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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Milchsäure produzierende Bakterien
und deren Verwendung.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
normale mikrobielle Flora der menschlichen Vagina umfasst Milchsäure produzierende
Bakterien, die herkömmlicherweise
als Döderlein-Bakterien
bezeichnet werden.
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Solche
Milchsäure
produzierenden Bakterien beziehen sich auf nichtsporenbildende grampositive Bakterien,
die durch Fermentierung verschiedener Zucker wie z. B. Glykogen
und/oder Glukose Milchsäure produzieren.
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Milchsäure produzierende
Bakterien umfassen zum Beispiel Bakterien der Gattungen Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus und Enterococcus.
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Milchsäure produzierende
Bakterien können
abhängig
von ihrem Stoffwechselweg in homofermentative und heterofermentative
Bakterien eingeteilt werden. Homofermentative Bakterien (z. B. Lactobacillus
acidophilus) produzieren lediglich Milchsäure, wohingegen heterofermentative
Bakterien zum Beispiel auch Kohlenstoffoxid, Ethanol- oder Essigsäure produzieren.
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Die
Gattung Lactobacillus ist eine phänotypisch heterogene Gruppe
aus fakultativ anaeroben, katalasenegativen, stäbchenförmigen Milchsäure produzierenden
Bakterien. Über
50 verschiedene Arten sind anerkannt und diese Arten besitzen im
Wesentlichen DNA mit einem geringen Gehalt an Guanin (G) und Cytosin (C),
ungefähr
33–53%.
Der GC-Gehalt ist innerhalb einer Art konstant. Im Menschen sind
mehrere Arten von Lactobacillus zu finden, z. B. in der Mundhöhle, dem
Darmtrakt und der Vagina. Die Arten des Lactobacillus, die in der
Vagina vorkommen, sind zum Beispiel Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus
casei (Unterart rhamnosus) und Lactobacillus jensenii.
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Die
Gattung Pediococcus ist phänotypisch
eine Gruppe grampositiver, katalasenegativer, fakultativ anaerober,
sauerstofftoleranter, rundgeformter (Durchmesser ungefähr 0,6–1,0 μm) nicht
pathogener Milchsäure produzierender
Bakterien.
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Gesunde,
fruchtbare Frauen (ungefähr
15–60
Jahre) weisen zwischen den Menstruationen in der Vagina einen pH-Wert
von ungefähr
3,8–4,2
auf, vor allem als Ergebnis der Milchsäureproduktion. Eine säurehaltige
Umgebung verhindert das vaginale Niederlassen von zum Beispiel Bakterien,
die sich im Darm befinden, wie z. B. Gardnerella vaginalis, Mobiluncus,
Bakteroiden, Prevotella und Escherichia coli.
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Die
Haut des Urogenitaltraktes und die urogenitalen Schleimmembranen
einer gesunden Frau beherbergen eine spezifische Flora vorteilhafter
und/oder symbiotischer Mikroorganismen, wie z. B. verschiedene Arten
von Lactobacillus. Jedoch kann der Urogenitaltrakt auch von Mikroorganismen
kolonisiert werden, die Krankheiten verursachen. Die Kolonisation
unerwünschter
Mikroorganismen kann ein Ergebnis sexueller Übertragung sein, spontan auftreten
oder das Ergebnis einer gestörten
normalen mikrobiellen Flora sein. Von Letzterem weiß man zum
Beispiel, dass es nach bestimmten Therapien mit Antibiotika auftritt.
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Somit
kann die mikrobielle Flora des weiblichen Urogenitaltraktes, wie
z. B. in der Vagina, durch eine mikrobielle Infektion gestört und verändert werden,
wie z. B. Hefe (Candida albicans), Trichomonas vaginalis, Neisseria
gonorrhoeae und Chlamydia trachomatis und bakterielle Vaginose (gekennzeichnet
durch ein Übergewicht
an Gardnerella vaginalis und Mobiluncus), eine antibiotische Behandlung
oder anderen oftmals komplexen Fällen.
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Während Menstruation
und Geschlechtsverkehr wird der pH-Wert in der Vagina durch das
Hinzufügen von
Blut bzw. Sperma erhöht.
Diese Flüssigkeiten
enthalten viele Proteine, die von Bakterien (z. B. Gardnerella vagnalis
und Mobiluncus) verdaut werden können,
die, wie vorstehend dargestellt, unter den Bedingungen eines erhöhten pH-Werts
in der Vagina etabliert werden können.
Dann werden Abbauprodukte, wie z. B. Amine (z. B. Putrescin und
Cadacerin) produziert. Bei erhöhtem
pH-Wert werden diese Amine flüchtig
und bilden einen „fischartigen" Geruch. Des Weiteren
haben diese Frauen oft Beschwerden wie starken vaginalen Ausfluss und
Irritation. Dieser Zustand wird als bakterielle Vaginose (BV) bezeichnet
und ist der am meisten verbreitete Zustand im Zusammenhang mit Irritation
und erhöhter
Menge an riechendem vaginalen Ausfluss (siehe Morris, M; Nicoll,
A; Simms, I; Wilson, J; Catchpole, M, Bacterial vaginosis: A public
health review, British Journal of Obstetrics and Gynaecology (Bakterielle
Vaginose: Eine Bewertung der Volksgesundheit, Britisches Journal der
Geburtshilfe und Gynäkologie),
108(5): 439–450,
Mai 2001).
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Bakterielle
Vaginose wird als Ergebnis verlagerter vaginaler Milchsäure produzierender
Bakterien betrachtet, die durch eine Vielzahl unerwünschte Arten
ersetzt wurden, wie z. B. Gardnerella vaginalis, Bakterioide, Mobiluncus,
Prevotella bivia und Mycoplasma hominis.
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Ein
Verfahren zur Diagnose der bakteriellen Vaginose (BV) wird durch
Amsel-Kriterien
beschrieben. Zuerst wird der pH-Wert des vaginalen Ausflusses gemessen.
Der pH-Wert wird bei 90% der Frauen mit BV über 4,5 bewertet. Zweitens
wird, wenn dem vaginalen Ausfluss 10% KOH hinzugegeben wird, bei
ungefähr 70%
der Frauen mit BV ein „fischartiger" Geruch entstehen.
Drittens wird oftmals das Vorhandensein von Plattenepitheizellen
im Nativpräparat
bedeckt mit kleinen Coccobacilli („Hinweiszellen") beobachtet. Ein
anderer zuverlässiger
Test für
BV ist die direkte Gram-Färbung
des vaginalen Fluids. Ein standardisiertes Verfahren zur Interpretation
der Gram-Färbungen
bei BV wurde von Nugent et al. dargestellt (siehe Beispiel 1).
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Es
ist bekannt, dass Milchsäure
produzierende Bakterien die Fähigkeit
besitzen, das Wachstum zu hemmen und/oder die Pathogenität vieler
mit urogenitalen Infektionen assoziierten Pathogene zu reduzieren (siehe
z. B. Redondo-Lopez, V; Cook, R L; Sobel, J D, Emerging role of
lactobacillus in the control and maintenance of the vaginal bacterial
microflora, Reviews of infectious diseases [Neue Rolle des Lactobacillus
in der Kontrolle und Bewahrung der vaginalen bakteriellen Mikroflora, Überblick über Infektionskrankheiten],
vol 12, no 5, sep–oct
1990, und Boris, S; Barbes, C, Role played by lactobacilli in controlling
the population of vaginal pathogens, Microbes and infection [Die
Rolle von Lactobacilli in der Steuerung der Population vaginaler
Pathogene], vol 2, pp 543–546,
2000).
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Es
ist ebenfalls bekannt, dass die antagonistischen Eigenschaften von
Milchsäure
produzierenden Bakterien gegen diese Pathogene mindestens teilweise
durch ihre Fähigkeit
gekennzeichnet sind, verschiedene antagonistische Substanzen, wie
Milchsäure,
Wasserstoffperoxid und Bacteriocine zu produzieren.
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Eine
gesunde Vagina beherbergt schätzungsweise
zwischen 108–109 cfu
(Kolonien formende Einheiten) an Milchsäure produzierenden Bakterien.
Die Zusammensetzung dieser Flora ist ein Ergebnis, dessen spezifische
Stämme
die Frau von ihrer Mutter geerbt hat und/oder die aus ihrem Verdauungstrakt
in den Urogenitaltrakt abgewandert sind.
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Der
Stand der Technik beschreibt Rezepturen, wie z. B. Suspensionen,
Zäpfchen
und Gelatinekapseln, die lebenswichtige Milchsäure produzierende Bakterien
umfassen. Solche Rezepturen sind zum Beispiel in
US 5 466 463 und
WO 9 309 793 offenbart.
