DE60226254T3

DE60226254T3 - Milchsäureproduzierende Bakterien zur Verwendung als probiotische Organismen in der menschlichen Scheide

Info

Publication number: DE60226254T3
Application number: DE60226254.2T
Authority: DE
Inventors: Carolina Samuelsson; Endre Kvanta; Anna Weiner Jiffer
Original assignee: Ellen AB
Current assignee: Ellen AB
Priority date: 2001-09-20
Filing date: 2002-09-19
Publication date: 2017-11-16
Anticipated expiration: 2022-09-20
Also published as: PL369201A1; EP1427808B1; SE521022C2; EP1427808A1; JP2005507256A; ATE393211T2; US20080057046A1; CA2459178A1; SE0103127D0; AU2002343282B2; IL160937A0; JP4223955B2; CN1308436C; US7312067B2; DE60226254D1; DE60226254T2; ES2305313T5; CN1556852A; EP1427808B2; CA2459178C

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Milchsäure produzierende Bakterien und deren Verwendung.
Hintergrund der Erfindung
Die normale mikrobielle Flora der menschlichen Vagina umfasst Milchsäure produzierende Bakterien, die herkömmlicherweise als Döderlein-Bakterien bezeichnet werden.
Solche Milchsäure produzierenden Bakterien beziehen sich auf nicht-sporenbildende grampositive Bakterien, die durch Fermentierung verschiedener Zucker wie z. B. Glykogen und/oder Glukose Milchsäure produzieren.
Milchsäure produzierende Bakterien umfassen zum Beispiel Bakterien der Gattungen Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus und Enterococcus.
Milchsäure produzierende Bakterien können abhängig von ihrem Stoffwechselweg in homofermentative und heterofermentative Bakterien eingeteilt werden. Homofermentative Bakterien (z. B. Lactobacillus acidophilus) produzieren lediglich Milchsäure, wohingegen heterofermentative Bakterien zum Beispiel auch Kohlenstoffoxid, Ethanol- oder Essigsäure produzieren.
Die Gattung Lactobacillus ist eine phänotypisch heterogene Gruppe aus fakultativ anaeroben, katalasenegativen, stäbchenförmigen Milchsäure produzierenden Bakterien. Über 50 verschiedene Arten sind anerkannt und diese Arten besitzen im Wesentlichen DNA mit einem geringen Gehalt an Guanin (G) und Cytosin (C), ungefähr 33–53%. Der GC-Gehalt ist innerhalb einer Art konstant. Im Menschen sind mehrere Arten von Lactobacillus zu finden, z. B. in der Mundhöhle, dem Darmtrakt und der Vagina. Die Arten des Lactobacillus, die in der Vagina vorkommen, sind zum Beispiel Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus casei (Unterart rhamnosus) und Lactobacillus jensenii.
Die Gattung Pediococcus ist phänotypisch eine Gruppe grampositiver, katalasenegativer, fakultativ anaerober, sauerstofftoleranter, rundgeformter (Durchmesser ungefähr 0,6–1,0 μm) nicht pathogener Milchsäure produzierender Bakterien.
Gesunde, fruchtbare Frauen (ungefähr 15–60 Jahre) weisen zwischen den Menstruationen in der Vagina einen pH-Wert von ungefähr 3,8–4,2 auf, vor allem als Ergebnis der Milchsäureproduktion. Eine säurehaltige Umgebung verhindert das vaginale Niederlassen von zum Beispiel Bakterien, die sich im Darm befinden, wie z. B. Gardnerella vaginalis, Mobiluncus, Bakteroiden, Prevotella und Escherichia coli.
Die Haut des Urogenitaltraktes und die urogenitalen Schleimmembranen einer gesunden Frau beherbergen eine spezifische Flora vorteilhafter und/oder symbiotischer Mikroorganismen, wie z. B. verschiedene Arten von Lactobacillus. Jedoch kann der Urogenitaltrakt auch von Mikroorganismen kolonisiert werden, die Krankheiten verursachen. Die Kolonisation unerwünschter Mikroorganismen kann ein Ergebnis sexueller Übertragung sein, spontan auftreten oder das Ergebnis einer gestörten normalen mikrobiellen Flora sein. Von Letzterem weiß man zum Beispiel, dass es nach bestimmten Therapien mit Antibiotika auftritt.
Somit kann die mikrobielle Flora des weiblichen Urogenitaltraktes, wie z. B. in der Vagina, durch eine mikrobielle Infektion gestört und verändert werden, wie z. B. Hefe (Candida albicans), Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae und Chlamydia trachomatis und bakterielle Vaginose (gekennzeichnet durch ein Übergewicht an Gardnerella vaginalis und Mobiluncus), eine antibiotische Behandlung oder anderen oftmals komplexen Fällen.
Während Menstruation und Geschlechtsverkehr wird der pH-Wert in der Vagina durch das Hinzufügen von Blut bzw. Sperma erhöht. Diese Flüssigkeiten enthalten viele Proteine, die von Bakterien (z. B. Gardnerella vagnalis und Mobiluncus) verdaut werden können, die, wie vorstehend dargestellt, unter den Bedingungen eines erhöhten pH-Werts in der Vagina etabliert werden können. Dann werden Abbauprodukte, wie z. B. Amine (z. B. Putrescin und Cadacerin) produziert. Bei erhöhtem pH-Wert werden diese Amine flüchtig und bilden einen „fischartigen” Geruch. Des Weiteren haben diese Frauen oft Beschwerden wie starken vaginalen Ausfluss und Irritation. Dieser Zustand wird als bakterielle Vaginose (BV) bezeichnet und ist der am meisten verbreitete Zustand im Zusammenhang mit Irritation und erhöhter Menge an riechendem vaginalen Ausfluss (siehe Morris, M; Nicoll, A; Simms, I; Wilson, J; Catchpole, M, Bacterial vaginosis: A public health review, British Journal of Obstetrics and Gynaecology (Bakterielle Vaginose: Eine Bewertung der Volksgesundheit, Britisches Journal der Geburtshilfe und Gynäkologie), 108(5): 439–450, Mai 2001).
Bakterielle Vaginose wird als Ergebnis verlagerter vaginaler Milchsäure produzierender Bakterien betrachtet, die durch eine Vielzahl unerwünschte Arten ersetzt wurden, wie z. B. Gardnerella vaginalis, Bakterioide, Mobiluncus, Prevotella bivia und Mycoplasma hominis.
Ein Verfahren zur Diagnose der bakteriellen Vaginose (BV) wird durch Amsel-Kriterien beschrieben. Zuerst wird der pH-Wert des vaginalen Ausflusses gemessen. Der pH-Wert wird bei 90% der Frauen mit BV über 4,5 bewertet. Zweitens wird, wenn dem vaginalen Ausfluss 10% KOH hinzugegeben wird, bei ungefähr 70% der Frauen mit BV ein „fischartiger” Geruch entstehen. Drittens wird oftmals das Vorhandensein von Plattenepithelzellen im Nativpräparat bedeckt mit kleinen Coccobacilli („Hinweiszellen”) beobachtet. Ein anderer zuverlässiger Test für BV ist die direkte Gram-Färbung des vaginalen Fluids. Ein standardisiertes Verfahren zur Interpretation der Gram-Färbungen bei BV wurde von Nugent et al. dargestellt (siehe Beispiel 1).
Es ist bekannt, dass Milchsäure produzierende Bakterien die Fähigkeit besitzen, das Wachstum zu hemmen und/oder die Pathogenität vieler mit urogenitalen Infektionen assoziierten Pathogene zu reduzieren (siehe z. B. Redondo-Lopez, V; Cook, R L; Sobel, J D, Emerging role of lactobacillus in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora Reviews of infectious diseases [Neue Rolle des Lactobacillus in der Kontrolle und Bewahrung der vaginalen bakteriellen Mikroflora, Überblick über Infektionskrankheiten], vol 12, no 5, sep – oct 1990, und Boris, S; Barbes, C, Role played by lactobacilli in controlling the population of vaginal pathogens, Microbes and infection [Die Rolle von Lactobacilli in der Steuerung der Population vaginaler Pathogene], vol 2, pp 543–546, 2000).
Es ist ebenfalls bekannt, dass die antagonistischen Eigenschaften von Milchsäure produzierenden Bakterien gegen diese Pathogene mindestens teilweise durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet sind, verschiedene antagonistische Substanzen, wie Milchsäure, Wasserstoffperoxid und Bacteriocine zu produzieren.
Eine gesunde Vagina beherbergt schätzungsweise zwischen 10⁸–10⁹ cfu (Kolonien formende Einheiten) an Milchsäure produzierenden Bakterien. Die Zusammensetzung dieser Flora ist ein Ergebnis, dessen spezifische Stämme die Frau von ihrer Mutter geerbt hat und/oder die aus ihrem Verdauungstrakt in den Urogenitaltrakt abgewandert sind.
Der Stand der Technik beschreibt Rezepturen, wie z. B. Suspensionen, Zäpfchen und Gelatinekapseln, die lebenswichtige Milchsäure produzierende Bakterien umfassen. Solche Rezepturen sind zum Beispiel in US 5 466 463 und WO 9 309 793 offenbart.
Darüber hinaus ist bekannt, wie saugfähige Artikel, wie z. B. Tampons und Damenbinden, mit Milchsäure produzierenden Bakterien imprägniert werden, mit dem Zweck, eine normale mikrobielle Flora in dem Urogenitaltrakt der Frau zu bewahren und dadurch urogenitale Infektionen zu verhindern oder eine normale mikrobielle Flora in dem Urogenitaltrakt der Frau zu regenerieren. Solch ein Produkt ist in EP 0 594 628 und der Schwedischen Patentanmeldung 0003544-4 offenbart. Ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Harnwegsinfektionen, welches das Verabreichen isolierter Milchsäure produzierender Bakterien der Gattung Lactobacillus an die Vagina umfasst, ist in US 6 180 100 offenbart. Die Lactobacilli sind fähig, die Vagina für bis zu 5 Wochen nach einer einzelnen Eintröpfelung zu kolonisieren.
Jedoch ist es, um den vorstehenden Effekt zu erhalten, wichtig, dass die Uropathogen hemmenden Milchsäure produzierenden Bakterien wirklich kolonisieren und sich in vivo etablieren und tatsächlich mehr als einen Menstrualzyklus nach der vaginalen Verabreichung in der Vagina verbleiben.
Ob ein Bakterienstamm die Vagina kolonisieren wird oder nicht hängt von den adhäsiven Eigenschaften des spezifischen Bakterienstammes sowie dem hormonellen Zustand, dem Nährzustand und dem Säurezustand der Vagina ab. Eine anhaltende Genitalinfektion oder Behandlung mit Antibiotika wird die Fähigkeit eines eingeführten Stammes zur Kolonisierung der Vagina ebenfalls beeinflussen.
Der Menstrualzyklus beeinflusst ebenfalls die Haftfestigkeit und die maximale Haftfestigkeit tritt vor der Ovulation und vor der Menstrualblutung auf ( US 6,180,100 und Chan et al., Journal of Urology (Journal der Urologie), März 1984). Somit ist die schwierigste Zeit für die Kolonisierung und Etablierung der verabreichten Milchsäure produzierenden Bakterien in der Vagina die Menstrualblutung.
Im Hinblick auf die Kolonisierung und Etablierung von Milchsäure produzierenden Bakterien in vivo kann eine erhebliche Ungleichheit zwischen klinischen Ergebnissen und erwartetem bakteriellen Verhalten aus der Interpretation der in vitro Analyseergebnisse bestehen. Es ist üblich, dass zwischen verschiedenen Bakterienarten in der Vagina Interaktionen auftreten und dieses Interaktionsmuster im Labor nur schwer nachzubilden ist. Daher kann sich, selbst wenn eine Bakterienart in vitro vielversprechende Ergebnisse zeigt, möglicherweise nicht in vivo etablieren und nicht den gewünschten therapeutischen Effekt bereitstellen, d. h. die Effekte einer mikrobiellen Infektion des Urogenitaltraktes zu verhindern oder zu lindern und/oder die Infektion zu behandeln.
Darüber hinaus ist es äußerst wichtig, dass die Bakterien Stabilität ihres genetischen Profils zeigen, sowohl nach wiederholter Kultivierung in Massenherstellung als auch über längere Zeiträume hinweg in vivo.
Ein anderes Kriterium, das erfüllt werden muss, um ein annehmbares Verbrauchsprodukt zu produzieren, das den gewünschten therapeutischen Effekt bereitstellt, ist die Erhaltung der bakteriellen Lebensfähigkeit nach Lyophilisierung der Bakterien und nach Lagerung der lyophilisierten Bakterien (d. h. Haltbarkeit).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung offenbart neuartige isolierte Bakterienstämme der Gattung Lactobacillus, die die Fähigkeit besitzen, nach vaginaler Verabreichung von mindestens einem der Bakterienstämme selbst während der Menstrualblutung in einer menschlichen Vagina, die eine gestörte vaginale Mikroorganismenflora aufweist, zu kolonisieren und sich zu etablieren. Die Bakterien werden als etabliert betrachtet, wenn die Bakterien nach mindestens zwei Menstrualzyklen nach der Verabreichung noch in der Vagina vorhanden sind.
Ein Vorteil ist, dass die Bakterienstämme gemäß der Erfindung die Fähigkeit zeigen, sich während der Menstrualblutung zu etablieren, da die Bakterien dann leicht verabreicht werden können, zum Beispiel mithilfe eines mit den Bakterien imprägnierten Tampons.
Etablierte Milchsäure produzierende Bakterien der genannten Stämme verhindern und lindern die Effekte von mikrobieller Infektion des Urogenitaltraktes, insbesondere bakterielle Vaginose und/oder behandeln diese. Um diese therapeutischen Effekte zu erhalten, ist es notwendig, dass sich die Bakterien nach der Verabreichung leicht etablieren und somit noch nach mehreren Menstrualblutungen in der Vagina vorhanden sind.
Die Bakterienstämme wurden gemäß der Budapester Vereinbarung an der BCCM/LMG (Belgische koordinierte Mikroorganismensammlung/Laboratorium voor Microbiloligie-Bacteriénverzammeling, Universiteit Gent) in Belgien am 14. Juni 2001 hinterlegt und umfassen den Stamm des Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, bezeichnet durch den Anmelder als LN 113, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20562 und den Stamm des Lactobacillus fermentum, bezeichnet durch den Anmelder als LN 99 oder Varianten davon mit im Wesentlichen entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung eines Bakterienstammes der Gattung Lactobacillus oder Pediococcus, der die Fähigkeit besitzt, in einer menschlichen Vagina zu kolonisieren und sich zu etablieren, selbst während der Menstrualblutung, wobei

