KR100592717B1 - 간 손상 보호 및 예방에 유용한 활성을 갖는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간세포 보호 및 간 손상 예방에 유효하며 항산화효과를 나타내는 락토바실러스 플랜타륨 추출물과 간 기능 개선 효과를 나타내는 밀크씨슬을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.

락토바실러스 플랜타륨, 밀크씨슬, 항산화, 간세포 보호, 간손상 예방

Description

간 손상 보호 및 예방에 유용한 활성을 갖는 조성물{Composition having preventive and therapeutic effects of liver damage}

도 1은 본 발명의 조성물의 간기능 보호작용에 대한 효과를 알아보기 위해 각 실험구의 쥐에 사염화탄소를 경구투여하여 임의로 간손상을 준 후 간세포 손상 지표물질인 sGOT 및 sGPT 치를 측정한 것이다.

음성대조군 : 정상식이 투여군

양성대조군 : 사염화탄소 투여군

락토바실러스 플랜타륨 추출물 : 사염화탄소와 락토바실러스 플랜타륨 추출물 투여군

도 2는 본 발명의 조성물의 간기능 보호작용에 대한 효과를 알아보기 위해 각 실험구의 쥐에 사염화탄소를 경구투여하여 임의로 간손상을 준 후 간세포 손상 지표물질인 sGOT 및 sGPT 치를 측정한 것이다.

음성대조군 : 정상식이 투여군

양성대조군 : 사염화탄소 투여군

락토바실러스 플랜타륨,밀크씨슬 복합추출물 : 사염화탄소와 락토바실러스 플랜타륨 추출물과 밀크씨슬 복합물 투여군

본 발명은 간세포 보호 및 간 손상 예방에 효과가 탁월한 조성물에 관한 것이다.

간은 우리 몸에서 가장 큰 장기로서 각종 대사작용, 해독, 분해, 합성 및 분비를 담당하는 매우 중요한 장기이다. 보다 자세히 살펴보면 에너지 대사를 관리하는 기능이 있어 음식물에서 흡수된 모든 영양소들이 간에서 에너지를 생산할 수 있는 물질로 대사되어 전신에 공급되거나 저장된다. 간은 약 2,000여종의 효소, 알부민, 응고인자들의 혈청단백, 답즙산, 인지질, 콜레스테롤 등의 지방 등을 합성하고 저장하며 분배하는 기능이 있다. 해독 및 분해 기능으로서 약물, 술, 독성물질 등을 해독시키므로 간세포가 손상되기 쉽고 따라서 약물성, 독성, 알코올성 간질환 등이 흔히 발생하게 된다. 또한 각종 대사산물을 담관을 통해 십이지장으로 배설하는 기능 및 면역기능이 있어 우리의 생명유지에 중요한 역할을 하고 있다. 간은 앞에서 나열한 것 같이 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있고 영양소 이외에도 많은 독성물질에 노출될 위험이 다른 장기보다 많아 그만큼 손상될 확률도 매우 높다. 간은 재생능력이 우수한 장기로 약간의 손상이 있을 경우에는 충분히 정상으로 회복되지만, 손상이 지속될 경우에는 간 조직의 일부가 완전히 파괴되고 간 기능도 저하되는 등 정상간으로의 회복이 어려운 상태가 된다. 이러한 간 손상이 만성화되면 그 원인에 상관없이 간 섬유화 또는 간경화, 간암으로 진행된다. 간 섬유화, 간경화, 간암 등은 현재 뚜렷한 치료제 및 치료법이 없는 질환으로 그 사망률 또한 높은 질환이다. 그러므로 간 손상이 만성화되기 전에 이러한 간 손상을 예방 및 치료하는 것이 간 섬유화, 간경화 또는 간암으로의 진행을 억제하는데 매우 중요하다. 간은 질환초기에는 자각증상이 없고 간 손상 정도가 심한 정도에 이르러서야 자각증상이 나타남으로써 간 질환의 조기 발견은 그만큼 어렵다. 현재 간염, 간경화의 예방 및 치료를 위해 가장 일반적으로 사용하는 약제로는 우르소데옥시콜린산, 면역자극제, 항바이러스제, 실리마린, 운지다당체, 비타민 B군, 메티오닌 등이 사용되고 있으나 이 약제들 중 어느 것도 아직까지 임상적으로 만족스러운 효과를 제공하는 것은 없었다. 따라서 최근에는 평상시 용이하게 섭취하여 간에 부담을 주지 않으면서도 간손상을 치료할 뿐 아니라 예방할 수 있는 방법을 찾고자 하는 노력이 진행되고 있다.

