KR100591245B1

KR100591245B1 - 뇌 항산화활성을 가지는 참취 추출물

Info

Publication number: KR100591245B1
Application number: KR1020030047598A
Authority: KR
Inventors: 김미리
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2003-07-12
Filing date: 2003-07-12
Publication date: 2006-06-19
Also published as: KR20050007955A

Abstract

본 발명은, 참취를 물, 알코올 또는 물-알콜 혼합물로 추출하여 얻는 항산화활성을 가지는 참취 추출물에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명에 의한 참취 추출물은, (A) 참취를 알코올로 추출하고 농축하여 알코올 추출물을 수득하는 알코올추출단계; (B) 상기 알코올추출단계를 거친 추출물을 헥산 및 물을 사용하여 헥산층과 물층으로 분획한 후 물층을 수득하는 분획1단계; 및 (C) 상기 분획단계를 거친 물층에 클로로포름을 가하고 분획하여 재차 물층을 수득하는 분획2단계;를 포함하는 단계에 의하여 제조될 수 있다.

본 발명에 의하여, IC₅₀ 이 낮으면서 독성이 없고 손쉽고 저렴하게 구할 수 있어서 일상식생활에서 채소로 많이 이용하는 참취로부터 뇌 항산화 효과가 우수한 추출물을 획득할 수 있게 된다.

항산화, 활성산소, 참취, 지질과산화, 뇌항산화, 식용식물, 추출, 분획

Description

뇌 항산화활성을 가지는 참취 추출물{An Extract Having an Antioxidative Activity in Brain Tissue}

도 1은 본 발명에 의한 참취 추출물의 용매 분획을 수득하는 과정을 보여주는 개략 흐름도.

도 2는 추출에 의해 우수한 항산화 효과를 보여주는 몇몇 시료 및 그 항산화 정도를 보여주는 도표.

도 3은 KA에 의한 뇌독성 유발 효과를 보여주는 도표.

도 4는 본 발명에 의한 추출물이 뇌조직에서의 지질과산화에 미치는 영향을 보여주는 도표.

도 5는 본 발명에 의한 추출물이 GSH peroxidase의 활성을 회복시켜주는 것을 보여주는 도표.

본 발명은 항산화활성을 가지는 참취 추출물에 관한 것이다.

Glutamate 수용체를 매개로 한 흥분성 독성은 다양한 뇌질환의 원인으로 알려져 있다(Jhamandas et al., 1994). KA(KA)는 여러 종류의 흥분성 아미노산의 신경독성연구를 위한 모델시약으로 사용되어 왔는데 이는 KA에 의해 유발된 흥분독성은 glutamate의 과다방출이 뇌신경조직의 병리적 손상을 초래하기 때문이다(Olney et al., 1974; Coyle and Puttfarcken, 1993). KA는 흥분성 아미노산 수용체를 활성화시키는데 이로인해 활성산소종의 과다 방출로 인한 지질과산화에 의하여 뇌신경 조직의 손상을 유발시킨다(Floreani et al., 1997; Saija et al., 1997). 대표적인 뇌질환으로는 Alzheimer's disease(AD)(Furuta et al., 1995; Good et al., 1996), multiple sclerosis(MS)(Takeda et al., 1996), amyotrophic lateral sclerosis (ALS)(Rosen et al., 1993), Parkinson's disease(PD)(Bowling & Beal, 1995), 뇌졸중(stroke), 허혈장애(ischemia) 등이 잘 알려져 있는데, 특히 Alzheimer's disease, Parkinson's disease, 뇌졸중 등을 비롯한 노인성 뇌 질환에서 뇌 세포 내 radicals 형성을 수반하는 oxidative stress가 병인에 해당하는 것으로 보고되어 왔다(Tappel, 1997).

Oxidative stress는 세포나 조직이 toxic free radicals에 의해 손상되는 것을 의미하는 것으로 oxidative stress에 의한 신경 세포의 손상(neuronal damage)은 정상적인 노화 과정 중에 발생하는 뇌세포의 손상과 AD, PD, ALS, 치매 등 뇌신경조직의 퇴행성 질환(Neurodegenerative disease)(Good et al.,1996;Bowling & Beal, 1995; Tappel, 1997)에 관련하는 것으로 알려져 있다. 뇌는 다량의 molecular oxygen (O₂)을 소비한다. 뇌 무게는 체중의 2% 밖에 되지 않으나 산소 소비량은 전체의 20%를 차지하여(Sokoloff, 1960) 뇌 조직내 산소의 분압이 높아지게 되는데 이때에 glutamate decarboxylase의 활성이 감소하거나 oxygen free radical 형성의 증가로 경련이 유도될 수가 있다(Halliwell & Gutteridge, 1989). 특히, 뇌조직은 free-radical 공격에 대해서 민감한데, 이러한 이유는 뇌 신경세포에는 protective mechanism이 충분하지 못하며, 산화되기 쉬운 다가불포화지방산(long chain unsaturated fatty acids)이 고농도로 존재하고, radicals 형성시 촉매로 이용되는 금속이온(Fe²⁺, Cu²⁺) 등이 존재하기 때문이다.

포유동물의 신경계 중 흥분성 아미노산 신경계(excitatory amino acids system, EAAs system)의 과대흥분은 간질(epilepsy), AD, PD, 뇌졸중, trauma 등의 질환의 유발에 관련되어 있는데, 이러한 질병유발에 free radicals의 증가에 기인하는 oxidative stress가 관여하는 것으로 알려져 있다(Rosen et al., 1993; Pellegrini-Giampietro et al., 1990). 흥분성 아미노산 신경계를 활성화시켜 뇌 손상을 일으키는 물질을 흥분성 신경독(excitotoxins)이라 부르며, 이들에 의해 과도하게 흥분된 EAAs system은 신경세포 내의 이온의 유입과 free radicals 생성을 유도하여 신경세포의 손상을 일으킨다. 흥분성 아미노산 신경계의 glutamate 수용체는 일종의 ligand-gated ion channel로서 이 수용체는 agonist의 선택성에 따라서 N-methyl-D-aspartate(NMDA), α-amino-4-isoxazole-propionic acid(AMPA), kainate(Nakanishi, 1992) subtype receptor로 구분된다. 이들 수용체의 과도한 흥분은 신경세포의 손상을 초래하는 데, NMDA 수용체의 과도한 흥분은 Ca²⁺ 의 유입으로 세포 구성성분인 지질, 단백질 및 핵산의 분해를 초래하는 반면에, non-NMDA 수용체의 과도한 흥분은 Na⁺ 의 유입에 따른 신경세포의 용적증가(swelling)를 초래한다. 아울러non-NMDA 수용체인 kainate 수용체가 활성화되는 경우에도 많은 ROS의 생성을 통해 뇌신경세포의 손상이 유발되는 것으로 알려져 있다(Olney et al., 1974).

