PL184603B1

PL184603B1 - Środek farmaceutyczny do leczenia i lub profilaktyki uszkodzenia i niewydolności wątroby

Info

Publication number: PL184603B1
Application number: PL96323320A
Authority: PL
Inventors: Adawi@Diya; Jeppson@Bengt; Molin@Göran
Original assignee: Probi Ab
Priority date: 1995-05-09
Filing date: 1996-05-08
Publication date: 2002-11-29
Also published as: PL323320A1; NO975136L; GR980300028T1; WO1996035440A1; NO975136D0; BR9608284A; SE9501719D0; KR19990008403A; EE03597B1; CN1190346A; ES2112818T1; NO317668B1; EE9700269A; EP0825869B1; JPH11504936A; CA2220498A1; ES2112818T3; CN1152678C; DE69622855D1; JP4058560B2

Abstract

1. Srodek farmaceutyczny do leczenia i/lub profilaktyki uszkodzenia i niewydolnosci watroby oraz stanów powstalych na skutek zwiazanej z nimi translokacji bakterii u ssaków, w tym ludzi, zawierajacy substancje czynne i farmaceutycznie dopuszczalny nosnik i/lub substancje pomocnicze, znamienny tym, ze jako substancje czynne zawiera szczep Lacto- bacillus plantarum zdolny do kolonizacji ludzkiej blony sluzowej jelita in vivo i arginine. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek farmaceutyczny do leczenia i/lub profilaktyki uszkodzenia i niewydolności wątroby oraz stanów powstałych na skutek związanej z nimi translokacji bakterii u ssaków, w tym ludzi.

Translokacja bakterii, czyli przemieszczanie się drobnoustrojów i związków toksycznych ze światła jelita, przechodzących przez barierę stanowiącą błonę śluzową lub przedostających się przez ścianę jelita, odgrywa decydującą rolę w rozwoju wielu chorób. Translokacja bakterii może np. wystąpić u pacjentów o obniżonej odporności, u chorych pacjentów w stanie krytycznym i z niewydolnością wielu narządów, u pacjentów z wieloma urazami i w przypadkach oparzeń, w chorobach wątroby i chorobach zapalnych jelit, a także u pacjentów niedożywionych. Wirusowe zapalenie wątroby, piorunująca niewydolność wątroby, marskość wątroby, alkoholowe zapalenie wątroby, zapalenie dróg żółciowych oraz choroby autoimmunizacyjne, takie jak przewlekłe aktywne zapalenie wątroby, stanowią choroby wątroby, podczas których może zajść translokacja bakterii.

W przypadku ostrej niewydolności wątroby w wyniku zapalenia wątroby, ostrego zatrucia lub po poważnej operacji chirurgicznej wątroby, zachodzi wzmożona translokacja bakterii z jelita. Może to wyjaśniać pewne infekcyjne komplikacje obserwowane w takich stanach. Przy ostrej niewydolności wątroby występuje wysoka śmiertelność, a tę śmiertelność można w znacznym stopniu przypisać dużej liczbie przypadków^ posocznicy. U pacjentów w stanie krytycznym i o obniżonej odporności większość infekcji jest spowodowana przez własną mikroflorę pacjenta, a u wielu pacjentów umierających na skutek posocznicy lub niewydolności wielu narządów występuje bakteriemia jelitowa, dla której nie zidentyfikowano ogniska zakaźnego, co wskazuje, że infekcje te pochodzą z jelita. Z uwagi na bardzo częste występowanie klinicznie znaczącej posocznicy bakteryjnej w czasie piorunującej niewydolności wątroby istnieje również potrzeba profilaktyki.

184 603

Translokacja bakterii może doprowadzić do posocznicy, co nasila niewydolność wątroby i może doprowadzić do niewydolności wielu narządów. W leczeniu nasilającej się infekcji bakteryjnej stosuje się antybiotyki wykazujące wiele działań ubocznych, a ponadto mogą one wpływać na barierę stanowiącą jelitową błonę śluzową oraz mikroflorę.

Te odkrycia doprowadziły do zwiększonego zainteresowania gatunkami drobnoustrojów, które mogą korzystnie wpływać na równowagę drobnoustrojową gospodarza, np. przez wytwarzanie czynników przeciwdrobnoustrojowych lub konkurencyjny wzrost. Bakterie Lactobacillus należą do najczęściej badanych gatunków i wykazano, że w pewnych przypadkach przeciwdziałają one proliferacji patogenów. Bakterie Lactobacillus stanowią integralną część normalnego żołądkowo-jelitowego układu mikroekologjcznego i uczestniczą w metabolizmie gospodarza. Doniesiono, że bakterioterapia z wykorzystaniem bakterii Lactobaciilus jest skuteczna w przypadku zarówno rzekomobłoniastego, jak i wrzodziejącego zapalenia okrężnicy.

