ES2305313T3

ES2305313T3 - Bacterias que producen acido lactico para el uso como organismos probioticos en la vagina humana.

Info

Publication number: ES2305313T3
Application number: ES02780211T
Authority: ES
Inventors: Carolina Samuelsson; Endre Kvanta; Anna Weiner Jiffer
Original assignee: Ellen AB
Current assignee: Ellen AB
Priority date: 2001-09-20
Filing date: 2002-09-19
Publication date: 2008-11-01
Anticipated expiration: 2022-09-19
Also published as: PL369201A1; EP1427808B1; SE521022C2; DE60226254T3; EP1427808A1; JP2005507256A; ATE393211T2; US20080057046A1; CA2459178A1; SE0103127D0; AU2002343282B2; IL160937A0; JP4223955B2; CN1308436C; US7312067B2; DE60226254D1; DE60226254T2; ES2305313T5; CN1556852A; EP1427808B2

Abstract

Una cepa bacteriana aislada del género Lactobacilo o Pediococo que se caracteriza porque se escoge en el grupo formado por la cepa de Lactobacillus gasseri, LN 40, depositada con el nombre de LMG-20560, la cepa de Lactobacillus casei subsp rhamnosus, LN 113, depositada con el nombre de LMG P-20562, la cepa de Lactobacillus fermentum, LN 99, depositada con el nombre de LMG P-20561, la cepa de Lactobacillus crispatus, LN 01, depositada con el nombre de LMG P-20558, y la cepa de Pediococcus acidilactici, LN 23, depositada con el nombre LMG P- 20559, y que tiene la capacidad de colonizar y de establecerse en la vagina humana tras administración vaginal, incluso durante el flujo menstrual, en el que dicha cepa/s bacteriana/s se considera/n establecida/s si la cepa/s bacteriana/s está/n presentes en una vagina después de al menos dos ciclos menstruales desde el momento de la administración, habiendo sido depositadas dichas cepas bacterianas en Belgian Coordinated Collections of Microorganisms el 14 de Junio de 2001.

Description

Bacterias que producen ácido láctico para el uso como organismos probióticos en la vagina humana.

Campo técnico

La presente invención se refiere a bacterias que producen ácido láctico y a su uso.

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Antecedentes técnicos

La flora microbiana normal de la vagina humana comprende bacterias que producen ácido láctico, que tradicionalmente se han denominado Bacilos de Döderlein.

Tales bacterias productoras de ácido láctico se refieren a bacterias que no forman esporas, Gram positivo y que producen ácido láctico mediante la fermentación de varios azúcares, tales como glucógeno y/o glucosa.

Las bacterias que producen ácido láctico comprenden, por ejemplo, bacterias de los géneros Lactobacilo, Leuconostoc, Pediococo, Estreptococo, Lactococo y Enterococo.

Las bacterias que producen ácido láctico pueden dividirse en bacterias homofermentativas y heterofermentativas, dependiendo de sus rutas metabólicas. Las bacterias homofermentativas (por ejemplo Lactobacillus acidophilus) producen simplemente ácido láctico, mientras que las bacterias heterofermentativas también producen, por ejemplo, óxido de carbono, etanol y ácido acético.

El género Lactobacilo es un grupo fenotípicamente heterogéneo de bacterias anaerobias desde el punto de vista facultativo, catalasa-negativa, con forma de huso y que producen ácido láctico. Se reconocen alrededor de 50 especies distintas, y generalmente estas especies poseen un ADN con bajo contenido en guanina (G) y citosina (C), aproximadamente de 33-53%. El contenido G-C es constante dentro de las especies. Algunas especies de Lactobacilo se encuentran en humanos, por ejemplo en la cavidad bucal, tracto intestinal y en la vagina. Las especies de Lactobacilo que se encuentran presentes en la vagina son, por ejemplo, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus casei (subespecie rhamnosus) y Lactobacillus jensenii.

El género Pediococo es, desde el punto de vista fenotípico, un grupo de bacterias Gram-positivo, catalasa-negativa, facultativamente anaerobias, oxígeno-tolerantes, con forma de huso (diámetro de alrededor de 0,6-1,0 \mum), no patógenas y productoras de ácido láctico.

Las mujeres sanas y fértiles (de edad entre 15 y 60 años) presentan un pH de alrededor de 3,8-4,2 en la vagina entre menstruaciones, principalmente como resultado de la producción de dicho ácido láctico. El medio ácido evita que bacterias que están presentes en el colon, tales como Gardnerella vaginalis, Mobiluncus Bacteroides, Prevotella y Eschericha coli, se instalen en la vagina.

La piel del tracto urogenital y las membranas mucosas urogenitales de mujeres sanas albergan una flora específica de microorganismos comensales y/o beneficiosos, tales como varias especies de Lactobacilo. No obstante, el tracto urogenital también puede estar colonizado por microorganismos causantes de enfermedades. La colonización por microorganismos no deseados puede ser el resultado de transmisión sexual, puede tener lugar de forma espontánea o puede ser el resultado de la perturbación de una flora microbiana normal. Se sabe que esto último ocurre, por ejemplo, tras determinadas terapias antibióticas.

De esta forma, la flora microbiana del tracto urogenital femenino, tal como la vagina, puede sufrir perturbación o alteración provocada por una infección microbiana, tal como una levadura (Candida albinancs), Tricomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis, vaginosis bacteriana (caracterizada por una mayor prevalencia de Gardnerella vaginalis y Mobiluncus) y tratamiento antibiótico u otras causas a menudo complejas.

Durante la menstruación y el coito, aumenta el pH de la vagina por la adición de sangre y esperma, respectivamente. Estos fluidos contienen muchas proteínas, que pueden ser digeridas por bacterias (por ejemplo Gardnerella vaginalis y Mobiluncus) que, como se ha descrito anteriormente, pueden alojarse en la vagina en condiciones de pH elevado. A continuación, se generan productos de degradación, tales como aminas (por ejemplo putrescina y cadaverina). A pH elevado, estas aminas se vuelven volátiles y presentan un olor "a pescado". De manera adicional, estas mujeres presentan síntomas de elevado flujo vaginal e irritación. Esta afección se denomina vaginosis bacteriana (BV) y constituye la afección más común asociada a irritación vaginal y elevada cantidad de flujo vaginal de fuerte olor (véase Morris, M; Nicoll, A; Simas, I; Wilson, J; Catchpole, M, Bacterial vaginosis: A public health review, British Jornal of Obstetrics and Gynaecology, 108(5): 439-450, Mayo 2001).

Se piensa que la vaginosis bacteriana es el resultado de la sustitución de bacterias vaginales productoras de ácido láctico por una variedad de especies no deseadas tales como Gardnerella vaginalis, Bacteroides, Mobiluncus, Prevotella bivia y Micoplasma hominis.

