CN1184637A - 治阴道病的乳杆菌及制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明治阴道病的乳杆菌及制剂涉及用于治疗细菌性阴道病的德氏乳杆菌乳酸亚种的乳杆菌和含有该菌株活菌的外用微生态制剂。以该菌为有效活性成分配制的外用药,置于人体阴道内,用于治疗阴道病,特别是治疗细菌性阴道病。本发明的乳杆菌制剂,是以该乳杆菌与载体或赋形剂混合的外用活菌制剂剂型可为粉剂或膜剂或囊剂或片剂或栓剂。
Description
本发明涉及用于治疗阴道炎的德氏乳杆菌乳酸亚种的乳杆菌和含有该菌株活菌的外用微生态制剂。
近年来，随着微生态学的发展，微生物菌体制剂的开发和其在临床医学中的利用，已报导的微生态制剂，包括利用乳酸杆菌、双歧杆菌等用于防治肠道治病菌群过渡繁殖引起疾病的制剂，已在临床应用中显示出良好的效果(康白：正常菌群在仿制肠道传染病中的意义，中国微生态学杂志1989年康白论文集专刊p28-30)。对于治疗阴道病还是使用抗生素，抗生素不但杀死有害致病菌，也杀死有利健康的菌损坏人体的微生态及健康。用过抗生素后，细菌性阴道病易复发，更易引起外界治病菌的感染。长期使用抗生素，致病菌易产生抗药性。美国的性传染疾病杂志1992；19(3)：第146-148页报导的乳杆菌对细菌性阴道病的治疗，是利用冻干的嗜酸乳杆菌按双盲动法，对照组使用安慰剂，对60例细菌性阴道病进行治疗，观察其疗效。28例用药组中，16例阴道涂片恢复正常，而用安慰剂的对照组29例病人的阴道涂片均未恢复。但是，其治愈率只有56％，而且嗜酸乳杆菌在阴道的粘附定植性差，用药后复发率较高，复发率在81％。其所用的菌对白色念球菌无拮抗作用。
本发明的目的是提供一种生长旺盛、遗传稳定、产酸量较高、在阴道的粘附定植性好，最好需氧条件下生长良好，用于治疗阴道病，特别是细菌性阴道病的新乳杆菌菌株，进而提供治疗细菌阴道病的乳杆菌制剂。
针对本发明的目的，进行了健康人阴道乳杆菌属的分析、患有阴道病者阴道微生物群的分析，特别是细菌性阴道病阴道微生物的分析。结果表明阴道病及细菌性阴道病病人的阴道乳杆菌的平均浓度明显低于健康人，而肠杆菌、葡萄球菌、棒状杆菌、类杆菌属、支原体却明显增多，菌群失调是细菌性阴道病发病的原因。
本发明用于治疗细菌性阴道病的乳杆菌DM8908菌株，经中国科学院微生物研究所确定为德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)。这株德氏乳杆菌乳酸亚种的乳杆菌DM8909是申请人于1996年11月4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC NO.0277的乳杆菌菌株。该菌具有产乳酸高和产过氧化氢，杀死有害治病菌，而且具有很好的在阴道上皮细胞粘附定植优势，抑制有害治病菌的生长繁殖，是很好的调节阴道菌群平衡、拮抗外侵菌生长的乳杆菌。其具有遗传的稳定性，经测定和动物试验其无毒、无副作用。乳杆菌DM8909主要对苦杏仁、乳糖、蔗糖产酸，对蜜二糖不产酸，DNA的G+C含量测定为49.12％，而且不含质粒。该菌株的其他生物特性为：
1、形态和染色：革兰氏阳性，直杆菌，喳状排列或不规则，无芽苞、鞭毛、荚膜。
2、培养特性：为兼性厌氧菌，传代后需氧培养生长良好，35℃-42℃均能够生长，最佳温度37℃，pH值3.0-8.0，最佳pH6.0。
3、生化反应：葡萄糖 甘露糖 果糖 半乳糖 蔗糖 麦糖 纤维糖 乳糖 棉糖 甘露醇 山梨醇 七叶灵+ + + + ± + + ± + - - +苦杏仁 木糖 鼠李糖 阿拉伯糖+ - - -
乳杆菌DM8909菌对灭滴灵、碳胺甲基异恶唑、头孢甲氧霉素耐药；对麦迪霉素、先锋霉素、庆大霉素、妥布霉素、青霉素、氨卞、链霉素、红霉素、洁霉素、先锋5号、卡那霉素、新霉素、四环素、痢特灵、氯霉素高度敏感；对多粘菌素、羧苄青霉素、丁胺卡那霉素中度敏感。乳杆菌DM8909菌对酸耐性强，在pH2.5、8.0均可存活。乳杆菌DM8909菌在液体中50℃条件下30分钟可存活，但60℃时10分钟即被灭活，在干燥粉末中60℃条件下30分钟仍可存活。乳杆菌DM8909菌株自1989年分离以来已传代50次和传代72代都未发现变异菌株，遗传稳定，至今仍未发现变异菌株。乳杆菌DM8909菌种有斜面、半固体和冻干三种保存方式。斜面及半固体每月传代一次，冻干保存每年复苏一次。在Lbs(lc)液体培养基中，37℃培养，活菌数在试管内36小时可达到高峰，48小时并不增加，72小时开始下降。
