6°C zeigt;
2 ein Diagramm ist, das die Stabilität von LB931 zeigt, mit denen ein absorbierender Gegenstand imprägniert wurde;
3 und 4 die Menge an LB931 zeigen, die auf die Harnleiteröffnung und die perineale Haut bei jungen Mädchen übertragen wurde, nach der Verwendung einer LB931 umfassenden Slipeinlage.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele beschrieben.
Beispiel 1: Isolierung und Typisierung von Lactobacillus plantarum, Stamm LB931
Gesunden Frauen wurden Bakterienproben entnommen. Aus diesen Proben isolierte man Bakterienstämme, und diese Stämme wurden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, das Wachstum von Enterobakterien zu inhibieren, gescreent (Daten nicht gezeigt). Der beste Stamm, der aus einer gesunden schwangeren Frau isoliert wurde, wurde als Lactobacillus plantarum gemäß dem Testkit API 50 CH (API systems, BioMerieux, FR) klassifiziert und als LB931 bezeichnet. Der Stamm wurde ferner durch DNA-Analyse mit SDS-page bei BCCM/LMG (Belgien) als Lactobacillus plantarum-pentosus-paraplantarum typifiziert.
Beispiel 2: Inhibierungsfähigkeit des Stamms LB931
Der Zweck dieses Experiments war es, die Fähigkeit des Stamms LB931, das Wachstum von anderen Bakterien zu inhibieren, zu verdeutlichen. LB931 wurde in MRS-Brühe (Merck, DE) bei einer Temperatur von 37°C in 5 % CO₂ über Nacht kultiviert. Man gab 1 ml, der 10⁸ Bakterien enthielt, zu 25 ml geschmolzenem 2 %igem Agar in MRS-Brühe. Die Mischung wurde in eine Petrischale gegossen, kongelieren gelassen und wie zuvor beschrieben 24 Stunden inkubiert. Weitere 25 ml des M17-Agars (Merck, DE) wurden auf die erste Schicht gegossen und man ließ die Platten 4 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Ähnliche Agarplatten ohne LB931 wurden ebenfalls hergestellt und als Kontrollplatten verwendet.
Die Indikatorbakterien wurde getrennt in einem TY-Medium (Holm et al., APMIS 1967; 69, 264) bei 37°C in Luft kultiviert. Die Kulturen wurden in eine Bertanischale mit 25 Abteilungen überführt, wobei jede Abteilung 0,25 ml (10⁶ Bakterien/ml) hielt. Aus jeder dieser Schalen wurden die Bakterien überführt und auf die Lactobacillus enthaltenden Agarplatten gestempelt unter Verwendung von Steers Stahlstiftreplikator (Steers et al., J. Antibiot. Chemother. 1979; 9, 307). Die Platten wurden bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Platten wurden gelesen und man stellte fest, ob a) die Indikatorbakterien gewachsen waren; b) das Wachstum der Indikatorbakterien inhibiert wurde oder c) es zu keinem Wachstum der Indikatorbakterien gekommen war. Der pH einer jeden Platte wurden ebenfalls überwacht.
Die Ergebnisse der Störtests werden in Tabelle I gezeigt.
Tabelle I
Die Ergebnisse zeigen, daß Lactobacillus plantarum, LB931, das Wachstum einer großen Zahl von Bakterienstämmen inhibiert oder verhindert, während andere Lactobacillusstämme weitgehend unbeeinträchtigt bleiben.
