DE69622855T2

DE69622855T2 - Pharmazeutische zusammensetzungen welche lactobacillus plantarum und arginin beinhalten

Info

Publication number: DE69622855T2
Application number: DE69622855T
Authority: DE
Inventors: Diya Adawi; Bengt Jeppson; Goeran Molin
Original assignee: Probi AB
Current assignee: Probi AB
Priority date: 1995-05-09
Filing date: 1996-05-08
Publication date: 2003-04-10
Anticipated expiration: 2016-05-09
Also published as: PL323320A1; NO975136L; GR980300028T1; WO1996035440A1; NO975136D0; BR9608284A; SE9501719D0; KR19990008403A; EE03597B1; CN1190346A; ES2112818T1; NO317668B1; EE9700269A; EP0825869B1; JPH11504936A; CA2220498A1; ES2112818T3; PL184603B1; CN1152678C; DE69622855D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Lactobacillus plantarum-Stamm mit der Fähigkeit, in Kombination mit Arginin menschliche Darmschleimhaut zu besiedeln oder daran anzuhaften. Diese Zusammensetzung kann für die prophylaktische oder heilende Behandlung eines akuten Leberschadens und -versagens sowie von damit verbundenen Bedingungen verwendet werden, bei denen eine defekte Schleimhautmembranbarriere und eine erhöhte bakterielle Translokation vorhanden ist.

Hintergrund der Erfindung

Eine bakterielle Translokation, d. h. das Entweichen von Mikroorganismen und toxischen Verbindungen aus dem Darmhohlraum durch Überschreiten der Darmschleimlhautbarriere oder durch Überqueren der Darmwand ist von wesentlicher Bedeutung bei der Entwicklung vieler Krankheiten. Eine bakterielle Translokation kann z. B. bei immungeschwächten Patienten, bei schwerkranken Patienten und Patienten mit Multiorganversagen, bei Patienten mit mehreren Traumen und Verbrennungen, bei Lebererkrankungen und entzündlichen Darmerkrankungen und bei Patienten, die an Fehl- bzw. Unterernährung leiden, auftreten. Virushepatitis, fulminantes Leberversagen, Zirrhose, Alkoholhepatitis, Cholangitis und Autoimmunerkrankungen wie chronisch-aktive Hepatitis sind Lebererkrankungen, bei denen eine bakterielle Translokation stattfinden kann.
Bei einem akuten Leberversagen im Anschluss an eine Hepatitis, Vergiftungen oder nach einer größeren Leberoperation ist eine erhöhte bakterielle Translokation aus dem Darm vorhanden. Dies kann einige der infektiösen Komplikationen erklären, die bei diesen Zuständen auftreten. Akutes Leberversagen weist eine hohe Mortalitätsrate auf und ein erheblicher Anteil der Mortallität kann auf das häufige Auftreten einer Sepsis zurückgeführt werden. Bei schwerkranken oder immungeschwächten Patienten werden die meisten Infektionen von der eigenen Mikroflora der Patienten verursacht und viele Patienten, die an Sepsis oder Multisystemorganversagen sterben, weisen eine enterische Bakteriämie auf, für welche kein septischer Fokus nachgewiesen wird, was darauf hindeutet, dass diese Infektionen ihren Ursprung im Darm haben können. Aufgrund des häufigen Vorkommens einer klinisch bedeutsamen bakteriellen Sepsis während eines fulminanten Leberversagens besteht auch ein Bedarf an einer prophylaktischen Behandlung.
Eine bakterielle Translokation kann zu einer Sepsis und Septikämie führen, welche das Leberversagen verstärken und zu einem Multiorganversagen führen können. Die Behandlung der erhöhten Bakterieninfektion erfolgt unter Verwendung von Antibiotika, welche viele Nebenwirkungen aufweisen und die Darmschleimhautbarriere und die Mikroflora beeinflussen können.
Diese Befunde haben zu einem gesteigerten Interesse für Mikrobenarten geführt, welche das mikrobielle Gleichgewicht des Wirts günstig beeinflussen können, z. B. durch Herstellen von antimikrobiellen Komponenten oder durch kompetitives Wachstum. Lactobacillus gehörte zu den am häufigsten untersuchten Arten und in bestimmten Fällen wurde gezeigt, dass er der Ausbreitung von Pathogenen entgegenwirkt. Lactobacilli stellen einen integralen Bestandteil der normalen gastrointestinalen Mikroökologie dar und sind am Wirtsmetabolismus beteiligt. Es wurde berichtet, dass eine Bakteriotherapie mit Lactobacilli sowohl bei pseudomembranöser Colitis als auch bei Colitis ulcerosa wirksam sind.
Die Aminosäure Arginin hat eine starke Wirkung auf das Immunsystem des Körpers, insbesondere nach einem Trauma. Außerdem ist Arginin eine bekannte Vorstufe von Polyaminen, welche als wichtige Vermittler des Zellwachstums und der Differenzierung angesehen werden. Es ist auch bekannt, dass Arginin das lokale und systemische Immunsystem stimuliert.