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Darüber hinaus
ist bekannt, wie saugfähige
Artikel, wie z. B. Tampons und Damenbinden, mit Milchsäure produzierenden
Bakterien imprägniert
werden, mit dem Zweck, eine normale mikrobielle Flora in dem Urogenitaltrakt
der Frau zu bewahren und dadurch urogenitale Infektionen zu verhindern
oder eine normale mikrobielle Flora in dem Urogenitaltrakt der Frau
zu regenerieren. Solch ein Produkt ist in
EP 0 594 628 und der
Schwedischen Patentanmeldung 0003544-4 offenbart.
Ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Harnwegsinfektionen,
welches das Verabreichen isolierter Milchsäure produzierender Bakterien
der Gattung Lactobacillus an die Vagina umfasst, ist in
US 6 180 100 offenbart.
Die Lactobacilli sind fähig,
die Vagina für
bis zu 5 Wochen nach einer einzelnen Eintröpfelung zu kolonisieren.
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Jedoch
ist es, um den vorstehenden Effekt zu erhalten, wichtig, dass die
Uropathogen hemmenden Milchsäure
produzierenden Bakterien wirklich kolonisieren und sich in vivo
etablieren und tatsächlich
mehr als einen Menstrualzyklus nach der vaginalen Verabreichung
in der Vagina verbleiben.
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Ob
ein Bakterienstamm die Vagina kolonisieren wird oder nicht hängt von
den adhäsiven
Eigenschaften des spezifischen Bakterienstammes sowie dem hormonellen
Zustand, dem Nährzustand
und dem Säurezustand
der Vagina ab. Eine anhaltende Genitalinfektion oder Behandlung
mit Antibiotika wird die Fähigkeit eines
eingeführten
Stammes zur Kolonisierung der Vagina ebenfalls beeinflussen.
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Der
Menstrualzyklus beeinflusst ebenfalls die Haftfestigkeit und die
maximale Haftfestigkeit tritt vor der Ovulation und vor der Menstrualblutung
auf (
US 6,180,100 und
Chan et al., Journal of Urology (Journal der Urologie), März 1984).
Somit ist die schwierigste Zeit für die Kolonisierung und Etablierung
der verabreichten Milchsäure
produzierenden Bakterien in der Vagina die Menstrualblutung.
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Im
Hinblick auf die Kolonisierung und Etablierung von Milchsäure produzierenden
Bakterien in vivo kann eine erhebliche Ungleichheit zwischen klinischen
Ergebnissen und erwartetem bakteriellen Verhalten aus der Interpretation
der in vitro Analyseergebnisse bestehen. Es ist üblich, dass zwischen verschiedenen
Bakterienarten in der Vagina Interaktionen auftreten und dieses
Interaktionsmuster im Labor nur schwer nachzubilden ist. Daher kann
sich, selbst wenn eine Bakterienart in vitro vielversprechende Ergebnisse
zeigt, möglicherweise
nicht in vivo etablieren und nicht den gewünschten therapeutischen Effekt
bereitstellen, d. h. die Effekte einer mikrobiellen Infektion des
Urogenitaltraktes zu verhindern oder zu lindern und/oder die Infektion
zu behandeln.
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Darüber hinaus
ist es äußerst wichtig,
dass die Bakterien Stabilität
ihres genetischen Profils zeigen, sowohl nach wiederholter Kultivierung
in Massenherstellung als auch über
längere
Zeiträume
hinweg in vivo.
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Ein
anderes Kriterium, das erfüllt
werden muss, um ein annehmbares Verbrauchsprodukt zu produzieren,
das den gewünschten
therapeutischen Effekt bereitstellt, ist die Erhaltung der bakteriellen
Lebensfähigkeit nach
Lyophilisierung der Bakterien und nach Lagerung der lyophilisierten
Bakterien (d. h. Haltbarkeit).
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung offenbart neuartige isolierte Bakterienstämme der
Gattungen Lactobacillus und Pediococcus, die die Fähigkeit
besitzen, nach vaginaler Verabreichung von mindestens einem der
Bakterienstämme
selbst während
der Menstrualblutung in einer menschlichen Vagina zu kolonisieren
und sich zu etablieren. Die Bakterien werden als etabliert betrachtet,
wenn die Bakterien nach mindestens zwei Menstrualzyklen nach der
Verabreichung noch in der Vagina vorhanden sind.
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Ein
Vorteil ist, dass die Bakterienstämme gemäß der Erfindung die Fähigkeit
zeigen, sich während
der Menstrualblutung zu etablieren, da die Bakterien dann leicht
verabreicht werden können,
zum Beispiel mithilfe eines mit den Bakterien imprägnierten
Tampons.
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Etablierte
Milchsäure
produzierende Bakterien der genannten Stämme verhindern und lindern
die Effekte von mikrobieller Infektion des Urogenitaltraktes, insbesondere
bakterielle Vaginose und/oder behandeln diese. Um diese therapeutischen
Effekte zu erhalten, ist es notwendig, dass sich die Bakterien nach
der Verabreichung leicht etablieren und somit noch nach mehreren
Menstrualblutungen in der Vagina vorhanden sind.
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Die
Bakterienstämme
wurden gemäß der Budapester
Vereinbarung an der BCCM/LMG (Belgische koordinierte Mikroorganismensammlung/Laboratorium
voor Microbiloligie-Bacterienverzammeling, Universiteit Gent) in
Belgien am 14. Juni 2001 hinterlegt und umfassen die Stämme von
Lactobacillus gasseri, bezeichnet durch den Anmelder als LN 40,
hinterlegt unter der Nummer LMG P-20560, den Stamm des Lactobacillus
casei subsp. rhamnosus, bezeichnet durch den Anmelder als LN 113,
hinterlegt unter der Nummer LMG P-20562, den Stamm des Lactobacillus
fermentum, bezeichnet durch den Anmelder als LN 99, hinterlegt unter
der Nummer LMG P-20561, den Stamm des Lactobacillus crispatus, bezeichnet
durch den Anmelder als LN 01, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20558,
und den Stamm des Pediococcus acidilactici, bezeichnet durch den
Anmelder als LN 23, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20559, oder
Varianten davon mit im Wesentlichen entsprechenden phänotypischen
Eigenschaften.
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Darüber hinaus
beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung
eines Bakterienstammes der Gattung Lactobacillus oder Pediococcus,
der die Fähigkeit
besitzt, in einer menschlichen Vagina zu kolonisieren und sich zu
etablieren, selbst während
der Menstrualblutung, wobei
- (a) ein Bakterienmuster,
wie z. B. ein vaginales Fluid, aus dem Vaginaltrakt einer Frau mit
einer normalen, gesunden vaginalen Mikroorganismenflora entnommen
wird,
- (b) Milchsäure
produzierende Bakterien aus dem vaginalen Muster aus Schritt (a)
ausgewählt
werden,
- (c) die Milchsäure
produzierenden Bakterien aus Schritt (b) in vitro in einem geeigneten
Nährmedium
reinkultiviert werden, was zumindest einen isolierten Bakterienstamm
liefert,
- (d) mindestens ein reinkultivierter Bakterienstamm aus Schritt
(c) und/oder eine Kombination aus mindestens zwei Bakterienstämmen aus
Schritt (c) bewertet wird bezüglich
ihrer Fähigkeit,
nach vaginaler Verabreichung des Bakterienstammes an eine Frau während ihrer
Menstrualblutung in der Vagina zu kolonisieren und sich darin zu
etablieren, wobei die Frau eine gestörte vaginale Mikroorganismenflora
aufweist und der Bakterienstamm bzw. die Bakterienstämme als
etabliert betrachtet wird/werden, wenn der Bakterienstamm bzw. die
Bakterienstämme
nach mindestens zwei Menstrualzyklen nach der Verabreichung noch
in der Vagina vorhanden ist/sind, und
- e) mindestens ein Bakterienstamm aus Schritt (d) ausgewählt wird,
der die Fähigkeit
zeigt, in der Vagina zu kolonisieren und sich darin zu etablieren.
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Vorzugsweise
wird mindestens ein reinkultivierter Bakterienstamm aus Schritt
(c) und/oder eine Kombination aus mindestens zwei Bakterienstämmen aus
Schritt (c) lyophilisiert.
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Darüber hinaus
wird/werden dieser/diese Stamm/Stämme vorzugsweise bewertet und
ausgewählt
bezüglich
der Stabilität
der bakteriellen Lebensfähigkeit
nach der Lyophilisierung und Lebensfähigkeit der lyophilisierten
Bakterien über
lange Aufbewahrungszeiten hinweg, wobei die bakterielle Lebensfähigkeit
als stabil betrachtet wird, wenn mindestens 40% der Bakterien nach
Lyophilisierung und einer Lagerung der lyophilisierten Bakterien
während
mindestens 12 Monaten bei –18°C eine bewahrte
Lebensfähigkeit
besitzen.