Un método para diagnosticar la vaginosis bacteriana (BV) es el descrito por Amsel Criteria. En primer lugar, se mide el pH del flujo vaginal. Se eleva el pH de alrededor de 90% de mujeres con BV por encima de 4,5. En segundo lugar, si se añade KOH al 10% al flujo vaginal, se libera un olor "a pescado" en alrededor de 70% de las mujeres con BV. En tercer lugar, se observa la presencia de una preparación húmeda de células de epitelio pavimentoso cubiertas con pequeños cocobacilos ("células con indicios"). Otro ensayo fiable para la BV es la tinción Gram directa del fluido vaginal. Nugent y col. presentan un método estándar para la interpretación de tinciones Gram para BV (véase Ejemplo 1).

Se sabe que las bacterias productoras de ácido láctico presentan capacidad para inhibir la proliferación y/o para reducir la patogenicidad de muchos microorganismos asociados a infecciones urogenitales (véase por ejemplo, Redondo-Lopez, V; Cook, R.L.; Sobel, J.D., Emerging role of lactobacillus in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora, Reviews of infectious diseases, vol 12, Nº. 5, Sept-Oct 1990, y Boris, S; Barbes, C, Role placed by lactobacilli in controlling the population of vaginal pathogens, Microbes and infection, vol 2, pp 543-546, 2000).

También se sabe que las propiedades antagonistas de las bacterias que producen ácido láctico frente a dichos patógenos se denotan, al menos parcialmente, por su capacidad para producir distintas sustancias antagonistas, tales como ácido láctico, peróxido de hidrógeno, bacteriocinas, etc.

Se estima que una vagina sana alberga entre 10^{8}-10^{9} cfu (= unidades formadoras de colonia) de bacterias productoras de ácido láctico. La composición de esta flora es el resultado de las cepas específicas que la mujer ha heredado de su madre y/o de las cepas que han migrado desde su tracto digestivo hasta su tracto urogenital.

La técnica anterior describe formulaciones, tales como suspensiones, supositorios y cápsulas de gelatina, que comprenden bacterias viables productoras de ácido láctico. Tales formulaciones se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº. 5.466.463 y en el documento WO 9.309.793.

Además, se sabe como impregnar productos absorbentes, tales como tampones y compresas, con bacterias productoras de ácido láctico con el fin de conservar una flora microbiana normal en el tracto urogenital femenino, evitando de esta forma infecciones urogenitales, o de regenerar una flora microbiana normal en el tracto urogenital femenino. Dicho producto se describe en la patente europea 0 594 628 y en la solicitud de patente sueca 0003544-4.

La patente de EE.UU. Nº. 6.180.100 describe un método para el tratamiento o la prevención de infecciones del tracto urinario que comprende administrar a la vagina bacterias aisladas de ácido láctico del género Lactobacilo. Dichos Lactobacilos son capaces de colonizar la vagina durante 5 semanas tras una única instilación.

No obstante, para obtener el efecto descrito anteriormente resulta crucial que las bacterias productoras de ácido láctico que inhiben los uropatógenos colonicen y se establezcan in vivo, y que tras la administración a la vagina permanezcan en la misma durante un período de tiempo superior al de un ciclo menstrual.

El hecho de que una cepa bacteriana colonice o no la vagina depende de las propiedades adhesivas de la cepa bacteriana específica, así como de las condiciones hormonales, nutricionales y de acidez de la vagina. El desarrollo de una infección genital o el tratamiento con antibióticos también influyen en la capacidad de la cepa introducida para colonizar la vagina.

El ciclo menstrual también afecta a la adherencia, teniendo lugar la máxima adherencia antes de la ovulación y antes del flujo menstrual (patente de EE.UU. Nº. 6.180.100 y Chan y col., Journal of Urology, Marzo 1984). De esta forma, el período más difícil para que se produzca la colonización y el establecimiento en la vagina de las bacterias productoras de ácido láctico administradas es durante el flujo menstrual.

Con respecto a la colonización y al establecimiento de las bacterias productoras de ácido láctico in vivo, existe disparidad entre los resultados clínicos y el supuesto comportamiento bacteriano derivado de la interpretación de los resultados de los análisis in vitro. Las interacciones entre especies bacterianas diferentes en la vagina resultan frecuentes, y este patrón de interacción es complicado de recrear en el laboratorio. De este modo, incluso si unas especies bacterianas exhiben resultados in vitro prometedores, podrían no establecerse in vivo y por tanto no proporcionar el efecto terapéutico deseado, es decir, evitar o aliviar los efectos de, y/o el tratamiento de, infecciones microbianas en el tracto urogenital.

Además, resulta de vital importancia que la bacteria muestre estabilidad de perfil genético por un lado tras cultivos repetidos en producción a gran escala y por otro, durante períodos de tiempo largos in vivo.

Otro criterio que debe satisfacer la generación de un producto de consumo aceptable que proporcione el efecto terapéutico deseado es la conservación de la viabilidad bacteriana tras liofilización de la bacteria y tras almacenamiento de la bacteria liofilizada (es decir, vida útil de almacenaje).

Sumario de la invención

La presente invención describe nuevas cepas bacterianas aisladas del género Lactobacilo y Pediococo, que presentan la capacidad de colonizar y establecerse en la vagina humana tras administración vaginal, incluso durante el flujo menstrual, de al menos una de las cepas bacterianas. Se considera que las bacterias se han establecido si se encuentran presentes en la vagina tras al menos dos ciclos menstruales desde el momento de la administración.

Es una ventaja que las cepas bacterianas de acuerdo con la invención muestren capacidad para establecerse durante el flujo menstrual, ya que la bacteria puede administrarse de forma fácil mediante el empleo, por ejemplo, de un tampón impregnado con dicha bacteria.

Las bacterias productoras de ácido láctico establecidas pertenecientes a dichas cepas evitan, alivian los efectos y/o tratan las infecciones microbianas del tracto urogenital, en particular la vaginosis bacteriana. Para obtener los efectos terapéuticos deseados, resulta esencial que las bacterias se establezcan tras la administración, y de este modo, estén presentes en la vagina incluso después de varios flujos menstruales.