Stand der Technik

SE 9501056-7 bezieht sich auf die Verwendung von bestimmten Lactobacillus-Stämmen mit einem Adhäsin, das eine Anhaftung an einem Rezeptor in menschlichen Darmepithelzellen ermöglicht, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche die Immunreaktion auslöst, und auch für die Behandlung einer Translokation von pathogenen oder potenziell pathogenen Bakterien über das intakte Darmepithel. Diese Anmeldung bezieht sich besonders auf die Verwendung von Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595 und Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843 sowie von anderen Lactobacillus plantarum-Stämmen, die zu einem Cluster, wie er angegeben ist, gehören.
Gianotti, Luca et al., Annals of surgery, Band 217, Nr. 6, 644-654, untersuchen die Auswirkung von Arginin in der Nahrung auf eine bakterielle Translokation. Ein gesteigertes Überleben konnte bei Tieren beobachtet werden, welche mit einer Arginin-ergänzten Diät gefüttert wurden. Quantitative Koloniezählungen und der berechnete Prozentsatz von verbliebenen lebensfähigen Bakterien zeigte, dass die Fähigkeit zum Abtöten von translozierten Organismen bei Tieren, die Arginin erhielten, erheblich gesteigert war.
Daly, John E., et al., Surgery 112: 55-67, 1992, zeigen, dass eine enterale Ernährung mit zusätzlichem Arginin, RNA und Omega-3-Fettsäuren bei Patienten nach einer Operation die Immunabwehr über verschiedene Mechanismen verbessert.