Arginina jest aminokwasem silnie działającym na układ odpornościowy organizmu, zwłaszcza po urazie. Ponadto arginina jest znanym prekursorem poliamin uważanych za ważne mediatory wzrostu i różnicowania komórek. Wiadomo także, że arginina pobudza miejscowy i ustrojowy układ odpornościowy.

W publikacji WO 96/29083 (PCT/SE96/00372) opisano zastosowanie pewnych szczepów Lactobacillus wykazujących nadawane przez adhezynę przywieranie do receptora w ludzkich jelitowych komórkach nabłonkowych, do wytwarzania środka farmaceutycznego wyzwalającego reakcję odpornościową, oraz wleczeniu stanów związanych z translokacją patogenicznych lub potencjalnie patogenicznych bakterii przez nienaruszony nabłonek jelitowy. Publikacja ta dotyczy w szczególności zastosowania Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595 i Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843 oraz innych szczepów Lactobacillus plantarum należących do określonej grupy.

Luca Gianotti i inni, Annals of Surgery, Vol 217, No. 6, 644-654, badali wpływ argininy w pokarmie na translokację bakterii. Zwiększone przeżycie można zaobserwować w przypadku zwierząt, którym podawano pokarm wzbogacony w argininę. Miano ilościowe kolonii oraz obliczony procent pozostających żywych bakterii wykazały, że zdolność do uśmiercania organizmów, które przemieściły się, znacznie zwiększa się w przypadku zwierząt, którym podawano argininę.

John E. Dały i inni, Surgery 112: 55-67, 1992, wykazali, że dojelitowe odżywianie uzupełniającą argininą, RNA i kwasami ω-3-tłuszczowymi pacjentów po operacji zwiększa obronę odpornościową według różnych mechanizmów.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że połączenie pewnych szczepów Lactobacillus i argininy znacząco zmniejsza stopień uszkodzenia i niewydolności wątroby, związane z translokacją bakterii.

Tak więc wynalazek dotyczy środka farmaceutycznego do leczenia i/lub profilaktyki uszkodzenia i niewydolności wątroby oraz stanów powstałych na skutek związanej z nimi translokacji bakterii u ssaków, w tym ludzi, zawierającego substancje czynne i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i/lub substancje pomocnicze, a cechą tego środka jest to, że jako substancje czynne zawiera szczep Lactobacillus plantarum zdolny do kolonizacji ludzkiej błony śluzowej jelita in vivo i argininę.

Środek farmaceutyczny według wynalazku jako szczep Lactobacillus plantarum korzystnie zawiera szczep Lactobacillus plantarum należący do grupy wykazującej w analizie za pomocą endonukleaz restrykcyjnych podobieństwo wynoszące ponad 70% w stosunku do szczepu Lactobacillus plantarum 299 o numerze depozytowym DSM 6595, przy wykorzystaniu współczynnika korelacji momentu iloczynu Pearsona oraz nieważonego algorytmu grup par ze średnimi arytmetycznymi (UPGMA; GelCompare 3.0, Applied Maths, Kortrijk, Belgia).

Korzystnie środek farmaceutyczny jako szczep Lactobacillus plantarum zawiera Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595 lub Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843.

Korzystnie środek farmaceutyczny jako argininę zawiera L-argininę.

Środek farmaceutyczny zazwyczaj jest przeznaczony do podawania doustnego lub doodbytniczego.

184 603

Analiza z wykorzystaniem endonukleaz restrykcyjnych, REA, dotyczy analizy układu rozszczepiania uzyskanego w elektroforezie na żelu agarowym bakteryjnego chromosomowego DNA, który został rozłożony enzymami restrykcyjnymi w sposób opisany poniżej przy identyfikacji genotypu. Charakteryzując szczepy na podstawie ich układu REA można ustalić identyczność użytych izolatów.

W szczególności środek farmaceutyczny według wynalazku zawiera dowolny szczep z grupy obejmującej:

Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595

Lactobacillus plantarum 299v DSM 9843

Lactobacillus plantarum 79

Lactobacillus plantarum 105

Lactobacillus plamtarum 107 oraz inne szczepy wykazujące ponad 70% podobieństwo do L. plantarum 299 na podstawie REA.

Korzystne szczepy Lactobacillus plantarum opisano w publikacji WO 96/29083.

Środek farmaceutyczny zazwyczaj zawiera szczep Lactobacillus wykazujący nadawane przez adhezynę przywieranie do receptora na ludzkich jelitowych komórkach nabłonkowych. Wzajemnie przywieranie receptora glikoproteiny i adhezyny jest hamowane przez cukier α -metylomannozyd, co sugeruje, że receptor zawiera mannozę. Receptor ten różni się jednak od zawierającego mannozę receptora względem jimbrii E. coli typu 1, co można wykazać na podstawie testów hemaglutynacji. Sądzi się, że receptor zawiera sekwencję Manal-2Man.