KA는 강한 중추신경계의 흥분성 독소로 수 시간 또는 수 일간 지속되는 급성 또는 아급성 간질형(epileptiform) 활성을 나타내며 궁극적으로는 신경세포 뿐 아니라 glia, myelin sheaths 등에서 비가역적인 신경병리학적인 변화를 초래한다(Sperk, 1994). 이외에 KA는 뇌 손상을 직접적으로 유도할 뿐 아니라 아울러 뇌 독성을 나타낼 수 있는 정도의 glutamate양을 방출한다(Robert et al., 1993). 이처럼 KA에 의해 유도된 신경 세포 사멸은 활성 산소종(ROS)의 생성으로 인한 세포막의 파괴에 기인되며 이러한 신경세포독성은 항산화제의 투여에 의해 보호되는 것으로 보고되었다(Coyle & Puttfarcken, 1993).

세포내 oxidant radicals이 조직손상의 요인으로 잘 알려진 경우로는 알코올, 사염화탄소, 페놀류, 방사선 조사, 자외선 등의 외부환경에 의한 간세포의 손상, radicals 생성에 따른 간, 폐, 심장 등 여러 조직의 손상에 대한 보고 등이 있으며(Judah & McLean, 1970), 기타 일부 발암 물질의 독성도 지질과산화를 통해 일어난다고 알려져 있다(Ames, 19984; Kensler & Trush, 1984; Zimond et al., 1992). 이처럼 조직내에서 oxidative stress를 유발하는 물질에 대한 연구는 많이 진행되어 왔으나, 뇌세포에서 선택적으로 radicals을 형성하는 물질에 대한 연구는 부진한 실정이었다.

최근 뇌에서 선택적으로 oxidative stress를 유발하는 물질에 대한 연구가 활발히 진행되면서 아울러 이러한 oxidative stress의 보호제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. Reactive oxygen species(ROS)에 대한 세포내 존재하는 보호물질로는 glutathione(Roberts & Francetic, 1993; Marcos et al., 1995), α-tocopherol(Hoekstra, 1975; Kormbrist & Movis, 1980; Reddy et al., 1982; Earnster & Nordenbrand, 1967), vitamin A(Earnster & Nordenbrand, 1967), vitamin C(Rustia, 1975), selenium(Hoestra, 1975) 외에, 항산화 효소계로 superoxide dismutase(McCord & Fridvovich, 1969), catalase, glutathione peroxidase(Roberts & Francetic, 1993; Tappel, 1978), glutathione S- transferase(Roberts & Francetic, 1993; Burk et al., 1980), glutathione reductase(Tietze, 1969; Floreani et al., 1997; Phillis, 1994), quinone reductase(Prestera et al., 1993) 등이 있다.

Glutathione(GSH)은 뇌를 포함한 여러조직 세포에서 수 mM 농도로 존재하며 oxidative stress에 대한 주요 항산화제로서(Yoshika et al., 1977) H₂O₂나 lipid hydroperoxides를 환원시키는 과정에서 glutathione disulfide(GSSG)로 산화된다. 또한 세포내 Ca²⁺의 항상성을 유지시켜주며(Ca²⁺-ATPase), 항산화제의 재생을 통해 잠재적으로 neurotoxic factor인 glutamate를 glutathione의 전환에 기여하기도 한다. 세포내 환원형 GSH 농도는 glutathione reductase에 의해서 유지되는데, NADPH의 존재하에 glutathione reductase은 산화된 GSSG를 환원하여 glutathione를 재생시킨다. 이와 같이 glutathione는 비효소적 또는 효소적으로 세포내 redox balance를 유지시켜 ROS에 의한 산화적 손상을 막아주는 중요한 역할을 한다(Novak et al., 1978). ROS 형성을 막거나 제거하는 효소로는 superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase가 있다(Halliwell, 1978).

뇌의 항산화계 시스템을 살펴보면 Parkinson's disease 환자에서는 glutathione peroxidase 와 glutathione reductase 활성도에 모두 변화가 없었으나, GSH양은 감소하였고 GSSG는 증가하는 것으로 보고되었다(Sian et al., 1994). 반면에 AD환자의 경우는 GSH과 GSSG의 함량이 모두 증가하였다(Alams et al., 1991). 한편, Senescence accelerated mice(SAM)의 경우 ddY 마우스와 비교해 볼 때 GSH 함량과 SOD 활성도가 더 낮은 것으로 보고된 바 있다(Liu & Mori, 1993). 또한 어린 뇌와 비교해 볼 때 노화된 뇌에서는 glutathione reductase가 현저히 감소하는 것으로 보고되었다(Benzi et al, 1989). Wistar 랫드의 경우, 9개월에 비해 28개월령의 뇌에서는 GR가 약 20% 정도 감소하였다. 한편, GR 활성도의 변화는 뇌의 부위에 따라 변화를 보이는데, 35개월령의 뇌는 5개월령에 비해 피질(cortex)부위에서 glutathione reductase 활성도가 41 % 정도 감소한 반면, 시상(thalamas)부위에서는 35 %정도 감소한 것으로 보고된 바 있다.