乳杆菌DM8909菌在Lbs(Lc)平板上，37℃72小时培养，形成直径1.5-2.5mm的白色、光滑、隆起、周边整齐的菌落；在Lbs(Lc)液体培养基内生长均匀、不形成菌膜，培养24小时以上管底有微细颗粒；在Lbs(Lc)半固体穿刺培养，菌体沿接种线生长，上下粗细一致。乳杆菌DM8909菌在普通营养鲸脂及ENB平板上不生长。发酵葡萄糖主要产生乳酸。
将乳杆菌DM8909菌单独培养，同时将葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌分别单独培养，并分别与乳杆菌DM8909菌混合培养，进行比较。混合培养的葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌的活菌数明显低于单独培养的活菌数(P＜0.02，P＜0.005，P＜0.05)，而且葡萄球菌、大肠杆菌混合培养的pH也随时间的延长而下降(P＜0.01，P＜0.011)。乳杆菌DM8909单独培养与混合培养之间，活菌数无明显差异，pH值无差异(见表1、表2)。乳杆菌DM8909是一株很好的生态优势常住菌对有害菌之间有拮抗关系，与酵母菌呈共生关系，所代谢的产物乳酸、过氧化氢是形成阴道酸性环境的有效物质，有效地保持了生态的平衡。但据资料报导，德氏乳杆菌乳酸亚种为非阴道正常定植菌。为此，将葡萄球菌、肠杆菌、白色念球菌分别单独与阴道上皮细胞混合培养，并分别与乳杆菌DM8909菌混合后再与阴道上皮细胞混合培养，进行比较粘附竞争能力。取阴道上皮细胞悬液及菌液各1ml混合，37℃2小时温育后用RPMI-1640洗涤细胞3次，G3玻璃滤器抽滤除去未粘附细菌。涂片，室温干燥，甲醇固定10分钟，革兰氏染色，镜下观察。为了分析pH对细菌粘附能力的影响，菌液、细胞悬液制备及温育全过成分别在pH3.5、4.5、5.5、7.2环境中进行。计数采取每载玻片随机数50个上皮细胞，计算每个上皮细胞上粘附的细菌数。统计学处理采取比较组间均数差异用student′s-t检测，见表3表4。另外，单独对致病率较高的金黄葡萄菌进行了试验。将等量的乳杆菌DM8909、金黄葡萄菌混合，分别制成pH7.2混合液1和pH4.5混合液2。同样制成含等量金黄葡萄菌的菌液3。A组是取混合液1与阴道上皮细胞液混合培养。B组是取混合液2，37℃温育8-12小时后加入阴道上皮细胞液混合培养。C组是取菌液3与阴道上皮细胞液混合培养。D组是菌液3在pH4.5条件下37℃孵育8-12小时，然后与阴道上皮细胞液混合调制pH7.2后培养。具体见实施例5及表15。可以看出，乳杆菌8909在阴道上皮细胞有极强的粘附能力，不但能在阴道里定植，而且有抑制有害细菌的粘附的能力，特别是在其产酸造成阴道酸性环境下其抑制有害菌粘附生长的能力更强，对有害菌有极强的拮抗能力。不仅对葡萄球菌、肠杆菌有拮抗能力，而且对白色念球菌也有拮抗能力。
为适应作为药物，经培养乳杆菌DM8909具有兼厌氧性。本发明治阴道炎的乳杆菌制剂是含有该乳杆菌DM8909活性成分的乳杆菌制剂。以该菌为有效活性成分配制的外用药，置于人体阴道内，用于治疗阴道病，特别是治疗细菌性阴道病(或称非特异性阴道炎)。本发明的乳杆菌制剂，是德氏乳杆菌乳酸亚种的DM8909乳杆菌与载体或赋形剂混合的外用活菌制剂。剂型可为粉剂或膜剂或囊剂或片剂或拴剂。这样更便于对乳杆菌DM8909的使用，更有利于其活性和药性的发挥。粉剂和膜剂在冰箱4℃及室温20℃±2℃下的活菌数按月检测结果见表6。采用本发明的乳杆菌制剂进行了临床应用，对细菌性阴道病的病人进行了治疗，并用该病通常的诊断方法进行了治疗效果的检测。经对治疗的病人阴道pH值、阴道分泌物清洁度、细菌的检出数的检测，有效率达百分之百，治愈率达到87％以上，复发率极低，几乎不复发。本发明的乳杆菌制剂对滴虫性阴道炎也非常有效。