(a) ein Bakterienmuster, wie z. B. ein vaginales Fluid, aus dem Vaginaltrakt einer Frau mit einer normalen, gesunden vaginalen Mikroorganismenflora entnommen wird,
(b) Milchsäure produzierende Bakterien aus dem vaginalen Muster aus Schritt (a) ausgewählt werden,
(c) die Milchsäure produzierenden Bakterien aus Schritt (b) in vitro in einem geeigneten Nährmedium reinkultiviert werden, was zumindest einen isolierten Bakterienstamm liefert,
(d) mindestens ein reinkultivierter Bakterienstamm aus Schritt (c) und/oder eine Kombination aus mindestens zwei Bakterienstämmen aus Schritt (c) bewertet wird bezüglich ihrer Fähigkeit, nach vaginaler Verabreichung des Bakterienstammes an eine Frau während ihrer Menstrualblutung in der Vagina zu kolonisieren und sich darin zu etablieren, wobei die Frau eine gestörte vaginale Mikroorganismenflora aufweist und der Bakterienstamm bzw. die Bakterienstämme als etabliert betrachtet wird/werden, wenn der Bakterienstamm bzw. die Bakterienstämme nach mindestens zwei Menstrualzyklen nach der Verabreichung noch in der Vagina vorhanden ist/sind, und
e) mindestens ein Bakterienstamm aus Schritt (d) ausgewählt wird, der die Fähigkeit zeigt, in der Vagina zu kolonisieren und sich darin zu etablieren.