현재까지 세포내에서 생성되는 oxidant radicals에 대한 항산화 보호측면에 서 여러 가지 천연항산화제의 효과가 보고되었는데 주로 한약재나 식품성분의 항산화에 관한 것으로, 간 조직에 관한 연구보고가 대부분이며 뇌 조직의 항산화에 관련된 연구는 매우 부진하다. 한편 노인성 뇌질환의 발병을 예방하는 측면에서의 치료제 개발 연구로 신경보호치료에 초점을 맞추고 있는데, 최근에 free radicals의 소거제, 칼슘 길항제, NMDA 및 non-NMDA 수용체 길항제 등(Olney et al., 1991; Brouillet & Beal, 1993; Kim & Kwon, 1999)이 뇌 보호목적으로 개발되어 일부 사용되고 있으나 뇌 보호용 항산화제의 경우 인체 안전성이 입증되지 못한 상태이어서 내재 항산화제를 제외하고는 실용이 부진하다. 이러한 관점에서 보면 우리가 흔히 먹는 식용 식물자원은 인체 안전성이 어느 정도 검증된 것이라고 간주되므로 이러한 시용식물자원을 활용할 필요가 있으나 대개의 경우 간 등 다른조직에 대한 연구이고 뇌 보호목적으로 수행된 연구보고는 미흡하다.

KA에 의해 유발된 rat의 뇌조직에서 GSH 함량은 감소되었고 지질과산화는 증가되었다(Floreani et al., 1997; Gupta et al., 2002). 또한, KA에 의해 유발된 뇌신경 독성이 glutathione, melatonin, trans-resveratrol에 의해 보호되었다고 보고되었다(Saija et al., 1997; Floreani et al., 1997; Gupta et al., 2002). 이같은 면에서 채소 추출물은 다양한 종류의 항산화물질을 함유하고 있으므로 ROS에 의해 손상된 뇌조직을 보호할수 있을 것으로 생각되며, 또한, 효과적으로 뇌의 blood brain barrier를 통과할 수 있는 항산화제는 흥분성 독성 물질에 의하여 유발된 뇌신경독성을 효과적으로 보호할 수 있을 것으로 생각된다.

산채류에는 각종 알칼로이드, 탄닌, 사포닌, 배당체, flavonoid 류 등이 많 이 함유되어 있기 때문에 생리활성이 다양할 것으로 보이며(14), 특히, 항산화 작용도 매우 크리라 생각된다. 본 발명자는 뇌 질환의 주요 병인인 뇌 조직에서 oxidative stress에 대한 보호 또는 예방효과를 나타내는 식용식물자원으로부터 뇌조직에서의 항산화활성이 우수한 후보를 검토한 바, 다양한 식용식물 자원 중에서 참취의 추출물이 항산화활성, 특히 뇌세포에 대한 항산화활성이 우수함을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

참취(Aster scaber Thunb.)는 우리나라 산야에 널리 퍼져있을 뿐 아니라, 일상식생활에서 많이 애용되는 산채류 중의 하나이다. 참취는 민간요법으로 상처, 뱀에 물린데, 두통, 어지럼증 등의 치료에 오래 전부터 이용되어 왔다(Kim et al., 1997). 본 발명자의 선행연구에서 참취에탄올 추출물은 mouse에 NMDA에 의해 유발된 뇌에서의 oxidaative stress에 대한 보호효과가 뛰어났는데, 특히, NMDA에 의해서 감소된 glutathione의 함량을 효과적으로 회복시켜주었다(Lee et al., 2002).

본 발명은, 뇌질환의 주요 병인인 뇌에서의 oxidative stress에 대한 보호 또는 예방효과를 나타내는 물질을 식용식물자원으로부터 선별하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 선별된 후보 식물로부터 선택적으로 oxidative stress를 유발시키는 물질을 효과적으로 추출하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 추출물이 함유된 항산화활성용 기능성 식품 또는 의약 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 참취를 물, 알코올 또는 물-알콜 혼합물로 추출하여 얻는 항산화활성을 가지는 참취 추출물에 관한 것이다.

나아가 (D) 상기 분획2단계를 거친 물층에 에틸아세테이트를 가하고 분획하여 재차 물층을 수득하는 분획3단계; (E) 상기 분획3단계를 거친 물층에 부탄올을 가하고 분획하여 부탄올층을 수득하는 분획4단계; 및 (F) 상기 분획4단계를 거친 부탄올층 분획을 저온저압하에서 증발시켜 농축분획을 수득하는 농축단계;를 추가하여 고순도, 고농도의 항산화활성을 가지는 참취 추출물을 얻는 것도 가능하다.

본 발명에서 상기 알코올은 95∼100% 농도의 메탄올 또는 에탄올인 것이 바람직하다.

상기와 같은 방법에 따라 제조된 참취 추출물은 항산화활성이 우수하기 때문 에, 본 발명에 의한 참취 추출물을 유효성분으로 포함하는 각종의 기능성 식품 또는 뇌질환 예방-치료용 항산화제가 가능함은 당업자에게 당연할 것이다.

상기 뇌질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병, 허혈성 뇌졸증 또는 퇴행성 척추손상 등 뇌기능의 손상 내지 저하에 의한 어떠한 질환도 이에 해당될 수 있다.

본 발명에 의한 참취 추출물의 획득방법은 다음과 같은 복잡한 사전실험 및 확인실험에 의해 결정되었다.

(1) 식용식물자원의 확보, 전처리 및 시료 추출물 제조 : 다수의 식용식물자원들을 가공방법을 달리하여(열풍건조 및 동결건조) 시료 제조 및 시료의 용매 추출물 및 용매 분획물 제조하였다.

(2) 식용식물자원의 뇌항산화 효과 측정(in vitro) : 소의 뇌 조직에서 H₂O₂및 Fe³⁺을 사용하여 유발된 지질 과산화를 TBARS로 측정하여 지질과산화에 대한 보호작용이 우수한 식용식물자원 추출물 및 추출방법을 선별하였다. 이 과정을 통하여 참취 등 국내 고유 식용식물 용매 추출물로부터 열처리 시에도 항산화 효과가 뛰어난 6종을 선별하였다. 또한 동물실험을 통해 참취 메탄올 추출물의 butanol 분획이 마우스에 흥분성 독소로 작용하는 KA(KA) 유도에 의한 뇌항산화 보호효과가 우수함을 확인하였다.