Dichas cepas bacterianas han sido depositadas de acuerdo con el Acuerdo de Budapest en el BCCM/LMG (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/Laboratorium loor Microbioligie-Bacterienverzammeling, Universiteit Gent) en Bélgica el 14 de Junio de 2001, y comprenden la cepa de Lactobacillus gasseri, denominada por el solicitante como LN 40, depositada con el nombre de LMG P-20560, la cepa de Lactobacillus casei subsp rhamnosus, denominada por el solicitante LN 113, depositada con el nombre de LMG P-20562, la cepa de Lactobacillus fermentum, denominada por el solicitante LN 99, depositada con el nombre de LMG P-20561, la cepa de Lactobacillus crispatus, denominada por el solicitante LN 01, depositada con el nombre de LMG P-20558 y la cepa de Pediococcus acidilactici, denominada por el solicitante LN 23, depositada con el nombre de LGM P-20559, o sus variantes que presentan las correspondientes características fenotípicas. Además, la presente invención describe un método para el aislamiento de una cepa bacteriana del género Lactobacilo o Pedicoco que presenta la capacidad de colonizar y establecerse en la vagina humana, incluso durante el flujo menstrual, en la que

a): se toma una muestra bacteriana, tal como fluido vaginal, del tracto vaginal de una mujer con flora vaginal de microorganismos sana y normal,

b): se escogen bacterias productoras de ácido láctico a partir de la muestra vaginal de la etapa a),

c): se lleva a cabo un cultivo puro de las bacterias productoras de ácido láctico de la etapa b), in vitro, en un medio de nutrientes apropiado proporcionando al menos una cepa bacteriana aislada,

d): se evalúa la capacidad de colonización y establecimiento en la vagina de al menos una cepa bacteriana cultivada de forma pura de la etapa c) y/o una combinación de al menos dos cepas bacterianas de la etapa c), tras administración vaginal de la cepa bacteriana a una mujer durante el flujo menstrual, presentando dicha mujer una flora vaginal de microorganismos alterada, en el que dicha cepa o cepas bacterianas se considera/consideran establecidas si la cepa/cepas bacteriana se encuentra presente en la vagina después de al menos dos ciclos menstruales desde el momento de la administración, y

e): se escoge al menos una cepa bacteriana de la etapa d) que muestre dicha capacidad para colonizar y establecerse en la vagina.

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Preferiblemente, al menos una cepa bacteriana cultivada de forma pura de la etapa c) y/o una combinación de al menos dos cepas bacterianas de la etapa c) se encuentra liofilizada.

Además, preferiblemente, esta/estas cepa/cepas se evalúa/evalúan y se escoge/escogen de forma que se garantice la estabilidad de la viabilidad bacteriana tras liofilización así como la viabilidad de las bacterias liofilizadas durante largos períodos de almacenaje, en el que dicha viabilidad bacteriana se considera estable si al menos 40% de las bacterias presentan viabilidad tras la liofilización y tras el almacenamiento de las bacterias liofilizadas a -18ºC aproximadamente durante al menos 12 meses.

La presente invención también describe una cepa bacteriana del género Lactobacilo o Pedicoco que presenta la capacidad de colonizar y establecerse en la vagina humana durante el flujo menstrual, en el que la cepa puede aislarse de acuerdo con el método anteriormente descrito. Preferiblemente, dichas cepas bacterianas son la cepa Lactobacillus gasseri, denominada por el solicitante como LN 40, depositada con el nombre de LMG P-20560, la cepa de Lactobacillus casei subsp rhamnosus, denominada por el solicitante LN 113, depositada con el nombre de LMG P-20562, la cepa de Lactobacillus fermentum, denominada por el solicitante LN 99, depositada con el nombre de LMG P-20561, la cepa de Lactobacillus crispatus, denominada por el solicitante LN 01, depositada con el nombre de LMG P-20558 y la cepa de Pediococcus acidilactici, denominada por el solicitante LN 23, depositada con el nombre de LGM P-20559, o sus variantes que presentan las correspondientes características fenotípicas y/o genotípicas.

Además, la presente invención describe una composición para la profilaxis o el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, que comprende al menos una de dichas cepas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23).

Preferiblemente, la composición comprende todas las cepas mencionadas, es decir la cepa LN 40, la cepa LN 113, la cepa LN 99, la cepa LN 01 y la cepa LN 23.

Se sabe en la técnica que una combinación de bacterias distintas reduce el tiempo de generación de una bacteria, dando lugar a un crecimiento bacteriano más rápido. Además, dado que las diferentes especies de bacterias productoras de ácido láctico presentan diferentes características y patrones de fermentación, es preferible emplear una combinación de diferentes especies bacterianas.

Una combinación de todas las cepas de acuerdo con la invención, es decir, LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23, muestra incluso una inhibición de uropatógenos mayor que cada una de dichas cepas por separado.

Preferiblemente, la composición se formula para administración vaginal, en forma de supositorio, cápsula, píldora, comprimido, suspensión, pulverización, gel, crema, polvo o cualquier otra forma de inserción vaginal.

De manera adicional, la presente invención describe un producto higiénico, tal como un producto absorbente femenino (por ejemplo un tampón, compresa o salvaslip), un pañal y un artículo de protección frente a incontinencias, para la profilaxis y/o el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, que comprende al menos una de dichas cepas bacterianas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23).

Preferiblemente, el producto higiénico comprende todas las cepas mencionadas, es decir la cepa LN 40, la cepa LN 113, la cepa LN 99, la cepa LN 01 y la cepa LN 23, por las mismas razones sugeridas anteriormente en cuanto a la composición.

Preferiblemente, el producto higiénico es un tampón.

Además, la presente invención describe el uso de al menos una de dichas cepas bacterianas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23) para la producción de una composición o de un producto higiénico para la profilaxis y/o el tratamiento de las infecciones del tracto urogenital, preferiblemente vaginosis bacteriana o cualquier otro trastorno bacteriano de la vagina.

Otras características y ventajas de la presente invención resultarán claras a partir de la siguiente descripción detallada del mismo.

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Breve descripción de los dibujos

Las Fig. 1a y 1b muestran el proceso de crecimiento de las cepas bacterianas LN 40, LN 99, LN 113 y LN 23, respectivamente.

La Fig. 2 muestra un dibujo de un gel con productos específicos de tinción generados empleando RAPD y electroforesis de gel. Se comparan las cepas LN 40, LN 99, LN 113, LN 01 y LN 23, respectivamente, con cepas tipo de las respectivas especies bacterianas.

Las Fig. 3 y 4 muestran la configuración experimental empleada en el Ejemplo 6.

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Descripción detallada de la invención

Según se emplea en la presente memoria, la expresión "bacterias productoras de ácido láctico" significa bacterias que producen ácido láctico mediante fermentación.

Según se emplea en la presente memoria, la expresión "cantidad eficaz terapéuticamente" significa una cantidad que conduce al efecto terapéutico deseado.

El efecto terapéutico deseado es la profilaxis y/o el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, tal como vaginosis bacteriana o cualquier otro trastorno bacteriano de la vagina.

Según se emplea en la presente memoria, la expresión "cepa bacteriana aislada" significa que la cepa podría cultivarse in vitro en un cultivo que comprende dicha cepa.

Según se emplea en la presente memoria, la expresión "muestra bacteriana" significa una muestra que comprende bacterias. Por ejemplo, la muestra podría ser fluido/flujo vaginal.

Según se emplea en la presente memoria, la expresión "flora vaginal de microorganismos sana y normal" significa que la mujer no presenta enfermedades vaginales, y que la tinción Gram de la muestra vaginal proporciona un valor total de 0-3 de acuerdo con el método presentado por Nugent y col. (véase Ejemplo 1).

