TR201806889T4 - İn vitro fertilizasyonun tahmin başarısına yönelik yeni yöntem ve kit. - Google Patents

Abstract

Buluş orana bağlı başarılı bir gebelik ihtimalini belirlemek üzere bir yöntemi içerir, söz konusu oran bir öznenin bir numunesinde, tercihen bir idrar numunesinde toplam bakteri miktarına göre Lactobacillus ve Staphylococcus bakterisinin varlığını kullanan bir formül olarak gösterilir. Ayrıca buluş, buluşun yönteminin uygulanmasına ve sonuç çıktısı verilmesine yönelik bir kit, tercihen bir qPCR kiti içerir. Bu tür bir yöntem ve kit IVF veya ICSI gibi yapay bir döllenme yöntemi geçiren veya buna uygun öznelerde başarılı bir gebelik ihtimalinin öngörülmesine yönelik özellikle avantajlıdır.

Description

TARIFNAME IN VITRO FERTILIZASYONUN TAHMIN BASARISINA YÖNELIK YENI YÖNTEM VE BULUS SAHASI Bulus insan üremesi alani, daha özellikle insan üremesinin basarisiz oldugu durumlar ile ilgilidir. Bu tür bir durumda, kadinlara gebe kalmalarinda yardimci olmak üzere yapay yöntemler üzere mevcuttur ancak bu tedavilerin basarisi düsüktür ve daha önemlisi öngörülemez. Mevcut bulus bu noktada in vitro fertilizasyonda basari ihtimalini öngörmeye yönelik daha güvenilir bir yöntem saglar.

ALTYAP I Sub-fertilite bati dünyasindaki çiftlerin %10 ila 15iini etkiler. Bu sub-fertilite vakalarin yarisinda kadinlara ait nedenlere, %20-26'sinda erkeklere ait nedenlere atfedilir ve çocuk isteklerini gerçeklestirmek üzere in vitro fertilizasyon (IVF) veya intra-sitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) basvurur. Bu tekniklerin basari orani baslamis döngü basina oraninin arttirilabilmesi halinde bu, büyük duygusal ve ekonomik fayda olacaktir.

Yardimci gebelik tedavilerinin kisisel ve toplumsal yükü nedeniyle, oldukça düsük bir basari ihtimaline sahip çiftleri ve yüksek bir spontan gebelik ihtimaline sahip çiftleri tespit etmek istenendir. Özellikle infertilite nedeni bilinmeyen çiftler yüksek bir spontan gebelik orani gösterir ve yakin izlem bunlar için istenen olabilir (Brandes, M. et al., vakalarin ilerleyip ilerlemedigine karar vermeye yönelik, bir kadinin IVF/ICSI akabinde hamile kalip kalamayacagini ve canli dogum yapip yapamayacagini kesin olarak öngören modellere yönelik bir ihtiyaç vardir. On yildan fazla bir süre boyunca yas, basarisiz olmus önceki IVF girisimlerinin sayisi ve infertilitenin olasi nedeni dahil klinik veriye dayali olarak canli dogum ihtimalini öngören modeller mevcut olmustur öngörülene karsi gözlemlenen canli dogum orani %40-60 olmustur (Nelson, S.M. and Lawlor DA. . Bu yazarlar yas ve infertilite nedeni üzerinde daha fazla katmanlasma, kullanilan (kullanilacak) prosedür, yumurta kaynagi ve çocuk istegi süresini kullanarak 140.000`den fazla kadindan veriye dayali olarak iyilestirilmis bir model gelistirmistir. Yeni modelin alici isletim egrisine yönelik egri altinda kalan alani (AUROC) bu yeni modelin ne kadar iyi fonksiyon gösterdigine yönelik kullanilmasi durumunda, küçük ancak kaydadeger bir artis rapor edilmistir öngörü sunar gibi görünür. Ancak, bu modelin bireysel bir bazda ne kadar iyi öngörüde bulundugu henüz bilinmez. sonucu ile ilgili olarak Lactobacillus ve Staphylococcus'un saptanmasini açiklar.

Canli bir dogum yolu üç kritik adima, yumurtanin fertilizasyonu, kadin ortami tarafindan döllenmis yumurtanin kabulü ve gerçek canli doguma kadar ayrica gelismesine indirgenebilir. Birinci adimin yapay olarak gerçeklestirilmesi (örnegin IVF ve ICSI) durumunda canli bir doguma ulasma ihtimali ikinci adima yönelik markörler araciligiyla tanimlanabilir. Ancak, döllenmis yumurtanin kabulünden sorumlu faktörler neredeyse bilinmezdir. Dolayisiyla bu ikinci adimda basariyi öngörecek kriter olusturmak halihazirda imkansizdir.

Dolayisiyla, bireysel bir bazda basarili bir IVF/ICSI tedavisi ihtimalini daha hatasiz bir sekilde öngörebilen bir modele yönelik bir ihtiyaç vardir.

BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Bulusçular bu noktada bireysel bir bazda basarili (veya basarisiz) bir IVF/ICSI tedavisi ihtimalinde öngörülebilirligi %75-100'e arttiran gelistirilebilen bir model bulmustur. Bu, mevcut bulusun kapsamini tanimlayan ekli istemler 1-13 dogrultusunda basarili bir gebelik ihtimalinin öngörülmesine yönelik bir yöntem ve kitin formülasyonuna yol açmistir. Açiklama bir öznede asagidaki adimlari içeren basarili bir gebelik ihtimalinin öngörülmesine yönelik bir yöntem saglar: a. Bir idrar numunesinin alinmasi; b. Söz konusu numunede mevcut bakterinin toplam miktarinin bir yüzdesi olarak bakteri türleri Lactobaci/lus ve Staphylococcus'un miktarinin belirlenmesi; c. Söz konusu bakteriler arasindaki orana dayali olarak basarili bir gebelik ihtimalinin öngörülmesi.

Tercihen, söz konusu yöntemde özne IVF veya ICSI gibi yapay bir döllenmeden geçer veya buna uygundur. Tercih edilen diger bir düzenlemede, Lactobacillus türü Lactobacillus crispatus'tur ve Staphy/ococcus türü Staphy/ococcus aureus'tur.

Bakteri miktarinin ölçümünün PCR, daha çok tercih edildigi üzere qPCR araciligiyla gerçeklestirilmesi ayrica tercih edilir, bu yöntemde akabinde Staphylococcus tercihen GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-s' primerleri kullanilmasi araciligiyla belirlenir ve Lactobaci/Ius tercihen 5'-GATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGA-S' ve 5'- AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC-S' primerleri kullanilmasi araciligiyla belirlenir.

Alternatif olarak, bakteri miktarinin ölçümü kütle spektrometresi, daha çok tercih edildigi üzere MALDI-TOF kütle spektrometresi araciligiyla gerçeklestirilir.

Daha spesifik olarak bulusa göre yöntemde, basarili bir gebelik ihtimali asagidaki formül araciligiyla belirlenir: Y = a* ( Laciobacillus %'si ) - b*(Staphylococcus %'si ) - c a 0.025 ila 0.051 arasinda bir degere sahiptir; b 0.04 ila 0.07 arasinda bir degere sahiptir; 0 -1.10 ila 066 arasinda bir degere sahiptir; LactobacII/us bakterisinin miktaridir; Staphylococcus bakterisinin miktaridir; ve burada Y basari ihtimalini temsil eder.

Tercihen bu formülde a 0.025 ila 0.04 arasinda bir degere sahiptir, ayrica tercihen b daha çok tercih edildigi üzere -1.06 ila -1.01 arasinda bir degere sahiptir.

Bakteri saptanan numuneler idrar numuneleri olabilir ve tercihen bakteriler bir orta-akim idrar numunesinde saptanir, ancak numuneler ayrica bir vajinal smear gibi vajinal numuneler olabilir.

Açiklama ayrica basarili bir gebelik ihtimalinin öngörülmesine yönelik, asagidaki unsurlari içeren bir kit saglar: a. Bir özneden bir numune içindeki toplam bakteri içeriginin ölçülmesine yönelik b. Lactobacillus bakterisi içeriginin ölçülmesine yönelik araçlar; c. Staphy/ococcus bakterisi içeriginin ölçülmesine yönelik araçlar; d. Yukarida açiklanan formüle göre ihtimalin hesaplanmasina yönelik araçlar.

Tercihen, bu tür bir kitte Lactobaci/Ius bakterisi içeriginin ölçülmesine yönelik araçlar 5'- primerlerini içerirken, Staphylococcus bakterisi içeriginin ölçülmesine yönelik araçlar 5'- GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3' primerlerini içerir. Bu tür bir kitte bir özneden bir numunedeki toplam bakteri içeriginin ölçülmesine yönelik araçlarin bakteriyel 163 rDNA'ya yönelik spesifik bir genel primer seti içermesi ayrica tercih edilir, daha çok tercih edildigi üzere söz konusu genel primer seti en az bir ileri ve en az bir revers EUB primeri içerir.