(3) 선정된 우수한 후보식물자원 및 추출방법에 의한 추출물에 대하여 in vivo 동물실험을 통해 뇌 조직에서 oxidative stress에 대한 보호효과 분석 : oxidative stress를 유발시킨 후 다음과 같이, 치사율, 신경행동학적 변화, 생화화적 지표 등을 분석하였다.

(3-1) 뇌 조직 내 oxidative stress 유도 : KA를 투여하여 oxidative stress 유발 후 치사율, 체중, 신경행동학적 변화를 분석

(3-2) 생화학적 지표분석 : 마우스 뇌조직에서 지질 과산화물(TBARS), total glutathione(Tietze & Floreani 등) 함량, 항산화관련 효소(Glutathione peroxidase(GP, Tappel의 방법), Glutathione reductase(GR, Pinto 등) 등의 활성도 분석

(4) 발명의 완성 : 최종적으로 선별된 식물 및 추출방법에 따라 수득한 참취 추출물이 특히 뇌 항산화활성에 우수함을 확인하였다.

이하 실시예 및 적용예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

실험방법

(1) 실험동물의 준비 및 사육

체중 20-25g의 ICR male mouse를 분양받아 실험에 사용하였다. 순화 및 실험기간 중에 mouse는 polycarbonate 케이지(19×25×13 cm, 명진기계) 당 5수씩 사육하고, 사료는 실험동물용 고형사료(삼양사료)를, 음수는 상수도수를 자유섭취하도록 하였다. 실험실 환경은 온도 23±3 ℃, 상대습도 60±10 %, 24시간 양압환기, 조명 07:00-19:00 및 조도 150-200 lux로 조절하였다. 순화 기간 중 건강하다 고 판단된 동물만을 무작위로 군을 분리하여 실험에 사용하였다.

(2) 뇌 조직내 oxidative stress 유도 및 뇌 조직 적출

아래에서 설명되는 시료액의 투여 당일 오전 10시에 동물의 체중을 측정하고, 경구투여용 존데(sonde)를 사용하여 각각의 시료용액을 3 ㎖/kg의 양으로 4일간 경구투여하였다. 대조군은 4일간 증류수를 투여하였다. 3일째에 시료 투여 1시간 후 뇌 손상 유도를 위해 40 mg/kg의 KA를 증류수에 녹여 10 ㎖/kg의 양으로 복강내에 주사하였다. 대조군은 증류수만을 4일간 투여하고 KA는 투여하지 않은 군으로 정상적인 기준치로 삼았다.

모든 동물을 5 일째(시료 투여 종료 1일 후, KA투여 2일 후)에 체중을 측정한 후, ethyl ether로 마취시킨 다음 복대동맥을 절단, 방혈하여 희생시켰다. 뇌를 신속하게 적출하여 생리식염수로 세척한 다음 대뇌만을 절단하여 중량을 측정한 후 -70℃ 에 보존하면서 실험에 사용하였다. 본 실험에서 동물관리 및 실험처치는 미국 National Research Council이 Committee on Care and Use of Laboratory Animals에서 제정한 "Guide for Care and Use of Laboratory Animal (National Institute of Health Publ. # 85-23, 1985)(67)"에 의거 수행하였다.

(2) 식용식물자원 등의 입수

신선한 참취(Aster scaber Thunb.), 머위(Petasite japonicus MAX.), 고들빼기, 씀바귀 등 각종 식용식물자원을 대전의 농수산물 도매시장 또는 강원도 산채시험장에서 입수하였다. KA, glutathione reductase(Type III from bakers yeast), cumene peroxide, reduced glutathione(GSH), oxidized glutathione(GSSG), tetramethoxypropane, 5,5'-dithio-2-nitrobenzoic acid(DTNB), xanthine, NADP, NADPH, thiobarbituric acid(TBA), epicatechin and bovine serum albumin은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO) 제품을 구입하였다.

(3) 식용식물자원의 용매추출 및 시료액의 준비

식용식물자원 일정량을 물에서 깨끗이 씻은 후 물기를 빼고 무게를 잰 후 열풍건조 (70℃) 또는 동결건조시켰다. 건조시킨 식용식물자원 일정량을 곱게 갈아 체(200 mesh)에 내린 후 건조분말 1g에 무수메탄올 25 mL를 넣어 암소(15℃)에서 3일간 추출한 후, 무수메탄올로 3회 반복 추출하여 얻은 추출물을 감압 건조시켜 용매를 제거한후 냉동고(-24℃)에 보관하면서 사용하였다.

추출물의 투여 개시일에 추출물과 증류수(vehicle로 50% ethanol, saline, 1% CMC, 증류수를 사용하여 예비실험한 결과, saline이나 증류수의 경우가 효과적이었다)를 1 : 2 (g/v)로 섞어 잘 용해시켜 냉장고에 보존하면서 시료액으로 이용하였다.

(4) 용매별 추출 분획물 제조(도 1)

항산화 효과가 우수한 것으로 확인된 참취를 깨끗이 씻은 후 열풍건조(열풍건조시의 항산화 활성은 동결건조시와 차이가 없었으므로(도 2 참고), 에너지, 비용면에서 실용적인 열풍건조법을 선택함) 건조시킨 후 잘게 부수어 건조 산채류 무게의 10배의 무수 메탄올을 넣어 암소(15℃)에서 3일간 추출하였다. 메탄올 추출물을 감압건조(rotary evaporator, RE111, B

chi사, Swizerland)시켜서 메탄올 추출물을 얻었다. 계통 용매분획하기 위해 메탄올 추출물을 증류수에 용해시켜, hexane으로 분획물을 얻어 chlorophyll 등이 용해된 hexane층을 버리고 나머지 물분획에 chloroform, ethyl acetate,n-butanol을 순차적으로 사용하여 분획물을 얻었다. 각 용매 분획물은 저온 감압 하에 용매를 제거한 후에 실험에 사용하였다.