Vorzugsweise wird mindestens ein reinkultivierter Bakterienstamm aus Schritt (c) und/oder eine Kombination aus mindestens zwei Bakterienstämmen aus Schritt (c) lyophilisiert.
Darüber hinaus wird/werden dieser/diese Stamm/Stämme vorzugsweise bewertet und ausgewählt bezüglich der Stabilität der bakteriellen Lebensfähigkeit nach der Lyophilisierung und Lebensfähigkeit der lyophilisierten Bakterien über lange Aufbewahrungszeiten hinweg, wobei die bakterielle Lebensfähigkeit als stabil betrachtet wird, wenn mindestens 40% der Bakterien nach Lyophilisierung und einer Lagerung der lyophilisierten Bakterien während mindestens 12 Monaten bei –18°C eine bewahrte Lebensfähigkeit besitzen.
Außerdem wird/werden dieser/diese Stamm/Stämme vorzugsweise bewertet und ausgewählt bezüglich der genetischen Stabilität nach wiederholter Kultivierung und in vivo nach vaginaler Verabreichung, wobei die Bakterien als genetisch stabil betrachtet werden, wenn ihr genetisches Profil in vivo für mindestens 12 Monate bewahrt ist.
Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls einen Bakterienstamm der Gattung Lactobacillus oder Pediococcus, der die Fähigkeit besitzt, während der Menstrualblutung in einer menschlichen Vagina zu kolonisieren und sich zu etablieren, wobei der Stamm gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren isoliert werden kann. Solche Bakterienstämme sind vorzugsweise die Stämme des Lactobacillus gasseri, bezeichnet durch den Anmelder als LN 40, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20560, der Stamm des Lactobacillus casei subsp rhamnosus, bezeichnet durch den Anmelder als LN 113, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20562, der Stamm des Lactobacillus fermentum, bezeichnet durch den Anmelder als LN 99, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20561, der Stamm des Lactobacillus crispatus, bezeichnet durch den Anmelder als LN 01, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20558, und der Stamm des Pediococcus acidilactici, bezeichnet durch den Anmelder als LN 23, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20559, oder Varianten davon mit im Wesentlichen entsprechenden phänotypischen und/oder genotypischen Eigenschaften.
Des Weiteren beschreibt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Behandlung von Infektionen des Urogenitaltraktes, umfassend mindestens einen der Bakterienstämme (LN 113 und LN 99).
Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung alle Stämme, d. h. Stamm LN 113 und Stamm LN 99.
Im Stand der Technik ist bekannt, dass eine Kombination aus verschiedenen Bakterien die Generationszeit eines Bakteriums verkürzt, was ein schnelleres Bakterienwachstum zur Folge hat. Darüber hinaus wird bevorzugt, eine Kombination aus verschiedenen Bakterienarten zu verwenden, da verschiedene Arten von Milchsäure produzierenden Bakterien verschiedene Fermentierungsmuster und -eigenschaften aufweisen.
Eine Kombination aus allen Stämmen gemäß der Erfindung, d. h. LN 113 und LN 99 zeigt eine noch bessere Hemmung von Uropathogenen als jeder Stamm einzeln genommen.
Die Zusammensetzung wird vorzugsweise zur vaginalen Verabreichung formuliert, wie z. B. ein Zäpfchen, eine Kapsel, Pillen, Tabletten, Suspension, Spray, Gel, Creme, Puder oder jede andere Form zur vaginalen Einführung.
Des Weiteren beschreibt die vorliegende Erfindung einen Hygiene-Artikel, wie z. B. ein saugfähiges Produkt (z. B. Tampon, Damenbinde, Slipeinlage), eine Windel und einen Inkontinenzschutz zur Behandlung von Infektionen des Urogenitaltraktes, umfassend mindestens einen der Bakterienstämme (LN 113 und LN 99).
Vorzugsweise umfasst der Hygiene-Artikel alle Stämme, d. h. Stamm LN 113 und Stamm LN 99 aus denselben Gründen, wie vorstehend in Bezug auf die Zusammensetzung angegeben.
Der Hygiene-Artikel ist vorzugsweise ein Tampon.
Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung mindestens eines Bakterienstammes (LN 113 und LN 99) für die Produktion einer Zusammensetzung oder eines Hygiene-Artikels zur Behandlung von Infektionen des Urogenitaltraktes, vorzugsweise bakterieller Vaginose oder einer anderen bakteriellen Störung in der Vagina.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung deutlich.
Kurzbeschreibung der Figuren
1a und 1b stellen den Wachstumsprozess der Bakterienstämme LN 40, LN 99, LN 113 bzw. LN 23 dar.
2 stellt ein Bild eines Gels mit stammspezifischen Produkten dar, die mithilfe von RAPD und Gelelektrophorese erzeugt wurden. Die Stämme LN 40, LN 99, LN 113, LN 01 bzw. LN 23 werden mit der Stammart der entsprechenden Bakterienarten verglichen.
3 und 4 zeigen den in Beispiel 6 verwendeten Versuchsaufbau.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie hierin verwendet, meint der Begriff „Milchsäure produzierende Bakterien” Bakterien, die durch Fermentierung Milchsäure produzieren.
Wie hierin verwendet, meint der Begriff „therapeutisch effektive Menge” eine Menge, die zu dem gewünschten therapeutischen Effekt führen wird.
Der gewünschte therapeutische Effekt ist die Prophylaxe und/oder Behandlung von Infektionen des Urogenitaltraktes, wie z. B. bakterielle Vaginose oder jede andere bakterielle Störung in der Vagina.
Wie hierin verwendet, meint der Begriff „isolierter Bakterienstamm”, dass der Stamm in vitro in einer diesen Stamm umfassenden Kultur kultiviert sein könnte.
Wie hierin verwendet, meint der Begriff „Bakterienmuster” ein Bakterien umfassendes Muster. Das Muster kann zum Beispiel vaginales(r) Fluid/Ausfluss sein.
Wie hierin verwendet, meint der Begriff „normale, gesunde vaginale Mikroorganismenflora”, dass die Frau keine vaginalen Beschwerden hat und die Gram-Färbung des vaginalen Musters eine Gesamtpunktzahl von 0–3 gemäß dem von Nugent et al (siehe Beispiel 1) dargestellten Verfahren aufweist.
Wie hierin verwendet, meint der Begriff „gestörte vaginale Mikroorganismenflora”, dass die Frau einige vaginale Beschwerden hat, wie z. B. erhöhten vaginalen Ausfluss und/oder „fischartigen” Vaginalgeruch. Darüber hinaus weist die Gram-Färbung des vaginalen Musters eine Gesamtpunktzahl von mindestens 4, im Besonderen ≥ 7, gemäß dem von Nugent et al (siehe Beispiel 1) dargestellten Verfahren auf.
Wie hierin verwendet, meint der Begriff „geeignetes Nährmedium” ein Medium, wie z. B. eine LAB-Brühe oder MRS-Brühe, in der die Bakterien kultiviert werden können.
Wie hierin verwendet, meint der Begriff „Hygiene-Artikel” Tampons (sowohl digitale Tampons als auch Tampons mit einem Applikator), Damenbinden, Slipeinlagen, Windeln, Inkontinenzschutz und Ähnliches.
Die vorliegende Erfindung offenbart neuartige isolierte Bakterienstämme von Milchsäure produzierenden Bakterien der Gattung Lactobacillus, die die Fähigkeit besitzen, nach vaginaler Verabreichung von mindestens einem der Bakterienstämme selbst während der Menstrualblutung in einer menschlichen Vagina, die eine gestörte vaginale Mikroorganismenflora aufweist, zu kolonisieren und sich zu etablieren. Die Bakterien werden als etabliert betrachtet, wenn die Bakterien nach mindestens zwei Menstrualzyklen nach der Verabreichung noch in der Vagina vorhanden sind.
Die Bakterienstämme wurden gemäß der Budapester Vereinbarung an der BCCM/LMG (Belgische koordinierte Mikroorganismensammlung/Laboratorium voor Microbiloligie-Bacteriénverzammeling, Universiteit Gent) in Belgien am 14. Juni 2001 hinterlegt und umfassen den Stamm des Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, bezeichnet durch den Anmelder als LN 113, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20562 und den Stamm des Lactobacillus fermentum, bezeichnet durch den Anmelder als LN 99, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20561, oder Varianten davon mit im Wesentlichen entsprechenden phänotypischen und/oder genotypischen Eigenschaften.
Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung eines Bakterienstammes der Gattung Lactobacillus oder Pediococcus, der die Fähigkeit besitzt, in einer menschlichen Vagina zu kolonisieren und sich zu etablieren, wobei

(a) ein Bakterienmuster, wie z. B. ein vaginales Fluid, aus dem Vaginaltrakt einer Frau mit einer normalen, gesunden vaginalen Mikroorganismenflora entnommen wird,
(b) Milchsäure produzierende Bakterien aus dem vaginalen Muster aus Schritt (a) ausgewählt werden,
(c) die Milchsäure produzierenden Bakterien aus Schritt (b) in vitro in einem geeigneten Nährmedium reinkultiviert werden, was zumindest einen isolierten Bakterienstamm liefert,
(d) mindestens ein reinkultivierter Bakterienstamm aus Schritt (c) und/oder eine Kombination aus mindestens zwei Bakterienstämmen aus Schritt (c) bewertet wird bezüglich ihrer Fähigkeit, nach vaginaler Verabreichung des Bakterienstammes an eine Frau während ihrer Menstrualblutung in der Vagina zu kolonisieren und sich darin zu etablieren, wobei die Frau eine gestörte vaginale Mikroorganismenflora aufweist und der Bakterienstamm bzw. die Bakterienstämme als etabliert betrachtet wird bzw. werden, wenn der Bakterienstamm bzw. die Bakterienstämme nach mindestens zwei Menstrualzyklen nach Verabreichung noch in der Vagina vorhanden ist/sind, und
e) mindestens ein Bakterienstamm aus Schritt (d) ausgewählt wird, der die Fähigkeit zeigt, in der Vagina zu kolonisieren und sich darin zu etablieren.