Beschreibung der Erfindung

Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass eine Kombination von bestimmten Stämmen von Lactobacillus und Arginin das Ausmaß eines Leberschadens und -versagens, die mit einer bakteriellen Translokation verbunden sind, wesentlich verringert.
Die Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend
- einen Lactobacillus plantarum-Stamm mit der Fähigkeit, menschliche Darmschleimhaut in vivo zu besiedeln;
- Arginin; und
- einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Die Erfindung bezieht sich besonders auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei der Lactobacillus-Stamm ein Adhäsin aufweist, das eine Anhaftung an einem Rezeptor auf menschlichen Darmepithelzellen ermöglicht. Die Adhäsion zwischen dem Glycoproteinrezeptor und dem Adhäsin wird durch den Zucker α-Methylmannosid gehemmt, was impliziert, dass der Rezeptor mannosehaltig ist. Dieser Rezeptor unterscheidet sich jedoch von dem mannosehaltigen Rezeptor für E. coli-Typ 1-Fimbrien, was mittels Hämagglutinationstests gezeigt werden kann. Es wird angenommen, dass der Rezeptor die Manα1-2Man-Sequenz enthält.
Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei der Lactobacillus plantarum-Stamm zu einem Cluster gehört, der eine Ähnlichkeit der Restriktionsendonukleasenanalyse von mehr als 70% mit dem Stamm Lactobacillus plantarum 299, Hinterlegungsnummer DSM 6595, unter Verwendung des Pearson- Produkt-Moment-Korrelationskoeffizienten und des ungewichteten Paargruppenalgorithmus mit arithmetischen Mittellwerten (UPGMA; GelCompare 3.0, Applied Maths, Kortrijk, Belgien) aufweist.
Die Restriktionsendonukleasenanalyse, REA, bezieht sich auf die Analyse des Spaltungsmusters, das bei einer Elektrophorese der bakteriellen chromosomalen DNA, welche mit Restriktionsenzymen nach dem nachstehend unter Genotyp-Identifizierung beschriebenen Verfahren aufgespalten wurde, auf Agargel gebildet wird. Durch die Charakterisierung der Stämme mittels ihres REA-Musters kann die Identität der verwendeten Isolate festgestellt werden.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine Zusammensetzung, umfassend einen der Stämme
Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595
Lactobacillus plantarum 299v DSM 9843
Lactobacillus plantarum 79
Lactobacillus plantarum 105
Lactobacillus plantarum 107
oder andere Stämme mit mehr als 70% Ähnlichkeit mit L. plantarum 299 hinsichtlich der REA.
Die bevorzugten Lactobacillus plantarum-Stämme sind in unserer mitanhängigen Anmeldung SE 9501056-7 beschrieben.
Das Arginin in der Zusammensetzung ist vorzugsweise L-Arginin. Es ist jedoch auch möglich, ein argininreiches Protein wie etwa Baumwollsamenprotein oder ein Protein aus Sojabohnen oder Erbsen zu verwenden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung umfasst außer dem Lactobacillus-Stamm und Arginin auch einen Träger, welcher pharmazeutisch annehmbar ist. Herkömmliche Träger sind z. B. physiologisch annehmbare Substrate, die durch das in Frage kommende Bakterium fermentiert werden, sowie Lebensmittel verschiedener Art, insbesondere auf der Basis von Stärke oder Milch, aber auch inerte feste oder flüssige Substanzen wie Kochsalzlösung oder Wasser. Ein geeignetes Substrat sollte flüssige oder feste Fasern enthalten, welche im Gastrointestinaltrakt nicht resorbiert werden und kurze Fettsäuren bilden, wenn sie mit Lactobacillus vergoren