(5) 항산화효과 분석실험(in vivtro)

(5-1) 지질 과산화 조건 설정

뇌균질액(6 mg/㎖)의 지질과산화를 유발시키기 위해 뇌균질액 1 ㎖에 25 M의 ascorbate 와 0.2 mM의 Fe³⁺을 넣고 30분간 37℃ incubator에서 진탕하면서 반응시킨 후 ascorbate(25 M) 및 Fe³⁺(0.2 mM)의 단독 또는 ascorbate와 Fe³⁺ 의 혼합물을 넣은 후, 15% trichloroacetic acid(1 ㎖), TBA 시약(500 ㎕)를 가하고 100 ℃ incubator에서 15분간 중탕 후 얼음 속에서 급냉시켰다. 상기 혼합액을 14,000rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 533 nm에서 흡광도(A)를 측정하였다(Bidlack and Tappel 22). 표준곡선은 1,1,3,3,-tetraethoxypropane의 가수분해물인 malondialdehyde를 사용하여 작성하였으며(23), IC50을 구하여 항산화 정도를 평가하였다.

(5-2) 지질 과산화에 대한 항산화효과 측정

상기의 지질과산화 조건에 식물자원 추출물을 넣고 동일 방법에 따라 533 nm에서의 흡광도(A)를 측정하였다. 이 때 별도로 EtOH 또는 표준 항산화제의 효과도 측정 비교하였다.

항산화 효과(%)는 다음과 같은 식으로 계산하였다.

상기 식에서 각 기호의 의미는 다음과 같다.

A1 : 뇌균질액만이 처리된 경우의 흡광도

A2 : 뇌균질액이 가해진 경우의 흡광도

A3 : 뇌균질액, ascorbate 및 Fe³⁺이 가해진 경우의 흡광도

A4 : 뇌균질액, ascorbate 및 Fe³⁺에 추출물이 가해진 경우의 흡광도

(6) Mouse 뇌조직내 총 glutathione 함량 측정

(6-1) 시료의 준비

마우스 뇌 조직 membrane 전량을 취해서 6% metaphosphoric acid(40 ㎖/g tissue)가 되도록 균질화시킨 후, 27,000rpm(4℃)에서 20분간 원심분리하여 상징액을 10 mM phosphate buffer(pH 7.4)에 분산시켜서 사용하였다.

(6-2) 총 glutathione 함량 측정

총 glutathione은 Tietze(43)와 Floreani 등(44)의 방법을 약간 변형하여 사용하였다 . GSH가 5, 5-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid, DTNB)에 의해서 계속적으로 산화되며 GR의 존재 시에 NADPH에 의해서 환원되는 enzymatic recycling procedure를 측정하는 원리로 GSH이 산화되면 GSSG이 형성되고 이것은 다시 GR와 만나면 GSH로 되돌아가는 원리를 이용한다.

5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB가 GSH과 반응하면 chromophoric product(2-nitro-5-thiobenzoic acid)의 노란색 침전물이 형성된다. 2-nitro-5-thiobenzoic acid(TNB)의 형성속도는 흡광도를 측정하여 standard curve를 참고하여 GSH를 정량할 수 있다. 제조한 시료의 상등액 50 ㎕를 취해서 500 ㎕ 의 cuvette cell에 0.1M의 potassium phosphate/EDTA buffer(pH 7.4) 390 ㎕를 넣고 10mM의 [5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB] 25㎕, 5mM NADPH 80㎕를 취해서 3 분간 평형을 유지시킨 후에 2U의 GR(type Ⅲ Sigma, from bakers yeast, diluted in 0.1M phosphate buffer pH 7.4)을 넣은 후 반응을 개시하였다. Spectrophotometer(Pharmacia Co.)로 412nm에서 흡광도를 측정하였다. 2-nitro-5-thiobenzoic acid(TNB)를 형성하는 속도는 흡광도를 연속적으로 측정하였다. 즉 standard curve도 6%의 metaphosphic acid로 제조하고 phosphate/EDTA buffer(pH 7.4)로 희석하여 standard curve를 그려서 각각의 농도를 구하였다.

(7) 뇌 조직내 항산화효소 활성도 측정

(7-1) 시료의 준비

세포질 분획은 ICR 마우스의 뇌 조직을 Bansal 등(71)의 방법에 따라서 130mM KCl을 함유한 30mM HEPES buffer(pH 7.4) 에 균질화시켜서 얻었으며 시료를 분주하여 -70℃ 냉장고에 보관하면서 항산화효소계 효소(SOD, catalase, GP, GR) 측정 실험에 사용하였다.

(7-2) Glutathione peroxidase(GP) assay

GP는 Tappel(36)의 방법을 사용하여 정량하였다. 4.0 mM EDTA를 함유한 0.3 M sodium phosphate buffer(pH 7.2) 148 ㎖에 26.56 mM의 H2O 148 ㎕와 catalase의 작용을 억제하기 위해서 sodium azide 75 ㎕를 넣고 세포질 enzyme 50 ㎕를 미리 넣어 두고, 294.4mM glutathione 9 ㎕, NADPH 16 ㎕, GR(1 unit/㎖) 4 ㎕, 1mM cumene hydroperoxide 48 ㎕를 넣은 후에 3분간 반응시켰다. 이 때 GR 측정용 세포질 enzyme과 cumene hydroperoxide를 제외한 값을 blank로 보정한다.

340nm에서 NADPH의 흡광도가 감소되는 속도를 관찰한다. 1 unit의 효소활성은 NADPH에 대한 6.22 mM-1cm-1의 millimolar extinction coefficient로 나타내었다. GP의 활성도의 1 unit는 mg protein당 1분간 산화되는 M 수로 정한다.

(7-3) Glutathione reductase(GR) assay

뇌 조직의 GR 효소의 활성측정은 Pinto 등의 방법(73)에 따라 구한다. GR은 GSSG와 NADPH가 H+와 반응할 때 GR가 반응을 하여 2분자의 GSH과 NADPH를 생성하는 원리를 이용한 것이다. 즉, NADPH의 감소율을 20℃, 340nm에서 측정하여 GR 흡광도가 감소하는 원리를 이용한다. 초기 몇 분을 반응속도로 하고 효소활성을 계산 한다.