Vorzugsweise wird mindestens ein reinkultivierter Bakterienstamm aus Schritt (c) und/oder eine Kombination aus mindestens zwei Bakterienstämmen aus Schritt (c) lyophilisiert.
Eine notwendige Menge an Bakterien sollte nach der Lyophilisierung lebensfähig sein und die Lebensfähigkeit nach der Lagerung bewahren. Darüber hinaus sollte eine notwendige Menge an lyophilisierten Bakterien, die zum Beispiel in Zusammensetzungen und/oder Hygiene-Artikeln für den Handel formuliert sind, die Lebensfähigkeit nach Lagerung bei Zimmertemperatur bewahren.
Darüber hinaus wird/werden dieser/diese Stamm/Stämme vorzugsweise bewertet und ausgewählt bezüglich der Stabilität der bakteriellen Lebensfähigkeit nach der Lyophilisierung und Lebensfähigkeit der lyophilisierten Bakterien über lange Aufbewahrungszeiten hinweg, wobei die bakterielle Lebensfähigkeit als stabil betrachtet wird, wenn mindestens 40 der Bakterien nach Lyophilisierung und einer Lagerung der lyophilisierten Bakterien während mindestens 12 Monaten bei –18°C eine bewahrte Lebensfähigkeit besitzen.
Darüber hinaus sollte mindestens 1% der in einer Art Aufbewahrungsmatrix, wie z. B. ein Öl, und in einer Zusammensetzung und/oder einem Hygiene-Artikel eingeschlossenen formulierten lyophilisierten Bakterien die Lebensfähigkeit für mindestens 12 Monate bei Zimmertemperatur bewahren.
Darüber hinaus ist die Stabilität des genetischen Profils der Bakterien nach wiederholter Kultivierung in Massenproduktion und während der Herstellungsvorgänge für zum Beispiel Zusammensetzungen und Hygiene-Artikel eine wichtige Eigenschaft. Die Bakterien sollten vorzugsweise ihr genetisches Profil nach mindestens 10 wiederholten Kultivierungen bewahren. Darüber hinaus sollten die Bakterien genetische Stabilität in vivo über längere Zeiträume nach der Verabreichung zeigen, wie z. B. mindestens 12 Monate. Daher wird/werden dieser/diese Stamm/Stämme vorzugsweise bewertet und ausgewählt bezüglich der genetischen Stabilität in vivo nach vaginaler Verabreichung, wobei die Bakterien als genetisch stabil betrachtet werden, wenn ihr genetisches Profil in vivo für mindestens 12 Monate bewahrt ist. Außerdem sind das Bakterienwachstum und die Generationszeit entscheidend. Vaginal verabreichte lyophilisierte Bakterien sollten innerhalb von mindestens 4 Stunden nach der Verabreichung zu wachsen beginnen. Die Generationszeit sollte weniger als 2 h Stunden betragen.
Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls einen Bakterienstamm der Gattung Lactobacillus oder Pediococcus, der die Fähigkeit besitzt, während der Menstrualblutung in einer menschlichen Vagina zu kolonisieren und sich zu etablieren, wobei der Stamm gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren isoliert werden kann. Solche Bakterienstämme sind vorzugsweise die Stämme des Lactobacillus gasseri, bezeichnet durch den Anmelder als LN 40, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20560, der Stamm des Lactobacillus casei subsp rhamnosus, bezeichnet durch den Anmelder als LN 113, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20562, der Stamm des Lactobacillus fermentum, bezeichnet durch den Anmelder als LN 99, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20561, der Stamm des Lactobacillus crispatus, bezeichnet durch den Anmelder als LN 01, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20558, und der Stamm des Pediococcus acidilactici, bezeichnet durch den Anmelder als LN 23, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20559, oder Varianten davon mit im Wesentlichen entsprechenden phänotypischen und/oder genotypischen Eigenschaften.
Isolierung und Bewertung von Lactobacillus- und Pediococcusstämmen
Bakterienstämme der Gattungen Lactobacillus und Pedicoccus, die die Fähigkeit besitzen, in einer menschlichen Vagina zu kolonisieren und sich zu etablieren, wurden gemäß den folgenden Schritten isoliert:

– Entnahme eines vaginalen Fluids aus dem Vaginaltrakt einer Frau mit einer normalen, gesunden vaginalen Mikroorganismenflora,
– Auswahl der Milchsäure produzierenden Bakterien (ungefähr 25 verschiedene Stämme) aus dem vaginalen Fluid durch Platzieren eines Abstrichs des Fluids auf ein MRS-Agar, das für Milchsäure produzierende Bakterien (einzelne Kolonien wurden ausgewählt und auf eine frische MRS-Agarplatte gegeben, um die Reinheit zu kontrollieren) ausgewählt wurde,
– Reinkultur der Milchsäure produzierenden Bakterien in vitro in einem geeigneten Nährmedium und unter geeigneten Bedingungen (pH-Wert, Temperatur etc.), was isolierte Bakterienstämme liefert, und
– anschließende Bewertung der reinkultivierten Bakterienstämme bezüglich ihrer Fähigkeit, nach vaginaler Verabreichung der Bakterienstämme an eine Frau während ihrer Menstrualblutung zu kolonisieren und sich in der Vagina zu etablieren, wobei die Frau eine gestörte vaginale Mikroorganismenflora aufweist.

LN 40 wurde in LAB-Brühe (pH-Wert von ungefähr 6,5) reinkultiviert, mikroaerophil bei ungefähr 37°C.
LN 113 wurde in MRS-Brühe (pH-Wert von ungefähr 6,5) reinkultiviert, mikroaerophil bei ungefähr 37°C.
LN 99 wurde in LAB-Brühe (pH-Wert von ungefähr 6,5) reinkultiviert, mikroaerophil bei ungefähr 37°C.
LN 01 wurde in MRS-Brühe (pH-Wert von ungefähr 6,5) reinkultiviert, anaerob bei ungefähr 37°C.
LN 23 wurde in MRS-Brühe (pH-Wert von ungefähr 6,5) reinkultiviert, mikroaerophil bei ungefähr 37°C.
Die reinkultivierten Bakterienstämme wurden zunächst bezüglich ihrer Generationszeit bewertet. Die Bakterienstämme (ungefähr 15 verschiedene Stämme), die eine Generationszeit < 30 Minuten zeigten, wurden ausgewählt. Diese ausgewählten Stämme wurden auf der Basis ihrer Fähigkeit, das Wachstum einiger Mikroorganismen in vitro zu hemmen, gescreent (Daten nicht dargestellt). Zunächst wurde die Fähigkeit bewertet, das Wachstum von Staphilococcus epidemidis (zwei verschiedene Stämme), Enterococcus cloace, Eschericha coli, Serratia marcesus, Micrococcus lysodeicticus und Candida albicans zu hemmen. 8 verschiedene Bakterienstämme (7 Stämme der Gattung Lactobacillus und 1 Stamm der Gattung Pediococcus) zeigten diese Fähigkeit und wurden deshalb ausgewählt. Diese 8 Stämme wurden ferner bezüglich ihrer Fähigkeit, das Wachstum der uropathogenen Gardnerella vaginalis zu hemmen, bewertet. Die besten Stämme (d. h. die Stämme mit dem besten Potential zum Kolonisieren einer gestörten vaginalen Mikroorganismenflora) waren LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23.
Diese Stämme wurden ferner mithilfe klinischer Studien bewertet, wobei die Bakterien als in der Vagina etabliert betrachtet werden, wenn die Bakterien nach mindestens zwei Menstrualzyklen nach Verabreichung noch in der Vagina vorhanden sind (die Verabreichung der Bakterien begann während der ersten Menstrualblutung). Die Bakterienstämme (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23), die die Fähigkeit zeigten, in der Vagina zu kolonisieren und sich zu etablieren, wurden ausgewählt.
Des Weiteren wurden die Stabilität der bakteriellen Lebensfähigkeit nach Lyophilisierung und die Lebensfähigkeit der lyophilisierten Bakterien über lange Aufbewahrungszeiten hinweg (Haltbarkeit), Bewahrung des genetischen Profils nach wiederholter Kultivierung und in vivo und der bakterielle Wachstumsprozess bewertet.
Beispiel 1: Kolonisierung und Etablierung von Milchsäure produzierenden Bakterien nach vaginaler Verabreichung
15 BV-Patientinnen (Frauen, bei denen bakterielle Vaginose diagnostiziert worden ist) wurden untersucht. Alle 15 Patientinnen wurden 3 Tage mit Clindamycin-Ovula (Dalacin^® 2% Ovula, von Pharmacia) behandelt. Danach wurde die Behandlung mit einem doppelblinden Placebo kontrollierten Teil fortgesetzt, in dem 6 Patientinnen während des ersten Menstrualzyklus nach der Behandlung mit Antibiotika Tampons verwendeten, die ungefähr 10³ cfu lyophilisierte Bakterien der Stämme LN 01, LN 23, LN 99, LN 113 und LN 40 umfassen. Die anderen 9 Patientinnen verwendeten herkömmliche Tampons ohne Milchsäure produzierende Bakterien.
Während der zweiten Monatsblutung verwendeten alle 15 Patientinnen herkömmliche Tampons ohne Milchsäure produzierende Bakterien und ein paar Tage nach der Blutung wurde ein vaginales Muster genommen.
Die vaginalen Muster wurden gram-gefärbt. In dem standardisierten Gram-Färbungsverfahren, dargestellt von Nugent et al, wird das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein bestimmter bakterieller Morphotypen analysiert. Die Morphotypen sind große, grampositive Bazillen des Lactobacillus-Morphotyps; kleinere gramvariable Bazillen, Gardnerella-Morphotyp genannt, und gekrümmte Stäbchen. Die in dem vaginalen Fluid vorhandenen Organismen werden quantifiziert und in eine Punktzahl übertragen (siehe Tabelle 1). Tabelle 1