간세포 보호 및 간 손상 예방에 유용한 조성물에 포함되는 밀크씨슬은 다양한 생리활성 작용으로 간세포 보호 기능이 뛰어난 것으로 알려져 있으며, 대표적인 생리활성으로는 항산화 작용, 세포막 수준에서의 독소 차단, 단백질 생합성 증가, 항혈전 효과, 그리고 항염 효과와 면역기능 증진 효과 등이 밝혀져 있다. 이는 밀크씨슬에서 추출되는 후라보노이드 화합물인 실리마린(silymarin)이 간이 손상되는 것을 막아주고 해독과정을 강화시키는데 큰 효과가 있다. 실리마린은 항산화제 작용하여 간의 손상을 막아준다. 비타민 E 와 비타민 C의 항산화작용에 비해 몇배 강력한 것이다. 또한 실리마린은 알코올 질환자에게 좋다는 것이 밝혀졌으며, 간경화환자의 면역기능을 증대시킬 수 있다는 보고가 있다.

한편, 유산균(lactic acid bacteria)은 세균 중에서 가장 오래전부터 인간에 게 유용하게 이용되고 있는 균으로서, 특히, 발효 유제품에서 보편적으로 이용되어 왔다. 유산균은 영양소의 흡수를 개선하고, 유당불내성(lactose intolerance)을 완화시키며, 장의 운동성을 개선하고 항암효과를 갖는다고 보고된 바 있다.

본 발명자들은 상기와 같이 인체에 유용하며 다양한 기능을 갖고 있는 유산균을 이용하여 간손상 보호 및 예방 할 수 있는 방법에 관해 연구하던 중, 유산균의 세포질 분획물 또는 유산균 파쇄물이 간기능 장애로부터 보호효과와 항산화 효능을 갖고 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 일상생활에서 쉽게 손상될 수 있으나, 이를 쉽게 인지할 수 없는 간의 기능저하를 예방 및 개선시키는 것을 목적으로 한다.

또 본 발명은 항산화와 간 기능 개선에 효과를 갖는 유산균 추출물과 밀크씨슬을 함유시킨 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum)으로부터 분리된 세포질 분획물과 밀크씨슬을 유효성분으로 포함하는 항산화, 간세포 보호 및 간손상 예방을 위한 기능성 식품을 제공한다.

본 발명에 따른 간기능 개선 조성물에는 밀크씨슬이 함유되어 있다. 밀크씨슬에는 실리마린이라는 성분이 함유되어 있는데, 이 성분은 간의 면역기능을 강화시켜주는 역할을 한다. 즉, 실리마린은 간 독성물질이 간 세포벽을 통하여 간 조직 으로 들어오는 것을 막아줄 뿐만 아니라, 세포 내 효소 활성을 증가시켜 간 독성물질을 해독시켜 준다. 이외에도, 간에 지방이 축적되는 것을 억제하는 작용이 있어서, 간의 지방변성을 개선시켜 준다.

이러한 효능을 나타내는 밀크씨슬의 함량(실리마린 40%)은 전체 조성물에 대하여 20 내지 50중량%가 바람직하다. 이는 20중량% 미만일 경우에는 활성 산소에 의한 파괴로부터 간세포를 보호하는 작용 및 세포를 더욱 건강하게 하는 작용이 미미하다는 문제점이 있으며, 50중량%를 초과할 경우에는 하루 적정 복용량을 초과하는 문제점이 있기 때문이다.

본 발명의 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum)균주는 독성이 없는 안정한 균주이며, 유효용량은 1 x 10⁸ ~ 4 x 10⁹ 균수/kg이고, 바람직하기로는 1 x 10⁹ ~ 2 x 10⁹ 균수/kg 이며, 하루 1∼3 회 투여될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum) 균주를 식품 또는 음료의 제조시에 상기 특정식품 소재 1g(또는 ㎖) 당 본 발명의 균을 1 x 10⁷ 내지 1 x 10⁹ 개(균수) 첨가하고, 바람직하게는 1 x 10⁸ 내지 5 x 10⁸ 개의 양으로 첨가한다. 본 발명의 균주의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있 음은 확실하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

〈실시예 1〉 유산균 세포질 분획물 및 파쇄물의 제조

MRS 배지(Difco) 3L에 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum)을 접종하여 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 8000rpm, 4℃로 원심분리(vision, Korea)하여 유산균을 회수하였고, 증류수로 3회 세척한 후 동결 건조시켜 보관하였다. 세포질 분획물을 분리하기 위하여, 상기에서 분리하여 동결 건조시킨 유산균을 증류수에 10mg/ml농도로 현탁하엿다. 현탁한 세포를 세포 파쇄기(Sonics and Materials In, Danbury, CT, USA)를 이용하여 30분간 파쇄하되, 발생되는 열을 얼음으로 냉각시키면서 파쇄하였다. 파쇄된 세포를 4℃에서 800g로 30분간 원심분리하여 세포 침전물을 제거하였다. 파쇄된 세포의 상층액으로부터 세포벽을 분리하기 위하여 70,000g로 30분간 초고속 원심분리(Ultracentrifuge, Hitach, Tokyo, Japan)하여 세포벽이 포함된 침전물을 제거함으로써 상층액인 세포질 분획물을 분리하였다.