효소반응은 시료 50 ㎕, 26.978 mM EDTA를 함유한 0.1M Tris-HCl buffer(pH 8.0) 406㎕, 66.0 mM GSSG 용액 35 ㎕를 함유된 용액에 9.18 mM NADPH 9 ㎕, 효소 50 ㎕를 첨가한 후 412nm에서 흡광도을 측정한다. 1 unit의 효소활성은 NADPH에 대한 6.22 mM-1cm-1의 millimolar extinction coefficient로 나타내었다. GR 활성도 blank로는 NADPH와 효소를 제외한 값을 측정하여 보정하였고 농도(C)를 실험에서 취한 양에 해당하는 단백질정량 농도로 나누어주어 결정한다.

(8) Mouse 뇌 조직(membrane)내 지질 과산화물(TBARS) 측정

뇌 조직의 지질과산화물은 thiobarbituric acid(TBA)방법(68)을 이용하여 생성된 malondialdehyde(MDA) 양을 측정하였다.

10 mM phosphate buffer, pH 7.4 완충용액에 부유시킨 membrane 용액(1 mg protein/㎖) 1㎖에 15% TCA(1 ㎖)를 가하고 0.75 % TBA 500㎕를 넣어 마개를 한 후 끓는 물에서 15분간 중탕을 하였다. 이것을 얼음물에 급히 냉각시키고, 14,000rpm에서 10분간 원심분리 한 후 상등액의 533nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 tetramethoxypropane(malinaldehyde bis, TMP)을 표준물질로 사용, 0.5N HCl로 standard stock solution을 만들어서 EtOH로 10배로 희석한 후에 standard curve를 그려서 reagent blank로 결과를 보정하였다.

(9) 단백질 정량

뇌 세포질의 단백질 정량은 bovine serum albumin(BSA)을 표준 단백질로 사용하여 Bradford 측정법(76)에 기초를 둔 Bio-Rad 단백질 정량법에 의한 Bio-Rad protein kit를 사용하여 595nm에서 측정하여 계산하였다.

(10) 통계처리

모든 실험군은 "평균(mean) ± 표준편차(S.D.)"로 표시하였고 두 실험군 간의 차이가 있을 경우 분산분석(ANOVA)을 행하여 대조군과 유의적인 차이가 있는 경우 Duncan's multiple range test를 실시하였다. 모든 통계처리는 SAS version 6.12) 통계 package를 이용하여 수행하였다(77).

실시예 1 : 식물자원 추출물의 제조 및 항산화 효과 비교

전기한 추출법에 따라 추출한 여러 가지 식물자원(시료)의 추출물을 각각 동결건조 및 열풍건조하여 항산화 효과를 분석하였다. 분석방법은 전기한 lipid peroxidation법을 이용하였다.

즉, 각각의 식물자원에 건조 방법을 달리하여 건조시켜 분말화한 후, 메탄올에 침지 하여 진공 농축한 후 hexane으로 클로로필의 색소층을 제거하였다.

(1) 동결건조시킨 시료의 메탄올 추출물에 대한, 뇌조직에서의 TBARS 형성 정도를 측정하여 항산화 정도를 평가한 결과 중에서 우수 이상으로 나타난 시료에 대한 것을 하기 표 1에 나타내었다.

표 1에서 볼 수 있듯이, 눈개승마, 곤달비, 쑥, 산두릅, 돈나물, 머위, 취, 질경이 곤달비, 씀바귀, 돈나물, 우엉, 산드룹, 미나리잎, 양파껍질 등의 시료가 90% 이상의 항산화 효과를 나타내었다. 그 외에 청상추, 땅두릅, 롤라로사, 무순, 산마늘, 곤드레, 미나리줄기, 깻잎, 파프리카, 가지, 치콘, 고수, 치커리 등은 50% 이상의 항산화 효과를 나타내었으나, 피망,(green, red), 풋고추, 비트, 향나물, 호박잎, 참나물, 쑥갓, 백년초는 매우 낮은 항산화력을 나타내었다.

(2) 시료를 열풍건조(70℃)한 경우, 뇌조직에 대한 항산화력을평가한 결과 중에서 우수 이상으로 나타난 시료에 대한 것을 하기 표 2에 나타내었다. 대부분의 시료는 열처리에 의해 10∼80% 정도 항산화력이 감소되었다.

동결건조에 비해 항산화력이 50%이상 감소된 시료는 Sedum, 미나리줄기, 깻잎, paprika, 연근, eggplant, 치콘, 연근이었다. 곤달비, 씀바귀, 무순, 산마늘, 곤드레, 어수리, 우엉, 산두릅, 머위줄기, 파세리는 열풍건조시에 동결건조에 비해 항산화정도가 20% 이하로 비교적 소폭 감소하였다. 그러나, 산나물로 이용되는 눈개승마, 곤달비, 쑥, 머위, 취, 질경이는 열풍건조시에도 동결건조된 경우와 같이 항산화력이 90% 이상을 나타내었다. 시료 중에는 열풍건조에 의한 경우가 동결건조에 의한 경우보다 항산화력이 증가된 종류가 확인되었다. 호박잎, 참나물, coriander, 쑥갓 등이 50% 이상 항산화력이 증가되었는데, 호박잎은 동결건조시에는 1.8%로 거의 활성을 나타내지 않았으나, 열처리에 의해 92%로 대폭 증가하였다. 그 다음으로는 참나물과 미나리잎이 각각 76%로 상당히 증가하였으며, 기타 쑥갓(51%), coriander(33%), 비트(35%), 감자껍질(31%) 등도 상당히 증가하였다. 특히 본 발명에 의한 참취 추출물의 경우, 오히려 열풍건조(즉, 열처리)에 의해 100%의 항산화 효율을 나타내었다. 반면에 토마토(25%), 피망(25), 풋고추(25%), 향나물(20%) 등은 증가정도가 30% 미만이었다.