Beispiel 3: Die Überlebensfähigkeit von LB931 in unterschiedlichen Präparaten

a) In einer Suspension aus gleichen Teilen Magermilch und 0,9 %iger NaCl aufgelöste LB931 LB931 wurde in Magermilch aufgelöst, die 0,9 % NaCl enthielt. Die aufgelösten Bakterien wurden dann bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert. Die Menge der Bakterien wurde kontinuierlich durch Zellzählung überwacht. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle II beschrieben. Tabelle II
Die Ergebnisse zeigen, daß LB931 in einer Mischung aus Magermilch und NaCl über einen Zeitraum von einem Monat bei +4°C stabil sind.
b) Ein Magermilchpräparat mit LB931 wurde nach Standardverfahren gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wurde in Petrischalen bei Raumtemperatur und bei +6°C gelagert. Die Zahl der Bakterien wurde nach 7 bzw. 25 Tagen bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle III beschrieben. Tabelle III
Die Zahl der Bakterien in dem gefriergetrockneten Pulver wurde ebenfalls jede vierte Woche bis zur 68. Woche überwacht. Diese Ergebnisse werden in 1 präsentiert. Angesichts der Figur ist es offensichtlich, daß LB931 bei Raumtemperatur und +6°C 22 Wochen stabil sind. Nach einem Jahr bei +6°C sind mehr als 10⁵ cfu/mg LB931 lebensfähig.
c) Man testete die Fähigkeit von LB931, in synthetischem Urin mit einem pH von 6,6 zu überleben. Der synthetische Urin enthielt mono-, ein divalentes Kat- und Anionen und ferner Harnstoff, und wurde nach den Spezifikationen in Geigy, Scientific Tables, Bd. 2, B. Ausg. 1981, S. 53, hergestellt. Zu dem sterilen synthetischen Urin gab man ein Nährmedium für Mikroorganismen. Das Nährmedium wurde gemäß den Daten von der Zusammensetzung der Hook- und FSA-Medien hergestellt. Zu 1 ml synthetischem Urin gab man 10³ LB931-Bakterien und inkubierte die Proben 18 h bei 32°C. Nach der Inkubation betrug die Bakterienzahl in der Probe > 10⁵/ml. LB931 ist in der Lage, in synthetischem Urin zu überleben und zu wachsen.
d) Man untersuchte die Fähigkeit von LB931, auf einem absorbierenden Gegenstand (Slipeinlage) zu überleben. Man gab eine Suspension von LB931 (150 μl) zu dem absorbierenden Gegenstand und lagerte den Gegenstand danach in einer dichten Verpackung bis zu 9 Monate lang. Die Ergebnisse werden in 2 gezeigt. Eine große Bakterienzahl überlebte 7 Monate.
e) Schließlich testete man die LB931 hinsichtlich ihrer Eigenschaften während einer Wachstums- und Lagerperiode. Man kultivierte LB931 in MRS-Brühe und überführte alle drei Tage über einen Zeitraum von drei Monaten. Danach wurde die LB931 Anfangsprobe und die letzte überführte Probe im API-Test, PGFE- und Störtest verglichen. Die beiden Proben waren in allen Tests identisch. Dies zeigt, daß LB931 sehr stabil nach der Lagerung und mehreren Überführungen in einem Wachstumsmedium ist.

Beispiel 4: Transfer von LB931 auf die Haut des Perineums und die Harnleiteröffnung bei Frauen
Um den Transfer von LB931 auf das Perineum beim Tragen einer Slipeinlage zu untersuchen, führte man die folgende Untersuchung durch. Alle Testpersonen waren Frauen im Alter von 12 bis 60 Jahren, und man führte die Tests zwischen den Menstruationsperioden, soweit auftretend, durch. Die Testprodukte wurden aus einer herkömmlichen Slipeinlage hergestellt, die eine flüssigkeitsdurchlässige äußere Schicht, eine flüssigkeitsundurchlässige Rückschicht und dazwischen eine absorbierende Schicht mit 100-200 g/m² durch chemischen Aufschluß hergestellten Zellulosezellstoff umfaßte. Man sprühte eine Suspension von LB931-Bakterien auf die absorbierende Seite des Testprodukts in einer Menge von 10⁹ koloniebildenden Einheiten pro Produkt.