Söz konusu kitte ihtimalin hesaplanmasina yönelik araçlarin ölçülen bakteriyel degerleri girdi olarak alabilen ve yukarida açiklandigi üzere formüle göre ihtimali hesaplayabilen bir islemci içermesi ayrica tercih edilir ve tercihen islemci kiti kullanan kisi tarafindan okunabilen bir sinyal aracina ihtimal çiktisini verebilir.

DETAYLI AÇIKLAMA Asagidaki açiklamada ve örneklerde birçok ifade kullanilir. Bu tür ifadelere yönelik kapsam dahil olmak üzere, tarifname ve istemlerin açik ve tutarli bir anlayisini saglamak amaciyla asagidaki tanimlar saglanir. Burada aksi belirtilmedikçe, kullanilan tüm teknik ve bilimsel ifadeler bu bulusun ait oldugu teknikte uzman bir kisi tarafindan yaygin olarak anlasilan ile ayni anlama sahiptir. çikartildigi bir prosedürdür. Bunlar bir laboratuvar prosedüründe sperm ile döllenir ve akabinde döllenmis yumurta (embriyo) kadinin rahmine geri birakilir. edildigi bir test-tüpünde fertilizasyon prosedürü olan intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu anlamina gelir. ICSI çogunlukla erkek infertilitesine yönelik yapilir ve bir IVF prosedürün parçasini olusturulabilir. idrardan) akabinde bir idrar akisinin ortasinda toplanan bir idrar numunesi olarak tanimlanir. Bir orta-akim idrar numunesi ayrica bir 'kolay alinmis numune” olarak adlandirilir.

Bir 'idrar yolu enfeksiyonu' (UTI) idrar yolunun herhangi bir parçasini etkileyen bir bakteriyel enfeksiyondur. Semptomlar sik idrar çikma hissi ve/veya ihtiyaci, idrara çikma sirasinda agri ve bulanik idrari içerir. zincirlerine translasyonunun gerçeklestigi ribozomlarin bilesenini olusturan hücre çekirdeginin çekirdegindeki DNA'dir. Farkli organizmalarin ribozomal RNA'sinin gen dizilerinin karsilastirilmasi, organizmalar arasindaki evrimsel iliskileri belirlemek üzere kullanilmistir.

Bulusçular bu noktada döllenmis yumurtanin rahimde yerlesme basarisini öngören faktörlerden birinin, kadinin üro-genital alandaki bakteriyel popülasyonun olusumu araciligiyla olusturuldugunu bulmustur. Bakteriyel popülasyonlarin bilesiminin (örnegin bagirsakta veya vajinada) dogrudan ortamlarinin bir yansimasi oldugu ve bu bilesimin bu çevredeki degisikler üzerine degisebilecegi bilinir. Bu örnegin tüm insan popülasyon gruplari arasinda bagirsaktaki yerlesik bakterinin, karsilasilan bakteriyel türlerin çesidinin rastgele bir koleksiyonu olmadigi bulgudan belirgindir. Bunlar konaklari tarafindan saglanan ortam ile dinamik denge içinde olan farkli popülasyonlardir (Blaser, bagirsagi hücrelerinde olmayan kapasiteleri sagliyor olarak kabul edilen ve konaklarinin rejimine tepki veren bakterileri barindirir (De Filippo. C. et al.. 2010, PNAS bilesiminde bir degisimdir. Bagirsak mikrobiyotasinin bilesimini etkileyecek diger çevresel faktörler, konak faktörlerini örnegin (immün) savunma sistemleri, hücre yüzeyi karakteristiklerini ve bulunduklari nisin fiziksel karakteristiklerini içerir (Bâckhed, F. et Üro-genital sistemden bir örnek vajinal kosullarin degismesi durumunda meydana gelen vajinal bakteriyel popülasyondaki degisimdir. Genellikle, vajina 1 ila 6 bakteriyel türden olusan ve LactobaciI/us türlerinin hakim oldugu bir popülasyonu destekleyen 1911). Lactobacilli' ayrica düsük pH'i muhafaza eder ve ek olarak diger bakterilere karsi nisini etkin bir sekilde savunur. Bakteriyel vajinozise sahip kadinlarda pH daha yüksektir, vajinal bakteriyel popülasyon 17 türe kadar genisler ve Lactobaci'I/i'nin varligi patojenik bakterinin lehine oldukça azaltilir. Bakteriyel popülasyon bilesimindeki bu degismenin baslangici Lactobacil/us türlerindeki bir azalma veya diger bakterilerin bir invazyonu olabilir. Ancak, sürdürme, yeni durumda gelisen Lactobacillus türlerinde bir azalma, pH'ta artma ve Staphy/ococcus gibi türlerde artma arasinda bir degisken denge olacaktir. Bu degismelerin vajinozis semptomlarinin önünde gelmesi halinde olusturulmak üzere kalir.

Bakteriyel popülasyonlarin spesifik durumlari öngörmek üzere kullanilabilmesi bulgusu bakteriyel popülasyonlarin genis-spektrumlu 163 rDNA analizi ile arastirildigi üretrite sahip olan ve olmayan erkekler üzerinde küçük bir arastirma bulunmustur (Riemersma, bakterinin varligi üretrit yoklugu ile iliskilendirilmistir.

Mevcut bulusu olusturan arastirmada, bulusçular esas olarak iki soru sormustur: bir kadindaki idrar bakteriyel popülasyonu bu kadinin iç ortaminin gebeligi gerçeklestirmek üzere IVF veya lCSI'ye uygun olup olmadigina dair bilgiye sahip midir ve bakteriyel popülasyon idrar yolu enfeksiyonuna yönelik degisen bir risk ile ilgili midir? Birinci amacin arkasindaki düsünce IVF veya ICSI basarisina ilk adimin, yumurtanin yuvalanmasi gereken süreç boyunca kadinin iç ortami tarafindan yabanci bir vücudun, döllenmis yumurtanin kabulüdür. Bu iç ortam hormonal regülasyon altinda olacaktir. Bu regülasyonun yapisi tam anlamiyla bilinmez ancak yalnizca rahimdeki kosullari degil ayrica idrar yolu gibi vücuttaki baska yerdeki kosullari etkilemesi muhtemeldir. Böylece bu yabanci cisimlerin kabulünü, yerlesik bakteriyel popülasyonu, diger bir deyisle idrar yolunu etkileyecektir. Bu düsünceye bagli olarak arastirmayi yönlendiren iki hipotez olusturulmustur: birincisi, kadinlardaki bakteriyel popülasyonlar döllenmis bir yumurtanin ne kadar iyi kabul edilecegini gösterir ve ikincisi, idrardaki bakteriyel popülasyonlarin gebe olmasi durumunda bir kadinda meydana gelen çevresel degisimlere tepki verecektir. Gebelik boyunca idrar yolu, renal pelvis ve üretranin genislemesi, mesane düz kasinin gevsemesi ile iliskili mesanenin yer degistirmesi ve üriner staz ve kimyasal degisimler (idrar pH'i, idrar ozmolalitesi, glikozüri ve aminosidüri) gibi anatomik degisimlerden geçer. Bu degisen durumlarin yerlesik bakteri disindaki bakteri türlerine daha ilimli olmasi beklenebilir. Yerlesik bakterinin ayrica idrar yolunun kendisi içindeki sorunlarin kaynagi olabilmesi (enfeksiyon) nedeniyle çalismada ayrica idrardaki bakteriyel popülasyon bilesimi ile idrar yolu enfeksiyonu arasindaki iliski arastirilmistir.

Bu çalismada bes bakteriyel tür/susun bir çekirdek grubun test edilen tüm kosullarda (gebe, gebe degil, IVF/ICSI sonrasinda gebe degil) bulundugu görünmüstür.