由于该菌具有产乳酸量高，形成了阴道酸性环境，以控制阴道微生物群组成、维持阴道微生态平衡。该菌产生较高的过氧化氢，HO测定的含量为0.04％，是较好的阴道优势生态菌，特别是能有效的杀害有害菌和外来侵入菌，抑制其他菌种的生长和繁殖，具有极好的疗效。该菌没有质粒，不传递耐药性。该菌繁殖遗传稳定，能大量粘附于阴道组织表面而阻止肠杆菌、葡萄球菌、白色念球菌对阴道上皮细胞的粘附，阻止它们的定植生长，是极佳的生物医药菌种。乳杆菌DM8909是极好的预防和治疗细菌性阴道病又无副作用的生态制剂菌。
下面结合实例进一步说明本发明。
实施例1、将乳杆菌DM8909菌株接种于Lbc肉汤37℃培养48小时，再接种于培养液中37℃下培养。将培养液分离收集菌体，并将干燥无水碳酸钙与收集到的菌体混合成散状粉剂。干燥后80目过筛制成干菌粉。
将赋形剂药用淀粉、乳糖干燥后与菌粉混合成粉剂。使药粉活菌数达10亿/g。配比为DM8909活菌菌粉10克、药用淀粉80克、乳糖10克。将该乳杆菌粉剂按0.2克包容于10×20mm避孕膜内，用于防治阴道病。
实施例2、将上述的粉剂用聚乙烯醇制成的膜，包成片状，制成膜剂。每片含0.2克菌粉，用塑料袋密封，每袋10片。用该膜剂对33例诊断为细菌性阴道病的病人进行治疗。将膜剂直接放入阴道后穹窿，每天一次，每次一片，连续两周。用健康人32例进行对照观察，化验阴道分泌物pH、清洁度、菌群检测。非特异性阴道炎病人治疗前后阴道的pH值有明显的差异，治疗后的pH明显低于治疗前，而对照的健康人的pH治疗前后无明显差别。细菌性阴道病的病人阴道乳杆菌数治疗前后明显增加，治疗后达到健康人的水平，阴道葡萄球菌、肠杆菌、酵母菌数治疗前后明显减少，恢复到健康人的水平。细菌性阴道病的病人经治疗后的阴道清洁度也由原来的三、四级恢复到健康人的一、二级水平。细菌性阴道病的病人的治愈率达88.75％，好转率93.75％，有效率100％，尤其是对10例经抗生素治疗不愈者效果更佳。见表7、8、9、10。
实施例3、将实施例1的菌粉与赋形剂(乳糖20％，药用淀粉70-80％)混合成药粉，使药粉的乳杆菌DM8909活菌数大于0.25亿/g。将药粉分装在于2号药用胶囊内，每粒装入0.2克的药粉，制成胶囊剂型。该药主要用于治疗细菌性阴道病，用法是临睡前将该胶囊药粒放入阴道深道，每天一次，每次一粒，连续10天。经对29例细菌性阴道病的病人临床治疗，患者自觉症状明显好转或消失，妇科检查阴道壁充血小时、白带量及性状明显改善或恢复正常。29位细菌性阴道病的病人治疗前阴道乳杆菌对数量为4.01±1.18，而治疗后乳杆菌对数量增为6.12±1.66。治愈率89.65％，好转率93.10％。经与29位对照组的安慰剂治疗的比较，见表10、11、12，效果是非常显著的。
表1 单独培养与混合培养的功数对数值(单：单独培养 乳+葡；乳杆菌与葡萄菌混合培养，其余类推)
表2 单独培养与混合培养的pH
(单：单独培养 乳+葡；乳杆菌与葡萄球菌混合培养，其余类推)
| pH | ||||||||
| 0 | 12 | 24 | 36 | 48 | 72 | 96 | (h) | |
| 乳单乳+葡葡单乳+肠肠单乳+酵酵单 | 6.06.06.06.06.06.06.0 | 5.55.56.05.56.05.55.5 | 4.04.06.04.06.04.04.0 | 3.53.55.03.55.53.54.0 | 3.03.05.03.05.53.03.0 | 2.52.55.02.55.52.53.0 | 2.52.55.02.55.52.53.0 | |
表3 不同pH时每阴道上皮细胞粘附细菌数(X±SD)
| 菌名 | pH3.5 | pH4.5 | pH5.5 | pH7.2 |
| DM8909肠杆菌葡萄球菌白色念珠菌 | 114.98±24.49(6)6.28±1.83(5)**9.25±4.32(5)**8.22±3.18(5)** | 80.31±31.15(5)10.98±2.20(4)**15.02±3.14(4)**11.46±3.38(5)** | 63.26±25.06(5)27.93±10.92(4)*25.68±4.56(4)*18.24±4.89(5)* | 42.42±16.63(5)35.90±5.52(4)31.12±7.58(5)32.42±5.37(5) |
说明：1、( )：括号中数字为上皮细胞来源的志愿者例数
2、** ：P＜0.01
3、* ：P＜0.05