Code

Lactobacillus Morphotyp Gardnerella und Bakteroiden Morphotypen Gekrümmte ramvariable Stäbchen Punktzahl

4+ 0 0 0

₃₊ 1+ 1+ or 2+ 1

2+ 2+ 3+ or 4+ 2

1+ 3+ 3

0 4+ 4

Die Codes 0 bis 4+ basieren auf der durchschnittlichen Anzahl an Organismen mit dem Morphotyp pro Ölimmersionsfeld; 1+, < 1 vorhanden, 2+, 1–4 vorhanden, 3+, 5–30 vorhanden; 4+, ≥ 30 vorhanden. Eine Gesamtpunktzahl wird durch Summieren der Punktzahlen für alle drei Morphotypen erhalten. Die Gesamtpunktzahl wird folgendermaßen interpretiert: 0–3, normal; 4–6, mittel; und ≥ 7, BV. Tabelle 2

Patienten nummer	Gram-Färbung vor Untersuchungsbeginn	Tampons (L = Milchsäure produzierende Bakterien)	Gram-Färbung nach der zweiten Menstrualblutung
1	7	L	0
2	8	L	0
3	9		7
4	5		4
5	10		0
6	8		4
7	8	L	0
8	9		4
9	4	L	0
10	8		4
11	8		4
12	8		0
13	8	L	1
14	0		5
15	9	L	0

Bei den 6 Patientinnen, die den Tampon mit den Milchsäure produzierenden Bakterien verwendet haben, wurde keine bakterielle Vaginose festgestellt. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass die Milchsäure produzierenden Bakterien noch nach dem zweiten Menstrualzyklus in der Vagina vorhanden waren.
Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, dass eine relativ kleine Anzahl verabreichter Bakterien (ungefähr 10³ cfu) für eine vollständige vaginale Kolonisierung und Etablierung der Bakterienstämme während der Menstrualblutung gemäß der vorliegenden Erfindung ausreichend ist.
Des Weiteren weisen die Bakterienstämme gemäß der vorliegenden Erfindung ausgezeichnete adhäsive Eigenschaften an den vaginalen Schleimmembranen auf.
Beispiel 2: Kolonisierung und Etablierung von Milchsäure produzierenden Bakterien nach vaginaler Verabreichung
Vier gesunde Frauen ohne vaginale Beschwerden verwendeten während ihrer monatlichen Menstrualblutung über einen Zeitraum von 12–18 Monaten Tampons, die ungefähr 10³ cfu lyophilisierte Bakterien der Stämme LN 01, LN 23, LN 99, LN 113 und LN 40 umfassen.
Von jeder Frau wurden nach dem Testzeitraum vaginale Muster bewertet. Die in den Mustern gefundenen Lactobacillus- und Pediococcusstämme wurden mithilfe von RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – etwa zufällig vervielfältigte polymorphe DNA) identifiziert, wie in Beispiel 10 beschrieben.
LN 01 und LN 113 wurden in zwei der vaginalen Muster dieser Frauen identifiziert.
LN 40 wurde in einem der vaginalen Muster dieser Frauen identifiziert.
LN 23 und LN 99 wurden in keinem der vaginalen Muster dieser Frauen identifiziert.
Eine Erklärung für diese Ergebnisse könnte darin liegen, dass, wenn der Bakterienpool an eine Frau verabreicht wird, die eine gesunde Vaginalflora mit einem normalen vaginalen pH-Wert aufweist, LN 23 im Wesentlichen nicht wachsen wird. Wenn der Bakterienpool jedoch an eine Frau verabreicht wird, die eine gestörte vaginale Mikroorganismenflora aufweist, dann wird sich LN 23 zunächst etablieren und eine günstige Umgebung bereitstellen, in der die anderen Bakterienstämme (LN 01, LN 113, LN 40 und LN 99) wachsen können.
Es ist zu beachten, dass einzelne Unterschiede bezüglich der Eignung eines spezifischen Stammes und/oder spezifischen Kombinationen aus Stämmen bestehen, sich in der Vagina einer Frau zu etablieren und dort zu wachsen.
Mindestens einer der Bakterienstämme gemäß der Erfindung wurde in jedem vaginalen Muster identifiziert.
Beispiel 3: Stabilität der Lebensfähigkeit nach der Lyophilisierung und über lange Aufbewahrungszeiten hinweg (Haltbarkeit) der Bakterienstämme LN 40, LN 113, LN 99 und LN 23

Die lyophilisierten Bakterienstämme LN 40, LN 113, LN 99 und LN 23 wurden bezüglich ihrer Stabilität der Lebensfähigkeit über längere Aufbewahrungszeiten hinweg (d. h. Haltbarkeit) bei ungefähr –18°C bewertet. Tabelle 3

Zeit nach Lyophilisierung [Monate]	Lebensfähige Bakterien [cfu/g]
	LN 40	LN 113	LN 99	LN 23	LN 01
0	83 × 10⁹	224 × 10¹⁰	33 × 10⁹	83 × 109 10⁹	20 × 10⁹
12	47 × 10⁹ (~57%)	192 × 10¹⁰ (~86%)	14 × 10⁹ (~42%)	272 × 10⁹ (~94%)	19 × 10⁹ (~95%)
78	22 × 10⁹ (~27%)	46 × 10⁹ (~21%)	6 × 10⁹ (~18%)	155 × 10⁹ (~53%)	2 × 10⁹ (~10%)

Die in Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass mindestens 40% der Bakterien noch nach 12 Monaten bei –18°C lebensfähig sind. Darüber hinaus sind mindestens ungefähr 10–20% der Bakterien noch nach 78 Monaten bei –18°C lebensfähig.
Darüber hinaus wurden diese Bakterien auch gemäß API 50CH analysiert und die aus dieser Analyse erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Stämme LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01 ihr genetisches Profil bei Lagerung in lyophilisierter Form bei –18°C für mindestens 78 Monate bewahren.