Según se emplea en la presente memoria, la expresión "flora vaginal de microorganismos alterada" significa que la mujer presenta alguna enfermedad vaginal, tal como elevado flujo vaginal y/o olor vaginal "a pescado". Además, la tinción Gram de la muestra vaginal proporciona un valor total de al menos 4, en particular \geq 7, de acuerdo con el método presentado por Nugent y col. (véase Ejemplo 1).

Según se emplea en la presente memoria, la expresión "medio de nutrientes apropiado" significa un medio, tal como caldo LAB o caldo MRS, en el que puede llevarse a cabo el cultivo de las bacterias.

Según se emplea en la presente memoria, la expresión "producto higiénico" significa tampones (tanto tampones digitales como tampones con aplicador), compresas, salvaslips, pañales, artículos de protección frente a incontinencias y similares.

La presente invención describe nuevas cepas aisladas de bacterias productoras de ácido láctico del genero Lactobacilo y Pediococo, que presentan la capacidad de colonizar y establecerse en la vagina humana tras administración vaginal, incluso durante el flujo menstrual, de al menos una de las cepas bacterianas. Se considera que las bacterias se han establecido si están presentes en la vagina después de al menos dos ciclos menstruales desde el momento de la administración.

Dichas cepas bacterianas han sido depositadas de acuerdo con el Acuerdo de Budapest en el BCCM (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms) en Bélgica el 14 de Junio de 2001, y comprenden la cepa de Lactobacillus gasseri, denominada por el solicitante como LN 40, depositada con el nombre de LMG P-20560, la cepa de Lactobacillus casei subsp rhamnosus, denominada por el solicitante LN 113, depositada con el nombre de LMG P-20562, la cepa de Lactobacillus fermentum, denominada por el solicitante LN 99, depositada con el nombre de LMG P-20561, la cepa de Lactobacillus crispatus, denominada por el solicitante LN 01, depositada con el nombre de LMG P-20558 y la cepa de Pediococcus acidilactici, denominada por el solicitante LN 23, depositada con el nombre de LGM P-20559, o sus variantes que presentan las correspondientes características fenotípicas y/o genotípicas.

Además, la presente invención describe un método para el aislamiento de una cepa bacteriana del género Lactobacilo o Pedicoco que presenta la capacidad de colonizar y establecerse en la vagina humana, en la que

d): se evalúa la capacidad de colonización y establecimiento en la vagina de al menos una cepa bacteriana cultivada de forma pura de la etapa c) y/o una combinación de al menos dos cepas bacterianas de la etapa c), tras administración vaginal de la cepa bacteriana a una mujer durante el flujo menstrual, presentando dicha mujer una flora vaginal de microorganismos alterada, en el que dicha cepa/cepas bacteriana se considera establecida si la cepa/cepas bacteriana se encuentra presente en la vagina después de al menos dos ciclos menstruales desde el momento de la administración, y

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Preferiblemente, al menos una cepa bacteriana cultivada de forma pura de la etapa c), y/o una combinación de al menos dos cepas bacterianas de la etapa c) se encuentra liofilizada.

Una cantidad esencial de las bacterias debería ser viable tras la liofilización y posteriormente conservar la viabilidad durante el almacenaje. Además, una cantidad esencial de las bacterias liofilizadas formuladas en, por ejemplo, composiciones y/o productos higiénicos a escala comercial debería conservar la viabilidad tras almacenaje a temperatura ambiente.

De esta forma, preferiblemente, esta/estas cepa/cepas se evalúa/evalúan y se escoge/escogen de forma que se garantice la estabilidad de la viabilidad bacteriana tras liofilización así como la viabilidad de las bacterias liofilizadas durante largos períodos de almacenaje, en la que dicha viabilidad bacteriana se considera estable si al menos 40% de las bacterias presentan viabilidad tras la liofilización y tras el almacenaje de las bacterias liofilizadas a -18ºC aproximadamente durante al menos 12 meses.

Además, al menos 1% de las bacterias liofilizadas formuladas en algún tipo de matriz de conservación, tal como un aceite, e incluidas en una composición y/o en un producto higiénico deben conservar la viabilidad durante al menos 12 meses a temperatura ambiente.

Además, una característica importante es la estabilidad del perfil genético bacteriano tras cultivos repetidos en producción a gran escala, y durante los procesos de preparación de, por ejemplo, composiciones y productos higiénicos. Preferiblemente, las bacterias deben conservar su perfil genético después de al menos 10 cultivos repetidos. Además, las bacterias deben mostrar estabilidad genética in vivo durante largos períodos de tiempo después de la administración, tal como al menos 12 meses. De esta forma, preferiblemente, dicha cepa/cepas se evalúa/evalúan y se escoge/escogen para garantizar la estabilidad genética in vivo después de la administración, de forma que dichas bacterias se consideran genéticamente estables si conservan su perfil genético in vivo durante al menos 12 meses. Además, el crecimiento bacteriano y el tiempo de generación también son esenciales. Las bacterias liofilizadas administradas por vía vaginal deben comenzar a crecer al menos durante las 4 horas posteriores a la administración. El tiempo de generación debe ser menor que 2 h.

La presente invención también describe una cepa bacteriana del género Lactobacilo o Pedicoco que presenta capacidad para colonizar y establecerse en la vagina humana durante el flujo menstrual, en el que la cepa puede aislarse de acuerdo con el método descrito anteriormente. Preferiblemente, dichas cepas bacterianas son la cepa de Lactobacillus gasseri, denominada por el solicitante como LN 40, depositada con el nombre de LMG P-20560, la cepa de Lactobacillus casei subsp rhamnosus, denominada por el solicitante LN 113, depositada con el nombre de LMG P-20562, la cepa de Lactobacillus fermentum, denominada por el solicitante LN 99, depositada con el nombre de LMG P-20561, la cepa de Lactobacillus crispatus, denominada por el solicitante LN 01, depositada con el nombre de LMG P-20558 y la cepa de Pediococcus acidilactici, denominada por el solicitante LN 23, depositada con el nombre de LGM P-20559, o sus variantes que presentan las correspondientes características fenotípicas y/o genotípicas.

Aislamiento y evaluación de cepas de Lactobacilo y Pediococo

Se aislaron cepas bacterianas del género Lactobacilo y Pedicoco que presentaban la capacidad de colonizar y establecerse en la vagina humana, de acuerdo con las siguientes etapas:

-: se recogió fluido vaginal a partir del tracto vaginal de una mujer con flora vaginal de microorganismos sana y normal,

-: se escogieron bacterias productoras de ácido láctico (alrededor de 25 cepas distintas) a partir del fluido vaginal, colocando un frotis de dicho fluido sobre agar MRS selectivo para bacterias productoras de ácido láctico (se escogieron colonias individuales y se colocaron sobre una placa de agar MRS puro para controlar la pureza),

-: a continuación, se cultivaron de forma pura bacterias productoras de ácido láctico in vitro en un medio de nutrientes apropiado, y bajo condiciones apropiadas (pH, temperatura, etc), proporcionando cepas bacterianas aisladas, y

-: posteriormente se evaluaron las cepas bacterianas cultivadas de forma pura en cuanto a su capacidad para colonizar y establecerse en la vagina, tras administración vaginal de las cepas bacterianas a una mujer durante el flujo menstrual, presentando dicha mujer una flora vaginal de microorganismos alterada.