bzw. fermentiert werden. Als ein Beispiel für geeignete stärkehaltige Substrate können Getreidearten wie etwa Hafer und Weizen, Mais, Wurzelgemüse wie etwa Kartoffeln und bestimmte Früchte wie etwa grüne Bananen genannt werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auf jede geeignete Weise verabreicht werden, vorzugsweise oral oder rektal, z. B. in Form eines Einlaufs. Sie kann auch enteral durch einen über den Magen in den Darm eingeführten Katheder oder direkt in den Darm verabreicht werden. Tests haben gezeigt, dass die Wirkung verbessert ist, wenn Ballaststoffe beispielsweise in form von Haferschleim oder von β-Glucanen zugeführt werden. Die Behandlung sollte einmal oder mehrmals täglich während eines Zeitraums von 1-2 Wochen erfolgen.
Bei Leberversagen, z. B. in Zusammenhang mit einer Leberoperation und einer Leberentzündung, übt die Leber nicht ihre normalen Funktionen aus und Ammoniak, Stickstoffverbindungen, Endotoxine und andere bakterielle Produkte gehen durch die Leber hindurch, ohne metabolisiert zu werden, und beeinflussen den ganzen Körper. Eine Möglichkeit, die Belastung der Leber unter diesen Umständen zu verringern, besteht darin, dem Patienten einen Einlauf zu machen oder eine Diarrhöe hervorzurufen, um den Darm zu spülen. Dabei werden viele Produkte entfernt, die für das Funktionieren des Darmes erforderlich sind. Eine Zusammensetzung der Erfindung ist in einer derartigen Situation vorzugsweise als Einlauf verabreichbar.
Der Lactobacillus-Stamm kann vorzugsweise in einer Konzentration von 10'-109 KBE/ml in der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden. Die bevorzugte Dosis von Arginin für einen Menschen beträgt 25-30 g/d.
Ein bevorzugter Träger für die orale Verabreichung ist ein milchsäurefermentiertes Nahrungsmittelprodukt wie etwa eine Nährlösung auf der Basis von Hafermehl, wie sie z. B. in WO 89/08405 beschrieben ist, oder auf der Basis von Milch, z. B. Käse. Ein weiterer bevorzugter Träger ist ein Ballaststoffprodukt, wie etwa β-Glucane, Pektin, Oligosaccharide, welche ihrerseits in dem milchsäurefermentierten Nahrungsmittelprodukt enthalten sein können. Bei einer oralen Verabreichung beträgt die bevorzugte Menge, die 1-5 mal täglich verabreicht werden soll, 100-200 ml.
Eine bevorzugte Zusammensetzung für eine orale Verabreichung umfasst die Argininkomponente, die davor geschützt ist, im Dünndarm verdaut zu werden, z. B. durch eine Voraggregation von Arginin mit einem gelbildenden Polysaccharid, welches, wenn es in dem Gastrointestinaltrakt quillt, einen Schutzgelüberzug bis zur Fermentation um Darm bereitstellt. Diese Art von Gelüberzug kann mit Pektinen, Guarkernpulver und Glucomannan aus der Konjac-Pflanze, wie etwa dem handelsüblichen Produkt Propal (Shimizu Co., Japan) erhalten werden.
Bei einer rektalen Verabreichung ist der Träger vorzugsweise eine physiologische Lösung, in welcher das Arginin und Lactobacillus suspendiert sind, gegebenenfallls zusammen mit einem Ballaststoff, wie β-Glucan oder Pektin. Die bevorzugte Menge, die 1-2 mal täglich verabreicht wird, beträgt dann 20-50 ml.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 ist ein Dendrogramm, welches die Ähnlichkeit in % zwischen verschiedenen getesteten Stämmen von Lactobacillus zeigt, welche durch das REA-Verfahren charakterisiert wurden, auf der Basis des Pearson-Produkt-Moment-Korrelationskoeffzienten und UPGMA.