Die lyophilisierten Bakterien (LN 40, LN 113, LN 99 und LN 23) wurden in Akosoft^® 36 (von Karlshamns AB) aufgelöst und bezüglich ihrer Stabilität der Lebensfähigkeit über längere Aufbewahrungszeiten hinweg (d. h. Haltbarkeit) bei ungefähr 8°C bzw. 22°C bewertet. Tabelle 4

Zeit nach der Herstellung (Woche/Monate)	Lebensfähige Bakterien (cfu/g)
	+8°C	+22°C
0	3,5 × 10¹⁰	3,5 × 10¹⁰
1 Woche	2,7 × 10¹⁰ (~75%)	1,9 × 10¹⁰ (~53%)
1	2,5 × 10¹⁰ (~71%)	1,3 × 10¹⁰ (~37%)
3,5	2,0 × 10¹⁰ (~55%)	6 × 10⁹ (~17%)
6	2,4 × 10¹⁰ (~68%)	3,9 × 10⁹ (~11%)
9	1,8 × 10¹⁰ (~50%)	1,0 × 10⁹ (~2,8%)
12	1,7 × 10¹⁰ (~49%)	1,3 × 10⁹ (~3,7%)

Die in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass ungefähr 45–50 der Bakterien noch nach 12 Monaten bei 8°C lebensfähig sind. Darüber hinaus sind ungefähr 4% der Bakterien bei Zimmertemperatur, d. h. 22°C, noch nach 12 Monaten lebensfähig.
Ähnliche Ergebnisse wurden für einen lyophilisierten Bakterienpool erhalten, der alle Bakterienstämme gemäß der Erfindung, einschließlich LN 01, umfasst.
Beispiel 4: Bewahrung des genetischen Profils nach wiederholter Kultivierung der Bakterienstämme LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23
Die Bakterienstämme (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23) wurden 10 mal wiederholt kultiviert und anschließend mit API 50CH bewertet. Die Fermentierungsmuster jedes Bakterienstammes (siehe Beispiel 9) waren nach der wiederholten Kultivierung bewahrt. Daher zeigen die Ergebnisse, dass die Bakterienstämme ihr genetisches Profil nach wiederholter Kultivierung bewahren.
Beispiel 5: Bakterienwachstumsprozess für Bakterienstämme LN 40, LN 99, LN 113, LN 23 und LN 01
Um den gewünschten therapeutischen Effekt bereitzustellen, sollten vaginal verabreichte lyophilisierte Bakterien innerhalb von mindestens 4 Stunden nach der Verabreichung zu wachsen beginnen.
Das Absorptionsvermögen (optische Dichte, OD) wurde für lyophilisierte Bakterien (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01), die der sterilisierten MRS-Brühe zugegeben wurden, bei 620 nm gemessen. Zwei Arten von Experimenten (siehe 1a und 1b) wurden durchgeführt: 0,01 g lyophilisierte Bakterien wurden zu 3 ml MRS-Brühe zugegeben, und 100 pl dieser Dispersion wurden mit 3 ml zusätzlicher MRS-Brühe verdünnt, und lyophilisierte Bakterien wurden zu MRS-Brühe zugegeben in einer Menge, die ein Absorptionsvermögen von ungefähr 0,100 zur Folge hat.
Die die vorstehenden Bakteriendispersionen enthaltenden Küvetten wurden bei 37°C gelagert und das Absorptionsvermögen wurde 10,5 h lang alle 15 min gemessen.
Wie in 1a und 1b deutlich wird, ist das Bakterienwachstum für jeden Bakterienstamm (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 bzw. LN 01) rasant und alle Bakterienstämme beginnen, innerhalb von mindestens 2 Stunden zu wachsen.
Darüber hinaus beträgt die Generationszeit jedes Bakterienstammes ungefähr 20–25 min. Daher wachsen die Bakterien schneller als Uropathogene, was im Hinblick auf die hierin beschriebene Verwendung der Bakterien sehr günstig ist.
Außerdem ist in der Technik bekannt, dass eine Kombination aus verschiedenen Bakterien die Generationszeit eines Bakteriums verkürzt, was ein schnelleres Bakterienwachstum zur Folge hat. Darüber hinaus wird bevorzugt, eine Kombination aus verschiedenen Bakterienarten zu verwenden, da verschiedene Arten von Milchsäure produzierenden Bakterien verschiedene Fermentierungsmuster und -eigenschaften aufweisen.
Es sollte beachtet werden, dass eine Kombination aus gefriergetrockneten LN 40, LN 99, LN 113, LN 23 und LN 01 innerhalb von 1,5 h zu wachsen beginnen, somit mindestens 25% schneller als die für jeden Bakterienstamm benötigte Zeit.
Beispiel 6: Fähigkeit, das Wachstum von Uropathogenen zu hemmen
Der Zweck dieses Beispiels liegt darin, zu zeigen, dass ein Bakterienpool aus LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01 in Bezug auf das Hemmen des Wachstums von Uropathogenen sogar noch effektiver ist als jeder der Bakterienstämme für sich betrachtet.
Die zu testenden Milchsäure produzierenden Bakterien wurden einem geschmolzenen, sterilen Stammagarmedium, wie z. B. einem MRS-Agar, zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde in eine Petrischale (Ø 90 mm) 1 gegeben und die Schale wurde auf die Art und Weise geneigt, dass das Agargemisch 2 an einer Seite der Schale lediglich ungefähr 1 mm vom Boden der Schale und auf der gegenüberliegenden Seite der Schale ungefähr 11 mm erreicht, wie in 3 dargestellt.
Das Uropathogen wurde homogen einem geschmolzenen, sterilen Stammagarmedium, wie z. B. einem VRB(Violett Rot Galle)-Agar, zugegeben. Das Gemisch wurde auf den vorstehend erwähnten verfestigten Agar gegeben, umfassend die Milchsäure produzierenden Bakterien, wie in 3 dargestellt, und es wurde ebenfalls zugelassen, dass sich dieses Agargemisch 3 verfestigt.
Die Milchsäure produzierenden Bakterien und das Uropathogen wurden anschließend für ungefähr 24 h bei 37°C bebrütet. Zwei klare Bereiche 4 und 5 waren anschließend in der vorstehend erwähnten Schale 1 sichtbar, wie in 4 dargestellt. In dem ersten Bereich 4 konnte das Uropathogen wachsen. In dem zweiten Bereich 5 hatten die Milchsäure produzierenden Bakterien das Wachstum des Uropathogens gehemmt.
Die Fähigkeit der Milchsäure produzierenden Bakterien, das Uropathogen zu hemmen, kann quantifiziert werden, indem die Länge L des zweiten Bereiches 5, d. h. der gehemmte Wachstumsbereich 5, gemessen wird.
Ein Enteropathogen E coli(EPEC)-Stamm wurde in diesem Experiment verwendet.
Die Länge L des gehemmten Wachstumsbereichs lag für jeden der Bakterienstämme LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23 im Bereich von 8 bis 22 mm.
Jedoch wies der LN 40, LN 113, 10 LN 99, LN 01 und LN 23 umfassende Bakterienpool eine Länge L des gehemmten Wachstumsbereichs von 32–34 mm auf.
Daher ist ein alle Bakterienstämme LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23 umfassender Bakterienpool in Bezug auf das Hemmen des Wachstum von Uropathogenen, wie z. B. E coli, sogar noch effektiver als jeder der Bakterienstämme für sich betrachtet. Somit wird bevorzugt, eine Kombination der Bakterienstämme gemäß der Erfindung zu verwenden.
Charakterisierung der Bakterienstämme LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23
Die Bakterien wurden sowohl durch phänotypische als auch durch genotypische Verfahren charakterisiert.
Beispiel 7: Mikrobiologische Charakterisierung der Bakterienstämme LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23
Die Stämme (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01) wurden mit Bezug auf Zellmorphologie, Gram-Färbung, Oxidase- und Katalasereaktion charakterisiert.
Der Stamm LN 40 umfasste grampositive, katalasenegative, oxidasenegative, nichtstäbchenbildende, stäbchenförmige (ungefähr 0,9 μm × 3–10 μm) Bakterien, die als einzelne Zellen oder paarweise auftreten.
Der Stamm LN 99 umfasste grampositive, katalasenegative, oxidasenegative, nichtstäbchenbildende, stäbchenförmige (ungefähr 0,9 μm × 1,5–2,0 μm) Bakterien, die als einzelne Zellen oder paarweise auftreten.
Der Stamm LN 113 umfasste grampositive, katalasenegative, oxidasenegative, nichtstäbchenbildende, stäbchenförmige (ungefähr 0,9 μm × 2 μm) Bakterien, die als einzelne Zellen oder paarweise auftreten.
Der Stamm LN 01 umfasste grampositive, katalasenegative, oxidasenegative, nichtstäbchenbildende, gerade oder leicht gekrümmte stäbchenförmige (ungefähr 0,8–1,6 μm × 2,3–11 μm) Bakterien, die als einzelne Zellen oder in Ketten auftreten.
Der Stamm LN 23 umfasste grampositive, katalasenegative, oxidasenegative, nichtstäbchenbildende, stäbchenförmige (0 ungefähr 1 μm) Bakterien, die als einzelne Zellen oder paarweise auftreten.
Beispiel 8: SDS-PAGE und Clusteranalyse der Bakterienstämme LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23
Die Kulturen wuchsen auf einem MRS-Agar (Oxoid CM361) für 24 h bei 37°C unter anaeroben Bedingungen. Die Herstellung der Zellextrakte und die Proteingelelektrophorese (SDS-PAGE) wurden ausgeführt bei BCCM'''/LMG in Übereinstimmung mit dem Protokoll, das etabliert wurde von der Research Group of Laboratory for Microbiology, University Ghent (Pot, B, Vandamme, P, Kersters, K, Analysis of electrophoretic whole-organism protein fingerprints, Chemical Methods in Prokaryotic Systematics, M, Goodfellow, and A G, O'Donell (eds), J Wiley & Sons, Chichester (1994)) (Forschungsgruppe des Labors für Mikrobiologie, Universität Gent (Pot, B, Vandamme, P, Kersters, K, Analyse von elektrophoretischen Proteinfingerabdrücken des gesamten Organismus, Chemische Verfahren in Prokaryotischen Systematiken, M, Goodfellow und A G, O'Donell (eds), J Wiley & Sons, Chichester (1994))).
Die normalisierten und digitalisierten Proteinmuster wurden numerisch analysiert und mit den Referenzprofilen in der BCCM-Datenbank (Dezember 1999) für LN 40, LN 113, LN 99 und LN 23 in Cluster verpackt. LN 01 wurde analysiert und mit den Bezugsprofilen in der CCUG-Datenbank (Januar 2001) in Cluster verpackt.
Es wurde herausgefunden, dass der Stamm LN 40 zur Art des Lactobacillus johnsonii oder des Lactobacillus gasseri gehört.
Es wurde herausgefunden, dass LN 99 zur Art des Lactobacillus fermentum gehört.
Es wurde herausgefunden, dass der Stamm LN 113 zur Art des Lactobacillus casei subsp rhamnosus gehört.
Es wurde herausgefunden, dass der Stamm LN 23 zur Art des Pediococcus acidilactici gehört.
Es wurde herausgefunden, dass der Stamm LN 01 zur Art des Lactobacillus crispatus gehört.
Beispiel 9: Charakterisierung der Bakterienstämme LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01 unter Verwendung von API 50CH und rapid ID32 strep
Die Fähigkeit der Stämme (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01), verschiedene Kohlehydrate zu fermentieren, ist in Tabelle 5 dargestellt. Die Tests wurden mithilfe von API 50CH und API rapid ID32 Strep bei 37°C gemäß Herstelleranweisungen durchgeführt. Für die Ergebnisse, die sich zwischen API 50CH API und rapid ID32strep unterscheiden, wird das API 50CH-Ergebnis als zuverlässiger betrachtet.
Die entstandenen Fermentierungsmuster wurden in der CCUG-Datenbank gesucht. Die höchsten Datenbanktreffer, die für jeden Stamm erhalten wurden, bestätigten die Ergebnisse aus der vorstehend beschriebenen Analyse (SDS-PAGE/Clusteranalyse) in Bezug darauf, zu welcher Bakterienart der jeweilige Stamm gehört.
Darüber hinaus bestätigte die Reaktion mit rhamnose, dass der Stamm LN 113 zur Art des Lactobacillus casei subsp rhamnosus gehört.
Jedoch zeigten Vergleiche zwischen LN 40, LN 99, LN 113, LN 23 bzw. LN 01 und Stammarten jeder Bakterienart (CCUG 31451^T, CCUG 30138^T, CCUG 21452^T, CCUG 32235^T bzw. CCUG 44117^T) wesentliche Unterschiede für alle Stämme (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01) in Bezug auf Fermentierungsmuster.