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Außerdem wird/werden
dieser/diese Stamm/Stämme
vorzugsweise bewertet und ausgewählt
bezüglich
der genetischen Stabilität
nach wiederholter Kultivierung und in vivo nach vaginaler Verabreichung,
wobei die Bakterien als genetisch stabil betrachtet werden, wenn
ihr genetisches Profil in vivo für
mindestens 12 Monate bewahrt ist.
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Die
vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls einen Bakterienstamm der
Gattung Lactobacillus oder Pediococcus, der die Fähigkeit
besitzt, während
der Menstrualblutung in einer menschlichen Vagina zu kolonisieren
und sich zu etablieren, wobei der Stamm gemäß dem vorstehend beschriebenen
Verfahren isoliert werden kann. Solche Bakterienstämme sind
vorzugsweise die Stämme
des Lactobacillus gasseri, bezeichnet durch den Anmelder als LN
40, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20560, der Stamm des Lactobacillus
casei subsp rhamnosus, bezeichnet durch den Anmelder als LN 113,
hinterlegt unter der Nummer LMG P-20562, der Stamm des Lactobacillus
fermentum, bezeichnet durch den Anmelder als LN 99, hinterlegt unter
der Nummer LMG P-20561, der Stamm des Lactobacillus crispatus, bezeichnet
durch den Anmelder als LN 01, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20558,
und der Stamm des Pediococcus acidilactici, bezeichnet durch den
Anmelder als LN 23, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20559, oder
Varianten davon mit im Wesentlichen entsprechenden phänotypischen
und/oder genotypischen Eigenschaften.
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Des
Weiteren beschreibt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung
zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Infektionen des Urogenitaltraktes,
umfassend mindestens einen der Bakterienstämme (LN 40, LN 113, LN 99,
LN 01 und LN 23).
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Vorzugsweise
umfasst die Zusammensetzung alle Stämme, d. h. Stamm LN 40, Stamm
LN 113, Stamm LN 99, Stamm LN 01 und Stamm LN 23.
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Im
Stand der Technik ist bekannt, dass eine Kombination aus verschiedenen
Bakterien die Generationszeit eines Bakteriums verkürzt, was
ein schnelleres Bakterienwachstum zur Folge hat. Darüber hinaus
wird bevorzugt, eine Kombination aus verschiedenen Bakterienarten
zu verwenden, da verschiedene Arten von Milchsäure produzierenden Bakterien
verschiedene Fermentierungsmuster und -eigenschaften aufweisen.
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Eine
Kombination aus allen Stämmen
gemäß der Erfindung,
d. h. LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23 zeigt eine noch bessere
Hemmung von Uropathogenen als jeder Stamm einzeln genommen.
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Die
Zusammensetzung wird vorzugsweise zur vaginalen Verabreichung formuliert,
wie z. B. ein Zäpfchen,
eine Kapsel, Pillen, Tabletten, Suspension, Spray, Gel, Creme, Puder
oder jede andere Form zur vaginalen Einführung.
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Des
Weiteren beschreibt die vorliegende Erfindung einen Hygiene-Artikel,
wie z. B. ein saugfähiges Produkt
(z. B. Tampon, Damenbinde, Slipeinlage), eine Windel und einen Inkontinenzschutz
zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Infektionen des Urogenitaltraktes,
umfassend mindestens einen der Bakterienstämme (LN 40, LN 113, LN 99,
LN 01 und LN 23).
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Vorzugsweise
umfasst der Hygiene-Artikel alle Stämme, d. h. Stamm LN 40, Stamm
LN 113, Stamm LN 99, Stamm LN 01 und Stamm LN 23 aus denselben Gründen, wie
vorstehend in Bezug auf die Zusammensetzung angegeben.
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Der
Hygiene-Artikel ist vorzugsweise ein Tampon.
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Darüber hinaus
beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung mindestens eines
Bakterienstammes (LN 40, LN 113, LN, LN 99, LN 01 und LN 23) für die Produktion
einer Zusammensetzung oder eines Hygiene-Artikels zur Prophylaxe und/oder Behandlung
von Infektionen des Urogenitaltraktes, vorzugsweise bakterieller
Vaginose oder einer anderen bakteriellen Störung in der Vagina.
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Andere
Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der
nachstehenden ausführlichen
Beschreibung der Erfindung deutlich.
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Kurzbeschreibung der Figuren
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1a und 1b stellen
den Wachstumsprozess der Bakterienstämme LN 40, LN 99, LN 113 bzw. LN
23 dar.
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2 stellt
ein Bild eines Gels mit stammspezifischen Produkten dar, die mithilfe
von RAPD und Gelelektrophorese erzeugt wurden. Die Stämme LN 40,
LN 99, LN 113, LN 01 bzw. LN 23 werden mit der Stammart der entsprechenden
Bakterienarten verglichen.
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3 und 4 zeigen
den in Beispiel 6 verwendeten Versuchsaufbau.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Wie
hierin verwendet, meint der Begriff „Milchsäure produzierende Bakterien" Bakterien, die durch Fermentierung
Milchsäure
produzieren.
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Wie
hierin verwendet, meint der Begriff „therapeutisch effektive Menge" eine Menge, die
zu dem gewünschten
therapeutischen Effekt führen
wird.
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Der
gewünschte
therapeutische Effekt ist die Prophylaxe und/oder Behandlung von
Infektionen des Urogenitaltraktes, wie z. B. bakterielle Vaginose
oder jede andere bakterielle Störung
in der Vagina.
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Wie
hierin verwendet, meint der Begriff „isolierter Bakterienstamm", dass der Stamm
in vitro in einer diesen Stamm umfassenden Kultur kultiviert sein
könnte.
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Wie
hierin verwendet, meint der Begriff „Bakterienmuster" ein Bakterien umfassendes
Muster. Das Muster kann zum Beispiel vaginales(r) Fluid/Ausfluss
sein.
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Wie
hierin verwendet, meint der Begriff „normale, gesunde vaginale
Mikroorganismenflora",
dass die Frau keine vaginalen Beschwerden hat und die Gram-Färbung des
vaginalen Musters eine Gesamtpunktzahl von 0–3 gemäß dem von Nugent et al (siehe
Beispiel 1) dargestellten Verfahren aufweist.
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Wie
hierin verwendet, meint der Begriff „gestörte vaginale Mikroorganismenflora", dass die Frau einige vaginale
Beschwerden hat, wie z. B. erhöhten
vaginalen Ausfluss und/oder „fischartigen" Vaginalgeruch. Darüber hinaus
weist die Gram-Färbung
des vaginalen Musters eine Gesamtpunktzahl von mindestens 4, im
Besonderen ≥7,
gemäß dem von
Nugent et al (siehe Beispiel 1) dargestellten Verfahren auf.
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Wie
hierin verwendet, meint der Begriff „geeignetes Nährmedium" ein Medium, wie
z. B. eine LAB-Brühe
oder MRS-Brühe,
in der die Bakterien kultiviert werden können.
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Wie
hierin verwendet, meint der Begriff „Hygiene-Artikel" Tampons (sowohl
digitale Tampons als auch Tampons mit einem Applikator), Damenbinden,
Slipeinlagen, Windeln, Inkontinenzschutz und Ähnliches.
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Die
vorliegende Erfindung offenbart neuartige isolierte Bakterienstämme von
Milchsäure
produzierenden Bakterien der Gattungen Lactobacillus und Pediococcus,
die die Fähigkeit
besitzen, nach vaginaler Verabreichung von mindestens einem der
Bakterienstämme
selbst während
der Menstrualblutung in einer menschlichen Vagina zu kolonisieren
und sich zu etablieren. Die Bakterien werden als etabliert betrachtet, wenn
die Bakterien nach mindestens zwei Menstrualzyklen nach der Verabreichung
noch in der Vagina vorhanden sind.
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Die
Bakterienstämme
wurden gemäß der Budapester
Vereinbarung an der BCCM/LMG (Belgische koordinierte Mikroorganismensammlung/Laboratorium
voor Microbiloligie-Bacterienverzammeling, Universiteit Gent) in
Belgien am 14. Juni 2001 hinterlegt und umfassen die Stämme von
Lactobacillus gasseri, bezeichnet durch den Anmelder als LN 40,
hinterlegt unter der Nummer LMG P-20560, den Stamm des Lactobacillus
casei subsp. rhamnosus, bezeichnet durch den Anmelder als LN 113,
hinterlegt unter der Nummer LMG P-20562, den Stamm des Lactobacillus
fermentum, bezeichnet durch den Anmelder als LN 99, hinterlegt unter
der Nummer LMG P-20561, den Stamm des Lactobacillus crispatus, bezeichnet
durch den Anmelder als LN 01, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20558
und den Stamm des Pediococcus acidilactici, bezeichnet durch den
Anmelder als LN 23, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20559, oder
Varianten davon mit im Wesentlichen entsprechenden phänotypischen
und/oder genotypischen Eigenschaften.