表4
| 肠杆菌 | 葡萄球菌 | 白色念珠菌 | |
| DM8909预先温育无DM8909存在 | 7.75±2.14(4)**15.02±3.14(4) | 4.94±0.81(4)**10.98±2.20(4) | 8.96±1.10(4)*11.46±3.38(5) |
说明：同表1。
表6 DM8909菌株活菌数检测结果(lgn/g)
| 月数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 冰箱室温 | 10.92±0.4610.67±0.68 | 10.90±0.7010.70±0.55 | 10.60±0.3010.20±0.21 | 10.40±0.5210.00±0.79 | 10.60±0.1110.30±0.85 |
| 月数 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 冰箱室温 | 10.50±0.8010.01±0.42 | 9.87±0.7710.10±0.99 | 9.20±0.249.00±0.70 | 8.80±0.908.70±1.20 | 8.70±0.898.80±1.42 |
| 月数 | 11 | 12 |
| 冰箱室温 | 8.30±1.018.00±0.89 | 8.10±1.007.80±0.49 |
(n=3)
表6-1 室温下定菌生留样观察活菌数测定结果(亿/g)
| 批号 | 留样日期 | 观察结果(月) | |||||
| 0 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 | ||
| 940306940312940320 | 94、3、2594、3、2594、3、25 | 1.61.81.5 | 0.550.490.78 | 0.070.170.067 | 0.0530.0450.067 | 0.0260.0310.045 | 0.0090.0210.011 |
表6-2 4℃下定菌生留样观察活菌数测定结果(亿/g)
| 批号 | 留样日期 | 观察结果(月) | |||||
| 0 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 | ||
| 940306940312940320 | 94、3、2594、3、2594、3、25 | 1.61.81.5 | 1.61.81.0 | 0.641.071.02 | 0.240.670.85 | 0.130.670.40 | 0.130.250.40 |
表7 阴道pH的比较
| 分 组 | 例 数 | 平均pH值 | 对照组 | P值 |
| 对 照 组治疗组用药前治疗组用药后 | 323333 | 4.0031±0.26584.9406±0.31403.8656±0.1807 | 1.522.533.51 | ＜0.001＜0.001＜0.20 |
表8 阴道微生物的比较(平均对数值比较)
| 乳杆菌 | 葡萄球菌 | 肠杆菌 | 酵母菌 | |
| 对 照 组治疗组(药前)治疗组(药后) | 7.1664±1.0915.1235±1.56657.9958±0.7058 | 4.3938±1.01605.3691±0.70273.6305±0.5494 | 3.3996±0.54155.1515±1.01553.2663±0.6337 | 4.2276±1.13775.8183±0.75683.8432±0.6044 |
表9 各组微生物平均对数值比较的P值
| 对比组 | 乳杆菌 | 葡萄球菌 | 肠杆菌 | 酵母菌 | |
| 对照组治疗组治疗后 | 1.522.533.51 | P＜0.001P＜0.001P＜0.002 | P＜0.001P＜0.001P＜0.05 | P＜0.001P＜0.001P＜0.05 | P＜0.01P＜0.001P＜0.05 |
表10 微生物检出率的比较(32例)
| 对 照 组 | 治 疗 前 | 治 疗 后 | ||||
| 例数 | ％ | 例数 | ％ | 例数 | ％ | |