상기에서 회수된 유산균의 현탁에 사용되는 완충용액으로는 트리스 버퍼(Tris buffer), 포스페이트 버퍼(phosphate buffer) 등 당업계에서 통상적으로 사용되는 완충용액이라면 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 상기 현탁된 유산균의 파쇄는 호모지나이즈(homogenize), 초음파분쇄(sonication) 등 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이 이용될 수 있다. 또한, 상기에서 유산균 파쇄물로부터 세포 침전물 및 세포벽을 분리, 제거하는 방법으로는 원심분리(centrifugation) 방법을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum) 세포질 분획물을 유효성분으로 포함할 수도 있고, 이용상의 편의 등을 위하여 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum)을 세포 파쇄기로 파쇄한 유산균 파쇄물을 유효성분으로 포함하여 제조될 수도 있다.

〈실시예 2〉락토바실러스 플랜타륨 추출물의 항산화 효과

2-1) 검체 준비

쥐(rat) 5주령의 스프레규 도우레이(Sprague Dawley) 종에 아무것도 투여하지 않은 음성대조군, 사염화탄소만을 투여한 양성대조군 그리고 사염화탄소와 실시에 1에서 제조된 락토바실러스 플랜타륨 추출물을 분말화하여 증류수에 20% 농도로 녹인 후 체중100g당 2ml을 경구투여한 후 24시간 후에 쥐를 마취시킨 후 개복하고 간을 적출하기 직전에 하대정맥에서 1ml 정도의 혈액을 채취하고 혈청을 분리한 후 -70℃에 보관한다.

2-2) MDA 활성도 측정

Thiobarbituric acid를 이용하여 MDA농도를 측정하였다. 0.16M KCl이 포함된 0.2M 트리스(pH7.4)완충용액으로 조직을 균질화시켜서 reagent와 완전히 섞고 15분간 가열하여 식힌 후 1,000g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하여 형광분석 파장 535nm에서 흡광도를 측정한다.

2-3) GSH 함량 측정

GSH 함량은 PBS로 세 번 씻고 세포를 용해시킨 후 Elman방법을 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정한다.

2-4) GSH-Px 활성도 측정

end-point direct assay 방법으로 cumene hydroperoxide를 기질로 사용하여 분당 환원된 GSH의 감소량으로 활성도를 측정한다.

2-5) GST 활성도 측정

GST 활성도는 Habig(1974)의 방법에 기초하여 1-chloro-2,4-dinitrobenzene을 첨가하고 1분간 반응시킨 후 405nm에서 3분간 흡광도 증가를 측정한다.

2-6) Catalase (CAT)활성도

Catalase 활성도는 Aebi (1984)의 방법에 따라 간조직 파쇄한 후 10,000×g 으로 원심분리한 후 50mM, pH 7.0 phosphate buffer로 희석한 다음 30mM H₂O₂을 넣어 혼합한 다음 30초간 240nm에서 흡광도의 감소를 측정하고 H₂O₂의 molar extinction coefficient인 43.6M-1cm-1을 이용하여 활성도를 계산한다.

측정한 결과를 표1에 나타내었다.

[표 1]

〈실시예 3〉 유산균 추출물의 간기능 보호 실험

실시예 1에서 제조한 유산균 추출물의 간기능 보호작용에 대한 효과를 알아 보기 위해 5주령된 건강한 쥐를 각 실험구별로 6마리씩 선별하여 간기능 보호 효과를 확인하였다. 사염화탄소 (CCl₄)는 간에 독성을 주는 표본물질로서 간세포 배양, 간 박편 (slice) 배양 그리고 마우스나 래트에 직접 투여하는 방법 등을 이용하여 간 독성을 연구하는데 널리 사용되고 있다. 사염화탄소는 간에서 복합적인 기능을 하는 시토크롬 (cytochrome) P450 과 같은 대사효소에 의해 대사되어 매우 반응성이 강한 자유 라디칼인 CCl₃ 와 Cl을 형성하게 되고 자유 라디칼인 CCl₃ 은 축적된 간 중성지방이나 막 인지질에 있는 지방산의 산화를 유발시켜 지질의 산패를 일으켜 산소와 결합한 후 지질 과산화 작용을 통하여 유기 과산화물을 형성한다. 이어서 지질 과산화작용을 통하여 간장에 지방이 축적되고, 단백질 합성능력은 감소하 게 되어 글리코겐이 분해되고 혈관내의 세포질 효소들이 파괴되어 간조직의 괴사가 일어난다. (Recknagel, R. 0., et al. Pharmacol. Rev, 19:145-208, 1967; Chang, I. M. et al. Drug and chemical toxicology, 6(5):443-453, 1983). 각 실험구의 쥐에 간손상을 임의로 주기 위하여 사염화탄소를 생체 중량대비 1.2ml/kg 경구투여 한 직후 실시예 1에서 제조된 20% 락토바실러스 플랜타륨(2ml/100g)추출물을 경구투여한 후 24시간 경과 후 Retiman-Fankel법을 이용한 영동제약(주)의 GOT와 GPT활성 측정용 kit를 이용하여 각 군에서 간세포 손상지표물질인 sGOT 및 sGPT치를 측정하였다.