Um die Gegenwart der LB931 im Perineum der 13 Testpersonen zu bestimmen, führte man einen sogenannten Abstrichtest durch. Die Bakterien wurden gesammelt, indem man einen sterilen Stab mit einer Baumwollspitze, den man in eine sterile Natriumchloridlösung getaucht hatte, über einen definierten Hautbereich rieb. Man bestimmte das Auftreten von LB931 und anderen LBs auf der Haut des Perineums und der Harnleiteröffnung. Die Testpersonen wurde auf diese Weise untersucht, um eine Vergleichsprobe zu erstellen. Dann trugen die Testpersonen die Slipeinlage 5 Stunden lang am Morgen. Die Slipeinlage wurde entfernt und man bestimmte erneut das Auftreten von hinzugefügten Milchsäurebakterien und natürlichen Milchsäurebakterien direkt nach dem Entfernen der Slipeinlage. Diese Probe wurde als Probe 1 bezeichnet. Nach 4-5 weiteren Stunden wurde eine weitere Probe genommen und als Probe 2 bezeichnet. Der Milchsäurebakterien-Typus wurde mit Hilfe von Rogosa-Agar mit Vancomycin für LB931 und anaerob inkubierten Rogosa-Agarplatten für andere LBs identifiziert. Eine weitere Identifizierung wurde durch API (BioMerieux, FR) und PFGE ("pulsed field electrophoresis", Elektrophorese mit gepulstem Feld) vorgenommen. Die Ergebnisse werden in Tabelle IV gezeigt. LB931 konnte auf der Haut des Perineums oder auf der Harnleiteröffnung bei allen Frauen nach dem Gebrauch einer mit LB931 besprühten Slipeinlage nachgewiesen werden.
Beispiel 5: Übertragung von LB931 auf die Haut des Perineums und die Harnleiteröffnung bei Mädchen
13 junge Mädchen im Alter von 3 bis 12 Jahren beteiligten sich an dieser Studie. Man erhielt Bakterienproben von der Haut des Perineums und der Harnleiteröffnung, indem man zunächst einen Baumwollstab in MRS-Brühe tauchte und dann den Stab sanft auf der Haut oder Epitheloberfläche rieb. Schließlich wurde der Abstrich in ein Probenröhrchen getaucht, das MRS-Brühe enthielt. Man erhielt die Proben nach dem folgenden Schema:

Probe 0: Eine Vergleichsprobe wurde am Abend vor dem Beginn der Studie mit den LB931-Bakterien erhalten. Abend, Tag 1; eine Slipeinlage wird angelegt.
Probe 1: Morgen, Tag 2. Eine neue Slipeinlage wird während des Tages getragen.
Probe 2: Eine Probe wird am Abend vor einem optionalen Bad und vor dem Anlegen einer neuen Slipeinlage genommen. Abend, Tag 2;
Probe 3: Gleiches Verfahren wie für Probe 1. Morgen, Tag 3;
Probe 4: Gleiches Verfahren wie für Probe 2. Abend, Tag 3;
Probe 5: Gleiches Verfahren wie für Probe 1. Morgen, Tag 4;
Probe 6: Eine Probe wird am Abend vor einem optionalen Bad genommen. Während der Nacht wurde keine Slipeinlage getragen. Abend, Tag 4;
Probe 7: Eine Probe wird am Morgens des Tags 5 genommen. Während des Tags wurde keine Slipeinlage getragen.
Probe 8: Die letzte Probe wird am Abend des Tags 5 genommen.

Die Ergebnisse werden in 3 (Harnleiteröffnung) und 4 (Perineumhaut) präsentiert. Die Ergebnisse zeigen, daß LB931 von einem absorbierenden Gegenstand übertragen werden kann.
Beispiel 6: Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika und spermaziden Mitteln
Man bestimmte die MIC-Werte von Lactobacillus plantarum LB931 mit einem E-Test (Brown et al., J. Antimicrob. Chemother. 991; 27: 185-190). Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle V beschrieben.
Tabelle V
Die Empfindlichkeit gegenüber antibiotischen Substanzen wurde ebenfalls mit dem SIR-System bestimmt. In Tabelle VI bedeutet S empfindlich und R resistent.