Lactobaci'llus crispatus ve Staphy/ococcus aureus tüm numunelerin çogunlugunda mevcutken, E. coli, Streptomyces sp. ve kültür/enmemis bakteri izolati CH96FC_H1O daha küçük numune sayilarinda bulunmustur. Tüm kadinlarda, ayri olarak maksimal 4 türden olusan toplam popülasyonun %70'inden fazlasi, toplam popülasyonun diger türlerin kisa bir listesini içermistir (bakiniz Tablo 5). Bakteriyel türlerin uzun bir listesi numunelerin bir veya birkaçinda küçük yüzdelerde bulunmustur (bakiniz Tablo Tüm test kosullari altinda kadinlarda bulunan 5 bakteriyel türün çekirdek grubu bir dis havuzdan idrar yolunu istila etmek üzere yüksek bir ihtimale sahip olan, idrar yolundaki kosullara daha iyi adapte olan veya konak tarafindan daha iyi kabul edilen türleri temsil edebilir. Ikinci grup seyrek olarak bulunan, ancak ayri kadinlarda zamanla devamlik gösterebilen ve baskin tür olabilen türlerden olusur. Bu türlerin neden daha sik bulunmamasinin nedenleri, bu bakterilerin tüm kadinlara yönelik ayni olmamasi nedeniyle idrar yolunun dis havuzlara maruz kalmasi veya spesifik konak faktörlerinin bunlarin varliklarina kadinlarin yalnizca küçük bir alt kümesinde imkan saglamasi olabilir. Yalnizca tek bir numunede bulunan çok sayidaki türler idrar yolunda iyi hayatta kalmayan buradan geçenleri temsil edebilir. Çalismadan, bir kadinin gebe olmasi durumundan idrar yolundaki bakteriyel popülasyon bilesiminin önemli bir derecede degistigi sonucuna varilabilir. Gebelikten önce bakteriyel popülasyonda çesitli Lactobacillus suslari (baslica L. crispatus) hakimdir. Gebelik boyunca Lactobacillus, genellikle baskin tür olan diger bakteri, baslica Staphy/ococcus aureus ile degistirilir. Bu degisme, IVF/ICSI geçiren ancak gebe kalmayan kadinlarda gerçeklesmemesi nedeniyle kadinlarin geçirdigi prosedür nedeniyle olmamistir.

Süphesiz, gebeligi belirlemenin daha kolay yollarinin olmasi nedeniyle idrar yolu popülasyonunun bir kadinin gebe olup olmadigini yansittigi bulgu klinik olarak ilgisizdir.

Ilgili olma, açik bir sekilde kadinin fertilite durumunun idrar yolundaki bakteriyel popülasyon etkiledigi gözlem araciligiyla belirlenir. Bu idrar yolundaki bakteriyel popülasyonun konagin iç kosullarina yönelik bir markör oldugu hipotezini destekler.

Bu çalisma, bu markör fonksiyonunun gebe kalmak isteyen bir kadinin fertilitesinin teshis edilmesine yönelik yeterli bir sekilde spesifik oldugunu gösterir. Deneysel bölümden belirgin oldugu üzere, IVF/ICSI prosedürü öncesinde idrardaki Lactobaci'I/us türü ve Staphylococcus türünün göreceli varligi üzerine olusturulan bir model Buna göre, açiklama bir öznede asagidaki adimlari içeren basarili bir gebelik ihtimalinin öngörülmesine yönelik bir yöntem saglar: a. Bir idrar numunesinin alinmasi; b. Söz konusu numunede mevcut bakterinin toplam miktarinin bir yüzdesi olarak bakteri türleri Lactobacillus ve Staphylococcus'un miktarinin belirlenmesi; 0. Söz konusu bakteriler arasindaki orana dayali olarak basarili bir gebelik ihtimalinin öngörülmesi.

Bu tür bir yöntem, IVF veya ICSI gibi yapay bir döllenme yöntemi geçiren veya buna uygun öznelere yönelik tercih edilmesine ragmen, bu tür bir kapsamla sinirli degildir.

Yöntem ayrica dogal bir yolda gebe kalma ihtimallerinin ne kadar olacagi ile ilgilenen öznelere yönelik faydali olabilir. Bu bakimdan, numunelerin erkek öznelerden, genç erkek öznelerden veya halihazirda gebe kadinlardan, diger bir deyisle, gebe kalamayan kadinlardan alinmasi durumunda yöntemin ayrica dogru bir öngörü vermesi dikkat çekicidir: bu numunelerden test sonucunun negatif oldugu görülmüstür.

Süphesiz, yapay döllenmenin kullanilmadigi vakalarda, yukarida sekilde hesaplanan basarili bir gebelik ihtimali yalnizca gebe kalma ihtimalinin partnerin infertilitesi veya kadin öznedeki yogun fizyolojik islev bozuklugu (örnegin bir rahmin olmamasi, hormonal dengesizlik, vb.) tarafindan etkilenmedigi durumlar ile ilgilidir.

Tercihen saptanacak Lactobaci/Ius türü Lactobacillus crispatus olur. Ancak, ayrica diger Lactobacillus türlerini, örnegin L. jensenii', L. iners ve L. gasseri'yi saptamak ayrica faydali olabilir. Bu türlere kadinlarin bazilarinda rastlanir ve bu türlerin Lactobacillaceae grubuna eklenmesi yukaridaki yöntemin öngörü gücünü arttirir.

Aynisi, yalnizca Staphyloccus aureus'a degil ayni zamanda 8. epidermi'dis, S. haemolyti'cus ve S. cohniiye rastlanilan ve öngörü gücüne eklenecegi bilinen Staphylococcus için dogrudur. Tercihen, bulusun yönteminde bakteriyel türlerin saptanmasi PCR ve tercihen qPCR gibi moleküler biyolojik analizler araciligiyla gerçeklesir. Bu tür bir analizde bakteri saptanir ve saptanacak bakteriye spesifik olan primerler ile amplifikasyon araciligiyla miktari belirlenir. Lactobacil/us durumunda bu L. crispatus'a spesifik primerlerin kullanilabilecegi ancak tercihen bu tür primerlerin ayrica, yukarida bahsedildigi üzere diger Lactobaci//us türlerini taniyacagi anlamina gelir.

Halihazirda, optimum bir saptama yöntemi Ömek 2'de kullanildigi üzere Lactobaci'l/us'a spesifik primerleri içerir.

Benzer bir çalisma yöntemi ayrica Staphylococcus türlerinin saptanmasi için geçerlidir, burada agirlikli olarak 8. aureus saptanmalidir, ancak burada ayrica 8. epidermidis, S. haemolyticus ve S. cohnii'nin saptanmasi kapsanabilir. Ayrica bu durumda, Örnek 2'de gösterildigi üzere primer seti optimum sonuçlar verir.

Ancak, kullanilmasi gerekenin saptanan Lactobacillus ve Staphylococcusiun mutlak orani olmadigi anlasilmalidir. Bunun yerine, toplam bakteri içerigi bakimindan bu bakterilerinin yüzdelerinin orani kullanilir. Numunedeki toplam bakteri içerigini belirlemek amaciyla, tüm bakterilerde mevcut olan 168 rDNA'nin korunmus parçalarini taniyan primerleri kullanma firsati saglayan bakteriyel 16s rDNA'yi taniyan primerleri kullanmak tercih edilir. Bakteriyel 163 rDNA'ya spesifik olan ve dolayisiyla diger organizmalardan biyolojik materyalin mevcut oldugu bir numunede yalnizca bakteriyi taniyabilen primer setleri literatürde açiklanmistir. Wikipedia sitesinde (httpzl/en.wikipedia.org/wiki/ asagidaki primerler açiklanir: Primer adi Dizi (5'-3') PHmeradi U1492R 11OOF 11OOR Oldukça iyi uyan bir primer seti birkaçi mevcut olan (örnegin EUB f933 ve EUB r1387; EUB 8f ve EUB söz konusu EUB primerlerini kullanir.

Ayrica EUR primerleri bazinda bakteriyel 163 rDNAinin saptanmasina yönelik kitler ticari olarak temin edilebilir (örnegin Iris technologies Int.'den, Cursdorf, Almanya Onar®EUB kiti).

Bulusun diger bir düzenlenmesinde, numunedeki bakteri miktarlari, kütle spektrografisi, Raman spektrografisi ve benzeri gibi spektrografik araçlar araciligiyla belirlenir.

Tercihen bu tür bir miktar ölçümünde, MALDI-TOF analitik araç olarak kullanilir.

Toplam bakteri belirlenmesi durumunda, bakteri orani ve dolayisiyla basarili bir gebelik ihtimali miktarlarinin ve Lactobacillus ve Staphy/ococcus miktarlarinin asagidaki formüle göre hesaplanabilir.

Y = a* (Laciobacillus %'sil - b*( Staphylococcus %'si) - c a 0.025 ila 0.051 arasinda bir degere sahiptir; b 0.04 ila 0.07 arasinda bir degere sahiptir; 0 -1.10 ila -0.66 arasinda bir degere sahiptir; Lactobaci'l/us bakterisinin miktaridir; Staphylococcus bakterisinin miktaridir; ve burada Y basari ihtimalini temsil eder. Y degeri asagidaki formül araciligiyla 0 (sifir basari ihtimali) ile 1 (kesin basari) arasinda olan bir ihtimale dönüstürülebilir; Ihtimal : eYl(1+eY) gebelige karsi gerçek gebeligin karsilastirilmasina yönelik en iyi esik degeri ihtimal=0.5 olarak bulunmustur. 0.57e esit veya bundan yüksek bir Y degeri akabinde ihtimali öngörür ve 0.5'ten düsük bir deger basarisizligi öngörür. Bu esik degeri ile formül kadinlarin %86'sinda birinci IVF/ICSI denemesi akabinde hatasiz bir sekilde gebeligi öngörmüstür ve kadinlarin %92.3'ünde 1 yil boyunca birçok deneme akabinde hatasiz bir sekilde gebeligi öngörmüstür. Böylece kadinlar IVF/ICSI akabinde gebe kalmisken, vakalarin %7.7,sinde formül basarisizlik öngörmüstür (yanlis negatif). %3.8'de gebelik bir düsük nedeniyle tamamlanmamistir. %3.8'de formül gerçek canli dogumu gözden kaçirmistir. Formülün gebelik öngördügü vakalarin %25'inde devam eden herhangi bir gebelik gerçeklestirilmemistir (yanlis pozitif).