| 乳杆菌葡萄球菌肠杆菌酵母菌 | 3228116 | 10087.534.37518.75 | 32292410 | 10090.6257531.25 | 3228127 | 10087.537.521.815 |
其中肠杆菌的检出率的比较，治疗前与治疗后及对照组与治疗前的比较的P＜0.05。
表11 定菌生治疗非特异性阴道炎对阴道PH与清洁度的影响
| 分 组 | 例 数 | PH 值 | 清 洁 度 | ||||
| 3.0 | 4.0 | 5.0 | I | II | III | ||
| 治疗前治疗后 | 2923 | 010 | 59 | 244 | 020 | 213 | 80 |
表12 阴道菌群的变化
| 分 组 | 例数 | 阴道菌群定量(10n/g) | ||
| 乳 杆 菌 | 肠 杆 菌 | 酵 母 菌 | ||
| 治疗前治疗后 | 2929 | 4.01±1.186.12±1.66 | 4.34±1.001.11±1.28 | 2.02±1.530.71±1.19 |
表2指出，治疗前乳杆菌少，肠杆菌多，治疗后乳杆菌增加，肠杆菌减少，酵母菌(主要是白色念珠菌)治疗前多，治疗后明显减少。
实施例4、在大连医科大学附属二院对患细菌性阴道病的志愿病人进行了临床治疗。所用的定菌生是含本发明的乳杆菌DM8909活菌的丸药，每丸药所含乳杆菌DM8909活菌数大于2×10。
材料与方法
1、药品及给药方法 大连医科大学微生态学研究所研制的乳杆菌
生态制品——定菌生，活菌数2×107/丸。每晚临睡前由患者自行将
药品放入阴道深处1丸，连续10天；用药期间禁止性生活，避免全身
使用抗生素及阴道局部用药。
2、研究对象
2.1 正常对照 32例，年龄24-38岁，排除妇科疾病，3天内无
性生活史，2周内无全身抗生素应用史及阴道局部用药史；
2.2 定菌生治疗组 62例，年龄23-52岁，按实用妇产科学标
准确诊为非特异性阴道炎患者。
3、化验检查
3.1 阴道pH值测定 用上海试剂三厂精密pH试纸；
3.2 阴道微生物学检查 用自制0.2ml不锈钢长柄小钓刮取阴道
分泌物，定性、定量检测乳杆菌、肠杆菌、葡萄球菌、白色念珠菌；
3.3 阴道清洁度检查 根据阴道分泌物涂片染色确定。
3.4 胶丸崩解度测定 将胶丸放入阴道后穿窿后2h观察其溶解
度。
4、治疗效果观察
5、统计学处理Studet′s-t检验。
结 果
1、治疗前后阴道pH值变化(见表16)
表16 定菌生治疗前后阴道pH值的变化
| 分 组 | 例 数 | 不 同 pH 值 例 数 | X±SD | ||
| pH3.0 | pH4.0 | pH 5.0 | |||
| 对照组治疗前治疗后 | 326256 | 12027 | 141122 | 7517 | 4.00±0.274.82±0.43*3.79±0.22 |
*P＜0.05
由表-16可见，阴道炎组阴道平均pH值显著高于正常对照组(P＜0.05)；治疗后阴道pH值恢复正常，与正常对照组比，无统计学差异。
2、阴道微生物群的变化(见表-、表-18)。
表17 定菌生治疗前后阴道微生物群变化(lgn CFU/ml)
| 微生物数分组 | 乳杆菌 | 葡萄球菌 | 肠杆菌 | 白色念珠菌 |
| 对 照 组治 疗 前治 疗 后 | 7.17±1.094.60±1.38*7.01±1.15 | 4.39±1.025.37±0.70*3.63±0.89 | 3.40±0.543.84±0.76*2.26±0.93 | 3.20±1.324.20±1.14*2.38±0.88 |
*P＜0.05
从表17可见，治疗前阴道乳杆菌数量显著低于正常对照组(P＜0.01)；治疗后乳杆菌数量增多，与正常组相比，无统计学差异。葡萄球菌、肠杆菌、白色念珠菌经治疗后均有所降低(P＜0.05)。
表18 定菌生治疗前后各微生物检出率比较(％)
| 检出率分组 | 乳杆菌 | 匍萄球菌 | 肠杆菌 | 白色念珠菌 |
| 对 照 组治 疗 前治 疗 后 | 100(32/32)100(62/62)100(56/56) | 87.50(28/32)88.70(55/62)86.00(40/56) | 34.38(11/32)45.00(28/62)37.50(21/56) | 18.75(6/32)30.6(19/62)32 (18/56) |