Identifizierung von Stämmen

Die Stämme 299 und 299v, welche beide aus gesunder menschlicher Darmschleimhaut isoliert wurden, sind bei der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH am 2. Juli 1991 bzw. 16. März 1995 hinterlegt worden und haben die Hlinterlegungsnummern DSM 6595 (299) und DSM 9843 (299v) erhalten.
Phänotypische Identifizierung. Die Stämme 299, 299v, 79, 105 und 107 sind Grampositive, Katalase-negative Stäbchen, die auf Rogosa-Agar bei pH 5, 5 wachsen und Milchsäure aus Glucose anaerob erzeugen können. Die Fähigkeit der Stämme, verschiedene Kohlenhydrate zu vergären, ist in Tabelle 1 gezeigt. Die Tests wurden mittels des API 50 CH gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Tabelle 1
Phänotypisch können die Stämme als Lactobacillus plantarum identifiziert werden.

Genotypische Identifizierung

REA

Die Stämme wurden im Hinblick auf das Spaltungsmuster der chromosomalen DNA durch das Restriktionsendonukleasenanalyseverfahren (REA-Verfahren) nach Stähl M, Molin G, Persson A, Ahrne S & Stähl S. International Journal of Systematic Bacteriology, 40: 189-193, 1990 und weiter entwickelt durch Johansson, M-L, et al., International Journal of Systematic Bacteriology 45: 670-675, 1995 untersucht. Schematisch kann die REA wie folgt beschrieben werden: chromosomale DNA aus den an der Studie beteiligten Stämmen wurde hergestellt und durch Restriktionsendonukleasen gespalten. 0,75 ug von jeder DNA wurden getrennt bei 37ºC während 4 h mit 10 Einheiten HindIII, Clal und EcoRI verdaut; jede Endonuklease wurde getrennt verwendet. Stähl et al., oben, verwendeten Asp718 anstelle von HindIII, aber der Verdau mit Asp718 führte zu zu vielen großen Banden, um für die vorliegende Methode optimal zu sein. Die gespaltenen DNA-Fragmente werden durch Gelelektrophorese unter Verwendung von untergetauchten horizontalen Agaroseplattengelen der Größe nach aufgetrennt. Die Gele bestanden aus 150 ml 0,9% Agarosen (ultrareine DNA-Qualität; niedrige Elektroendosmose; BioRad Laboratories, Richmond, USA) und wurden als Plattengele gegossen (150 · 235 mm). 0,2 ug eines Markers für DNA mit hohem Molekulargewicht (Bethesda Research Laboratories, BRL) zusammen mit 0,5 ug eines DNA-Molekulargewichtsmarkers VI (Boehringer Mannheim, Deutschland) wurden als Standardsubstanzen verwendet. Zusätzlich wurde mit EcoRI verdautes pHC 79 (Molekulargewicht 4,2 · 10&sup6;; Boehringer Mannheim) als interner Standard zu jeder Vertiefung zugegeben. Eine minimale Bandenverzerrung und eine maximale Schärfe wurden durch Auftragen der Proben- DNA in Ficoll-Ladepuffer (2 g Ficoll, 8 ml Wasser, 0,25% Bromphenol) erreicht.
Die Gele wurden mit einer konstanten Spannung von 40 V 18 h bei 8,5ºC laufen gelassen. Der Puffer (89 mM Tris, 23 mM H&sub3;PO&sub4;, 2 mM Natrium-EDTA, pH 8,3) wurde während der Laufzeit umgewälzt. Danach wurden die Gele 20 Minuten in Ethidiumbromid (2 ug/ml) angefärbt und in destilliertem Wasser entfärbt, bei 302 nm mit einem UV- Transilluminator (UVP Inc. San Gabriel, USA) sichtbar gemacht und fotografiert. Diese Art der Durchführung der Gelelekarophorese ergab gut verteilte und relativ gut aufgetrennte Banden bis herab zu einem Molekulargewicht von 1, 2 · 106.
Die Bandenmuster auf Fotonegativen wurden mit einem Laserdensitometer (UltroScan XL; LKB-Produkter AB, Bromma, Schweden) eingescannt. Die Auflösung betrug 1000 Punkte pro Bahn und jede Bahn war ungefähr 50 mm lang. Daten wurden unter Verwendung des LKB 2400 GelScan XL Softwarepakets (LKB-Produkter AB) erhalten. Die Bandenmuster wurden normalisiert und das Hintergrundrauschen wurde abgezogen, wobei der Rolling-Disk-Algorithmus des GelCompar 3.0-Programms (Applied Maths, Kortrijk, Belgien) verwendet wurden. Die Daten von den drei Spaltungen (durch HindIII, Clal und EcoRI) wurden für jeden Stamm kombiniert (wobei GelCompar 3.0 verwendet wurde).
Der Datensatz wurde unter Verwendung des Pearson-Produkt-Moment-Korrelationskoeffizienten (r) und des ungewichteten Paargruppenalgorithmus mit arithmetischen Mittelwerten (UPGMA) (Romersburg, H. C., 1984, Cluster analysis for research. Lifetime Learning Publications, Belmont, California, USA) analysiert. Die Pearson-Korrelationskoeffizienten und die UPGMA-Werte wurden für den vollständigen Datensatz berechnet und das GelCompar 3.0-Programm wurde verwendet. In Fig. 1 wurde der Cluster mit einer Ähnlichkeit > 70% mit L. plantarum 299 hervorgehoben.

Bestimmung der Plasmidprofile

Die Stämme wurden gemäß dem von Chassy et al. (1976) beschriebenen Verfahren auf den Gehalt an Plasmiden getestet. Lactobacillus plantarum 299, 299v, 79 und 105 wiesen identische Plasmidprofile auf, d. h. fünf Plasmide mit 4, 9, 15, 21 und > 30 MDa. Lactobacillus plantarum 107 wies drei Plasmide mit 4, 15 und 21 MDa auf.