Gebe kalmak isteyen ve IVF/ICSI ile ilerleyip ilerlemeyecegine karar vermek üzere bir öngörü testini kullanan kadinlarin özellikle bir yanlis negatif öngörüyü kabul etmeyeceginden dolayi, yanlis-negatif öngörüleri %3.8'ten sifira indirmek istenendir. Bu durumda, esik degeri 0.04'e düsürülmelidir. Ancak bu esik degerinde formül tüm kadinlar için gebeligi öngörür, bu süphesiz istenen degildir.

Tamamlanmis gebeligin en iyi öngörüsüne yönelik, a`nin 0.03 ile 0.051 arasinda bir degere sahip olurken, ayrica tercihen b'nin 0.056 ila 0.064 arasinda bir degere sahip oldugu bir formül kullanilir. Ayrica c'nin -1.06 ila -1.03 arasinda bir degere sahip olmasi tercih edilir. Gebelik elde etme ihtimaline yönelik esik akabinde tercihen 0.5 olur.

Bir özneden bir numune tercihen bir idrar numunesi, daha çok tercih edildigi üzere bir orta-akim idrar numunesidir. Bunun idrardaki bakteriyel popülasyonu en iyi sekilde temsil etmesi nedeniyle, bu tür bir orta-akim idrar numunesi tercih edilir. Bunun nedeni ilk idrarin üretrayi temizlemesi ve üretraya yerlesen bakteriyi beraberinde götürecek olmasidir.

Bulusun yöntemini bir vajinal numunede gerçeklestirmek ayrica mümkündür. Ayni türlerdeki bakteriler ile vajinada karsilasilmasi nedeniyle, benzer bir oran ve tercihen basarili bir gebelik ihtimalinin öngörülmesine yönelik benzer bir formülün idrar numunelerine yönelik kullanilabilmesi olasidir. a, b ve c degerlerinin optimize edilmesinin gerekmesi olasidir ancak bu tür optimizasyon teknikte uzman kisinin uzmanligindadir.

Burada ayrica basarili bir gebelik ihtimalinin belirlenmesine yönelik bir kit açiklanir. Bu tür bir kit numunedeki toplam bakteri içeriginin belirlenmesine yönelik araçlar ve Lactobaci/Ius ve Staphy/ococcus bakterisinin her ikisinin saptanmasina yönelik araçlar içerecektir. Ayrica, bu tür bir kit yukarida temsil edildigi üzere formül bazinda ihtimalin hesaplanmasina yönelik araçlar içerecektir. ihtimalin hesaplanmasina yönelik bu tür araçlar toplam bakteri içeriginin ve yukarida bahsedilen spesifik bakteri cinsleri/türlerinin saptanma degerlerini alabilen bir islemci içerecektir. Islemci akabinde burada açiklandigi üzere formüle göre Yiyi hesaplayacaktir ve basarili bir gebelik ihtimali çiktisini verecektir. Bu çikti sayisal bir deger formunda olabilir (gerçek Y degeri formülden çikar) ancak bu, örnegin kirmizi (negatif) veya yesil (pozitif ihtimal) olacak bir sinyal isik kaynagi araciligiyla veya Y'nin sayisal degerini temsil eden bir renk-kodlu çubuk araciligiyla ayrica ihtimalin bir göstergesi olabilir, burada negatif degerler kirmizi isik (orta siddette negatif) vasitasiyla koyu kirmizidan (fazlasiyla negatif) sariya (yaklasik sifir) bir gradyani gösterir ve pozitif degerler yesil isik (orta siddette pozitif) vasitasiyla saridan (yaklasik sifir) koyu yesile (fazlasiyla pozitif) bir gradyani gösterir. Bu tür bir sekilde özne öngörü güvenilirliginin görsel bir göstergesini alabilir. Tüm uygulamalarda, standart ayari 0.5'ten olan ihtimale yönelik esik degerinin yanlis pozitif öngörülerin sayisinin arttirilmasi pahasina yanlis negatif öngörülerin sayisini azaltmak üzere düsürülür. Süphesiz, Y degerini temsil eden diger göstergeler mümkün olacaktir ve teknikte uzman kisi yukaridaki düzenlemelerde varya ntlar tasarlayabilecektir.

Hasta dahil' edilmesi ve grup atamasi çalismaya kaydedilmistir. Bu 98 kadindan 40'i (%41) bazi durumlarda birçok deneme akabinde 3 yillik çalisma sirasinda gebe kalmistir. Bilgilendirilmis onay ve bir orta-akim idrar toplamanin nasil gerçeklestirilecegine dair talimat verilmesi akabinde, kadinlar 1”inci muayene sirasinda bir orta-akim idrar numunesi teslim etmistir ve önceki antibiyotik kullanimi ve önceki UTI hakkinda sorulari cevaplamistir. Bir idrar kabi ve orta-akim idrar toplanmasi prosedürünü anlatan bir dosya almislardir. Gebeliklerinin 16'nci haftasindayken veya gebe kalmamis kadinlar için embriyonun yerlestirilmesinden sonra karsilastirilabilir bir zamanda kadinlara 2'nci numuneyi toplamalari hatirlatilmistir. Idrar numunesi ayni gün hastaneye geri gönderilmistir veya dondurulmustur ve bir sonraki gün geri gönderilmistir. 2'inci numunenin toplanmasi akabinde kadinlar, gebeligin çiktisi veya sonraki gebelikler hakkinda veri toplamak üzere en fazla üç yil boyunca takip edilmistir. 98 kadindan 16'si anketteki tüm sorulari cevaplamamistir veya intakt bir ikinci idrar numunesi getirmemistir. Bunlar iki zaman noktasinda numune gerektiren bulus çalismamizin disinda birakilmistir. Geri kalan 82 kadindan 1'inci idrar numunesini takip eden birinci IVF/ICSI döngüsü araciligiyla gebe kalan ilk 21”i bulus çalismasi için dahil edilmistir. 2'nci numunesini topladiklarinda (embriyonun yerlestirilmesinden 16 hafta sonra) gebe olmayan yirmi bir kadin gebe-olmayan kadin grubuna dahil edilmistir. Dahil etme turu akabinde 2'nci numunesini topladigin gebe-olmayan 21 kadindan birinin gebe oldugu bulunmustur. Kisi gebe grubuna atanmistir. Bu n=22`|ik bir gebe grubu ve n=20'lik bir gebe olmayan grup ile sonuçlanmistir. Bu 42 kadinda genis spektrumlu 168 rDNA analizi araciligiyla her bir idrar numunesinde bakteriyel popülasyon belirlenmistir.

Ayrica kadinlar gebeliklerine ve bunun çiktilarina iliskin üç yil boyunca klinik olarak takip edilmistir. 42 kadinin tamaminin 1'inci idrar numunesinde tanimlanan bakteriyel türler IVF/ICSI çiktisini (gebe/gebe degil) öngören bir model olusturmak üzere kullanilmistir. Kadinlarin gebe kalmalari durumunda meydana gelen bakteriyel popülasyondaki degisimler baslica UTI nedenlerindeki degisimler ile karsilastirilmistir.

Ikincisi ayri bir gruptan elde edilmistir (asagiya bakiniz).

Iki idrar numunesinin her ikisini ve tam bir anketi getiren geri kalan 40 kadindan ve intakt bir birinci numune ve tam bir anketin her ikisini getiren kadinlardan, bagimsiz bir dogrulama grubu, n=42 olusturulmustur. Bu grupta, öngörü modeline dahil edilen bakteriye spesifik primerlere bagli olan bir qPCR testi kullanilarak yukarida elde edilen öngörü modeli dogrulanmistir.

Seçim protokolü nedeniyle bulus fazindaki gebelik basari oraninin 98 kadindan olusan grubun tümüne yönelik %41 ile karsilastirildiginda 22/42 = %52 olmustur.

Gruplarin karakteristikleri tablo 1`de gösterilir.

Dis/ama Kriterleri 16 haftalik çalisma süreci boyunca antibiyotik kullan veya bir UTI'ye sahip olan kadinlar disarida birakilmistir.