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Darüber hinaus
beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung
eines Bakterienstammes der Gattung Lactobacillus oder Pediococcus,
der die Fähigkeit
besitzt, in einer menschlichen Vagina zu kolonisieren und sich zu
etablieren, wobei
- (a) ein Bakterienmuster,
wie z. B. ein vaginales Fluid, aus dem Vaginaltrakt einer Frau mit
einer normalen, gesunden vaginalen Mikroorganismenflora entnommen
wird,
- (b) Milchsäure
produzierende Bakterien aus dem vaginalen Muster aus Schritt (a)
ausgewählt
werden,
- (c) die Milchsäure
produzierenden Bakterien aus Schritt (b) in vitro in einem geeigneten
Nährmedium
reinkultiviert werden, was zumindest einen isolierten Bakterienstamm
liefert,
- (d) mindestens ein reinkultivierter Bakterienstamm aus Schritt
(c) und/oder eine Kombination aus mindestens zwei Bakterienstämmen aus
Schritt (c) bewertet wird bezüglich
ihrer Fähigkeit,
nach vaginaler Verabreichung des Bakterienstammes an eine Frau während ihrer
Menstrualblutung in der Vagina zu kolonisieren und sich darin zu
etablieren, wobei die Frau eine gestörte vaginale Mikroorganismenflora
aufweist und der Bakterienstamm bzw. die Bakterienstämme als
etabliert betrachtet wird bzw. werden, wenn der Bakterienstamm bzw.
die Bakterienstämme
nach mindestens zwei Menstrualzyklen nach Verabreichung noch in
der Vagina vorhanden ist/sind, und
- e) mindestens ein Bakterienstamm aus Schritt (d) ausgewählt wird,
der die Fähigkeit
zeigt, in der Vagina zu kolonisieren und sich darin zu etablieren.
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Vorzugsweise
wird mindestens ein reinkultivierter Bakterienstamm aus Schritt
(c) und/oder eine Kombination aus mindestens zwei Bakterienstämmen aus
Schritt (c) lyophilisiert.
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Eine
notwendige Menge an Bakterien sollte nach der Lyophilisierung lebensfähig sein
und die Lebensfähigkeit
nach der Lagerung bewahren. Darüber
hinaus sollte eine notwendige Menge an lyophilisierten Bakterien,
die zum Beispiel in Zusammensetzungen und/oder Hygiene-Artikeln
für den
Handel formuliert sind, die Lebensfähigkeit nach Lagerung bei Zimmertemperatur
bewahren.
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Darüber hinaus
wird/werden dieser/diese Stamm/Stämme vorzugsweise bewertet und
ausgewählt
bezüglich
der Stabilität
der bakteriellen Lebensfähigkeit
nach der Lyophilisierung und Lebensfähigkeit der lyophilisierten
Bakterien über
lange Aufbewahrungszeiten hinweg, wobei die bakterielle Lebensfähigkeit
als stabil betrachtet wird, wenn mindestens 40% der Bakterien nach
Lyophilisierung und einer Lagerung der lyophilisierten Bakterien
während
mindestens 12 Monaten bei –18°C eine bewahrte
Lebensfähigkeit
besitzen.
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Darüber hinaus
sollte mindestens 1% der in einer Art Aufbewahrungsmatrix, wie z.
B. ein Öl,
und in einer Zusammensetzung und/oder einem Hygiene-Artikel eingeschlossenen
formulierten lyophilisierten Bakterien die Lebensfähigkeit
für mindestens
12 Monate bei Zimmertemperatur bewahren.
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Darüber hinaus
ist die Stabilität
des genetischen Profils der Bakterien nach wiederholter Kultivierung in
Massenproduktion und während
der Herstellungsvorgänge
für zum
Beispiel Zusammensetzungen und Hygiene-Artikel eine wichtige Eigenschaft. Die
Bakterien sollten vorzugsweise ihr genetisches Profil nach mindestens
10 wiederholten Kultivierungen bewahren. Darüber hinaus sollten die Bakterien
genetische Stabilität
in vivo über
längere
Zeiträume
nach der Verabreichung zeigen, wie z. B. mindestens 12 Monate. Daher
wird/werden dieser/diese Stamm/Stämme vorzugsweise bewertet und
ausgewählt
bezüglich
der genetischen Stabilität in
vivo nach vaginaler Verabreichung, wobei die Bakterien als genetisch
stabil betrachtet werden, wenn ihr genetisches Profil in vivo für mindestens
12 Monate bewahrt ist. Außerdem
sind das Bakterienwachstum und die Generationszeit entscheidend.
Vaginal verabreichte lyophilisierte Bakterien sollten innerhalb
von mindestens 4 Stunden nach der Verabreichung zu wachsen beginnen.
Die Generationszeit sollte weniger als 2 h Stunden betragen.
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Die
vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls einen Bakterienstamm der
Gattung Lactobacillus oder Pediococcus, der die Fähigkeit
besitzt, während
der Menstrualblutung in einer menschlichen Vagina zu kolonisieren
und sich zu etablieren, wobei der Stamm gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren
isoliert werden kann. Solche Bakterienstämme sind vorzugsweise die Stämme des
Lactobacillus gasseri, bezeichnet durch den Anmelder als LN 40,
hinterlegt unter der Nummer LMG P-20560, der Stamm des Lactobacillus
casei subsp rhamnosus, bezeichnet durch den Anmelder als LN 113,
hinterlegt unter der Nummer LMG P-20562, der Stamm des Lactobacillus
fermentum, bezeichnet durch den Anmelder als LN 99, hinterlegt unter
der Nummer LMG P-20561, der Stamm des Lactobacillus crispatus, bezeichnet
durch den Anmelder als LN 01, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20558,
und der Stamm des Pediococcus acidilactici, bezeichnet durch den
Anmelder als LN 23, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20559, oder
Varianten davon mit im Wesentlichen entsprechenden phänotypischen
und/oder genotypischen Eigenschaften.
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Isolierung und Bewertung von
Lactobacillus- und Pediococcusstämmen
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Bakterienstämme der
Gattungen Lactobacillus und Pedicoccus, die die Fähigkeit
besitzen, in einer menschlichen Vagina zu kolonisieren und sich
zu etablieren, wurden gemäß den folgenden
Schritten isoliert:
- – Entnahme eines vaginalen
Fluids aus dem Vaginaltrakt einer Frau mit einer normalen, gesunden
vaginalen Mikroorganismenflora,
- – Auswahl
der Milchsäure
produzierenden Bakterien (ungefähr
25 verschiedene Stämme)
aus dem vaginalen Fluid durch Platzieren eines Abstrichs des Fluids
auf ein MRS-Agar, das für
Milchsäure
produzierende Bakterien (einzelne Kolonien wurden ausgewählt und
auf eine frische MRS-Agarplatte
gegeben, um die Reinheit zu kontrollieren) ausgewählt wurde,
- – Reinkultur
der Milchsäure
produzierenden Bakterien in vitro in einem geeigneten Nährmedium
und unter geeigneten Bedingungen (pH-Wert, Temperatur etc.), was
isolierte Bakterienstämme
liefert, und
- – anschließende Bewertung
der reinkultivierten Bakterienstämme
bezüglich
ihrer Fähigkeit,
nach vaginaler Verabreichung der Bakterienstämme an eine Frau während ihrer
Menstrualblutung zu kolonisieren und sich in der Vagina zu etablieren,
wobei die Frau eine gestörte
vaginale Mikroorganismenflora aufweist.
-
LN
40 wurde in LAB-Brühe
(pH-Wert von ungefähr
6,5) reinkultiviert, mikroaerophil bei ungefähr 37°C.
-
LN
113 wurde in MRS-Brühe
(pH-Wert von ungefähr
6,5) reinkultiviert, mikroaerophil bei ungefähr 37°C.
-
LN
99 wurde in LAB-Brühe
(pH-Wert von ungefähr
6,5) reinkultiviert, mikroaerophil bei ungefähr 37°C.
-
LN
01 wurde in MRS-Brühe
(pH-Wert von ungefähr
6,5) reinkultiviert, anaerob bei ungefähr 37°C.