Tabelle VI
LB931 ist gegenüber einigen Antibiotika empfindlich, die üblicherweise für Infektionen des Harntrakts verschrieben werden, aber LB931 ist auch beispielsweise gegenüber Nalidixinsäure und Norfloxacin resistent. LB931 zeigt auch Resistenz gegenüber Vancomycin.
Ferner führte man MIC-Tests für das spermazide Mittel Tergitol durch. LB931 wurde auf einem MRS-Agar in 5 % CO₂ bei 37°C 48 h lang kultiviert. Die Bakterien wurden in 3 ml MRS-Brühe inokuliert und 10 h unter den gleichen Bedingungen wie zuvor beschrieben inkubiert. 1,5 % der Kultur wurde erneut in 3 ml MRS-Brühe inokuliert und unter den gleichen Bedingungen 18 h inkubiert. Man verdünnte NP-9 Tergitol (Sigma, US), Charge 47F0002 in MRS-Brühe mit einer Temperatur von 37°C (reduzierte Viskosität) zu einer Stammlösung von 40 %. Mit dieser Stammlösung stellte man 3 ml-Lösungen der folgenden Konzentrationen her: 0 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 % und 40 %. Man gab 10 μl Bakterienkultur zu jeder Lösung. Die Vergleichsprobe wurde MRS-Agarplatten beigemischt und hinzugefügt. Man ließ die Platten in 5 % CO₂ bei 37°C 48 h lang wachsen, um die Zelldichte zu bestimmen. Der Rest der Lösungen wurde ohne Mischen in 5 % CO₂ bei 37°C 18 h lang inkubiert. Man verdünnte je 30 % und 40 % NP-9 enthaltende Lösungen in 37°C MRS-Brühe (reduzierte Viskosität). Alle Lösungen wurden kräftig gemischt, in sterilem 0,9 %igem NaCl verdünnt und zu MRS-Agarplatten gegeben. Man inkubierte die Platten in 5 % CO₂ bei 37°C über 48 h, um die cfu/ml zu bestimmen.
Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle VII beschrieben.
Die inokulierte LB931-Menge betrug 1,0 × 10⁷ cfu.
Die Ergebnisse zeigen, daß LB931 in der Lage ist, in bis zu 50 %igem Tergitol NP-9 gut zu überleben.
Beispiel 7: Haftung von LB931 an vaginalen Epithelzellen
a) Herstellung einer LB931-Suspension
Man ließ LB931 auf MRS-Agar (5 % CO₂, 37°C, 48 h) wachsen. Die Kultur wurde zu 3 ml Brühe (5 % CO₂, 37°C, 8 h) inokuliert. 2 % der resultierenden Kultur wurde erneut zu 10 ml MRS-Brühe (5 % CO₂, 37°C, 18 h) inokuliert. Die resultierende Kultur wurde 8 min bei 20°C und 2.000 Upm in einem Ausschwingrotor (820 × g) zentrifugiert. Das erhaltene Zellpellet wurde in 5 ml Milchsäurepuffer (10 mM Milchsäure, pH 4,5, 0,15 M NaCl) gewaschen. Die Bakterien wurden in Milchsäurepuffer verdünnt, bis der OD₅₀₀ etwa 1,0 (etwa 10⁸ cfu/ml) betrug.
b) Gewinnung von vaginalen Epithelzellen
Vaginale Epithelzellen wurde mit einem sterilen Baumwollstab gesammelt und die Zellen in 4 ml Milchsäurepuffer oder PBS in einem kleinen Röhrchen überführt. Das Röhrchen wurde gemischt und der Baumwollstab entfernt. Man zentrifugierte das Röhrchen 8 min bei 700 Upm und 20°C in einem Jouan CR-12 Ausschwingrotor (≈ 100 × g) und wusch den erhaltenen Pellet in 3 ml Milchsäurepuffer oder PBS. Man zählte die Zellen in einem Hematozytometer und stellte die Konzentration auf 10⁵-10⁶ Zellen/ml mit Milchsäurepuffer oder PBS ein. 5 ml Zellen wurden auf einem Mikroskopgläschen zur Kontrolle der Waschprozedur ausgebreitet (siehe unten).