Takip verisi (3 yillik süreç) Gebe grubundan 4 kadinda gebelik düsük (3) veya intra uterin ölüm (IUD) ile sonuçlanmistir. Ek prosedürler akabinde 4'ünün tamami 2'nci numunenin toplanmasi akabindeki 6 ay içinde basarili gebeliklere sahip olmustur.

Basarisiz olan IVF grubundan 12 kadin hiçbir zaman gebe kalamamistir, 7'si 2'nci numunenin toplanmasi sirasinda gebe kalmamistir ancak diger bir zaman noktasinda gebe kalmistir. Bunlar: Hasta 6, gebe>1'inci numune akabinde 1 yil, <2`nci numune akabinde 1 yil Hasta10, 1'inci numune akabindeki 1 yil içinde gebe (ikiz) Hasta 14, 1'inci numune akabindeki 1 yil içinde gebe Hasta 19, 1'inci numune akabindeki 1 yil içinde, düsük Hasta 58, 1'inci numunenin toplanmasi zamaninda spontan gebe oldugu bulunmustur. Bu IUD ile sonuçlanmistir. IVF sürmüstür ve embriyonun yerlestirilmesinden sonraki 16.haftada 2'nci numune toplanmistir. IVF basarisiz olmustur. Bu hasta birinci IVF/ICSI'nin çiktisinin testine ve gebelik nedeniyle degisimler testine yönelik gebe-olmayan gruba atanmistir. Bütünlük için model olusturulmasi ayrica gebe grubunu atanan hasta 58 ile gerçeklestirilmistir. Kisi bir kadinin 1 yil içinde gebe kalip kalamayacagi testine yönelik gebe grubuna atanmistir.

Hasta 78, spontan gebe› 1'inci ve 2'nci numune akabinde 1 yil, düsük.

Hasta 92, gebe (IVF) > 1'inci ve 2'nci numune akabinde 1 yil, düsük akabinde basarili spontan gebelik 1'inci numune akabinde 2 yil. 1'inci idrar numunesinin bakteriyel popülasyon verisi iki model olusturmak üzere ikiterimli regresyon analizine sokulmustur. Model 1 birinci lVF/ICSI denemesinin gebelik gerçeklestirip gerçeklestiremeyecegini öngörür. Model 2 bir kadinin IVF/ICSI denemelerinin (1 ila 3 deneme) 1 yili boyunca gebe kalip kalamayacagini öngörür. Bu modele yönelik modelin bagli oldugu 1`inci idrar numunesinin toplanmasi akabindeki 1 bir gebe olmayan grup vererek gebe grubuna atanmistir. Hastalar 6, 78 ve 92, gebeliklerinin ikinci numune toplanmasindan sonra 1 yildan fazla sürede baslamasi nedeniyle 1 yil içinde gebe olmayan grupta kalmistir. Öngörü modelleri 16. haftada toplanan idrar numunelerine uygulanmistir. Genis kapsamli analize bagli modeller, bagimsiz test grubundan dogrulanan bir türlere spesifik QPCR testine dönüstürülür.

Gebe olmayan ve gebe kadinlarda bakteriyel popülasyon ve UTI nedenleri DNA analizi ile bulunan bakteriyel popülasyonlar UTI'ye sahip olmayan gebe/gebe olmayan kadinlarin idrar yolunda düsük sayilarda mevcut olan bakterileri temsil eder.

Bu veri Erbil'de (Kürdistan Bölgesi, Irak) Dogum Hastanesinde bulunan kadinlardan idrar ve vajinal smear numunesi araciligiyla elde edilen gebe/ gebe olmayan kadindaki UTI ve vajinal enfeksiyon nedenleri hakkindaki veri ile karsilastirilmistir. 2009 boyunca smear kültürü sonuçlari (94 gebe degil ve 122 gebe) elde edilmistir.

Tablo 1. Iki hasta grubunun karakteristik/eri Gebe Gebe degil Gebe Gebe degil Sigara kullanan 1 1 Yil cinsinden çocuk istegi süresi 4.1±3.4 6.0±5.4 Neden Erkek 10 7 Erkek/ pesa 1 1 Erkek/ tuba 1 Serviks 1 döngü sorunlari 3 1 Bilinmiyor 5 7 Endometriyoz 1 ovarektomi 1 Yöntemler DNA pürifikasyonu. Bakteriyel popülasyon bilesimi genis spektrumlu bakteriyel 168 rDNA analizi araciligiyla degerlendirilmistir (Riemersma, W.A. et al., 2003, J. Clin. santrifüjlenmistir. Pellet ayrica kullanilana kadar -80°C`de saklanmistir. Akabinde150 pl pellet DNA ekstraksiyonu ve pürifikasyonuna yönelik kullanilmistir. <150ul`lik bir hacme sahip numunelere, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5)-O.1 mM EDTA-50 mM glikoz tamponunun dengeleyici bir miktari eklenmistir. Ilk olarak, 75 pl lizostafin solüsyonu (10 mg/ml; Sigma, St Louis, Mo.) eklenmistir ve karisim 30 dakika boyunca 37°C'ye isitilmistir.

Akabinde, 1 ml guanidinyum Iizis tamponu (4 mM guanidinyum izotiyosiyanat, 0.1 M Tris-HCI [pH eklenmistir ve karisim 1 saat boyunca oda sicakliginda tutulmustur, bunun akabinde 50 pl Celite süspansiyonu eklenmistir. Numuneler oda sicakliginda 10 dakika boyunca düzenli araliklarda karistirilmistir. Vortekse tabi tutma ve santrifüfleme (bir Eppendorf santrifüjünde 14,000 rpm'de 10 dakika) akabinde, süpernatant atilmistir ve pellet iki kere ikinci bir Iizis tamponu (4 M guanidinyum izotiyosiyanat, ile, iki kere etanol (%70) ile ve son olarak bir kere aseton ile yikanmistir. Pellet vakumda kurutulmustur ve içinde emülsifiye edilmistir. Numune 10 dakika boyunca 56°C'de isitilmistir ve santrifüjlenmistir (bir Eppendorf santrifüjünde 14,000 rpm'de 10 dakika). Süpernatant 50 mM Tris-HCI, 0.1 mM EDTA ve 50 mM glikoz içeren bir tamponda (pH 7.5) PCR'ye yönelik bir sablon olarak kullanilmistir.

PCR Saflastirilmis DNA'dan bakteriyel 168 rDNA'nin izolasyonu, genin korunmus parçasina karsi yönlendirilen primerler, EUB-L (5'-CTTTACGCCCATTTAATCCG-3') ve EUB-R (5'-AGA-GTTTGATCCTGGTTCAG-B') kullanilarak bir PCR reaksiyonu ile gerçeklestirilmistir. PCR küçük-alt birim (ssu) rDNA geninin 3'-terminal ucundan türeyen bir ~500-bp fragmenti olusturur (Wilson, K.H. et al., 1990, J. Clin. Microbiol. desoksinükleotit trifosfat doymus solüsyonu (Amersham Life Science, Cleveland, Ohio), 5 ul 10-kat-kosantre SuperTaq PCR tamponu (HT Biotechnology, Cambridge, Birlesik Krallik), her iki primerin 0.5 ul'si, 28.92 pl damitilmis su ve 0.08 pl SuperTaq polimerazi (15 U/ul; HT Biotechnology, Cambridge, Birlesik Krallik) eklenmistir. PCR solüsyonu 5 dakika boyunca 94°C'de bir ön-döngülü denatürasyon adimi akabinde (45 s) kapsamistir. Kontrol numunesi olarak, ek DNA numuneleri olmadan 50 pl PCR karisimi paralel olarak islenmistir. Akabinde, PCR ürünlerinin 10-pl'lik kisimlari etidiyum bromid içeren %1ilik bir agaroz jel üzerinde analiz edilmistir. Elektroforez 0.5X TBE'de (50 mM Tris, 50 mM borat, 1 mM EDTA) gerçeklestirilmistir; jeller aköz etidiyum bromidde (10 ng/ml) boyanmistir ve UV isiklandirmasi altinda fotograflanmistir.

Amplifikasyon ürünlerinin klonlanmasi. PCR amplifikasyonu ürünleri idrar mevcut olan farkli bakterilerden kaynaklanan 168 rDNA fragmentlerinin bir karisimini içerir. Bu fragmentleri ayirmak üzere bir klonlama-dönüstürme adimi gerçeklestirilmistir. Her bir 3 ul PCR ürünü bir pGEM-T easy vektöründe ligasyona yönelik kullanilmistir ve kompetent Escherichia coli' JM109 hücrelerine isi-soku araciligiyla dönüstürülmüstür.

Klonlar ampisilin (100 pg/ mi) ve X-Gal (5-bromo-4-kloro-3-indoIiI-ß-D-galaktopiranozid; 40 ug/ml) içeren LB agar plakalarinda 37°C'de bir gece boyunca yetistirilmistir.

Dönüsenler mavi-beyaz koloni tarama araciligiyla tanimlanmistir.