In Tabelle 5 beschreibt 1, dass keine Reaktion auftrat, 2 das Auftreten einer unbestimmten Reaktion, 3 das Auftreten einer Reaktion, 4 das Auftreten einer starken Reaktion und 5 das Auftreten einer sehr starken Reaktion. Tabelle 5

	LN 40	LN 99	LN 113	LN 23	LN 01
API 50CH
Kontrolle	1	1	1	1	1
Glyzerin	1	1	1	1	1
Erythritol	1	1	1	1	1
D-Arabinose	1	1	1	1	1
L-Arabinose	1	1	1	5	1
Ribose	1	5	5	5	1
D-Xylose	1	5	1	5	1
L-Xylose	1	1	1	1	1
Adonitol	1	1	1	1	1
0-Methyl-D-Xylosid	1	1	1	1	1
Galaktose	4	5	5	5	3
Glukose	5	5	5	5	5
Fruktose	5	4	5	5	5
Mannose	4	3	5	5	4
Sorbose	1	1	5	1	1
Rhamnose	1	1	3	1	1
Dulcitol	1	1	1	1	1
Inositol	1	1	3	1	1
Mannitol	1	1	5	1	1
Sorbitol	1	1	5	1	1
a-Methyl-D-Mannosid	1	1	1	1	1
a-Methyl-D-Glukosid	1	1	5	1	1
N-Acetyl-Glukosamin	5	1	4	4	3
Amygdalin	3	1	4	2	3
Arbutin	1	1	4	4	3
Aesculin	5	1	5	5	3
Salicin	2	1	4	4	3
Cellobiose	5	1	5	5	3
Maltose	5	4	3	1	5
Laktose	3	4	5	1	3
Melibiose	5	4	1	1	1
Saccharose	5	4	3	1	5
Trehalose	1	4	5	1	3
Inulin	1	1	1	1	1
Melezitose	1	1	5	1	1
D-Raffinose	5	4	1	1	3
Stärke	1	1	1	1	4
Glykogen	1	1	1	1	4
Xylitol	1	1	1	1	1
P-Gentiobiose	4	1	3	3	2
D-Turanose	1	1	5	1	3
D-Lyxose	1	1	3	1	1
D-Tagarose	2	1	5	4	1
D-Fukose	1	1	1	1	1
L-Fukose	1	1	1	1	1
D-Arabitol	1	1	1	1	1
L-Arabitol	1	1	1	1	1
Glukonat	1	3	2	1	1
2-Keto-Glukonat	1	1	1	1	1
5-Keto-Glukonat	1	1	1	1	1
API rapid ID32s
Arginindihydrolase	1	5	1	5	1
P-Glukosidase	5	1	5	3	1
3-Galaktosidase (1)	1	5	1	1	5
P-Glukuronidase	1	1	1	1	1
a-Galaktosidase	5	3	1	1	1
Alkalinphosphatase	1	1	1	1	2
Ribose	1	5	5	1	1
Mannitol	1	1	5	1	1
Sorbitol	1	1	1	1	1
Laktose	1	5	1	1	1
Trehalose	1	5	5	1	3
Raffinose	5	1	1	1	2
Acetoin	5	5	5	5	1
Alanin-Phenylalanin-Prolin-	5	1	4	3	5
P-Galaktosidase (2)	1	5	5	1	5
Pyroglutamat	4	1	5	1	1

N-Acetyl-p-Glukosamine	1	1	2	1	1
Hippurat	1	1	5	4	1
Glykogen	1	1	1	1	1
Pullulan	1	1	1	1	1
Maltose	2	5	1	1	5
Melibiose	5	1	1	1	1
Melezitose	1	1	2	1	1
Sukrose	5	5	1	1	5
L-Arabinose	1	1	1	1	1
D-Arabitol	1	1	1	1	1
Methyl-P-D-Glukopyranosid	2	1	1	1	1
Tagatose	3	1	3	1	1
P-Mannosidase	1	1	1	1	1
Cyclodextrin	1	1	1	1	1
Urease	1	1	1	1	1
Hämolyse	3	1	3	3	3