Jako argininę środek korzystnie zawiera L-argininę. Można jednak stosować także białko bogate w argininę, takie jak białko z nasion bawełny albo białko z soi lub grochu.

Środek farmaceutyczny według wynalazku zawiera oprócz szczepu Lactobacillus i argininy farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Do znanych nośników należą np. fizjologicznie tolerowane substraty fermentowane przez określone bakterie, a także różnego rodzaju produkty żywnościowe, zwłaszcza oparte na skrobi lub mleku, lecz również obojętne substancje stałe lub ciekłe, takie jak solanka lub woda. Odpowiedni substrat powinien zawierać ciecz lub stałe włókna, które nie są wchłaniane w przewodzie żołądkowo-jelitowym i które po sfermentowaniu przez Lactobacillus tworzą kwasy tłuszczowe. Jako przykładowe odpowiednie substraty zawierające skrobię można wymienić zboża, takie jak owies i pszenica, kukurydzę, warzywa korzeniowe, takie jak ziemniaki oraz pewne owoce, takie jak zielone banany.

Środek według wynalazku można podawać w dowolny odpowiedni sposób, korzystnie doustnie lub doodbytniczo, np. drogą wlewu doobytniczego. Można go także podawać dojelitowo przez cewnik wprowadzony do jelit przez żołądek, albo bezpośrednio do jelit. Testy wykazały, że osiąga się wzrost skuteczności, gdy stosuje się włókna spożywcze, np. w postaci kleiku owsianego lub β-glukanów. Leczenie powinno prowadzić się raz lub kilka razy dziennie przez 1-2 tygodnie.

Przy niewydolności wątroby, np. związanej z operacją wątroby i stanem zapalnym wątroby, wątroba nie wypełnia swoich normalnych funkcji, toteż amoniak, związki azotu, endotoksyny i inne produkty bakteryjne będą przechodzić przez wątrobę bez ulegania metabolizmowi i wpływać na cały organizm. Jednym ze sposobów zmniejszania obciążenia wątroby u pacjenta jest w takich przypadkach wlew doodbytniczy lub prowokowanie biegunki w celu przepłukania jelit. Jednakże wówczas zostaje usuniętych wiele produktów niezbędnych dla funkcjonowania jelit. W takiej sytuacji środek według wynalazku można korzystnie podawać drogą wlewu doodbytniczego.

Środek farmaceutyczny może korzystnie zawierać szczep Lactobacillus w stężeniu 10⁷10⁹ CFU/ml. Korzystna dawka argininy w przypadku człowieka wynosi 25-30 g/dzień.

Korzystnym nośnikiem przy podawaniu doustnym jest sfermentowany kwasem mlekowym produkt spożywczy, taki jak roztwór odżywczy oparty na mące owsianej, np. opisany w WO 89/08405. albo oparty na mleku, np. ser. Do innych korzystnych nośników należą odżywcze produkty włókniste, takie jak β-glukany, pektyna, oligosacharydy, które z kolei mogą

184 603 występować w produkcie spożywczym sfermentowanym kwasem mlekowym. Przy podawaniu doustnym korzystna dawka, podawana 1-5 razy dziennie, wynosi 100-200 ml.

Korzystny środek do podawania doustnego zawiera składnik argimnowy w postaci zabezpieczonej przed strawieniem w jelicie cienkim, np. w wyniku wstępnej agregacji argininy z tworzącym żel polisacharydem, który pęczniejąc w przewodzie żołądkowo-jelitowym będzie tworzyć żelową powłoczkę ochronną, aż do sfermentowania w okrężnicy. Tego typu powłoczkę żelową możną wytwarzać z pektyn, sproszkowanych nasion Cyamopsis tetragonolobus oraz glukomannanu z rośliny Konjac, takiego jak produkt handlowy Propal (Shimizu Co., Japonia).

Przy podawaniu doodbytniczym korzystny nośnik stanowi roztwór fizjologiczny, w którym dysperguje się argimnę i bakterie Lactobacillus, ewentualnie wraz z włóknem odżywczym, takim jak β-glukan lub pektyna. Korzystna ilość, podawana 1-2 razy dziennie, wynosi 20-50 ml.

Figura 1 przedstawia dendrogram pokazujący podobieństwo w procentach pomiędzy różnymi zbadanymi szczepami Lactobacillus, scharakteryzowanymi metodą REA opartą na współczynniku korelacji momentu iloczynu Pearsona oraz UPMGA.