Dizileme. Plazmidin eklendigi klonlarin tamamindan, plazmidler bir QIAgen Miniprep kit (QIAgen, Venlo, Hollanda) kullanilarak izole edilmistir. Numune basina en fazla 100 klon kullanilmistir. Her bir plazmid izolatina yönelik bir dizileme PCR'si 168 rDNA'nin degisken bölümünde yönlendirilen T7 primeri ile gerçeklestirilmistir, TAATACGACTCACTATAGGG. Ortaya çikan dizi BLAST veritabanindaki orijinal bakteriyel türü tanimlamak üzere kullanilmistir. Tüm sonuçlar spesifik bir bakteriyel tür tarafindan temsil edilen popülasyonun yüzdesini elde etmek üzere analiz edilen klonlarin toplam sayisi ile iliskili olmustur. Dolayisiyla 100 klonun analiz edilmesi ve 'si Lactobaci/lus crispatus'a yönelik diziyi vermistir popülasyonun %20'si Lactobaci/Ius crispatus olmustur.

PCR yaklasimi orijinal idrar numunesindeki bakteriyel popülasyonun bir nitel analizini verir. Nicel veriler veren kültürler enfeksiyon semptomlari olmayan bu kadinlarda gerçeklesti rilmemistir.

Istatistik Tüm istatistik test PASW ile gerçeklestirilmistir.

Gruplar içindeki 1'inci ve 2'nci numune arasindaki farklar eslestirilmis bir Student t-testi ile anlamliliga yönelik test edilmistir. Gruplar arasindaki farklar iki grubun esit varyansi ile eslestirilmemis bir Student t-testi ile test edilmistir. Öngörü modelleri ikiterimli regresyon analizi araciligiyla elde edilmistir.

Sonuçlar Bakteriyel popülasyonun bilesimi ve stabilitesi Tüm idrar numuneleri 1 ila 10 bakteriyel türlerden olusan bakteriyel popülasyonlara sahip olmustur. Tablo 2, biri gebe kalan ve biri gebe kalmayan 2 kadina yönelik sonuçlari gösterir. Bulunan çesitli bakteri türleri disinda bu bakteriyel popülasyonlarin gebe kalan veya kalmayan kadinlarda zamanlar ne kadar stabil olduklarini belirlemek ayrica ilgi çekicidir. Birinci bir stabilite ölçümü niteliksel olarak 2'nci numunede tekrar bulunan 17inci numuneden bakteriyel türlerin sayisina bakmaktir. Tablo 2”de bunlar kalin sayilar ile gösterilir. Dolayisiyla gebe kadina yönelik 4 bakteriyel türden 3'ü (%75) >16 haftalik bir zaman dilimi boyunca mevcut kalmistir (Lactobacillus crispatus susu ZDY35b, Staphylococcus aureus susu LA14 ve Pseudomonas acephalitica, %75 örtüsme) Gebe kalmayan kadinda örtüsme %60 olmustur.

Stabiliteye yönelik ikinci bir ölçüm iki numune arasindaki yüzdelerdeki mutlak örtüsmedir. Gebe kadina yönelik popülasyonun %37”si her iki zaman noktasi için ayni olmustur (%12 Lactobaci/Ius crispatus, %15 Staphylococcus aureus, %10 Pseudomonas acephalitica). Lactobacillus crispatus'tan Staphylococcus aureus'a büyük bir degisme meydana gelmistir. Gebe kalmayan kadinda popülasyonun %79'u Gebe Gebe degil 1'inci 2'nci 1'inci 25nci Pseudomonas acephali'tica %30 %10 Streptomyces sp. SD-Z %5 %0 Bre vundimonas sp. DB5 %14 %0 KÜItÜr/enmemis bakteri klonu %6 %1 5 Streptomyces sp. WYE 2 %0 %5 Bu analizin tüm gruplara uygulanmasi asagidakileri gösterir: Gebe grubuna yönelik bakteriyel türlerin ortalama sayisi her iki numunede 4 olmustur.

Gebe olmayan gruba yönelik bu sayi IVF/ICSI denemesinden önce 3 ve sonrasinda 4 olmustur. Gebe grubundan ortalama 1.9±1.2 bakteriyel tür her iki numunede mevcut olmustur. Gebe olmayan gruba yönelik bu sayi 2.1±0.9 olmustur. Türlerin çesidi her iki grup arasinda büyük oranda degismemistir. 1`inci ve 2'nci numune arasindaki tam örtüsme gebe olmayan grup 68±%24, ile karsilastirildiginda gebe grubunda büyük oranda düsük (p<0.001), 37±%23, olmustur.

Genel olarak bakteriyel popülasyon gebe kalmayan kadinlarda nitel olarak ve nicel olarak stabil olmustur. Gebe kalmayan kadinlarda ayri bakteri türlerinin bollugunda mevcut popülasyon içinde büyük degismeler meydana gelmistir. Bu degismenin yapisi asagida verilir. 2.; 33 9: cm_ 00 2.. 7...` 9... 9 2.32.. .2.2 ..5. .3.1.9.5 .n miuCGCFE::. ..2 w .3 ::L :::5 .5.1:.330 ne. 25:51; 5;:...PGCJ m m?... :::5 .r . . agiza:: TEL:: ..:35.3...xiiîî 2 maçini.: 5...: _:52_ ..1; 02 mm z::. .:2 :5.52553 3.0.. ::3:65_ M... I. mâ da Dw in «3 in en mm 3 2. p 2 b Sahaf? w ..:2 EE .estcscîizv w Kumru› EacmhngivçIOv m.. C... ..Amman .::arwwsnxqßçîüy 13:.. .:... .::5; :2?...795 239.5..., 53:.: :Sizîaiv N .0.5. ..1... .Eiöuugîou AC` .s b..? ;cazciîk 23 :AK Ee H` EP::.. .9: &Su D. 5.2 .5: &Awaîâq .5.5.5 i.. . .am 3_ ...H o_ 3 m0 5 3 3.2.# bu... 45.2` .2.2 E.: 3.1.3:: ::En v .br i.. ..::Ai vîçnmfî v3âCC$CIC~ ait:: :::Ficcs ..Zctiî ?çiréécttm .A ...3935. &Shangai ..Start SÜOSHB 335::: «:11 r; chcrîLizxvâ rövîîic. . 53:32:21. 2...::. 5.695. 53... 3 32.... ..9th 1.5.55::.5 .0.5. ES ..riccrcciaçiu 1. .5. d.. 55:59::..

T` .3. 9 âhigsubzm .2.2 S.: .I ;EaîSâ 6.4..“ ci.. @m :v v» ...m n i .on :53 town& ;sv ::akim :::3 ::2:55 !bu imani› ca.›iqi._ûoa 9 1 .v N Cum %3.. ip 3... :2: _S ...:;7J3~ › 2... ahir` F.` KN.: `ud ..Cu ?curdtuuh .2.2 5...: .223.233 ...HT .Hut ..5 ,1.5 Em . &75. 1:35 n1...._.`._$._. 2?.. bu:: 5. 25..: 55.2..? 1%.. ir::.. »2 _ E : :45?, . 1 . .1.320 îuâucnicaucsm v tursusu.. 6. &tasan; _ac_ 9.3... matogüâmi.

.... E.. 3 .:1 ..::îîîszia SE.: :5. .::suan »i . __um nruii..»Cr .0:10 Söuânugim .3.. ...:_Eîinbrâbp .. 7..... _:Eî.. afis::.. .m ECS::: ..C ...tügw ...avg Bakteri türleri ve baskin türler Toplamda 79 farkli bakteriyel türü bulunmustur, tablo 3'te bir genel taslak verilir.

Analizin çogunluguna yönelik elde edilen DNA dizisi ile BLAST veri bankasindaki türlere-spesifik dizi arasindaki eslesme %97'yi geçmistir. Daha düsük eslesme yüzdeleri tabloda gösterilir. Çogu tür yalnizca birkaç numunede bulunmustur. Tablo 4 bakteriyel türlerin bulundugu sikligi gösterir.

Tablo 4 Bir veya daha fazla numunede mevcut türlerin sayisi N numune/er: Spesifik bir türün mevcut oldugu numune/erin sayisi N türler: N numunelerin geçerli oldugu türlerin sayisi (dolayisiyla 49 tür yalnizca 1 numunede meydana gelirken 1 tür 75 numunede meydana gelmistir) Minor türler Çogu tür yalnizca 1 kadinin popülasyonunun %10'undan azi olarak ve genellikle yalnizca bir numunede mevcut olmustur. Gebe grubunda 19 tür her iki zaman noktasinda bulunmustur (ayni kadinda olmasi gerekli degildir), 16`si 1'inci numuneye yönelik ve 18'i 2`nci numuneye yönelik essiz olmustur. Gebe olmayan grupta 16 bakteriyel tür her iki numunede meydana gelmistir, 14`ü 1'inci numune yönelik ve 25'i 2'nci numuneye yönelik essiz olmustur. Dört farkli numune grubuna yönelik herhangi bir essiz bakteriyel tür olmamistir (gebe degil, gebe, basarisiz olan IVF/ICSI öncesi ve basarisiz olan IVF/ICSI sonrasi).