Biologische Tests an Ratten

Das Ziel dieses Experiments ist, die Wirkung der rektalen Verabreichung von verschiedenen Stämmen von Lactobacillus mit und ohne Arginin auf das Ausmaß eines Leberschadens und einer bakteriellen Translokation in einem akuten Leberschadenmodell zu untersuchen.
In dem Experiment wurden fünf verschiedene Lactobacillus-Stämme verwendet: L. reuteri R2LC, der aus Rattendarmschleimhaut isoliert wurde, L. rhamnosus DSM 6594 (Stamm 271), der aus menschlichem Dickdarm isoliert wurde, L. fermentum 8i'04: 3 (Stamm 245), der aus menschlichem Jejunum isoliert wurde, L. reuteri 108, der aus menschlichem Jejunum isoliert wurde und L. plantarum DSM 9843 (Stamm 299v), der aus menschlichem Jejunum und Rektum isoliert wurde. Alle Bakterienstämme wurden von dem Labor für Lebensmittelhygiene, Abteilung für Lebensmitteltechnologie, Universität Lund, Lund, Schweden (Laboratory of Food Hygiene, Dept. of Food Technology, Lund University, Lund, Sweden) erhalten.
Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewichtsbereich von 200-300 g wurden in 13 Gruppen von sechs Tieren eingeteilt: normale, akute Leberschadenkontrolle (ALI), mit Arginin-Verabreichung (SA), mit Lactobacillus reuteri R2CL-Verabreichung (SR), mit Lactobacillus reuteri R2CL + Arginin-Verabreichung (SRA), mit Lactobacillus rhamnosus 271-Verabreichung (SS), mit Lactobacillus rhamnosus 271 + Arginin-Verabreichung (SSA), mit Lactobacillus plantarum 299v-Verabreichung (SP), mit Lactobacillus plantarum 299v + Arginin-Verabreichung (SPA), mit Lactobacillus fermentum 8704: 3- Verabreichung (SF), mit Lactobacillus fermentum 8704: 3 + Arginin-Verabreichung (SFA), mit Lactobacillus reuteri 108-Verabreichung (ST) und mit Lactobacillus reuteri 108 + Arginin-Verabreichung (S'TA). Alle Tiere erhielten normales Rattenfutter (R3, Lactamin AB, Stockholm) und Wasser ad libitum während des Experiments und wurden in einem 12-stündigen Hell/Dunkel-Zyklus bei 22ºC Raumtemperatur gehalten. Die verschiedenen Lactobacillus-Stämme wurden rektal einmal täglich 8 Tage lang mit und ohne 2% Arginin durch einen Rektalschlauch verabreicht. Die tägliche Verabreichung der Lactobacillusstämme betrug ungefähr 3 · 10&sup9; KBE pro Tier in 3 ml. Ein akuter Leberschaden wurde am 8. Tag durch intraperitoneale Injektion von D-Galactosamin (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA), 1,1 g/kg Körpergewicht, induziert, was zu einem verstärkten Austritt von Bakterien aus dem Darmlumen in entfernte Organe führt. In der akuten Leberkontrollgruppe wurde normale Salzlösung 8 Tage lang täglich verabreicht und der Leberschaden am 8. Tag hervorgerufen. Proben wurden 24 und 48 Stunden nach dem Hervorrufen des Leberschadens genommen. Unter Etheranästhesie wurde eine Laparotomie durch einen Medianschnitt unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Pfortaderblut wurde für bakteriologische Tests gesammelt und arterielles Blut wurde für bakteriologische und Leberenzymtests gesammelt. Proben aus dem Lobus caudatus der Leber und aus mesenterischen Lymphknoten (MLN) wurden für bakteriologische Untersuchungen und Leberhistologieuntersuchungen erhalten.
Vorkommen von translozierten Bakterien. In der bakteriologischen Analyse wurden Blutproben unmittelbar in EDTA-enthaltende sterile Röhrchen gegeben. Gewebeproben wurden in 5 ml steriles Transportmedium gegeben. Die Proben wurden 5 Minuten lang in ein Ultraschallbad gegeben und auf Chiltern (Terma-Glas, Schweden) 2 Minuten verwirbelt. Die Gesamt-Aerobier-Plattenauszählung erfolgte durch Aufgeben von 1,0 ml der Probe auf Hirn-Herz-Bouillon-Agar BHI (Oxoid) und 3 Tage Inkubieren bei 37ºC. Die Gesamt-Anaerobier-Plattenauszählung erfolgte durch Aufgeben der Proben auf BHI und Inkubieren unter anaeroben Bedingungen bei 37ºC. Nach 3 Tagen wurde die Anzahl der auf jeder Platte gebildeten Kolonien ausgezählt und bezüglich des Gewichts des ursprünglichen Gewebes korrigiert. Das Vorkommen einer bakteriellen Translokation in verschiedenen Teilen von jeder Ratte der jeweiligen Gruppe von sechs Ratten ist in Tabelle 1 nachstehend angegeben. Tabelle 1 Vorkommen einer bakteriellen Translokation nach 24 h