Szczepy 299 i 299v, które wyodrębniono ze śluzówki jelit zdrowych ludzi, zdeponowano w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH odpowiednio 21i pca 1991 r. i 16 marca 1995 r., gdzie nadano im numery depozytowe DSM 6595 (299) i DSM 9843 (299v).

Identyfikacja fenotypowa

Szczepy 299, 299v, 79, 105 i 107 stanowią Gram-dodatnie, katalazo-ujemne pałeczki rozwijające się na agarze Rogosa przy pH 5,5, zdolne do wytwarzania kwasu mlekowego z glukozy w warunkach anaerobowych. Zdolność szczepów do fermentacji różnych węglowodanów podano w tabeli 1. Testy przeprowadzono zużyciem API 50 CH zgodnie z instrukcjami producenta.

Fenotypowo szczepy można zidentyfikować jako Lactobacillus plantarum.

Tabela 1

Zdolność fermentacyjna szczepów L. plantarum 299, L. plantarum 299v, L. plantarum 107, L. plantarum 105 i L. plantarum 275 w API 50CH w 30°C i 37°C

Węglowodan	L. plantarum 299	L. plantarum 299v	L. plantarum 107	L. plantarum 105	L. plantarum 79
30°C	37°C	30°C	37°C	30°C	37°C	30°C	37°C	30°C	37°C
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Gliceryna	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Erytrytol	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D-Arabinoza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
L-Arabinoza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Ryboza	+		+	+	+	+	+	+	+	+
D-Ksyloza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
L-Ksyloza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Adonitol	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
β-Metylo-ksylozyd	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Galaktoza	+	+	+		+	+	+	+	+	+
D-Glukoza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
D-Fruktoza		+	+	+	+	+	+	+		+
D-Mannoza	+		+	4-	+	+	+	+	+	+
L-Sorboza	-	-	-	-	-		-		-	-
Ramnoza							-	- \|

184 603 ciąg dalszy tabeli 1

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Dulcytol	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Inozytol	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Mannitol	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Sorbitol	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
α-Metylo-D-mannozyd	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
α-Metylo-ghikozyd	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
N-Acetylo-glukozamina	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Amigdalina	+	+	4·	+	+	+	+	+	+	+
Arbutyna	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Eskulina	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Salicyna	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Celobioza	+	+		+	+	+	+	+	+	+
Maltoza		+	+	+	+	+	+	+	+	+
Laktoza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Melibioza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Sacharoza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Trehaloza	+	+	+		+	+	+	+	+	+
Inulina	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Melezytoza		+	+	+	+	+	+	+	+	+
D-rafinoza	-	-	+	-	+	-	-	-	-	-
Skrobia	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Glikogen	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Ksylitol	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
β-Gencjobioza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
D-Turanoza		+		+	+	+	+	+	+	+
D-Liksoza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D-Tagaroza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D-Fukoza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
L-Fukoza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D-Arabitol	-	-	+	-	+	-	+	-	+	-
L-Arabitol	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Glukonian	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
2-Ketoglukonian	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
5-Ketoglukonian	-	-		-	-	-	-	-	-	-

Identyfikacja genotypowa

REA

Szczepy zbadano na podstawie układów rozszczepienia chromosomowego DNA z wykorzystaniem analizy endonukleazami restrykcyjnymi - REA - sposobem, który opisali M. Stahl, G Molin, A. Persson, S. Ahrne i S. Stahl, International Journal of Systematic Bacteriology 40: 189-193, 1990, następnie ulepszonym przez M-L. Johanssona i innych. International Journal of Systematic Bacteriology 45:670-675, 1995. Schematycznie REA można opisać następująco: Chromosomowe DNA ze szczepów wykorzystywanych w badaniach wypreparowano i rozszczepiono endonukleazami restrykcyjnymi. 0,75 pg każdego z DNA tra184 603 wiono osobno w 37°C przez 4 godziny z użyciem 10 jednostek HindIII, Clal i EcoRI; każdą endonukleazę zastosowano osobno. Stahl i inni, powyżej, zastosowali Asp718 zamiast Hindlll, jednakże przy trawieniu za pomocą Asp718 uzyskuje się zbyt wiele dużych pasm, aby w optymalny sposób wykorzystać stosowaną metodykę. Rozszczepione fragmenty DNA rozdzielono pod względem wielkości drogą elektroforezy w żelu, stosując zanurzone poziome bloki z żelu agarozowego. Żele zawierały 150 ml 0,9% agarozy (DNA-ultra czysta; niska elektro-endoosmoza; BioRad Laboratories, Richmond, USA) wylane w postaci bloków (150 x 235 nnn). Jako wzorce zastosowano 0,2 pg markera DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (Bethesda Research Laboratories, BRL) wraz z 0,5 pg markera masy cząsteczkowej DNA VI (Boehringer Mannheim, Niemcy). Dodatkowo pHC 79 strawiony EcoRI (masa cząsteczkowa

4,2 x 10⁶; Boehringer Mannheim) dodawano do każdej studzienki jako wzorzec wewnętrzny. Minimalne zniekształcenie pasm oraz maksymalną ostrość osiągano stosując próbkę DNA w buforze obciążającym Ficoll (2 g środka Ficoll, 8 ml wody, 0,25% bromofenol).