Major türler Bes tür 4 numune grubunun tamaminda meydana gelmistir. Lactobacil/us crispatus ve Staphy/ococcus aureus tüm numunelerin çogunlugunda mevcut olmustur. E coli', Streptomyces sp ve kültürlenmemis bakteri i'zo/ati CH96Fc_H10 daha az numunede ancak 4 grubun tamaminda mevcut olmustur.

Baskin türler (toplam popülasyonun en genis fraksiyonu) 4 numune grubuna yönelik baskin bir tür tarafindan isgal edilen ortalama yüzde numune gebe grup, %22 ila %88 araliginda), 56 ± %15 (1'inci numune gebe olmayan ila %100 araliginda) olmustur. Baskin türlerin genel bir taslagi tablo 5`te verilir.

Tablo 5 Baskin türler (%18 ila %100) Gebe grup Gebe olmayan grup No. birinci numune ikinci numune No. birinci numune ikinci numune LG Sa 6 Sa Sa 4 Lc Lc 6 Lc LC 2 Lc B RG4 2 LC Sa 1 Lc B CPB8 2 Li Li 1 LC Msb 1 Lcu Lcu 1 LG S 1 BC Lc 1 L] B RG4 1 00 CC 1 L] Sa 1 UbB UbE 1 B RG4 B RG4 Lc=LactobacilIus crispatus, Lcu=LactobacilIus curvatus klonu 8225, Li=Lact0bacillus inners, Lj=Lactobaci`lIus jensenii izolati C72, Sa=StaphyIococcus aureus, B RG4=BacilIus sp. RG4, Bcpb= Bacillus sp. CPB 8, Msb= Deniz Sedimani bakterisi ISA- Bacilius Clausii susu za-w-3, UbB: Kültürlenmemi's bakteri klonu BermudasB-EB, UbE= KÜItÜr/enmemis bakteri klonu E67BE-207 Gebe grubunda çesitli Lactobacillus suslari birinci zaman noktasinda alinan 22 numunenin 21'inde ve gebelik sirasinda alinan numunelerin 4'ünde baskin olmustur.

Gebelik sirasinda Staphy/ococcus aureus en sik baskin tür olmustur. 22 kadindan 'inde baskin türler her iki numuneye yönelik ayni olmustur.

Gebe olmayan grupta birinci numunedeki baskin türler 20 kadindan 11'ine yönelik bir Lactobacillus türü olmustur. 6 numunede bu Staphylococcus aureus olmustur. Baskin tür 20 kadindan 16'sina yönelik her iki numunede ayni olmustur.

Baskin türlerin tipine bagli olarak, bakteriyel popülasyon basarisiz olmus IVF prosedüründe (IVF prosedürünün herhangi bir etkisi yoktur) stabil görünür ve gebelik sirasinda güçlü degisimlere maruz kalir.

Gebelik sirasinda ve IVF akabinde bakteriyel p0pülasyondaki Spesifik degisimler Gebelik sirasinda meydana gelen bakteriyel türlerin bollugundaki degismeler baslica Gebe olmayan grupta 2'nciye karsi 1'inci numunedeki bolluk her iki Lactobacillus degismemistir.

Yukaridaki karsilastirmaya yönelik 2'nci numunenin toplanmasi sirasinda gebe olmayan ancak 1'inci numunenin toplanmasindan sonraki diger bir zaman noktasinda gebe kalan yedi kadin gebe olmayan gruba atanmistir. 7'den dördü 1'inci numunesinde Staphy/ococcus'a sahip olmamistir. Ikisi yüksek bir Staphylococcus varligina sahip olmustur ve 2'nci veya 3'üncü takip yilinda gebe kalmistir (birisi bir düsük yasamistir; birisi bir düsük akabinde iki yil sonra basarili bir spontan gebelik yasamistir). Yedinci kadin yüksek bir Staphy/ococcus varligi, birinci basarisiz IVF denemesi akabinde basarisiz bir ICSI yasamistir ve akabinde 1 yil içinde spontan gebe kalmistir (düsük).

Bakteriyel popülasyonun önceki UTI veya antibiyotik kullanimi ile iliskisi Gebe grubundan 5 kadin (%23) geçmiste bir UTI'ya sahip oldugu ve 2'si (%9) yakin zaman antibiyotik kullandigini bildirmistir. Gebe olmayan gruptan 9 kadin (%45) öncesinde bir UTI'ya sahip olmustur ve 5'i (%25) yakin zaman antibiyotik kullanmistir.

Farklar istatiksel olarak önemli ölçüde olmamistir. Önceki bir UTI veya antibiyotik kullanimi bildiren kadinlarindaki bakteriyel popülasyonlarin bilesimi, ilgili gruplardan diger kadindakinden önemli ölçüde farklilik göstennemistir. gebe olmayan gruba yönelik daha fazla Staphylococcus türü (27±%22'ye karsi 7±%11, Gebe ve gebe olmayan kadinlarda UTI ve vajinal enfeksiyonun temel nedenleri bölgesi Irak) Dogum hastanesine bulunan kadinlara yönelik gerçeklestirilmistir. Tablo 6'da sirasiyla gebe olan veya gebe olmayan kadinlara yönelik sonuçlar gösterilir. Gebe olmayan kadinlarda E coli tüm pozitif idrar kültürlerinin %44'ünde (70/158) ve Staphylococcus aureus %22”sinde (35/158) bulunmustur. Gebe kadinlarda E coli Vajinal smeara yönelik gebe olmayan kadinlarda E coli tüm pozitif smearlarin Gebe kadinlara yönelik sayilar E coliye yönelik %38 (28/74) ve Staphylococcus aureus'a yönelik %49 (36/74) olmustur. Idrar yönelik ve daha az bir kapsamda vajinal smeara yönelik olarak gebelik sirasinda artmis bir Staphy/ococcus aureus varligina toplam negatif pozitif pseudo. E Kleb. Staph. Enterob. Portus Streptoc. coli a sp.

Vajinal smear toplam negatif pozitif pseudo. E Kleb. Staph. Enterob. Portus Streptoc. coli a sp.

Pseudo. =pseudomonas türleri, Kleb.=K/ebsi'ella tür/eri, enterob.=enterobakter türleri, Streptoc. = streptococcus türleri.

Modeller 1'inci idrar numunesinde belirlenen bakteriyel türlerin girdisi ile ikiterimli regresyon analizi araciligiyla olusturulmustur (IVF/ICSI öncesi, n=42). Modele en çok katkiyi Lactobacillus türleri ve Staphy/ococcus türleri katki saglamistir. Birinci IVF/ICSI akabinde en iyi gebelik öngörüsü Y= 0.030*Lactobaci`llus %'si - 0.057*Staphylococcus numunenin toplanmasi zamaninda gebe kalmistir) denklem Y=0.034 *Lactobaci'l/us %'si - 0.064*Staphyiococcus %'si- 0.668 halini almistir ve dogru olarak öngörülen gebe %'si yil süreli modele yönelik çapraz tablo degerlerini gösterir. 1 yil süreli modelde birçok Öngörülen Birinci deneme dogruluk 1 yil dogruluk Iki modele yönelik ROC egrileri, egrinin altindaki alandan (0.819, 1'inci deneme ve 0.901, 1 yil) 1 yil içinde gebeligin en iyi öngörülen oldugu gösterir. Bu 1 yillik öngörüde infertilite nedeni dört yanlis pozitif öngörüden 3'üne ve 2 yanlis negatif öngörüden 1iine yönelik erkege ait olmustur. Neden 4 yanlis pozitif öngörüden 1line ve 2 yanlis negatif öngörüden 1'ine yönelik bilinmemistir.

Infertilite nedeni ile modelin öngörü gücü arasinda bir iliskinin mevcut olup olmadigini test etmek üzere kadinlar bilinen infertilite neden (n=30) ve bilinmeyen infertilite nedeni (n=12) olarak alt siniflara ayrilmistir [tablo 8]. 1 yillik öngörü Bilinen neden dogruluk Bilinmeyen dogruluk gözlemlenen degil 6 4 60 6 0 100 Ikinci numunenin toplanmasi sirasinda gebe olmayan kadinlara yönelik, n=20, yeni yeni denemeler araciligiyla gebe kalip kalmayacagini 2'nci numune bazinda öngörmek üzere kullanilmistir. Dört kadin bu süreçte gebe kalmistir (hastalar 10, 14, 19 ve 58).