* bedeutet p < 0,05, ** bedeutet p < 0,01 im Vergleich zu der akuten Leberkontrollgruppe
Bei der vorstehenden Zählung des Vorkommens einer bakteriellen Translokation wird das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Bakterien in dem Blut oder dem Gewebe der Ratte angegeben; d. h. ein positiver Wert wird einer Ratte zugewiesen, wenn mindestens ein Bakterium gefunden wird. Das Vorkommen einer bakteriellen Translokation wurde unter Verwendung des Fisher-Exakt-Tests bewertet. Ein Wahrscheinlichkeitswert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen.
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, nahm das Vorkommen einer bakteriellen Translokation in das Blut in der akuten Leberschadenkontrollgruppe im Vergleich mit der normalen Kontrolle signifikant zu. Das Vorkommen einer bakteriellen Translokation war jedoch in den Gruppen, denen L. plantarum 299v, L. reuteri R2LC und 108 und L. fermentum 8704: 3 mit und ohne Arginin verabreicht wurden, signifikant verringert. Das Vorkommen von translozierten Bakterien in der Leber und in mesenterischen Lymphknoten nahm in allen Gruppen im Vergleich mit der akuten Leberschadenkontrollgruppe leicht ab.
Leberenzyme im Blut. Die Spiegel der Leberenzyme Serumbilirubin (Bil), alkalische Phosphatase (ALP), Aspartat-Aminotransferase (ASAT) und Alanin-Aminotransferase (ALAT) in arteriellem Blut wurden nach einer Zentrifugation des Blutes (1000 xg, 10 min) an einem Kodak, Echa chem 701) XRC in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Committee on the Enzymes of the Scandinavian Society for Clinical Chemistry and Clinical Physiology (Scan J Clin Lalb Inves 1974; 33: 291-306) gemessen. Die Serum- Aminotransferasen sind empfindliche Indikatoren eines Leberzellschadens und sehr hilfreich zum Erkennen von akuten hepatozellulären Erkrankungen und sie sind die am häufigsten gemessenen Indikatoren von Lebererkrankungen. Hepatobiliäre Erkrankungen führen zur Erhöhung der alkalischen Phosphatase im Serum. Bei einem hepatozellulären Schaden sind die Serumbilirubinwerte höher. Die Kombination eines erhöhten Serumbilirubins, eines erhöhten ASAT oder ALAT und einer erhöhten alkalischen Phosphatase ermöglicht eine genaue Vorhersage des Vorliegens von Lebererkrankungen.
Alle Werte werden als Mittelwerte ± SEM wiedergegeben. Die Ergebnisse wurden mit paarweisen multiplen Vergleichsverfahren (all pairwise multiple comparison methods) statistisch ausgewertet. Tabelle 2 Spiegel von Leberenzymen in dem arteriellen Blut
* p < 0,05 verglichen mit der ALI-Gruppe unter Verwendung von Neuman-Keuls paarweisen multiplen Vergleichsverfahren
Aus der vorstehenden Tabelle ist ersichtlich, dass die Leberenzyme in allen Gruppen, denen Lactobacillus mit und ohne Arginin verabreicht wurde, abnahmen und dass diese Abnahme in der Gruppe, der die Kombination aus Arginin und Lactobacillus plantarum verabreicht wurde, am bedeutendsten war.
Leberhistologie. Proben von dem Leberlappen wurden in 4% Phosphat-gepufferten Formaldehyd gegeben. In Paraffin eingebettete Proben wurden in Scheiben geschnitten und nach der Einfärbung mit Hämatoxylin und Eosin unter einem Lichtmikroskop untersucht. Für jede Probe wurden mindestens drei Objektträger untersucht. Die leberhistologische Bewertung erfolgte gemäß Chojkier, M. et al., Gastroenterolgy 1985; 88: 115-21 und Shiratori, Y. et al., Hepatology 1988; 8(4): 815-21 mit einer geringfügigen Abwandlung. Das Ausmaß hepatozellulärer Nekrose und entzündlicher Zellinfiltration wurde in einem Blindversuch an dem Department of Pathology at Lund University wie folgt quantitativ bestimmt:
1 minimal
2 mäßig
3 submassiv
4 massiv
Die Ergebnisse des Tests sind in nachstehender Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Histologische Gesamtpunktzahl der Leber
* p < 0,05 im Vergleich mit der ALI-Gruppe unter Verwendung des paarweisen multiplen Vergleichsverfahrens von Dunn
Vierundzwanzig Stunden sowie 48 Stunden nach dem Leberschaden zeigte die histologische Leberpunktzahl einen signifikanten Unterschied bei der Gruppe, welcher L. plantarum + Arginin verabreicht wurde, verglichen mit der akuten Leberschadenkontrollgruppe.