표 2에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 참취 추출물을 포함하는 몇몇 시료는 70℃의 열풍건조에 의해 항산화력이 감소되지 않는 현상을 보인다. 이는 이들에 속하는 시료에 존재하는 항산화 성분이 건열 처리시에 안정하기 때문으로 생각되는데, 이들 성분은 70℃ 정도의 온화한 열처리 조건에서는 파괴되지 않는다고 보고되었다(18, 19). Lavelli 등(18)은 80℃에서 열풍건조한 토마토의 항산화 정도는 신 선한 토마토에 비해 감소되지 않았다고 보고하였는데, 이는 건조과정에서 ascorbic acid 함량은 감소되었지만 carotenoid 함량이 실질적으로 감소되지 않았으며, 환원성 phenol 화합물이 증가된데 기인된 것이라고 보고하였다. 토마토를 8 분간 stewing시에 개개의 carotenoid 함량은 감소되지 않으며(29), 토마토 통조림을 고온순간살균(120℃, 42초)시에 β-carotene의 파괴는 없었다(30). Nice 등(31)은 완두콩에 존재하는 bound phenol 화합물이 열 안정성을 나타내었다고 보고하였는데, 본 실시예에서 열에 의해 항산화 효과가 감소되지 않는 시료에도 이 같은 bound phenol 화합물이 있을 것으로 추정된다.

실시예 2 : 식용식물 메탄올 추추출물의 뇌항산화 IC ₅₀ 값 비교

열처리시에도 90%이상의 항산화력을 나타낸 식용식물자원 6종 쑥, 참취, 머위, 눈개승마, 곤달비, 질경이에 대하여 IC₅₀을 측정하여 표 3에 나타내었다.

이들 6종 시료의 IC₅₀ 값은 93∼790 g/ml 이었다. 쑥이 가장 낮았고 그 다음으로 참취, 머위, 눈개승마의 순으로 나타났다. 식용가능한 산채류는 약 100여종이 알려져 있다. 본 실시예에서는 IC₅₀ 이 낮으면서 독성이 없어 일상식생활에서 채소로 많이 이용하는 참취를 in vivo 동물을 이용한 뇌 항산화 실험을 위한 시료(식용식물자원)으로 선정하였다.

실시예 3 : 참취 메탄올 추출물 용매분획의 뇌항산화 IC ₅₀ 측정

전기한 실험방법에 따라 수득한 참취(Aster scaber Thunb.)의 메탄올 추출물에서 뇌항산화력이 큰 용매분획을 선정하기 위해 계통용매 추출(도 1)을 수행하여 얻은 각 용매분획에 대한 IC₅₀ 값을 표 4 에 나타내었다.

참취 용매 분획의 IC₅₀ 값은 0.028∼0,142 mg/mL 이었다. 뇌조직에서 지질과산화에 대한 보호 효과가 가장 높은 분획은 butanol 분획으로 0.028 mg/mL이었다. 따라서, 참취의 메탄올 추출물의 butanol 분획이 매우 우수한 뇌조직 항산화 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 4 : 식용식물자원 메탄올 추출물 용매분획의 뇌신경독성 보호효과

먼저, KA(KA)의 뇌신경독성은 실험동물인 mouse의 행동 변화로 관찰하였다. KA(50 mg/kg)를 mouse(male)에 i.p.로 투여하였을 때, 전형적인 sustained seizure 현상이 KA 투여 10분 후부터 뚜렷하게 나타났으며, 20-30분 동안 tremor 현상이 지속되었다. 그러나 대조군은 전혀 seizure 현상이 나타나지 않았다. 한편, KA와 식용식물 메탄올 추출물을 분산시켜 동물에 투여하는 vehicle로 ethanol(50%), CMC(1%), saline, 증류수를 사용하여 대조군과 KA+vehicle 투여군, KA+vehicle+추 출물 투여군에 대하여 치사율, 신경행동학적 변화, 체중, 뇌무게, 총 glutathione 함량, TBARS값을 분석한 결과(도시 생략) ethanol(50%)과 CMC(1%)는 부적합하였고, saline이나 증류수는 적합하였으므로 vehicle로 증류수를 사용하였다.

다음으로, KA의 뇌신경독성에 대한 몇가지 식용식물의 메탄올 추출물의 용매분획에 대한 보호효과를 분석하였다. 식용식물의 선정한 근거로는 in vitro 실험에서 뇌조직 지질과산화에 대한 IC₅₀ 값이 작은 6종 중에서 일상 식생활에서 흔히 섭취하면서 손쉽게 구입할수 있는 참취(Aster scaber Thunb.)를 선정하였고, 또한, 항산화 및 간해독에 좋다고 보고된 씀바귀(Ixeris dentata NAKAI), 고들빼기(Youngia sonchifolia MAX)를 동물실험에 사용하였다.

씀바귀 메탄올 추출물의 물분획(WFME of ID), 고들빼기 메탄올 추출물의 butanol분획(BFME of YS), 머위 메탄올 추출물의 물분획(WFME of PJ)과 butanol 물분획(BWFME of PJ), 참취 메탄올 추출물의 물분획(WFME of AS)과 메탄올 추출물의 butanol 분획(BFME of AS) 각각을 mouse에 구강으로 3일간 투여한 후 4 일째되는 날에 KA로 뇌조직내의 oxidative stress를 유발시켰다. 그 결과 KA에 의해 유발된 뇌독성에 의한 치사율과 신경독성학적 행동변화에 대한 결과는 표 5와 같다(표에서 N,S.는 p<0.05에서 유의성이 없음을 의미하며, 다른 문자 a, b 등은 유의성이 있음을 의미함, 이하 표에서 동일함). 체중과 뇌의 무게에는 처리군간에 유의적인 차이가 없었으며(도시 생략), 치사율과 경련개시시간을 고려하였을 때, 용매분획물을 1000mg/kg 투여시 효과가 있는 것으로는 씀바귀, 머위, 참취이었는데, 이중에서 일 상식생활에서 많이 이용하는 참취를 선정하여 뇌신경독성에 의한 생화학적 지표를 분석하기 위한 실험을 수행하였다. 참취 분획물 투여양은 1000mg/kg에 비하여 400mg/kg이 더 좋은 효과를 나타내었으므로 400mg/kg으로 하였고 butanol 분획이 물분획에 비해 in vitro에서 IC₅₀ 값이 더 낮았으므로 butanol 분획으로 선정하였다.