Elektroforezę w żelach prowadzono pod stałym napięciem 40 V przez 18 godzin przy pH 8,5. Bufor (89 mM Tris, 23 mM H3PO4, 2 mM sól sodowa EDTA, pH 8,3) recyrkulowano podczas elektroforezy. Żele barwiono następnie przez 20 minut bromkiem etydiowym (2 pg/ml) i odbarwiano w wodzie destylowanej, wizualizowano przy 302 nm w transluminatorze UV (UVP Inc., San Gabriel, USA) i fotografowano. Prowadząc elektroforezę w żelu w taki sposób uzyskano dobrze rozmieszczone i stosunkowo dobrze rozdzielone pasma w dół od masy cząsteczkowej 1,2 x 10⁶.

Układy pasm na negatywach skanowano laserowym densytometrem (UltroScan XL; LKBProdukter AB, Bromma, Szwecja). Rozdzielczość wynosiła 1000 punktów/ścieżkę, przy długości każdej ścieżki około 50 mm. Wyniki poddawano obróbce z wykorzystaniem pakietu oprogramowania LKB 2400 GelScan XL (LKB-Produkter AB). Układy pasm normalizowano, a tło stanowiące szum odejmowano z wykorzystaniem algorytmu rolling-disc programu GelCompar (Applied Maths, Kortrijk, Belgia). Wyniki z trzech rozszczepień (za pomocą, Hindin, ClaI i EcoRI) połączono dla każdego szczepu (z wykorzystaniem Gel Compar 3.0). Zestaw wyników analizowano z wykorzystaniem współczynnika korelacji momentu iloczynu Pearsona (r) oraz nieważonego algorytmu grup par ze średnimi arytmetycznymi (UPGMA) (H.C. Romersburg, 1984, Cluster analysis for research. Lifetime Leaming Publications, Belmont, Kalifornia, USA). Współczynniki korelacji Pearsona i wartości UPMGA wyliczano dla pełnego zestawu danych i wykorzystywano program GelCompar 3.0. Na fig. 1 zaznaczono grupę o podobieństwie > 70% w stosunku do L. plantarum 299.

Profile plazmidowe

Szczepy zbadano metodą opisaną przez Chassy'ego i innych (1976) pod względem zawartości plazmidów. Lactobacillus plantarum 299, 299v, 79 i 105 wykazują identyczne profile plazmidowe, to znaczy 5 plazmidów o 4, 9 15, 21 i > 30 MDa. Lactobacillus plantarum 107 zawiera 3 plazmidy o 4,15 i 21 MDa.

Testy biologioczne na szczurach

Celem tego doświadczenia było zbadanie wpływu podawania doodbytniczego różnych szczepów Lactobacillus z dodatkiem lub bez argininy na stopień uszkodzenia wątroby i tratslokację bakterii w modelu ostrej niewydolności wątroby.

W doświadczeniu wykorzystano 5 różnych szczepów Lactobacillus: L. reuteri R2LC wyodrębniony z błony śluzowej jelita szczura, L. rhamnosus DSM 6594 (szczep 271) wyodrębniony z ludzkiej okrężnicy, L. fermentom 8704:3 (szczep 245) wyodrębniony z ludzkiego jelita czczego, L. reuteri 108 wyodrębniony z ludzkiego jelita czczego oraz Z. plantarum DSM 9843 (szczep 299v) wyodrębniony z ludzkiego jelita czczego i odbytnicy. Wszystkie szczepy bakterii otrzymano z Laboratory of Food Hygiene, Dept, of Food Technology, Lund University, Lund, Szwecja.