Beispiel 10: Charakterisierung der Bakterienstämme LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01 unter Verwendung von zufällig vervielfältiger polymorpher DNA.
Darüber hinaus wurden die Bakterienstämme mit RAPD (zufällig vervielfältigter polymorpher DNA) analysiert. Dieses Verfahren wird zum Beispiel beschrieben von Willians, 3 G, et al, Nucl Acids Res, 18: 6531 (1990) und wurde bisher nicht nur verwendet, um Stammdiversiät zu detektieren, sondern auch für Genmapping, Populationsanalysen, Epidemiologie und zum Analysieren von taxonomischen und phylogenetischen Verhältnissen (Welsh, 3, et al, PCR 2: A Practical Approach (Ein praktischer Ansatz), McPherson, M 3, Hames, B D, and Taylor, G R, eds Chapter 11, IRL Press (1995).
Reproduzierbare Anordnungen aus stammspezifischen Produkten wurden unter Verwendung eines kurzen Oligonukleotidprimers (5'ACGCGCAAC 3') unter niedrigen Verknappungsbedingungen in PCR (Polymerase-Kettenreaktion) erzeugt. Die entstandenen Anordnungen wurden anschließend durch Gelelektrophorese analysiert und mit Stammarten jeder Bakterienart verglichen, die derselben Behandlung unterzogen wurde.
Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 2 zusammengefasst.
Bahn 1 ist L fermentum, ATCC 14931^T,
Bahn 2 ist LN 99,
Bahn 3 ist L crispatus, CCUG 44117^T,
Bahn 4 ist LN 01,
Bahn 5 ist ein 100 bp Molargewichtsmarker,
Bahn 6 ist LN 23,
Bahn 7 ist LN 40,
Bahn 8 ist LN gasseri, ATCC 19992^T,
Bahn 9 ist LN 113, und
Bahn 10 ist L casei ATCC 4646^T.
In 2 sind die Hauptunterschiede zwischen den Bakterienstämmen gemäß der vorliegenden Erfindung (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 und LN 01) und den jeweiligen Artenstämmen zu sehen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf eine Zusammensetzung zur Behandlung von Infektionen des Urogenitaltraktes, umfassend mindestens einen der Bakterienstämme (LN 113 und LN 99).
Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung alle Stämme, d. h. Stamm LN 113 und Stamm LN 99.
Die Zusammensetzung wird vorzugsweise zur vaginalen Verabreichung formuliert, wie z. B. ein Zäpfchen, eine Kapsel, Pillen, Tabletten, Suspension, Spray, Gel, Creme, Puder oder jede andere Form zur vaginalen Einführung, die herkömmliche in der Technik verwendete pharmazeutische Arzneiträger umfassen können. Des Weiteren beschreibt die vorliegende Erfindung einen Hygiene-Artikel, wie z. B. ein saugfähiges Produkt (z. B. Tampons, Damenbinden, Slipeinlagen etc.), Windeln und Inkontinenzschutz, zur Behandlung von Infektionen des Urogenitaltraktes, umfassend mindestens einen der Bakterienstämme (LN 113 und LN 99).
Vorzugsweise umfasst der Hygiene-Artikel alle Stämme, d. h. Stamm LN 113 und Stamm LN 99.
Der Hygiene-Artikel ist vorzugsweise ein Tampon.
Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung mindestens eines Bakterienstammes (LN 113 und LN 99) für die Produktion einer Zusammensetzung oder eines Hygiene-Artikels zur Behandlung von Infektionen des Urogenitaltraktes, vorzugsweise bakterieller Vaginose oder einer anderen bakteriellen Störung in der Vagina.
Zusammenfassend zeigen die Bakterienstämme LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 und LN 23 ausgezeichnete Eigenschaften in Bezug auf:

– die Fähigkeit, das Wachstum von Uropathogenen (einschließlich einem rasanten Bakterienwachstum) zu hemmen,
– Fähigkeit, nach vaginaler Verabreichung in vivo zu kolonisieren und sich zu etablieren, selbst während der Menstrualblutung,
– Stabilität der bakteriellen Lebensfähigkeit nach Lyophilisierung und über längere Aufbewahrungszeiten hinweg (Haltbarkeit), und
– Bewahrung des genetischen Profils nach wiederholter Kultivierung und in vivo.

Darüber hinaus werden diese Bakterienstämme auch im Hinblick auf ökonomische Aspekte bevorzugt.
Alles in allem implizieren diese Eigenschaften, dass die Bakterienstämme gemäß der vorliegenden Erfindung sehr gut geeignet sind für die industrielle Massenproduktion eines Verbrauchsartikels (wie z. B. einer Zusammensetzung oder eines Hygiene-Artikels), der die Bakterienstämme umfasst, um die Effekte einer mikrobiellen Infektion des Urogenitaltraktes zu verhindern oder zu verringern und/oder die Infektion zu behandeln.

Claims

Isolierter Bakterienstamm der Gattung Lactobacillus, dadurch gekennzeichnet, dass er aus der Gruppe der Stämme Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, LN 113, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20562 und Lactobacillus fermentum, LN 99, hinterlegt unter der Nummer LMG P-20561, ausgewählt ist und die Fähigkeit besitzt, nach vaginaler Verabreichung selbst während der Menstrualblutung in einer menschlichen Vagina, die eine gestörte vaginale Mikroorganismenflora aufweist, zu kolonisieren und sich darin zu etablieren, wobei der Bakterienstamm bzw. die Bakterienstämme als etabliert betrachtet werden, wenn der Bakterienstamm bzw. die Bakterienstämme nach wenigstens zwei Menstrualzyklen von der Verabreichung an gerechnet noch in der Vagina vorhanden sind, die Stämme wurden am 14. Juni 2001 bei den belgischen koordinierten Mikroorganismensammlungen hinterlegt.
Verfahren zur Isolierung eines Bakterienstammes der Gattung Lactobacillus oder Pediococcus, der die Fähigkeit besitzt, in einer menschlichen Vagina selbst während der Menstrualblutung zu kolonisieren und sich darin zu etablieren, die folgenden Schritte umfassend: a) Entnahme eines Bakterienmusters vom Vaginaltrakt einer Frau mit einer normalen, gesunden vaginalen Mikroorganismenflora, b) Auswahl von Milchsäure produzierenden Bakterien aus dem vaginalen Muster von Schritt (a), c) Reinkultur der Milchsäure produzierenden Bakterien aus Schritt (b) in vitro in einem geeigneten Nährmedium, was zumindest einen isolierten Bakterienstamm liefert, d) Bewertung zumindest eines reinkultivierten Bakterienstammes aus Schritt (c) und/oder einer Kombination zumindest zweier Bakterienstämme aus Schritt (c) bezüglich ihrer Fähigkeit, nach vaginaler Verabreichung des Bakterienstammes an eine Frau während ihrer Menstrualblutung in der Vagina zu kolonisieren und sich darin zu etablieren, wobei die Frau eine gestörte vaginale Mikroorganismenflora aufweist und der Bakterienstamm bzw. die Bakterienstämme als etabliert betrachtet werden, wenn der Bakterienstamm bzw. die Bakterienstämme nach wenigstens zwei Menstrualzyklen von der Verabreichung an gerechnet noch in der Vagina vorhanden sind, und e) Auswahl wenigstens eines Bakterienstammes aus Schritt (d), der die Fähigkeit zeigt, in der Vagina zu kolonisieren und sich darin zu etablieren.
Verfahren nach Anspruch 2 mit einem weiteren Schritt, bei dem zumindest ein rein kultivierter Bakterienstamm aus Schritt (c) und/oder eine Kombination zumindest zweier Bakterienstämme aus Schritt (c) lyophilisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 3 mit einem weiteren Schritt, bei dem zumindest ein lyophilisierter, rein kultivierter Bakterienstamm aus Schritt (c) und/oder eine Kombination zumindest zweier lyophilisierter Bakterienstämme aus Schritt (c) bezüglich der Stabilität der bakteriellen Lebensfähigkeit nach der Lyophilisierung sowie der Lebensfähigkeit von lyophilisierten Bakterien über lange Aufbewahrungszeiten hinweg bewertet und ausgewählt werden, worin die bakterielle Lebensfähigkeit als stabil angesehen wird, wenn zumindest 40% der Bakterien nach Lyophilisierung und einer Lagerung der lyophilisierten Bakterien während mindestens 12 Monaten bei –18°C eine bewahrte Lebensfähigkeit besitzen.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4 mit einem weiteren Schritt, bei dem zumindest ein lyophilisierter, rein kultivierter Bakterienstamm aus Schritt (c) und/oder eine Kombination zumindest zweier lyophilisierter Bakterienstämme aus Schritt (c) bezüglich der genetischen Stabilität bei wiederholter Kultivierung bewertet und ausgewählt werden.
Zusammensetzung für Behandlung von Infektionen des Urogenitaltrakts mit zumindest einem der Bakterienstämme nach Anspruch 1.
Für vaginale Verabreichung formulierte Zusammensetzung nach Anspruch 6.
Hygiene-Artikel für Behandlung von Infektionen des Urogenitaltrakts mit zumindest einem der Bakterienstämme nach Anspruch 1.
Hygiene-Artikel nach Anspruch 8 in Gestalt eines Tampons.
Verwendung zumindest eines der Bakterienstämme nach Anspruch 1 für die Herstellung einer Zusammensetzung oder eines Hygiene-Artikels für Behandlung von Infektionen des Urogenitaltrakts.
Verwendung nach Anspruch 10 für Behandlung von bakterieller Vaginose oder irgendeiner anderen bakteriellen Störung in der Vagina.