Zusammenfassung

Das Auftreten von Infektionen mit Darmbakterien bei Patienten mit akutem Leberversagen verschiedener Ätiologie ist sehr hoch, ungefähr 30-40%. Die Translokation der Bakterien an extraintestinale Orte verstärkt das Leberversagen und kann zu einer Septikämie und zu Multiorganversagen führen. Aus den vorstehenden Tests kann geschlossen werden, dass eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, umfassend Arginin und Lactobacillus plantarum-Stämme, beim Verhindern eines Leberschadens und -versagens und damit verbundener bakterielller Translokation anderen getesteten Stämmen überlegen zu sein schien, wie man an der signifikanten Abnahme der Freisetzung von Leberenzymen und Bilirubin, einer Abnahme der bakteriellen Translokation sowie an den Leberhistologie-Punktzahlen sehen kann.

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend

- einen Lactobacillus plantarum-Stamm mit der Fähigkeit, menschliche Darmschleimhaut in vivo zu besiedeln;

- Arginin; und

- einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Lactobacillus plantarum-Stamm ein Adhäsin aufweist, das eine Anhaftung an einem Rezeptor auf menschlichen Darmepithelzellen ermöglicht.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Lactobacillusstamm ein Stamm von Lactobacillus plantarum ist, der zu einem Cluster gehört, der eine Ähnlichkeit der Restriktionsendonukleasenanalyse von mehr als 70% mit einem Stamm Lactobacillus plantarum 299, Hinterlegungsnummer DSM 6595, unter Verwendung des Pearson-Produkt-Moment-Korrelationskoeffizienten und des ungewichteten Paargruppenalgorithmus mit arithmetischen Mittelwerten (unweighed pair group algorithm with aritmethic averages) (UPGMA; GelCompare 3.0, Applied Maths, Kortrijk, Belgien) aufweist.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei der Lactobacillus plantarum-Stamm ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, und Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das Arginin L-Arginin ist.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-5 für eine orale oder rektale Verabreichung.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-6 für die Behandlung eines akuten Leberschadens und -versagens und einer damit verbundenen bakteriellen Translokation bei Säugern, einschließlich des Menschen.

8. Zusammensetzung, umfassend eine Kombination aus einem Stamm von Lactobacillus plantarum und Arginin, zur Verwendung in einer Therapie.

9. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-6 und 8 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die heilende und/oder prophylaktische Behandlung eines Leberschadens und -versagens und einer damit verbundenen bakteriellen Translokation bei Säugern, einschließlich des Menschen.