-
LN
23 wurde in MRS-Brühe
(pH-Wert von ungefähr
6,5) reinkultiviert, mikroaerophil bei ungefähr 37°C.
-
Die
reinkultivierten Bakterienstämme
wurden zunächst
bezüglich
ihrer Generationszeit bewertet. Die Bakterienstämme (ungefähr 15 verschiedene Stämme), die
eine Generationszeit <30
Minuten zeigten, wurden ausgewählt.
Diese ausgewählten
Stämme
wurden auf der Basis ihrer Fähigkeit,
das Wachstum einiger Mikroorganismen in vitro zu hemmen, gescreent
(Daten nicht dargestellt). Zunächst
wurde die Fähigkeit
bewertet, das Wachstum von Staphilococcus epidemidis (zwei verschiedene
Stämme),
Enterococcus cloace, Eschericha coli, Serratia marcesus, Micrococcus
lysodeicticus und Candida albicans zu hemmen. 8 verschiedene Bakterienstämme (7 Stämme der
Gattung Lactobacillus und 1 Stamm der Gattung Pediococcus) zeigten
diese Fähigkeit
und wurden deshalb ausgewählt.
Diese 8 Stämme
wurden ferner bezüglich
ihrer Fähigkeit,
das Wachstum der uropathogenen Gardnerella vaginalis zu hemmen,
bewertet. Die besten Stämme
(d. h. die Stämme
mit dem besten Potential zum Kolonisieren einer gestörten vaginalen
Mikroorganismenflora) waren LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23.
-
Diese
Stämme
wurden ferner mithilfe klinischer Studien bewertet, wobei die Bakterien
als in der Vagina etabliert betrachtet werden, wenn die Bakterien
nach mindestens zwei Menstrualzyklen nach Verabreichung noch in
der Vagina vorhanden sind (die Verabreichung der Bakterien begann
während
der ersten Menstrualblutung). Die Bakterienstämme (LN 40, LN 113, LN 99,
LN 01 und LN 23), die die Fähigkeit
zeigten, in der Vagina zu kolonisieren und sich zu etablieren, wurden
ausgewählt.
-
Des
Weiteren wurden die Stabilität
der bakteriellen Lebensfähigkeit
nach Lyophilisierung und die Lebensfähigkeit der lyophilisierten
Bakterien über
lange Aufbewahrungszeiten hinweg (Haltbarkeit), Bewahrung des genetischen
Profils nach wiederholter Kultivierung und in vivo und der bakterielle
Wachstumsprozess bewertet.
-
Beispiel 1: Kolonisierung und Etablierung
von Milchsäure
produzierenden Bakterien nach vaginaler Verabreichung
-
15
BV-Patientinnen (Frauen, bei denen bakterielle Vaginose diagnostiziert
worden ist) wurden untersucht. Alle 15 Patientinnen wurden 3 Tage
mit Clindamycin-Ovula (Dalacin® 2% Ovula, von Pharmacia)
behandelt. Danach wurde die Behandlung mit einem doppelblinden Placebo
kontrollierten Teil fortgesetzt, in dem 6 Patientinnen während des
ersten Menstrualzyklus nach der Behandlung mit Antibiotika Tampons
verwendeten, die ungefähr
103 cfu lyophilisierte Bakterien der Stämme LN 01,
LN 23, LN 99, LN 113 und LN 40 umfassen. Die anderen 9 Patientinnen
verwendeten herkömmliche
Tampons ohne Milchsäure
produzierende Bakterien.
-
Während der
zweiten Monatsblutung verwendeten alle 15 Patientinnen herkömmliche
Tampons ohne Milchsäure
produzierende Bakterien und ein paar Tage nach der Blutung wurde
ein vaginales Muster genommen.
-
Die
vaginalen Muster wurden gram-gefärbt.
In dem standardisierten Gram-Färbungsverfahren,
dargestellt von Nugent et al, wird das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein
bestimmter bakterieller Morphotypen analysiert. Die Morphotypen
sind große,
grampositive Bazillen des Lactobacillus-Morphotyps; kleinere gramvariable
Bazillen, Gardnerella-Morphotyp genannt, und gekrümmte Stäbchen. Die
in dem vaginalen Fluid vorhandenen Organismen werden quantifiziert
und in eine Punktzahl übertragen
(siehe Tabelle 1). Tabelle 1
Code | |
Lactobacillus Morphotyp | Gardnerella
und Bakteroiden Morphotypen | Gekrümmte gramvariable Stäbchen | Punktzahl |
4+ | 0 | 0 | 0 |
3+ | 1+ | 1+
or 2+ | 1 |
2+ | 2+ | 3+
or 4+ | 2 |
1+ | 3+ | | 3 |
0 | 4+ | | 4 |
-
Die
Codes 0 bis 4+ basieren auf der durchschnittlichen Anzahl an Organismen
mit dem Morphotyp pro Ölimmersionsfeld;
1+, <1 vorhanden,
2+, 1–4
vorhanden, 3+, 5–30
vorhanden; 4+, ≥30
vorhanden. Eine Gesamtpunktzahl wird durch Summieren der Punktzahlen
für alle
drei Morphotypen erhalten. Die Gesamtpunktzahl wird folgendermaßen interpretiert:
0–3, normal;
4–6, mittel;
und ≥7, BV. Tabelle 2
Patienten
nummer | Gram-Färbung vor
Untersuchungsbeginn | Tampons
(L = Milchsäure
produzierende Bakterien) | Gram-Färbung nach
der zweiten Menstrualblutung |
1 | 7 | L | 0 |
2 | 8 | L | 0 |
3 | 9 | | 7 |
4 | 5 | | 4 |
5 | 10 | | 0 |
6 | 8 | | 4 |
7 | 8 | L | 0 |
8 | 9 | | 4 |
9 | 4 | L | 0 |
10 | 8 | | 4 |
11 | 8 | | 4 |
12 | 8 | | 0 |
13 | 8 | L | 1 |
14 | 0 | | 5 |
15 | 9 | L | 0 |
-
Bei
den 6 Patientinnen, die den Tampon mit den Milchsäure produzierenden
Bakterien verwendet haben, wurde keine bakterielle Vaginose festgestellt.
Darüber
hinaus zeigen die Ergebnisse, dass die Milchsäure produzierenden Bakterien
noch nach dem zweiten Menstrualzyklus in der Vagina vorhanden waren.
-
Darüber hinaus
zeigen diese Ergebnisse, dass eine relativ kleine Anzahl verabreichter
Bakterien (ungefähr
103 cfu) für eine vollständige vaginale
Kolonisierung und Etablierung der Bakterienstämme während der Menstrualblutung
gemäß der vorliegenden
Erfindung ausreichend ist.
-
Des
Weiteren weisen die Bakterienstämme
gemäß der vorliegenden
Erfindung ausgezeichnete adhäsive
Eigenschaften an den vaginalen Schleimmembranen auf.
-
Beispiel 2: Kolonisierung und Etablierung
von Milchsäure
produzierenden Bakterien nach vaginaler Verabreichung
-
Vier
gesunde Frauen ohne vaginale Beschwerden verwendeten während ihrer
monatlichen Menstrualblutung über
einen Zeitraum von 12–18
Monaten Tampons, die ungefähr
103 cfu lyophilisierte Bakterien der Stämme LN 01,
LN 23, LN 99, LN 113 und LN 40 umfassen.
-
Von
jeder Frau wurden nach dem Testzeitraum vaginale Muster bewertet.
Die in den Mustern gefundenen Lactobacillus- und Pediococcusstämme wurden
mithilfe von RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – etwa zufällig vervielfältigte polymorphe
DNA) identifiziert, wie in Beispiel 10 beschrieben.
-
LN
01 und LN 113 wurden in zwei der vaginalen Muster dieser Frauen
identifiziert.
-
LN
40 wurde in einem der vaginalen Muster dieser Frauen identifiziert.
-
LN
23 und LN 99 wurden in keinem der vaginalen Muster dieser Frauen
identifiziert.
-
Eine
Erklärung
für diese
Ergebnisse könnte
darin liegen, dass, wenn der Bakterienpool an eine Frau verabreicht
wird, die eine gesunde Vaginalflora mit einem normalen vaginalen
pH-Wert aufweist, LN 23 im Wesentlichen nicht wachsen wird. Wenn
der Bakterienpool jedoch an eine Frau verabreicht wird, die eine
gestörte vaginale
Mikroorganismenflora aufweist, dann wird sich LN 23 zunächst etablieren
und eine günstige
Umgebung bereitstellen, in der die anderen Bakterienstämme (LN
01, LN 113, LN 40 und LN 99) wachsen können.