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Se cultivó de forma pura LN 40 en un caldo LAB (alrededor de pH 6,5) micro-aerófilo a alrededor de 37ºC.

Se cultivó de forma pura LN 113 en un caldo MRS (alrededor de pH 6,5) micro-aerófilo a alrededor de 37ºC.

Se cultivó de forma pura LN 99 en un caldo LAB (alrededor de pH 6,5) micro-aerófilo a alrededor de 37ºC.

Se cultivó de forma pura LN 01 en un caldo MRS (alrededor de pH 6,5) micro-aerófilo a alrededor de 37ºC.

Se cultivó de forma pura LN 23 en un caldo MRS (alrededor de pH 6,5) micro-aerófilo a alrededor de 37ºC.

En primer lugar, se evaluó el tiempo de generación de las cepas bacterianas cultivadas de forma pura. Se escogieron las cepas bacterianas (alrededor de 15 cepas distintas) que mostraron un tiempo de generación < 30 minutos. Se registró la capacidad de estas cepas seleccionadas para inhibir el crecimiento de algunos microorganismos in vivo (datos no mostrados). En primer lugar, se evaluó la capacidad para inhibir el crecimiento de Staphilococcus epidemidis (dos cepas distintas), Enterococcus cloace, Escherichia coli, Serratia marcesus, Micrococcus lysodeicticus y Candida albicans. Ocho cepas bacterianas distintas (7 cepas del género Lactobacilo y 1 del género Pediococo) mostraron capacidad y, por tanto, fueron escogidas. Además, se evaluaron estas 8 cepas en cuanto a su capacidad para inhibir el crecimiento del uropatógeno Gardnerella vaginalis.

Las mejores cepas (es decir, las cepas que presentan mejora potencial para colonizar una flora vaginal de microorganismos alterada) fueron LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23.

Además, se evaluaron estas cepas mediante estudios clínicos, considerando que las bacterias se han establecido en la vagina si se encuentran presentes en la misma después de al menos dos ciclos menstruales desde el momento de la administración (la administración de las bacterias comienza durante el primer flujo menstrual). Se escogieron aquellas cepas bacterianas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23) que mostraron dicha capacidad para colonizar y establecerse en la vagina.

De manera adicional, se evaluó la estabilidad de la viabilidad bacteriana tras liofilización y la viabilidad de las bacterias liofilizadas durante largos períodos de almacenaje (duración útil de almacenaje), la conservación del perfil genético tras cultivos repetidos in vivo y el proceso de crecimiento bacteriano.

Ejemplo 1 Colonización y establecimiento de bacterias productoras de ácido láctico tras administración vaginal

Se estudiaron 15 pacientes con BV (mujeres a las que se las había diagnosticado vaginosis bacteriana). Las 15 pacientes fueron tratadas con óvulos de clindamicina (Dalacin® 2% ovule, de Pharmacia) durante 3 días. Posteriormente, el tratamiento continuó con una parte controlada con un placebo con ocultación doble, en la que 6 pacientes emplearon tampones formados aproximadamente por 10^{3} cfu de bacterias liofilizadas de las cepas LN 01, LN 23, LN 99, LN 113 y LN 40, durante el primer período menstrual después del tratamiento con antibióticos. Las otras 9 pacientes emplearon tampones convencionales sin bacterias productoras de ácido láctico. Durante el segundo período menstrual, las 15 pacientes emplearon tampones convencionales sin bacterias productoras de ácido láctico, y se tomó una muestra vaginal a los pocos días de esta menstruación.

Las muestras vaginales se sometieron a tinción de Gram. En el método estándar de tinción Gram presentado por Nugent y col., se analizó la presencia o ausencia de determinados morfotipos bacterianos. Los morfotipos son grandes, bacilos Gram-positivo del morfotipo Lactobacilo; pequeños bacilos de Gram variable denominado morfotipo Gardnerella y con forma de huso curvado. Se cuantificaron los organismos presentes en el fluido vaginal y se les asignó una puntuación (véase Tabla 1).

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TABLA 1

1

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Las puntuaciones de 0 a 4+ están basadas en el número medio de organismos con ese morfotipo por campo de inmersión en aceite; 1+, < 1 presente: 2+, 1-4 presentes; 3+, 5-30 presentes; 4+ \geq 30 presentes. La puntuación total se obtiene sumando las puntuaciones de los tres morfotipos. La puntuación total se interpreta como se muestra a continuación: 0-3, normal; 4-6, intermedia; y \geq 7, BV.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

2

No se detectó vaginosis bacteriana en las 6 pacientes que emplearon el tampón con las bacterias productoras de ácido láctico. Además, los resultados mostraron que las bacterias productoras de ácido láctico se encontraban presentes en la vagina después del segundo ciclo menstrual.

Además, estos resultados mostraron que un número relativamente pequeño de bacterias administradas (aproximadamente 10^{3} cfu) resulta suficiente para lograr una colonización vaginal completa así como el establecimiento durante el flujo menstrual de las cepas bacterianas de acuerdo con la presente invención.

De manera adicional, las cepas bacterianas de acuerdo con la invención presentan excelentes propiedades de adhesión a las membranas de la mucosa vaginal.

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Ejemplo 2 Colonización y establecimiento de bacterias productoras de ácido láctico tras administración vaginal

Cuatro mujeres sanas sin enfermedades de tipo vaginal emplearon tampones que comprendían aproximadamente 10^{3} cfu de bacterias liofilizadas de las cepas LN 01, LN 23, LN 99, LN 113 y LN 40, durante su flujo menstrual mensual, durante un período de 12-18 meses.

Después de dicho período de ensayo, se evaluaron las muestras vaginales de cada mujer. Se identificaron las cepas de Lactobacilo y Pediococo encontradas en las muestras mediante RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) como se describe en el Ejemplo 10.

Se identificaron LN 01 y LN 113 en dos de las muestras vaginales de dichas mujeres.

Se identificó LN 40 en una de las muestras vaginales de dichas mujeres.

No se identificaron LN 23 ni LN 99 en ninguna de las muestras vaginales de dichas mujeres.