Tablo 9 model araciligiyla öngörülen sonuca karsi gerçek sonucu gösterir. Yeni denemelerin gebelik ile sonuçlanmayacagi öngörüsü 14/15 vakada (%93) dogru olmustur. Öngörülen dogruluk %'si gebe degil gebe Modelin gebeligin 16. haftasinda elde edilen idrarlara uygulanmasi durumunda model bu kadinlardan herhangi birinin sonraki bir IVF/ICSI prosedürden gebe kalamayacagini öngörmüstü r. Öngörü modelinin dogrulanmasi için bir birini disarida birakma prosedürü uygulanmistir. Bu prosedürde bir model 41 hastanin verisinden olusturulmustur ve bu model bu hastanin lVF/lCSI ile baslangicin 1 yili içinde gebe kalip kalamayacagini öngörmek üzere disarida birakilan hastadan idrar verisine uygulanmistir. Sonuçlar (tablo 10) toplam 42 gruptan elde edilenler (tablo 7) ile tamamen eslesir. Öngörülen dogruluk %'si gebe degil gebe Dogrulama grubunda model 28 gebeligin 24'ünü ve 16 basarisizligin 12'sini hatasiz bir sekilde öngörmüstür (Tablo 10).

Mevcut model [5] ile karsilastirma Nelson modelinde bir canli doguma yönelik ayri ihtimal yas, çocuk istegi süresi ve birkaç diger klinik parametre bazinda öngörülür. Bu veriler arastirma grubuna yönelik modele girilmistir ve sonucu bir canli doguma sahip olmayan kadinlara karsi 1 yil içinde gözlemlenen canli doguma sahip kadinlara yönelik karsilastirilmistir, (Tablo 11). Öngörülen ihtimal her iki gruba yönelik degisiklik göstermemistir (p=0.18. eslenmemis Canli dogum ihtimalinin %'si (Nelson modeli) Ortalama s.d. gözlemlenen gebe degil 27 9 Staphylococcus türleri ve Lactobacillus türlerine yönelik qPCR Örnek iide gösterildigi üzere öngörü modelinin yalnizca Lactobacillus, Staphylococcus varligi ve mevcut olan toplam bakteri sayisina dair verileri kullanmasi nedeniyle, spesifik olarak bu üç degeri ölçmek için yönlendirilen bir qPCR prosedürünün gelistirilmesine karar verilmistir.

Bir idrar numunesinde bir PCR genel primer seti (EUB-R, EUB-L) ile gerçeklestirilir. Bu PCR'nin ürünü idrardaki tüm bakteriden derive edilen 168 rDNA'nin bir karisimi ve böylece toplam bakteri sayisinin temsilcisidir.

Akabinde bu Toplam karisiminda bir qPCR üç primer seti, bir genel primer seti, Lactobacillus'a (birçok türüne) spesifik bir primer seti ve Staphylococcus'a (birçok türüne) spesifik bir primer seti ile gerçeklestirilir.

Baslangiçtaki PCR ürünün toplam DNA içerigi bir nanodrop analizi vasitasiyla ölçülür.

Bu analizdeki DNA neredeyse tamamen 163 rDNA`dan olusur. Bu nanodrop analizi bazinda, her bir analizdeki toplam DNA miktari ayni tutulabilir.

Genel primer tüm 168 rDNA fragmentleri ile reakte olacaktir ve böylece bakteriyel popülasyonun %100'ünü tanimlayan CT degeri olusturacaktir. Genel primer seti ayrica baslangiçtaki PCR ürününün bir seyreltme dizisi üzerinde test edilecektir (1, 0.8, 0.6, Spesifik primer setleri ile qPCR analizi genel primer seti ile elde edilen CT degerine esit (popülasyonun yalnizca bir tür içermesi halinde) veya bundan yüksek (test edilen türlerin toplam popülasyonun yalnizca parçasi olmasi halinde) bir CT degeri ile sonuçlanacaktir. Seyreltme serileri bazinda, hangi yüzdenin bu spesifik CT degeri ile eslestigi belirlenebilir.

Staphvlococcus aureus primer seti (asagida açiklandigi üzere: Molecular analysis of bacterial population structure and dynamics during cold storage of untreated and treated milk. Rasolofo EA, St-Gelais D, LaPointe G, Roy D. Int J Food Microbiol. 2010 Ileri (nt 61) primer 5'-GAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGAC-S' Revers (nt 241) primer 5'-GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3' Fragment boyutu 201 bp Lactobacillus crispatus primer seti (asagida açiklandigi üzere: Quantitative PCR Assessments of Bacterial Species in Women with and without Bacterial Vaginosis.

Marcela Zozaya-Hinchliffe, Rebecca Lillis,David H. Martin, and Michael J. Ferris, J Clin Ileri primer GATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGA Revers primer AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC

Claims (1)

1. ISTEMLER Bir öznede basarili veya basarisiz bir gebelik ihtimalinin öngörülmesine yönelik yöntem olup, burada özne IVF veya ICSI gibi yapay bir döllenme yönteminden geçer veya buna uygundur, özelligi asagidaki adimlari içermesidir: Bir idrar veya vajinal numunenin alinmasi; b. Söz konusu numunede mevcut bakterinin toplam miktarinin bir yüzdesi olarak Lactobacillaceae grubuna, tercihen bir Lactobaci'llus türüne ait bakterinin ve bir Staphylococcus türüne ait bakterinin miktarinin belirlenmesi; ve c. Basarili bir gebelik ihtimalinin öngörülmesi burada basarili bir gebeligi ihtimali asagidaki formül araciligiyla belirlenir: Y = a* (Lactobacillus %'si ) - b*(Staphylococcus°/o'si) - c degere sahiptir; degere sahiptir; çok tercih edildigi üzere -1.06 ila -1.01 arasinda bir degere sahiptir; Lactobacillus bakterisinin miktaridir; Staphylococcus bakterisinin miktaridir; ve burada Y basari ihtimalini temsil eder. Istem 1`e göre yöntem olup, özelligi Lactobacillus türünün Lactobacillus crispatus olmasidir. Önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem olup, özelligi Staphylococcus türünün Staphylococcus aureus olmasidir. Önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem olup, özelligi bakteri miktari ölçümünün PCR, daha çok tercih edildigi üzere qPCR araciligiyla gerçeklestirilmesidir, tercihen burada Staphylococcus 5'- GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-S' primerlerinin kullanilmasi araciligiyla belirlenir. Istem 4'e göre yöntem olup, özelligi Lactobacil/ushn 5'- AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC-3' primerlerinin kullanilmasi araciligiyla belirlenmesidir. Istemler 1-4'e göre yöntem olup, özelligi bakteri miktari ölçümünün kütle spektrometresi, daha çok tercih edildigi üzere MALDI-TOF kütle spektrometresi araciligiyla gerçeklestirilmesidir. Önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem olup, özelligi bakterilerin bir idrar numunesinde, tercihen bir orta-akim idrar numunesinde belirlenmesidir. Istemler 1-6'dan herhangi birine göre yöntem olup, özelligi vajinal numunenin bir vajinal smear olmasidir. Istemler 1-8'den herhangi birine göre yöntem olup, özelligi basarili veya basarisiz bir gebelik ihtimalinin öngörülmesinin döllenmis yumurtanin rahimde basarili veya basarisiz bir yerlesmesi ihtimalinin öngörülmesidir. Basarili bir gebelik ihtimalinin öngörülmesine yönelik, asagidaki unsurlari içeren a. Bir özneden bir numune içindeki toplam bakteri içeriginin ölçülmesine yönelik b. Lactobaci'llus bakterisi içeriginin ölçülmesine yönelik araçlar, tercihen burada söz konusu araçlar 5'-GATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGA-3' ve 5'- AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC-3 primerlerini içerir; c. Staphy/ococcus bakterisi içeriginin ölçülmesine yönelik araçlar, tercihen burada söz konusu araçlar 5'-GAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGAC- 3' ve 5'-GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3' primerlerini içerir; d. Istem 1'de tanimlanan formüle göre ihtimali hesaplamak üzere ayarlanan 5 araçlar burada ihtimali hesaplamak üzere ayarlanan araçlar ölçülen bakteriyel içerik degerlerini girdi olarak alabilen ve istem 1'de tanimlandigi üzere formüle göre ihtimali hesaplayan bir islemci içerir. 11.Istem 10'a göre kit olup, özelligi bir özneden bir numunedeki toplam bakteri 10 içeriginin ölçülmesine yönelik araçlarin bakteriyel 168 rDNA'ya spesifik bir genel primer seti içermesidir. 12. Istem 11'e göre kit olup, özelligi genel primer setinin en az bir ileri ve en az bir revers EUB primeri içermesidir.13. Istem 12'ye göre kit olup, özelligi islemcinin kiti kullanan kisi tarafindan okunabilen bir sinyal aracina ihtimal çiktisini verebilmesidir.