-
Es
ist zu beachten, dass einzelne Unterschiede bezüglich der Eignung eines spezifischen
Stammes und/oder spezifischen Kombinationen aus Stämmen bestehen,
sich in der Vagina einer Frau zu etablieren und dort zu wachsen.
-
Mindestens
einer der Bakterienstämme
gemäß der Erfindung
wurde in jedem vaginalen Muster identifiziert.
-
Beispiel 3: Stabilität der Lebensfähigkeit
nach der Lyophilisierung und über
lange Aufbewahrungszeiten hinweg (Haltbarkeit) der Bakterienstämme LN 40,
LN 113, LN 99 und LN 23
-
Die
lyophilisierten Bakterienstämme
LN 40, LN 113, LN 99 und LN 23 wurden bezüglich ihrer Stabilität der Lebensfähigkeit über längere Aufbewahrungszeiten
hinweg (d. h. Haltbarkeit) bei ungefähr –18°C bewertet. Tabelle 3
Zeit
nach Lyophilisierung [Monate] | Lebens fähige Bakterien
[cfu/g] |
| LN
40 | LN
113 | LN
99 | LN
23 | LN
01 |
0 | 83 × 109 | 224 × 1010 | 33 × 109 | 83 × 109
109 | 20 × 109 |
12 | 47 × 109 (~57%) | 192 × 1010 (~86%) | 14 × 109 (~42%) | 272 × 109(~94%) | 19 × 109 (~95%) |
78 | 22 × 109 (~27%) | 46 × 109 (~21%) | 6 × 109 (~18%) | 155 × 109 (~53%) | 2 × 109 (~10%) |
-
Die
in Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass mindestens 40%
der Bakterien noch nach 12 Monaten bei –18°C lebensfähig sind. Darüber hinaus
sind mindestens ungefähr
10–20%
der Bakterien noch nach 78 Monaten bei –18°C lebensfähig.
-
Darüber hinaus
wurden diese Bakterien auch gemäß API 50CH
analysiert und die aus dieser Analyse erhaltenen Ergebnisse zeigen,
dass die Stämme
LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01 ihr genetisches Profil bei
Lagerung in lyophilisierter Form bei –18°C für mindestens 78 Monate bewahren.
-
Die
lyophilisierten Bakterien (LN 40, LN 113, LN 99 und LN 23) wurden
in Akosoft
® 36
(von Karlshamns AB) aufgelöst
und bezüglich
ihrer Stabilität
der Lebensfähigkeit über längere Aufbewahrungszeiten
hinweg (d. h. Haltbarkeit) bei ungefähr 8°C bzw. 22°C bewertet. Tabelle 4
Zeit
nach der Herstellung (Woche/Monate) | Lebensfähige Bakterien
(cfu/g) |
| +8°C | +22°C |
0 | 3,5 × 1010 | 3,5 × 1010 |
1
Woche | 2,7 × 1010 (~75%) | 1,9 × 1010 (~53%) |
1 | 2,5 × 1010 (~71%) | 1,3 × 1010(~37%) |
3,5 | 2,0 × 1010 (~55%) | 6 × 109 (~17%) |
6 | 2,4 × 1010 (~68%) | 3,9 × 109 (~11%) |
9 | 1,8 × 1010 (~50%) | 1,0 × 109 (~2,8%) |
12 | 1,7 × 1010 (~49%) | 1,3 × 109 (~3,7%) |
-
Die
in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass ungefähr 45–50% der
Bakterien noch nach 12 Monaten bei 8°C lebensfähig sind. Darüber hinaus
sind ungefähr
4% der Bakterien bei Zimmertemperatur, d. h. 22°C, noch nach 12 Monaten lebensfähig.
-
Ähnliche
Ergebnisse wurden für
einen lyophilisierten Bakterienpool erhalten, der alle Bakterienstämme gemäß der Erfindung,
einschließlich
LN 01, umfasst.
-
Beispiel 4: Bewahrung des genetischen
Profils nach wiederholter Kultivierung der Bakterienstämme LN 40,
LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23
-
Die
Bakterienstämme
(LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23) wurden 10 mal wiederholt
kultiviert und anschließend
mit API 50CH bewertet. Die Fermentierungsmuster jedes Bakterienstammes
(siehe Beispiel 9) waren nach der wiederholten Kultivierung bewahrt.
Daher zeigen die Ergebnisse, dass die Bakterienstämme ihr
genetisches Profil nach wiederholter Kultivierung bewahren.
-
Beispiel 5: Bakterienwachstumsprozess
für Bakterienstämme LN 40,
LN 99, LN 113, LN 23 und LN 01
-
Um
den gewünschten
therapeutischen Effekt bereitzustellen, sollten vaginal verabreichte
lyophilisierte Bakterien innerhalb von mindestens 4 Stunden nach
der Verabreichung zu wachsen beginnen.
-
Das
Absorptionsvermögen
(optische Dichte, OD) wurde für
lyophilisierte Bakterien (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01),
die der sterilisierten MRS-Brühe
zugegeben wurden, bei 620 nm gemessen. Zwei Arten von Experimenten
(siehe 1a und 1b) wurden
durchgeführt:
0,01 g lyophilisierte Bakterien wurden zu 3 ml MRS-Brühe zugegeben,
und 100 pl dieser Dispersion wurden mit 3 ml zusätzlicher MRS-Brühe verdünnt, und
lyophilisierte Bakterien wurden zu MRS-Brühe zugegeben in einer Menge,
die ein Absorptionsvermögen von
ungefähr
0,100 zur Folge hat.
-
Die
die vorstehenden Bakteriendispersionen enthaltenden Küvetten wurden
bei 37°C
gelagert und das Absorptionsvermögen
wurde 10,5 h lang alle 15 min gemessen.
-
Wie
in 1a und 1b deutlich
wird, ist das Bakterienwachstum für jeden Bakterienstamm (LN
40, LN 113, LN 99, LN 23 bzw. LN 01) rasant und alle Bakterienstämme beginnen,
innerhalb von mindestens 2 Stunden zu wachsen.
-
Darüber hinaus
beträgt
die Generationszeit jedes Bakterienstammes ungefähr 20–25 min. Daher wachsen die
Bakterien schneller als Uropathogene, was im Hinblick auf die hierin
beschriebene Verwendung der Bakterien sehr günstig ist.
-
Außerdem ist
in der Technik bekannt, dass eine Kombination aus verschiedenen
Bakterien die Generationszeit eines Bakteriums verkürzt, was
ein schnelleres Bakterienwachstum zur Folge hat. Darüber hinaus wird
bevorzugt, eine Kombination aus verschiedenen Bakterienarten zu
verwenden, da verschiedene Arten von Milchsäure produzierenden Bakterien
verschiedene Fermentierungsmuster und -eigenschaften aufweisen.
-
Es
sollte beachtet werden, dass eine Kombination aus gefriergetrockneten
LN 40, LN 99, LN 113, LN 23 und LN 01 innerhalb von 1,5 h zu wachsen
beginnen, somit mindestens 25% schneller als die für jeden Bakterienstamm
benötigte
Zeit.
-
Beispiel 6: Fähigkeit, das Wachstum von Uropathogenen
zu hemmen
-
Der
Zweck dieses Beispiels liegt darin, zu zeigen, dass ein Bakterienpool
aus LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01 in Bezug auf das Hemmen
des Wachstums von Uropathogenen sogar noch effektiver ist als jeder
der Bakterienstämme
für sich
betrachtet.
-
Die
zu testenden Milchsäure
produzierenden Bakterien wurden einem geschmolzenen, sterilen Stammagarmedium,
wie z. B. einem MRS-Agar, zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde
in eine Petrischale (∅ 90 mm) 1 gegeben und die Schale
wurde auf die Art und Weise geneigt, dass das Agargemisch 2 an einer Seite
der Schale lediglich ungefähr
1 mm vom Boden der Schale und auf der gegenüberliegenden Seite der Schale
ungefähr
11 mm erreicht, wie in 3 dargestellt.
-
Das
Uropathogen wurde homogen einem geschmolzenen, sterilen Stammagarmedium,
wie z. B. einem VRB(Violett Rot Galle)-Agar, zugegeben. Das Gemisch
wurde auf den vorstehend erwähnten
verfestigten Agar gegeben, umfassend die Milchsäure produzierenden Bakterien,
wie in 3 dargestellt, und es wurde ebenfalls zugelassen,
dass sich dieses Agargemisch 3 verfestigt.
-
Die
Milchsäure
produzierenden Bakterien und das Uropathogen wurden anschließend für ungefähr 24 h
bei 37°C
bebrütet.
Zwei klare Bereiche 4 und 5 waren anschließend in
der vorstehend erwähnten
Schale 1 sichtbar, wie in 4 dargestellt.