由表-18可见，治疗前、后及正常对照组间各微生物检出率无统计学差异。
3、阴道清洁度变化(见表-19)。
表19 定菌生治疗前后阴道清洁度
| 清洁度分 组 | I | II | III |
| 治疗前(29例)治疗后(23例) | 020 | 213 | 80 |
可见，经定菌生治疗后阴道清洁度有明显改善。
4 胶丸崩解度测验 本实验所用药用胶丸在蒸馏水内全部于30分钟内溶解。将此胶丸加入阴道后穿窿2h检测崩解度。在临床上共观察20例用药病人，19例病人阴道内的胶丸，在2h内全部崩解，1例未全崩解，经查该患者患阴道干燥症。
5 定菌生对阴道炎治疗效果
经定菌生治疗后，患者自觉症状明显好转或消失；妇科检查阴道壁充血消失、白带量及性状明显改善或恢复正常。本组62例，经定菌生治疗后，治愈率87.10％(54/62)；好转率91.93％(57/62)；尤其对抗菌素治疗无效者疗效更佳。
小 结
上述结果说明，定菌生对菌群失调性阴道炎有一定疗效。治愈率达87.10％，有效率为91.93％。在所有病例中，均未出现任何副作用及不良反应。
根据阴道pH值、清洁度测定及阴道微生物群定量分析，定菌生可降低阴道pH值及清洁度；调整阴道菌群结构，维持阴道微生态平衡。
初步认为，定菌生具有高效、无副作用、用药方便等特点。
实施例5、用本发明的乳杆菌DM8909对致病率较高的金黄葡萄菌在阴道上皮细胞粘复的抑制作用进行了试验：
1、材料与方法
1.1 阴道上皮细胞
取自10例妇科节育上环的就诊者，年龄为25-40岁，妇科检查正常，均为月经周期的9-12天，3天内无性生活史。
用棉球擦去阴道粘液及用刮匙轻刮阴道中后段上皮细胞，悬浮于15mlpH7.2RPMI-1640中，于旋涡混合器振荡后，1000rpm离心5min，重复2-3次，镜检观察内源性细菌是否全部除去，如没有完全除去，用G3玻璃滤器抽滤除去内源性细菌。以血球计数板计数，调整细胞浓度为1×105/ml。
1.2 菌液制备
1.2.1 乳杆菌DM8909菌液制备
将本室保存DM8909冻干管复苏，鉴定后接种于LC斜面培基上，需氧培养18hr，刮取菌苔至pH7.2RPMI-1640中，且用RPMI-1640洗涤细菌3次(2500rpm，10min)，比浊调整细菌浓度为1×103/ml。
1.2.2 金黄色葡萄球菌菌液制备
取妇科门诊患者阴道分泌物，划线于SP培基上需氧培养，37℃，18hr，挑取典型金黄色菌落，经鉴定确认为金黄色葡萄球菌，接种于Nb斜面，需氧培养，37℃，18hr，刮取菌苔用pH7.2 RPmI-1640洗涤3次(2500rpm，10min)，调整细菌浓度为1×103/ml。
1.2.3 乳杆菌金黄色葡萄球菌混悬液制备
粘附前将等量DM8909与等量葡萄球菌液分别离心去上清液后用总量的1/2RPMI1640将其混合，制成pH7.2混合液1。
同理制成pH4.5 RPMI1640混合菌液2。
1.3 粘附竞争实验
1.3.1 分组 本试验分为4组
A组取1ml混合液1与1ml阴道上皮细胞混合
B组取1ml混合液2，37℃温育8-12h，加入1ml阴道上皮细胞混合，调pH7.2。
C组为对照组1，取1ml金黄色葡萄菌液和1ml上皮细胞悬液混合
D组为对照组2，取1ml金葡菌液pH4.5条件下于37℃孵育8-12h，然后与1ml上皮细胞混合，调pH7.2。
A、B、C、D均于37℃孵育2h(pH均为7.2)，然后用RPMI-1640或PBS洗涤3次，每次1000rpm，5min。然后于G3玻璃滤器抽滤以去除未粘附细菌，其间用巴氏吸管轻轻吹打。最后加入10mlRPMI-1640，1000rpm离心5min，去上清液，加入适量RPMI1640，涂片，室温干燥，甲醇固定10min，革兰氏染色，镜下观察并随机计数50个阴道上皮细胞粘附的各类细菌数。
2、结果
表15 不同条件下每个阴道上皮细胞粘附的细菌数
| 组 别 | DM8909 | 金黄色葡萄球菌 |
| ABCD | 41.72±8.0438.28±4.03-- | 40.38±6.942 *15.28±4.86 **63.74±7.3823.62±3.49 |
* A组金黄色葡萄球菌的粘附数与DM8909的粘附数无显著差别
P＞0.05；与C组(对照1)相比，金葡菌的粘附数有显著差别，
P＜0.01