Samce szczura Spragae-Dawley o wa^e 200-300 g podzielono na 13 grup po 6 zwierząt: normalną kontrolną z ostrym uszkodzeniem wątroby (ALI), z uzupełniającym podawaniem argininy (SA), z uzupełniającym podawaniem Lactobacillus reuteri R2CL (SR), z uzupełniającym podawaniem Lactobacillus reuteri R2CL i argininy (SRA), z uzupełniającym podawaniem Lactobacillus rhamaosus 271 (SS), z uzupełniającym podawaniem Lactobacillus rhamnosus 271 i argininy (SSA), z uzupełniającym podawaniem Lactobacillus plantarum 299v (SP),

184 603 z uzupełniającym podawaniem Lactobacillus plantarum 299v i argininy (SPA), z uzupełniającym podawaniem Lactobacillus fermentum 8704:3 (SF), z uzupełniającym podawaniem Lactobacillus fermentum 8704:3 i argininy (SFA), z uzupełniającym podawaniem Lactobacillus reuteri 108 (ST) oraz z uzupełniającym podawaniem Lactobacillus reuteri 108 i argininy (STA). Wszystkie zwierzęta, które otrzymywały zwykłą karmę dla szczurów (R3, Lactamin AB, Sztokholm) oraz wodę bez ograniczeń przez cały czas doświadczenia, trzymano w temperaturze pokojowej 22°C w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność. Różne szczepy Lactobacillus podawano doodbytniczo raz dziennie przez 8 dni z 2% argininy lub bez przez rurkę doodbytniczą. Dzienna dawka uzupełniająca szczepów Lactobacillus wynosiła około 3 x 109 CFU/zwierzę, podawana w 3 ml. Ostrą niewydolność wątroby wywołano w 8 dniu przez dootrzewnową iniekcje D-galaktozaminy (Sigma Chemical Co., St Louis, USA), 1,1 g/kg wagi ciała, co spowodowało zwiększone przedostawanie się bakterii ze światła jelita do odległych narządów. W przypadku grupy kontrolnej z ostrą niewydolnością wątroby zwykłą solankę wprowadzano uzupełniająco przez 8 dni, po czym w 8 dniu wywołano uszkodzenie wątroby. Próbki pobierano w 24 godziny po rozwinięciu się uszkodzenia wątroby. Przy znieczuleniu eterem wykonywano laparotomię przez nacięcie wzdłuż linii środkowej w warunkach aseptycznych. Krew wrotną zbierano dla przeprowadzenia testów baktCTiologicznych, a krew tętmczą zbierano dla testów bakteriologicznych i oznaczania enzymów wątroby. Pobierano próbki z płata ogoniastego wątroby i krezkowych węzłów chłonnych (MLN) do badań bakteriologicznych i histologii wątroby.

Przypadki translokacji bakterii

Przy wykonywaniu analizy bakteriologicznej próbki krwi umieszczano natychmiast w sterylnych probówkach zawierających EDTA. Próbki tkanki umieszczano w 5 ml sterylnej pożywki transportowej. Próbki umieszczano w łaźni ultradźwiękowej na 5 minut, po czym miksowano w aparacie Chiltern (Terma-Glas, Szwecja) przez 2 minuty. Całkowite aerabowe miano płytki uzyskiwano umieszczając 1,0 ml próbki na mózgowo-sercowym agarze infuzyjnym BHI (Oxoid), po czym prowadzono inkubację przez 3 dni w 37°C. Całkowite anaerobowe miano płytki uzyskiwano umieszczając 1,0 ml próbki na mózgowo-sercowym agarze infuzyjnym BHI, po czym prowadzono inkubację w37°C w warunkach anaerobowych. Po 3 dniach liczbę kolonii powstałych na każdej płytce zliczano i dokonywano korekty związanej z wagą wyjściowej tkanki. Występowanie translokacji bakterii w różnych częściach każdego szczura z odpowiedniej grupy 6 szczurów podano poniżej w tabeli 2.

Tabela 2

Translokacja bakterii po 24 godzinach

Grupa	Krew wrotna	Krew tętnicza	Wątroba	MLN
Normalna	0/6	0/6	0/6	0/6
ALI	5/6	6/6	6/6	6/6
SA	5/6	3/6	6/6	4/6
SRA	1/6*	1/6**	4/6	2/6*
SR	2/6	1/6**	5/6	3/6
SSA	5/6	4/6	6/6	6/6
SS	3/6	3/6	6/6	6/6
SPA	2/6	1/6**	5/6	5/6
SP	3/6	2/6*	4/6	2/6*
SFA	1/6*	2/6**	5/6	5/6
SF	5/6	2/6*	5/6	5/6
STA	1/6*	1/6**	4/6	4/6
ST	^2/6	1/6**	4/6	4/6

♦oznacza p < 0,05;

** oznacza p < 0,01 w porównaniu z grupą kontrolną z ostrą niewydolnością wątroby

184 603

Przy ocenianiu przypadków translokacji bakterii stwierdzano obecność lub nieobecność bakterii w krwi lub tkance szczura; wartość dodatnią przyznawano szczurowi gdy znaleziono co najmniej jedną bakterię. Przypadki translokacji bakterii oceniano z wykorzystaniem testu dokładności Fishera. Poziom prawdopodobieństwa poniżej 0,05 uznawano za znaczący.