Como explicación a estos resultados puede decirse que, cuando se administra dicho agrupamiento bacteriano a una mujer con flora vaginal sana, con pH vaginal normal, LN 23 no crece de forma considerable. No obstante, cuando dicho agrupamiento bacteriano se administra a una mujer que muestra una flora vaginal de microorganismos alterada, LN 23 se establece inicialmente y proporciona un entorno favorable para que crezcan las otras cepas bacterianas (LN 01, LN 113, LN 40 y LN 99).

Debe notarse también que, a nivel individual, existen diferencias con respecto a la adecuación de una cepa específica, y/o combinaciones de cepas específicas, en lo que se refiere al establecimiento y crecimiento en la vagina de la mujer.

En cada muestra vaginal, al menos se identificó una de dichas cepas bacterianas de acuerdo con la invención.

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Ejemplo 3 Estabilidad y viabilidad tras liofilización y durante largos períodos de tiempo de almacenaje (duración útil de almacenaje) de cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99 y LN 23

Se evaluó la estabilidad de viabilidad durante largos períodos de tiempo de almacenaje (es decir la duración útil de almacenaje) a alrededor de -18ºC de cepas bacterianas liofilizadas LN 40, LN 113, LN 99 y LN 23.

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TABLA 3

3

Los resultados de la Tabla 3 muestran que al menos 40% de las bacterias todavía son viables después de 12 meses a -18ºC. Además, al menos alrededor de 10-20% de las bacterias todavía son viables tras 78 meses a -18ºC.

Además, también se analizaron estas bacterias de acuerdo con API 50CH, y los resultados obtenidos para este análisis indicaron que las cepas LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01 conservan su perfil genético durante al menos 78 meses durante el almacenaje en forma liofilizada a -18ºC.

Se dispersaron las bacterias liofilizadas (LN 40, LN 113, LN 99 y LN 23) en Akosoft® 36 (de Karlshamns AG) y se evaluó su estabilidad de viabilidad durante largos períodos de tiempo de almacenaje (es decir, duración útil de almacenaje) a alrededor de 8ºC y 22ºC, respectivamente.

TABLA 4

4

Los resultados de la Tabla 4 muestran que alrededor de 45-50% de las bacterias están todavía viables después de 12 meses a 8ºC. Además, alrededor de 4% de las bacterias están todavía viables después de 12 meses a temperatura ambiente, es decir 22ºC.

Se obtuvieron resultados similares para el agrupamiento de bacterias liofilizadas que comprendía las cepas bacterianas de acuerdo con la invención, incluyendo LN 01.

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Ejemplo 4 Conservación del perfil genético tras cultivos repetidos de las cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23

Se cultivaron de forma repetida durante 10 veces las cepas bacterianas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23) y posteriormente se sometieron a evaluación con API 50CH. Se conservó el patrón de fermentación de cada cepa bacteriana (véase ejemplo 9) tras el cultivo repetido. De esta forma, los resultados indicaron que dichas cepas bacterianas conservan su perfil genético tras cultivos repetidos.

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Ejemplo 5 Proceso de crecimiento bacteriano para las cepas bacterianas LN 40, LN 99, LN 113, LN 23 y LN 01

Para proporcionar dicho efecto terapéutico deseado, las bacterias liofilizadas administradas vaginalmente deberían comenzar el crecimiento en la vagina durante al menos 4 horas desde el momento de la administración.

Se midió la absorbancia (densidad óptica, OD) a 620 nm de las bacterias liofilizadas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01) añadidas al caldo MRS estéril. Se llevaron a cabo dos tipos de experimentos (véase Fig. 1a y 1b):

a): se añadieron 0,01 g de bacterias liofilizadas a 3 ml de caldo MRS, y se diluyeron 100 \mul de esta dispersión con 3 ml de caldo MRS adicional, y

b): se añadieron bacterias liofilizadas al caldo MRS en una cantidad que dio lugar a una absorbancia de aproximadamente 0,100.

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Se colocaron las cubetas que contenían las dispersiones de las bacterias anteriores a 37ºC y se midió la absorbancia cada 15 minutos durante 10,5 h.

Como puede observarse en la Fig. 1a y 1b, el crecimiento bacteriano para cada cepa (LN 40, LN 113, LN 99, LN23 y LN 01, respectivamente) es rápido, y todas las cepas bacterianas comienzan a crecer en un período de al menos 2 horas.

Además, el tiempo de generación de cada cepa bacteriana es de alrededor de 20-25 min. De esta forma, las bacterias crecen más rápido que los uropatógenos, lo que resulta muy favorable a la vista del uso de bacterias descrita en la presente memoria.

Además, se sabe en la técnica que una combinación de bacterias diferentes puede acortar el tiempo de generación de la bacteria, dando lugar a un crecimiento bacteriano incluso más rápido. Además, dado que las diferentes especies de bacterias productoras de ácido láctico presentan patrones de fermentación y características diferentes, es preferible utilizar una combinación de diferentes especies bacterianas.

Debe notarse que una combinación de LN 40, LN 99, LN 113, LN 23 y LN 01 secada por congelación comienza a crecer en 1,5 h, esto es al menos 25% más rápido que el tiempo necesario para cada una de las cepas bacterianas.

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Ejemplo 6 Capacidad para inhibir el crecimiento de uropatógenos

La finalidad de esta invención es mostrar que el agrupamiento bacteriano de LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01 es incluso más eficaz, a la hora de inhibir el crecimiento bacteriano de uropatógenos, que cada una de las cepas bacterianas por separado.

Las bacterias productoras de ácido láctico objeto de ensayo se añadieron de forma homogénea a un medio de agar, tamponado, estéril y fundido, tal como agar MRS. La mezcla obtenida se introdujo en una placa de Petri (de 90 mm de diámetro) 1 y la placa se inclinó de forma que la mezcla de agar 2 únicamente alcanzara alrededor de 1 mm desde la parte inferior de la placa en un lado de la misma, y alrededor de 11 mm en el lado opuesto de la placa, como se muestra en la Fig. 3.

Se añadió el uropatógeno de forma homogénea a un medio de agar, tamponado, estéril y fundido, tal como agar VRB (Violet Red Bile). La mezcla se introdujo en la parte superior del agar solidificado descrito anteriormente, que comprendía dichas bacterias productoras de ácido láctico, como se muestra en la Fig. 3, y también se dejó solidificar esta mezcla de agar 3.

Posteriormente, se incubaron a 37ºC durante alrededor de 24 h las bacterias productoras de ácido láctico y el uropatógeno. Como se muestra en la Fig. 4, se observaron dos zonas distintas 4 y 5 en la placa 1. En la primera zona 4, el uropatógeno había sido capaz de crecer. En la segunda zona 5, las bacterias productoras de ácido láctico habían inhibido el crecimiento del uropatógeno.

Es posible cuantificar la capacidad de las bacterias productoras de ácido láctico para inhibir el uropatógeno midiendo la longitud L de la segunda zona 5, es decir, la zona 5 de crecimiento inhibido.

En este experimento se empleó un enteropatógeno de cepa E coli (EPEC).