In dem ersten Bereich 4 konnte das Uropathogen wachsen.
In dem zweiten Bereich 5 hatten die Milchsäure produzierenden
Bakterien das Wachstum des Uropathogens gehemmt.
-
Die
Fähigkeit
der Milchsäure
produzierenden Bakterien, das Uropathogen zu hemmen, kann quantifiziert
werden, indem die Länge
L des zweiten Bereiches 5, d. h. der gehemmte Wachstumsbereich 5,
gemessen wird.
-
Ein
Enteropathogen E coli (EPEC)-Stamm wurde in diesem Experiment verwendet.
-
Die
Länge L
des gehemmten Wachstumsbereichs lag für jeden der Bakterienstämme LN 40,
LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23 im Bereich von 8 bis 22 mm.
-
Jedoch
wies der LN 40, LN 113, 10 LN 99, LN 01 und LN 23 umfassende Bakterienpool
eine Länge
L des gehemmten Wachstumsbereichs von 32–34 mm auf.
-
Daher
ist ein alle Bakterienstämme
LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23 umfassender Bakterienpool
in Bezug auf das Hemmen des Wachstum von Uropathogenen, wie z. B.
E coli, sogar noch effektiver als jeder der Bakterienstämme für sich betrachtet.
Somit wird bevorzugt, eine Kombination der Bakterienstämme gemäß der Erfindung
zu verwenden.
-
Charakterisierung
der Bakterienstämme
LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23
-
Die
Bakterien wurden sowohl durch phänotypische
als auch durch genotypische Verfahren charakterisiert.
-
Beispiel 7: Mikrobiologische Charakterisierung
der Bakterienstämme
LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23
-
Die
Stämme
(LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01) wurden mit Bezug auf Zellmorphologie, Gram-Färbung, Oxidase-
und Katalasereaktion charakterisiert.
-
Der
Stamm LN 40 umfasste grampositive, katalasenegative, oxidasenegative,
nichtstäbchenbildende, stäbchenförmige (ungefähr 0,9 μm × 3–10 μm) Bakterien,
die als einzelne Zellen oder paarweise auftreten.
-
Der
Stamm LN 99 umfasste grampositive, katalasenegative, oxidasenegative,
nichtstäbchenbildende, stäbchenförmige (ungefähr 0,9 μm × 1,5–2,0 μm) Bakterien,
die als einzelne Zellen oder paarweise auftreten.
-
Der
Stamm LN 113 umfasste grampositive, katalasenegative, oxidasenegative,
nichtstäbchenbildende,
stäbchenförmige (ungefähr 0,9 μm × 2 μm) Bakterien,
die als einzelne Zellen oder paarweise auftreten.
-
Der
Stamm LN 01 umfasste grampositive, katalasenegative, oxidasenegative,
nichtstäbchenbildende, gerade
oder leicht gekrümmte
stäbchenförmige (ungefähr 0,8–1,6 μm × 2,3–11 μm) Bakterien,
die als einzelne Zellen oder in Ketten auftreten.
-
Der
Stamm LN 23 umfasste grampositive, katalasenegative, oxidasenegative,
nichtstäbchenbildende, stäbchenförmige (0
ungefähr
1 μm) Bakterien,
die als einzelne Zellen oder paarweise auftreten.
-
Beispiel 8: SDS-PAGE und Clusteranalyse
der Bakterienstämme
LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23
-
Die
Kulturen wuchsen auf einem MRS-Agar (Oxoid CM361) für 24 h bei
37°C unter
anaeroben Bedingungen. Die Herstellung der Zellextrakte und die
Proteingelelektrophorese (SDS-PAGE) wurden ausgeführt bei
BCCM'''/LMG in Übereinstimmung mit dem Protokoll,
das etabliert wurde von der Research Group of Laboratory for Microbiology,
University Ghent (Pot, B, Vandamme, P, Kersters, K, Analysis of
electrophoretic whole-organism Protein fingerprints, Chemical Methods
in Prokaryotic Systematics, M, Goodfellow, and A G, O'Donell (eds), J Wiley & Sons, Chichester
(1994)) (Forschungsgruppe des Labors für Mikrobiologie, Universität Gent (Pot,
B, Vandamme, P, Kersters, K, Analyse von elektrophoretischen Proteinfingerabdrücken des
gesamten Organismus, Chemische Verfahren in Prokaryotischen Systematiken,
M, Goodfellow und A G, O'Donell (eds),
J Wiley & Sons,
Chichester (1994))).
-
Die
normalisierten und digitalisierten Proteinmuster wurden numerisch
analysiert und mit den Referenzprofilen in der BCCM-Datenbank (Dezember
1999) für
LN 40, LN 113, LN 99 und LN 23 in Cluster verpackt. LN 01 wurde
analysiert und mit den Bezugsprofilen in der CCUG-Datenbank (Januar
2001) in Cluster verpackt.
-
Es
wurde herausgefunden, dass der Stamm LN 40 zur Art des Lactobacillus
johnsonii oder des Lactobacillus gasseri gehört.
-
Es
wurde herausgefunden, dass LN 99 zur Art des Lactobacillus fermentum
gehört.
-
Es
wurde herausgefunden, dass der Stamm LN 113 zur Art des Lactobacillus
casei subsp rhamnosus gehört.
-
Es
wurde herausgefunden, dass der Stamm LN 23 zur Art des Pediococcus
acidilactici gehört.
-
Es
wurde herausgefunden, dass der Stamm LN 01 zur Art des Lactobacillus
crispatus gehört.
-
Beispiel 9: Charakterisierung der Bakterienstämme LN 40,
LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01 unter Verwendung von API 50CH und
rapid ID32 strep
-
Die
Fähigkeit
der Stämme
(LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01), verschiedene Kohlehydrate
zu fermentieren, ist in Tabelle 5 dargestellt. Die Tests wurden
mithilfe von API 50CH und API rapid ID32 Strep bei 37°C gemäß Herstelleranweisungen
durchgeführt.
Für die
Ergebnisse, die sich zwischen API 50CH API und rapid ID32strep unterscheiden,
wird das API 50CH-Ergebnis als zuverlässiger betrachtet.
-
Die
entstandenen Fermentierungsmuster wurden in der CCUG-Datenbank gesucht.
Die höchsten
Datenbanktreffer, die für
jeden Stamm erhalten wurden, bestätigten die Ergebnisse aus der
vorstehend beschriebenen Analyse (SDS-PAGE/Clusteranalyse) in Bezug
darauf, zu welcher Bakterienart der jeweilige Stamm gehört.
-
Darüber hinaus
bestätigte
die Reaktion mit rhamnose, dass der Stamm LN 113 zur Art des Lactobacillus
casei subsp rhamnosus gehört.
-
Jedoch
zeigten Vergleiche zwischen LN 40, LN 99, LN 113, LN 23 bzw. LN
01 und Stammarten jeder Bakterienart (CCUG 31451T,
CCUG 30138T, CCUG 21452T,
CCUG 32235T bzw. CCUG 44117T)
wesentliche Unterschiede für
alle Stämme
(LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01) in Bezug auf Fermentierungsmuster.