Jak to można stwierdzić na podstawie tabeli 2, liczba przypadków translokacji bakterii do krwi zwiększa się znacząco w grupie kontrolnej z ostrą niewydolnością wątroby w porównaniu z normalną grupą kontrolną. Liczba przypadków translokacji bakterii była natomiast znacząco niższa w grupach, którym uzupełniająco podano L. plantarum 299v, L reuteri R2LC i 108 oraz L. fermentum 8704:3, z dodatkiem lub bez argininy. Ilość przypadków translokacji bakterii w wątrobie i krezkowych węzłach chłonnych była nieznacznie niższa we wszystkich grupach w porównaniu z grupą kontrolną z ostrą niewydolnością wątroby.

Enzymy wątroby we krwi

Poziomy w surowicy krwi tętniczej enzymów wątroby, bilirubiny (Bil), fosfatazy alkalicznej (ALP), aminotransferazy asparaginianowej (ASAT) i aminotransferazy alaninowej (ALAT) oznaczano po wirowaniu krwi (1000 x g, 10 minut) w aparacie Kodak, Echa chem 700 XRC, zgodnie z zaleceniami Komitetu Enzymów Skandynawskiego Stowarzyszenia Chemii Klinicznej i Fizjologii Klinicznej (Scan. J. Clin. Lab. Inves. 1974. 33: 291-306). Aminotransferazy w surowicy stanowią czułe wskaźniki uszkodzenia komórek wątroby i są najbardziej przydatne w rozpoznawaniu ostrych chorób wątroby o podłożu komórkowym i stanowią najczęściej oznaczane wskaźniki chorób wątroby. Choroby wątroby związane z wydzielaniem żółci prowadzą do podwyższenia poziomu fosfatazy alkalicznej w surowicy. Przy uszkodzeniu komórek wątroby poziom bilirubiny w surowicy jest wysoki. Kombinacja zwiększonego poziomu bilirubiny w surowicy, podwyższonego poziomu ASAT lub ALAT oraz podwyższonego poziomu fosfatazy alkalicznej umożliwia z przewidywaną dokładnością stwierdzenie występowania choroby wątroby.

Wszystkie wartości podano jako średnie ± średni błąd standardowy. Wyniki oceniano statystycznie z wykorzystaniem metod wielokrotnego porównywania wszystkich par.

Tabela 3

Poziom enzymów wątroby we krwi tętniczej

Grupy	ALP (jiKat/litr)	Bil (pmol/litr)	ASAT (ąKat/litr)	ALAT (pKat/litr)
ALI	16,43±1,41	16,17±3,36	97,83±15,90	86,17±16,44
SA	14,86±1,12	14,57±220	59,83±12,54	50,50±8,89
SRA	14,55±1,48	14,50±4,15	60,42.12,92	48,87±12,04
SR	14,83±0,60	15,00±1,46	62,67±3,76	58,83±9,64
SSA	15,60±1,69	15,80±4,72	65,17±21,13	60,50± 17,99
SS	16,20±2,58	15,62±4,20	65,57±23,35	64,03±13,97
SPA	12,83±0,83	6,58±1,56	23,00±4,57*	25,32±5,16
SP	13,67±1,38	10,85±2,40	45,1^10,23	44,67±10,84
SFA	14,67±1,43	13,83±2,98	55,50±16,67	56,55±17,03
SF	14,92±0,84	14,83±5,69	57,35±13,53	57,67±13,20
STA	13,67±1,33	12,00±5,14	46,17±11,63	41,83±10,68
ST	14,17±1,19	I4,00±1,98	59,67±12,93	58,33±11,57

* p < 0,05 w porównaniu z grupą ALI z wykorzystaniem metody Neumana-Keulsa wielokrotnego porównywania wszystkich par

Na podstawie powyższej tabeli można stwierdzić, że poziom enzymów obniżył się we wszystkich grupach, którym uzupełniająco podawano bakterie Lactobacillus z dodatkiem lub

184 603 bez argininy, oraz że spadek ten był najbardziej znaczący w przypadku grupy, której uzupełniająco podawano kombinację argininy i Lactobacillus plantarum.

Histologia wątroby

Próbki płata wątroby umieszczono w 4% formalinie buforowanej fosforanem. Próbki osadzone w parafinie pocięto na płaty i zbadano pod mikroskopem optycznym po zabarwieniu hematoksyliną i eozyną. W przypadku każdej próbki zbadano co najmniej 3 płaty. Ocenę histologiczną wątroby przeprowadzono w sposób podany przez M. Chojkiera i innych, Gastroenterology 1985; 88: 115-21 oraz Y. Shiratoriego i innych, Hepatology 1988; 8(4): 81521, z niewielką modyfikacją. Średni stopień martwicy komórek wątroby i nacieczenie komórek zapalnych oznaczano ilościowo na ślepo na Wydziale Patologii Uniwersytetu w Lund zgodnie z następuj ącą skalą:

minimalny umiarkowany mniejszy od masowego masowy

Wyniki testu podano poniżej w tabeli 4.