La longitud L de la zona de crecimiento inhibido estaba dentro del intervalo de 8 a 22 mm para cada una de las cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23.

No obstante, el agrupamiento bacteriano que comprendía LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23 dio lugar a una longitud L de la zona de crecimiento inhibido de 32-34 mm.

De esta forma, el agrupamiento bacteriano formado por todas las cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23 es incluso más eficaz que cada una de las cepas bacterianas tomadas por separado a la hora de inhibir el crecimiento de uropatógenos, tales como E coli. Además, es preferible emplear la combinación de dichas cepas bacterianas de acuerdo con la invención.

Caracterización de cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23

Se caracterizaron las bacterias por medio de los métodos fenotípico y genotípico.

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Ejemplo 7 Caracterización microbiológica de las cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23

Se caracterizaron las cepas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01) con respecto a morfología celular, tinción de Gram, reacción de oxidasa y reacción de catalasa.

La cepa LN 40 comprendía bacterias Gram-positivo, catalasa-negativo, oxidasa-negativo, no formadoras de esporas, con forma de huso (alrededor de 0,9 \mum x 3-10 \mum), que aparecieron como células individuales o en pares.

La cepa LN 99 comprendía bacterias Gram-positivo, catalasa-negativo, oxidasa-negativo, no formadoras de esporas, con forma de huso (alrededor de 0,9 \mum x 1,5-2,0 \mum), que aparecieron como células individuales.

La cepa LN 113 comprendía bacterias Gram-positivo, catalasa-negativo, oxidasa-negativo, no formadoras de esporas, con forma de huso (alrededor de 0,9 \mum x 2 \mum), que aparecieron como células individuales o en pares.

La cepa LN 01 comprendía bacterias Gram-positivo, catalasa-negativo, oxidasa-negativo, no formadoras de esporas, con forma de huso recto o ligeramente curvado (alrededor de 0,8-1,6 \mum x 2,3-11 \mum), que aparecieron como células individuales o en cadenas.

La cepa LN 23 comprendía bacterias Gram-positivo, catalasa-negativo, oxidasa-negativo, no formadoras de esporas, con forma redondeada (alrededor de 1 \mum de diámetro), que aparecieron como células individuales o en pares.

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Ejemplo 8 SDS-PAGE y análisis tipológico de las cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23

Se sometieron a crecimiento cultivos en agar MRS (Oxoid CM361) durante 24 h a 37ºC en condiciones anaerobias. La preparación de los extractos celulares y la eletroforesis de gel de proteínas (SDS-PAGE) se llevó a cabo en BCCM^{TM}/LMG, de conformidad con el protocolo establecido por el Research Group of Laboratory for Microbiology, University Ghent (Pot, B, Bañadme, P, Kersters, K, Análisis of electrophoretic whole-organism protein fingerprints, Chemical Methods in Prokaryotic Systematics, M, Goodfellow, y A G, O'Donell (eds), J Wiley & Sons, Chichester (1994)).

Se analizaron numéricamente los patrones de proteínas normalizados y digitalizados y se agruparon con respecto a los perfiles de referencia de la base de datos BCCM (Diciembre 1999) para LN 40, LN 113, LN 99 y LN 23. Se analizó LN 01 y se agrupó con respecto a los perfiles de referencia de la base de datos CCUG (Enero 2001).

Se encontró que la cepa LN 40 pertenecía a la especie Lactobacillus johnsonii o Lactobacillus gasseri.

Se encontró que la cepa LN 99 pertenecía a la especie Lactobacillus fermentum.

Se encontró que la cepa LN 113 pertenecía a la especie Lactobacillus casei subs. rhamnosus.

Se encontró que la cepa LN 23 pertenecía a la especie Pediococcus acidilactici.

Se encontró que la cepa LN 01 pertenecía a la especie Lactobacillus crispatus.

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Ejemplo 9 Caracterización de cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01 empleando API 50CH y strep ID32 rápido

La Tabla 5 muestra la capacidad de las cepas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01) para fermentar distintos carbohidratos. Los ensayos se llevaron a cabo por medio de API 50CH y API strep ID32 rápido a 37ºC, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para los resultados que difieren entre API 50CH API y strep ID32 rápido, el resultado de API 50CH se considera el más fiable.

Se buscaron los patrones de fermentación resultantes en la base de datos CCUG. La puntuación más alta de la base de datos obtenida para cada cepa confirmó los resultados de los análisis anteriormente descritos (SDS-PAGE/análisis tipológico), con respecto a qué especies bacterianas corresponden respectivamente dichas cepas.

Además, la reacción con ramnosa confirmó que la cepa LN 113 pertenece a la especie Lactobacillus casei subs rhamnosus.

No obstante, las comparaciones entre LN 40, LN 99, LN 113, LN 23 y LN 01, respectivamente, y las cepas tipo de cada especie bacteriana (CCUG 3145^{T}, CCUG 30138^{T}, CCUG 21452^{T}, CCUG 32235^{T} y CCUG 44117^{T}, respectivamente), mostraron diferencias importantes para todas las cepas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01) con respecto a los patrones de fermentación.

En la Tabla 5, 1 indica que no tiene lugar reacción, 2 indica que tiene lugar una leve reacción, 3 indica la presencia de reacción, 4 indica la presencia de una reacción enérgica y 5 indica la presencia de una reacción muy enérgica.

TABLA 5

5

TABLA 5 (continuación)

6

7

TABLA 5 (continuación)

8

9

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Ejemplo 10 Caracterización de cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01 empleando ADN Polifórmico Amplificado de forma aleatoria

Además, se analizaron las cepas bacterianas por RAPD (ADN Polifórmico Amplificado de forma Aleatoria). Por ejemplo, esta técnica ha sido descrita por Willians, J G y col., Nucl Acid Res, 18:6531 (1990) y se ha utilizado previamente no sólo para detectar la diversidad de cepas sino también para llevar a cabo mapas genéticos, análisis de población, epidemiología y para analizar relaciones taxonómicas y filogenéticas (Welsh, J, y col., PCR 2: Practical Approach, McPherson, MJ, Hames, BD y Taylor, GR, eds Capítulo 11, IRL Press (1995).

Se generaron series reproducibles de productos específicos de cepas empleando un iniciador de oligonucleotido (5'ACGCGCAAC 3') bajo condiciones de baja escasez en PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa). Posteriormente, se analizaron las series resultantes mediante electroforesis de gel, y se compararon con cepas tipo de cada una de las especies bacterianas que habían sido sometidas al mismo tratamiento.

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La Fig. 2 muestra los resultados de este análisis.