c) Hafttests
0,5 ml LB931-Suspension und 0,5 ml Zellsuspension wurden kurz in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gemischt. Man stellte eine Kontrollprobe durch Mischen von 0,5 ml Zellsuspension und 0,5 ml Puffer her. Die Röhrchen wurden bei 20°C und 2.000 Upm (≈ 720 × g) zentrifugiert und danach 1 h bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation zentrifugierte man die Röhrchen 8 min bei 20°C und 700 Upm (≈ 90 × g). Die Pellets wurden in 1 ml Milchsäurepuffer oder PBS gewaschen. Schließlich suspendierte man den Pellet in 400-500 μl Milchsäurepuffer oder PBS.
d) Analyse
Man ließ 25 μl eines suspendierten Pellets in der Luft auf einem Mikroskopgläschen trocknen, worauf man fixierte und gram-färbte. Aus jeder Probe wurden 50 Epithelzellen analysiert. Man zählte die Zahl der an den Zellen haftenden LBS931 und teilte die Ergebnisse in fünf Gruppen ein (0-10, 11-30, 31-50, 51-100, >100 Bakterien/Zelle).
Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle VIII beschrieben.
Tabelle VIII
Die Ergebnisse zeigen klar, daß LB931-Bakterien gut an vaginalen Epithelzellen haften, unabhängig von dem Zeitpunkt der Probennahme für die Zellen.

Claims

Lactobacillus plantarum, Stamm LB931, der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen hinterlegt wurde und dem die Zugangsnummer DSM11918 zugeteilt wurde.
Lactobacillus plantarum, Stamm LB931, der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen hinterlegt wurde und dem die Zugangsnummer DSM11918 zugeteilt wurde, zur medizinischen Verwendung.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend Lactobacillus plantarum, Stamm LB931, der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen hinterlegt wurde und dem die Zugangsnummer DSM11918 zugeteilt wurde, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder Verdünnungsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie auch andere Milchsäurebakterien umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, die 10⁴ bis 10¹¹ cfu (Kolonie bildende Einheiten), vorzugsweise 10⁵ bis 10⁹ cfu, LB931 umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, welche eine Suspension, ein Spray, ein Gel, eine Creme, ein Pulver, eine Kapsel oder ein Vaginalsuppositorium ist.
Absorbierendes Produkt, beispielsweise ein Produkt für die Hygiene der Frau, eine Windel, eine Damenbinde, ein Slipschutz oder ein Inkontinenzschutz, dadurch gekennzeichnet, daß es Lactobacillus plantarum, Stamm LB931 umfaßt, der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen hinterlegt wurde und dem die Zugangsnummer DSM11918 zugeteilt wurde.
Absorbierendes Produkt gemäß Anspruch 7, welches 10⁴ bis 10¹¹ cfu, vorzugsweise 10⁵ bis 10⁹ cfu, LB931 umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, worin der pharmazeutisch annehmbare Träger Magermilch oder ein Wachstumsfaktor für Lactobacillus in Pulver- oder anderer Form ist.
Verwendung von Lactobacillus plantarum, Stamm LB931, der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen hinterlegt wurde und dem die Zugangsnummer DSM11918 zugeteilt wurde, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung und/oder Behandlung von Urogenitalinfektionen, beispielsweise der Besiedlung von Enterobakterien.
Verwendung von Lactobacillus plantarum, Stamm LB931, der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen hinterlegt wurde und dem die Zugangsnummer DSM11918 zugeteilt wurde, zur Herstellung eines absorbierenden Produkts, wie einer Windel, einer Damenbinde, einem Slipschutz oder einem Inkontinenzschutz, das zur Verhinderung und/oder Behandlung von Urogenitalinfektionen, beispielsweise der Besiedlung von Enterobakterien, geeignet ist.