-
In
Tabelle 5 beschreibt 1, dass keine Reaktion auftrat, 2 das Auftreten
einer unbestimmten Reaktion, 3 das Auftreten einer Reaktion, 4 das
Auftreten einer starken Reaktion und 5 das Auftreten einer sehr
starken Reaktion. Tabelle 5
| LN
40 | LN
99 | LN
113 | LN
23 | LN
01 |
API
50CH | | | | | |
|
Kontrolle | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Glyzerin | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Erythritol | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
D-Arabinose | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
L-Arabinose | 1 | 1 | 1 | 5 | 1 |
Ribose | 1 | 5 | 5 | 5 | 1 |
D-Xylose | 1 | 5 | 1 | 5 | 1 |
L-Xylose | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Adonitol | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
0-Methyl-D-Xylosid | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
|
Galaktose | 4 | 5 | 5 | 5 | 3 |
Glukose | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
Fruktose | 5 | 4 | 5 | 5 | 5 |
Mannose | 4 | 3 | 5 | 5 | 4 |
Sorbose | 1 | 1 | 5 | 1 | 1 |
Rhamnose | 1 | 1 | 3 | 1 | 1 |
Dulcitol | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Inositol | 1 | 1 | 3 | 1 | 1 |
Mannitol | 1 | 1 | 5 | 1 | 1 |
Sorbitol | 1 | 1 | 5 | 1 | 1 |
|
a-Methyl-D-Mannosid | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
a-Methyl-D-Glukosid | 1 | 1 | 5 | 1 | 1 |
N-Acetyl-Glukosamin | 5 | 1 | 4 | 4 | 3 |
Amygdalin | 3 | 1 | 4 | 2 | 3 |
Arbutin | 1 | 1 | 4 | 4 | 3 |
Aesculin | 5 | 1 | 5 | 5 | 3 |
Salicin | 2 | 1 | 4 | 4 | 3 |
Cellobiose | 5 | 1 | 5 | 5 | 3 |
Maltose | 5 | 4 | 3 | 1 | 5 |
Laktose | 3 | 4 | 5 | 1 | 3 |
|
Melibiose | 5 | 4 | 1 | 1 | 1 |
Saccharose | 5 | 4 | 3 | 1 | 5 |
|
Trehalose | 1 | 4 | 5 | 1 | 3 |
Inulin | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Melezitose | 1 | 1 | 5 | 1 | 1 |
D-Raffinose | 5 | 4 | 1 | 1 | 3 |
Stärke | 1 | 1 | 1 | 1 | 4 |
Glykogen | 1 | 1 | 1 | 1 | 4 |
Xylitol | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
P-Gentiobiose | 4 | 1 | 3 | 3 | 2 |
|
D-Turanose | 1 | 1 | 5 | 1 | 3 |
D-Lyxose | 1 | 1 | 3 | 1 | 1 |
D-Tagarose | 2 | 1 | 5 | 4 | 1 |
D-Fukose | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
L-Fukose | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
D-Arabitol | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
L-Arabitol | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Glukonat | 1 | 3 | 2 | 1 | 1 |
2-Keto-Glukonat | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
5-Keto-Glukonat | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
|
API
rapid ID32s | | | | | |
|
Arginindihydrolase | 1 | 5 | 1 | 5 | 1 |
P-Glukosidase | 5 | 1 | 5 | 3 | 1 |
3-Galaktosidase
(1) | 1 | 5 | 1 | 1 | 5 |
|
P-Glukuronidase | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
a-Galaktosidase | 5 | 3 | 1 | 1 | 1 |
Alkalinphosphatase | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 |
|
Ribose | 1 | 5 | 5 | 1 | 1 |
Mannitol | 1 | 1 | 5 | 1 | 1 |
Sorbitol | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
|
Laktose | 1 | 5 | 1 | 1 | 1 |
Trehalose | 1 | 5 | 5 | 1 | 3 |
Raffinose | 5 | 1 | 1 | 1 | 2 |
|
Acetoin | 5 | 5 | 5 | 5 | 1 |
Alanin-Phenylalanin-Prolin- | 5 | 1 | 4 | 3 | 5 |
P-Galaktosidase
(2) | 1 | 5 | 5 | 1 | 5 |
|
Pyroglutamat | 4 | 1 | 5 | 1 | 1 |
|
N-Acetyl-p-Glukosamine | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 |
|
Hippurat | 1 | 1 | 5 | 4 | 1 |
Glykogen | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Pullulan | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
|
Maltose | 2 | 5 | 1 | 1 | 5 |
Melibiose | 5 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Melezitose | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 |
|
Sukrose | 5 | 5 | 1 | 1 | 5 |
L-Arabinose | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
D-Arabitol | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
|
Methyl-P-D-Glukopyranosid | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Tagatose | 3 | 1 | 3 | 1 | 1 |
P-Mannosidase | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
|
Cyclodextrin | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Urease | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Hämolyse | 3 | 1 | 3 | 3 | 3 |
-
Beispiel 10: Charakterisierung der Bakterienstämme LN 40,
LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01 unter Verwendung von zufällig vervielfältiger polymorpher
DNA.
-
Darüber hinaus
wurden die Bakterienstämme
mit RAPD (zufällig
vervielfältigter
polymorpher DNA) analysiert. Dieses Verfahren wird zum Beispiel
beschrieben von Willians, J G, et al, Nucl Acids Res, 18: 6531 (1990)
und wurde bisher nicht nur verwendet, um Stammdiversiät zu detektieren,
sondern auch für
Genmapping, Populationsanalysen, Epidemiologie und zum Analysieren
von taxonomischen und phylogenetischen Verhältnissen (Welsh, 3, et al,
PCR 2: A Practical Approach (Ein praktischer Ansatz), McPherson,
M 3, Harnes, B D, and Taylor, G R, eds Chapter 11, IRL Press (1995).
-
Reproduzierbare
Anordnungen aus stammspezifischen Produkten wurden unter Verwendung
eines kurzen Oligonukleotidprimers (5'ACGCGCAAC 3') unter niedrigen Verknappungsbedingungen
in PCR (Polymerase-Kettenreaktion)
erzeugt. Die entstandenen Anordnungen wurden anschließend durch
Gelelektrophorese analysiert und mit Stammarten jeder Bakterienart
verglichen, die derselben Behandlung unterzogen wurde.
-
Die
Ergebnisse dieser Analyse sind in 2 zusammengefasst.
- Bahn 1 ist L fermentum, ATCC 14931T,
- Bahn 2 ist LN 99,
- Bahn 3 ist L crispatus, CCUG 44117T,
- Bahn 4 ist LN 01,
- Bahn 5 ist ein 100 bp Molargewichtsmarker,
- Bahn 6 ist LN 23,
- Bahn 7 ist LN 40,
- Bahn 8 ist LN gasseri, ATCC 19992T,
- Bahn 9 ist LN 113, und
- Bahn 10 isT LN casei ATCC 4646T.
-
In 2 sind
die Hauptunterschiede zwischen den Bakterienstämmen gemäß der vorliegenden Erfindung
(LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01) und den jeweiligen Artenstämmen zu
sehen.
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf eine Zusammensetzung
zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Infektionen des Urogenitaltraktes,
umfassend mindestens einen der Bakterienstämme (LN 40, LN 113, LN 99,
LN 01 und LN 23).
-
Vorzugsweise
umfasst die Zusammensetzung alle Stämme, d. h. Stamm LN 40, Stamm
LN 113, Stamm LN 99, Stamm LN 01 und Stamm LN 23.
-
Die
Zusammensetzung wird vorzugsweise zur vaginalen Verabreichung formuliert,
wie z. B. ein Zäpfchen,
eine Kapsel, Pillen, Tabletten, Suspension, Spray, Gel, Creme, Puder
oder jede andere Form zur vaginalen Einführung, die herkömmliche
in der Technik verwendete pharmazeutische Arzneiträger umfassen
können.
Des Weiteren beschreibt die vorliegende Erfindung einen Hygiene-Artikel,
wie z. B. ein saugfähiges
Produkt (z. B. Tampons, Damenbinden, Slipeinlagen etc.), Windeln
und Inkontinenzschutz, zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Infektionen
des Urogenitaltraktes, umfassend mindestens einen der Bakterienstämme (LN
40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23).
-
Vorzugsweise
umfasst der Hygiene-Artikel alle Stämme, d. h. Stamm LN 40, Stamm
LN 113, Stamm LN 99, Stamm LN 01 und Stamm LN 23.
-
Der
Hygiene-Artikel ist vorzugsweise ein Tampon.
-
Darüber hinaus
beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung mindestens eines
Bakterienstammes (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23) für die Produktion
einer Zusammensetzung oder eines Hygiene-Artikels zur Prophylaxe
und/oder Behandlung von Infektionen des Urogenitaltraktes, vorzugsweise bakterieller
Vaginose oder einer anderen bakteriellen Störung in der Vagina.
-
Zusammenfassend
zeigen die Bakterienstämme
LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23 ausgezeichnete Eigenschaften
in Bezug auf:
- – die Fähigkeit, das Wachstum von Uropathogenen
(einschließlich
einem rasanten Bakterienwachstum) zu hemmen,
- – Fähigkeit,
nach vaginaler Verabreichung in vivo zu kolonisieren und sich zu
etablieren, selbst während der
Menstrualblutung,
- – Stabilität der bakteriellen
Lebensfähigkeit
nach Lyophilisierung und über
längere
Aufbewahrungszeiten hinweg (Haltbarkeit), und
- – Bewahrung
des genetischen Profils nach wiederholter Kultivierung und in vivo.
-
Darüber hinaus
werden diese Bakterienstämme
auch im Hinblick auf ökonomische
Aspekte bevorzugt.
-
Alles
in allem implizieren diese Eigenschaften, dass die Bakterienstämme gemäß der vorliegenden
Erfindung sehr gut geeignet sind für die industrielle Massenproduktion
eines Verbrauchsartikels (wie z. B. einer Zusammensetzung oder eines
Hygiene-Artikels), der die Bakterienstämme umfasst, um die Effekte
einer mikrobiellen Infektion des Urogenitaltraktes zu verhindern
oder zu verringern und/oder die Infektion zu behandeln.