Tabela 4

Łączna ocena histologiczna wątroby

24 godziny	48 godzin
Grupa	Ocena łączna	Grupa	Ocena łączna
ALI	4,8±0,3	ALI	5,3±0,5
SA	4,3±0,2	SA	3,3±0,2*
SRA	3,5±0,6	SPA	3,0±0,6*
SR	4,0±0,3	SP	3,7±0,2
SSA	4,3±0,2
SS	4,2± 0,4
SPA	2,8±0,2*
SP	4,0±0,0
SFA	4,2±0,5
SF	4,0±0,5
STA	4,0±0,0
ST	4,3±0,3

* p < 0,05 w porównaniu z grupą ALI z wykorzystaniem metody Dunna wielokrotnego porównywania wszystkich par

W 24 godziny, a także w 48 godzin po uszkodzeniu wątroby ocena histologiczna wątroby wykazała znaczące różnice pomiędzy grupą, której podawano uzupełniająco L. plantarum i argininę oraz grupą kontrolną z ostrym uszkodzeniem wątroby.

Podsumowanie

Stopień występowania infekcji bakteriami jelitowymi u pacjentów z ostrą niewydolnością wątroby o różnej etiologii jest bardzo wysoki, około 30-40%. Translokacja bakterii do miejsc poza jelitem wzmaga niewydolność wątroby, co może doprowadzić do posocznicy i niewydolności wielu narządów. Na podstawie powyższych testów można wywnioskować, że środek według wynalazku, zawierający argininę i szczepy Lactobacillus plantarum wydaje się być korzystnieeszy porównaniu z innymi przebadanymi szczepami w zapobieganiu uszkodzeniu i niewydolności wątroby oraz stanów powstałych na skutek związanej z nimi translokacji bakterii, co można stwierdzić na podstawie znaczącego zmniejszenia uwalniania enzymów wątroby i bilirubiny, zmniejszenia translokacji bakterii oraz oceny histologii wątroby.

184 603

Lb. ptantamm Lb. ptantamm Lb. ptantamm Lb. ptantamm

101

256

Lb. ptantamm ATCC 14917^ Lb. piantarjm 36E Lb. ptantamm 95 Lb. planlantm 98 Lb. ptantangn 299 ‘

Lb. ptantamm Lb. ptantamm 107 Lb. ptantamm 105

Lb. ptantamm Lb. ptantamm Lb. ptantamm Lb. ptantamm Lb. ptantamm Lb. ptantamm Lb. ptaniarum Lb.“ptantamm

275 366 So5

ATCC 0014 120 44 CH

Lb.pontosus ATCC 6041^ Lb.“ptantamm‘ 442 Lb. termentum ATCC 14931 Pd. addOacti CCUG 32235 ^TLb. mutari DSM 20016 Lb. mutari DSM 20015 Lb.muteri N2LC Lb. mutari N5LC:2 Lb. mutari N2J Lb.muteri N5D:I Lb. mutari 1044 Lb.muteri 6SSl:t Lb. mutari 1046 Lb.muteri 8557:3 Lb. gasseri DSM 20243^TLb.vagina5s CCUG 31452 ^τUramytwoms DSM 20532 ^TLb. hetoefcus DSM 20075 ^TLb. “ptantamm' ATCC 10776

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Środek farmaceutyczny do leczenia i/lub profilaktyki uszkodzenia i niewydolności wątroby oraz stanów powstałych na skutek związanej z nimi translokacji bakterii u ssaków, w tym ludzi, zawierający substancje czynne i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i/lub substancje pomocnicze, znamienny tym, że jako substancje czynne zawiera szczep Lactobacillus plantarum zdolny do kolonizacji ludzkiej błony śluzowej jelita in vivo i argininę.
2. Środek farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że jako szczep Lactobacillus plantarum zawiera szczep Lactobacillus plantarum należący do grupy wykazującej w analizie za pomocą. endonukleaz restrykcyjnych podobieństwo wynoszące ponad 70% w stosunku do szczepu Lactobacillus plantarum 299 o numerze depozytowym DSM 6595, przy wykorzystaniu współczynnika korelacji momentu iloczynu Pearsona oraz nieważonego algorytmu grup par ze średnimi arytmetycznymi.
3. Środek farmaceutyczny według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako szczep Lactobacillus plantarum zawiera Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595 lub Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843.
4. Środek farmaceutyczny według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako argimnę zawiera L-argininę.
5. Środek farmaceutyczny według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jest przeznaczony do podawania doustnego lub doodbytniczego.