그 결과 도1에서 양성대조군에 비해 락토바실러스 플랜타륨 추출물 투여군에서 유의적인 수준으로 sGOT와 sGPT 수치가 감소하였다.

따라서 본 발명의 조성물은 간질환에 대해 예방 및 치료효과를 가지며, 또한 혈청중의 sGOT와 sGPT 수치를 저하시키는데 기여한다.

〈실시예 4〉유산균과 밀크씨슬 복합 추출물의 간기능 보호 실험

실시예 1에서 제조한 유산균 추출물과 밀크씨슬 복합추출물의 간기능 보호작용에 대한 효과를 알아보기 위해 각 실험구의 쥐에 사염화탄소를 생체 중량대비 1.2ml/kg 경구투여한 직후 실시예 1에서 제조된 20% 락토바실러스 플랜타륨(2ml/100g)추출물과 실리마린(250mg/kg)을 혼합한 물질을 경구투여한 후 24시간 경과 후 Retiman-Fankel법을 이용한 영동제약(주)의 GOT와 GPT활성 측정용 kit를 이용하여 간세포 손상지표물질인 sGOT 및 sGPT 치를 측정하였다.

그 결과를 도2에 나타난 바와 같이 양성대조군에 비해 락토바실러스 플랜타 륨, 밀크씨슬 복합물 투여군에서 유의적인 수준으로 sGOT와 sGPT 수치가 감소하였다.

〈실시예 5〉독성실험

실시예 1에서 제조된 조성물을 분말화하여 증류수에 20% 농도로 녹인 후 이를 독성실험에 이용되는 쥐(rat) 5주령의 스프레규 도우레이(Sprague Dawley)종에 경구투여 하였다. 경구투여량은 20% 용액 2ml/100g 체중의 쥐이며 이때 평균치 사량, 임상증상, 체중변화 등을 관찰하였다.

모든 투여용량 군에서 사망하는 쥐의 예는 관찰되지 않았고, 따라서 평균치사량은 20% 용액 2ml/100g 이상으로 추정된다. 또한 투여된 쥐의 모두에서 특이한 임상증상 및 체중변화를 관찰하지 못하였다. 따라서 실시예 1에서 제조된 물질의 독성은 거의 인정되지 않았으며, 매우 안전한 물질로 사료된다.

이상으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 간 기능 개선 조성물은 아무런 부작용의 염려 없이 복용 가능할 뿐만 아니라, 이를 복용할 경우, 간 보호, 콜레스테롤 감소 및 면역활성 효과가 우수하다.

Claims (4)

1. 간세포 보호 및 간 손상 예방에 유효하며 인체에 안전하며 항산화 효과를 나타내는 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum) 파쇄물 또는 세포질 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물
2. 제 1항에 있어서, 상기 유산균 파쇄물이 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 조성물:

   (a) 유산균을 배양하고 배양액으로부터 유산균을 회수하는 단계;

   (b) 상기 회수된 유산균을 완충용액 또는 증류수에 현탁하는 단계; 및

   (c) 상기 현탁된 유산균을 파쇄하는 단계.
3. 제 1항에 있어서, 상기 세포질 분획물이 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 조성물:

   (a) 유산균을 배양하고 배양액으로부터 유산균을 회수하는 단계;

   (b) 상기 회수된 유산균을 완충용액 또는 증류수에 현탁하는 단계;

   (c) 상기 현탁된 유산균을 파쇄하는 단계; 및

   (d) 상기 파쇄된 유산균으로부터 세포 침전물 및 세포벽을 분리, 제거하는 단계.
4. 제 1항에 있어서, 유산균 파쇄물 또는 세포질 분획물 (1×10⁷내지 1×10⁹ 균 당량/식품 gram)과 밀크씨슬 추출물을 전체 중량에 대하여 20내지 50 중량% 로 혼합되는 것을 특징으로 하는 조성물

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