** B组金黄色葡萄球菌的粘附数与DM8909的粘附数有显著差别
P＜0.01；与D组相比，金葡菌的粘附数有显著差别，P＜001
Claims (4)
1、一种治疗阴道炎新的乳杆菌菌株，其特征在于：菌株是保藏号为CGMCCNO.0277的德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)乳杆菌DM909菌株。
2、一种治阴道炎的乳杆菌制剂，其特征在于：含有有效成分德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)保藏号为CGMCC NO.0277的乳杆菌DM8909。
3、如权利要求2所说的乳杆菌制剂，其特征在于：德氏乳杆菌乳酸亚种的乳杆菌DM8909与载体或赋形剂混合的外用活菌制剂。
4、如权利要求3所说的乳杆菌制剂，其特征在于：剂型为粉剂或膜剂或囊剂或片剂或拴剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN96122282A CN1184637A (zh) | 1996-12-07 | 1996-12-07 | 治阴道病的乳杆菌及制剂 |
Applications Claiming Priority (1)
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| Publication Number | Publication Date |
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| CN1184637A true CN1184637A (zh) | 1998-06-17 |
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| CN96122282A Pending CN1184637A (zh) | 1996-12-07 | 1996-12-07 | 治阴道病的乳杆菌及制剂 |
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| Country | Link |
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| CN (1) | CN1184637A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1308436C (zh) * | 2001-09-20 | 2007-04-04 | 艾伦股份公司 | 作为人体阴道中的益生微生物的乳酸产生细菌 |
| CN102851248A (zh) * | 2012-09-18 | 2013-01-02 | 中国科学院微生物研究所 | 用于防治细菌性阴道病的詹氏乳杆菌 |
| CN105534948A (zh) * | 2015-12-17 | 2016-05-04 | 内蒙古双奇药业股份有限公司 | 一种可常温保存的阴道用活菌制剂及其制备方法 |
-
1996
- 1996-12-07 CN CN96122282A patent/CN1184637A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1308436C (zh) * | 2001-09-20 | 2007-04-04 | 艾伦股份公司 | 作为人体阴道中的益生微生物的乳酸产生细菌 |
| CN102851248A (zh) * | 2012-09-18 | 2013-01-02 | 中国科学院微生物研究所 | 用于防治细菌性阴道病的詹氏乳杆菌 |
| CN105534948A (zh) * | 2015-12-17 | 2016-05-04 | 内蒙古双奇药业股份有限公司 | 一种可常温保存的阴道用活菌制剂及其制备方法 |
| CN105534948B (zh) * | 2015-12-17 | 2019-05-03 | 内蒙古双奇药业股份有限公司 | 一种可常温保存的阴道用活菌制剂及其制备方法 |
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