La línea 1 es L fermentum, ATCC 1493^{T}

La línea 2 es LN 99

La línea 3 es L crispatus, CCUG 44117^{T}

La línea 4 es LN 01

La línea 5 es un marcador de peso 100 bp molar,

La línea 6 es LN 23,

La línea 7 es LN 40,

La línea 8 es L gasseri, ATCC 19992^{T}

La línea 9 es LN 113, y

La línea 10 es L casei ATCC 4646^{T}

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En la Fig. 2, pueden observarse importantes diferencias entre las cepas bacterianas de acuerdo con el presente invención (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01) y las respectivas cepas tipo.

El presente invención también se refiere a una composición para la profilaxis y/o el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, que comprende al menos una de dichas cepas bacterianas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23).

Preferiblemente, la composición comprende todas las mencionadas cepas, es decir la cepa LN 40, la cepa LN 113, la cepa LN 99, la cepa LN 01 y la cepa LN 23.

Preferiblemente, la composición se formula para administración vaginal, tal como supositorio, cápsula, pastillas, comprimidos, suspensión, pulverización, gel, crema, polvo o cualquier otra forma de inserción vaginal, que puede comprender excipientes farmacéuticos convencionales empleados en la técnica. De manera adicional, el presente invención describe un producto higiénico, tal como productos absorbentes femeninos (por ejemplo tampones, compresas, salvaslips, etc), pañales, y artículos de protección frente a incontinencias, para la profilaxis y/o el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, que comprende al menos una de dichas cepas bacterianas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23).

Preferiblemente, el producto higiénico comprende todas las cepas mencionadas, es decir la cepa LN 40, la cepa LN 113, la cepa LN 99, la cepa LN 01 y la cepa LN 23.

Preferiblemente, el producto higiénico es un tampón.

Además, la presente invención describe el uso de al menos una de dichas cepas bacterianas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23) para la producción de una composición o un producto higiénico para la profilaxis y/o el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, preferiblemente vaginosis bacteriana o cualquier otro trastorno bacteriano de la vagina.

En resumen, las cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23 mostraron excelentes propiedades con respecto a:

-: capacidad para inhibir el crecimiento de uropatógenos (incluyendo un crecimiento bacteriano rápido)

-: capacidad para colonizar y establecerse in vivo tras administración vaginal, incluso durante el flujo menstrual,

-: estabilidad de viabilidad bacteriana tras liofilización y durante largos períodos de almacenaje (duración útil de almacenaje), y

-: conservación del perfil genético tras cultivos repetidos in vivo.

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Además, estas cepas bacterianas también son favorables desde el punto de vista económico.

Igualmente, estas propiedades implican que las cepas bacterianas de acuerdo con el presente invención resultan muy apropiadas para la producción industrial a gran escala de un artículo de consumo (tal como una composición o un producto higiénico) que comprende dichas cepas bacterianas para evitar, aliviar los efectos y/o tratar infecciones microbianas del tracto urogenital.

Claims

1. Una cepa bacteriana aislada del género Lactobacilo o Pediococo que se caracteriza porque se escoge en el grupo formado por la cepa de Lactobacillus gasseri, LN 40, depositada con el nombre de LMG-20560, la cepa de Lactobacillus casei subsp rhamnosus, LN 113, depositada con el nombre de LMG P-20562, la cepa de Lactobacillus fermentum, LN 99, depositada con el nombre de LMG P-20561, la cepa de Lactobacillus crispatus, LN 01, depositada con el nombre de LMG P-20558, y la cepa de Pediococcus acidilactici, LN 23, depositada con el nombre LMG P-20559, y que tiene la capacidad de colonizar y de establecerse en la vagina humana tras administración vaginal, incluso durante el flujo menstrual, en el que dicha cepa/s bacteriana/s se considera/n establecida/s si la cepa/s bacteriana/s está/n presentes en una vagina después de al menos dos ciclos menstruales desde el momento de la administración, habiendo sido depositadas dichas cepas bacterianas en Belgian Coordinated Collections of Microorganisms el 14 de Junio de 2001.

2. Un método para el aislamiento de una cepa bacteriana del género Lactobacilo o Pediococo que tiene la capacidad de colonizar y establecerse en la vagina humana, incluso durante el flujo menstrual, que comprende las siguientes etapas:

a): se toma una muestra bacteriana del tracto vaginal de una mujer con flora vaginal de microorganismos normal y sana,

c): se cultivan in vitro de forma pura las bacterias productoras de ácido láctico de la etapa b) en un medio de nutrientes apropiado proporcionando al menos una cepa bacteriana aislada,

d): se evalúa al menos una cepa bacteriana cultivada de forma pura de la etapa c) y/o una combinación de al menos dos cepas bacterianas de la etapa c) con respecto a su capacidad para colonizar y establecerse en la vagina tras administración vaginal de la cepa bacteriana a una mujer durante el flujo menstrual, presentando dicha mujer una flora vaginal de microorganismos alterada, en el que se considera que dicha cepa/s bacteriana/s está/n establecida si la cepa/s está/n presente/s en la vagina después de al menos dos ciclos menstruales desde el momento de la administración, y

e): se escoge al menos una cepa bacteriana de la etapa d) que muestra la citada capacidad para colonizar y establecerse en la vagina.

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3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende otra etapa en la que al menos una cepa bacteriana cultivada de forma pura de la etapa c) y/o una combinación de al menos dos cepas bacterianas de la etapa c) se encuentra liofilizada.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende otra etapa en la que al menos se evalúa y se escoge una cepa bacteriana liofilizada y cultivada de forma pura de la etapa c) y/o una combinación de al menos dos cepas bacterianas liofilizadas de la etapa c), de forma que se garantice la estabilidad de la viabilidad bacteriana tras liofilización y la viabilidad de las bacterias liofilizadas durante largos períodos de almacenaje, en el que dicha viabilidad bacteriana se considera estable si al menos 40% de las bacterias presentan una viabilidad conservada tras liofilización y almacenaje de las bacterias liofilizadas a -18ºC durante al menos 12 meses.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, que comprende otra etapa en la que se evalúa y se escoge al menos una cepa bacteriana liofilizada y cultivada de forma pura de la etapa c) y/o una combinación de al menos dos cepas bacterianas liofilizadas de la etapa c), de forma que se garantice la estabilidad genética tras cultivos repetidos.

6. Una composición para la profilaxis y/o el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, que comprende al menos una de las cepas bacterianas de acuerdo con la reivindicación 1.

7. La composición de acuerdo con la reivindicación 6 formulada para administración vaginal.

8. Un producto higiénico para la profilaxis y/o el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, que comprende al menos una de las cepas bacterianas de acuerdo con la reivindicación 1.

9. El producto higiénico de acuerdo con la reivindicación 8, en la forma de tampón.

10. Uso de al menos una de las cepas bacterianas de acuerdo con la reivindicación 1, para la producción de una composición o un producto sanitario para la profilaxis y/o el tratamiento de infecciones del tracto urogenital.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, para la profilaxis y/o el tratamiento de vaginosis bacteriana o de cualquier otro trastorno bacteriano de la vagina.