실시예 5 : 참취 메탄올 추출물 butanol 분획의 뇌항산화 보호효과

(1) 치사율 및 신경행동학적 변화

KA의 뇌신경독성에 대한 참취 메탄올 추출물의 butanol분획(BFME of AS)에 대한 보호효과를 분석하기 위해 BFME of AS(0.4 g/kg)를 mouse에 구강으로 3일간 투여한 후 4 일째되는 날에 KA로 뇌조직내의 oxidative stress를 유발시켰다. 그 결과, 표 6에서와 같이, BFME of AS/KA군은 vehicle/KA군에 비해 seizure 유발 개시시간이 유의적으로 늦어졌다(p<0.05). 또한, 치사율은 대조군은 0%이었고, vehicle/KA군은 54%인데 비하여, BFME of AS/KA군은 25%로 현저하게 감소하였다. 그러나, BFME of AS의 투여양을 1 g/kg으로 증가시켜도 치사율에는 변화가 없었다. 한편, BFME of AS가 동물의 체중, 뇌무게에 미치는 영향을 살펴보았을 때, 표 7에서와 같이 유의적인 차이가 나타나지 않았으며 실험 5일간 모든 동물이 생존하였다.

(2)뇌조직내 환원성물질인 총 glutathione 함량 분석

KA에 의한 oxidative stress가 동물의 뇌에 독성을 유발하는지 알아보고자, KA(50 mg/kg)를 투여한 mouse 뇌조직에서의 oxidative stress의 생화학적 지표인 총 glutathione의 함량을 측정하였다(도 3). 도에서와 같이, vehicle/KA군은 mouse 뇌 cytosol의 glutathione 함량이 대조군에 비하여 73% 감소되었다(p<0.05). 그러나 BFME of AS는 KA 투여에 의해 낮아진 glutathione함량을 회복시켜주었는데, BFME of AS/KA군은 대조군의 glutathione 함량의 80.3% 가 회복되었다.

(3) 지질과산화(lipid peroxidation)에 대한 항산화효과 분석

BFME of AS가 KA 투여한 mouse 뇌조직에서의 지질과산화에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과, 도 4에서와 같이 KA투여군의 TBARS 값은 대조군에 비하여 122% 증가되었으나 BFME of AS (0.4 g/kg)/KA군은 대조군에 비하여 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 따라서, 참취 메탄올 추출물의 butanol 분획은 KA에 의해 유발된 mouse 뇌조직에서의 지질과산화를 효과적으로 방지함을 확인하였다.

(4) GSH peroxidase or GSH reductase 활성에 대한 효과 분석

KA 투여에 의한 뇌조직에서의 감소된 glutathione양을 회복시키는 mechanism을 알아보기 위하여 glutathione-related 효소 즉, GSH peroxidase와 GSH reductase의 활성도를 분석하였다. GSH peroxidase 활성도는 도 5에서와 같이 BFME of AS는 KA 투여에 의해 감소된 효소활성도를 유의적으로 회복시켜주었다(p<0.05). 그러나, GSH-reductase 활성도는 처리군간에 유의적인 차이가 없었다(도시 생략). 이러한 결과로부터 KA 투여에 의한 뇌조직에서의 신경독성은 GSH-reductase 활성도를 크게 변화시키지 않는 것으로 추정된다.

이상의 각종 실험에서 밝혀졌듯이, mice 뇌에 KA로 oxidative stress를 유발시킨 뇌조직에서 BFME of AS의 투여는 glutathione 절약 효과(GSH-sparing 효과) 뿐 아니라 지질과산화를 막아주는 작용을 나타내었다. 특히 참취 메탄올 추출물의 butanol 분획이 지질과산화에 대하여 가장 효과적이었다.

참취 추출물이 KA에 의하여 유발된 신경독성학적 행동 변화를 감소시켜주었고 또한, 치사율을 감소시켜준 결과는 모두 oxidative stress에 대한 보호효과임을 알 수 있다. 따라서, 이 같은 결과로부터 BFME of AS의 1차적인 뇌독성 보호효과는 최소한 부분적으로는 항산화력에 기인된다고 할 수 있다.

BFME of AS의 뇌 보호효과 작용의 기작은, 불균형된 glutamate/GABA content의 회복, 또는 voltage-gated Ca²⁺ channel의 저해 작용에 기인하는 것으로 추정된다.

본 발명에 Lipid peroxidation과 단백질 산화에 대해 방지효과가 뚜렷한 항산화 추출물을 얻을 수 있기 때문에 각종의 뇌 질환에 대한 기능성 식품 또는 예방-치료약제 조성물을 저렴하게 공급할 수 있게 된다.

Claims

참취를 알코올로 추출하고 농축하여 알코올 추출물을 수득하는 알코올추출단계;

상기 알코올추출단계를 거친 추출물을 헥산 및 물을 사용하여 헥산층과 물층으로 분획한 후 물층을 수득하는 분획1단계;

상기 분획단계를 거친 물층에 클로로포름을 가하고 분획하여 재차 물층을 수득하는 분획2단계;

상기 분획2단계를 거친 물층에 에틸아세테이트를 가하고 분획하여 재차 물층을 수득하는 분획3단계;

상기 분획3단계를 거친 물층에 부탄올을 가하고 분획하여 부탄올층을 수득하는 분획4단계; 및

상기 분획4단계를 거친 부탄올층 분획을 저온저압하에서 증발시켜 농축분획을 수득하는 농축단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 참취 추출물.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,

상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 참취 추출물.
제 4 항에 있어서,

상기 알코올은 95∼100%인 것을 특징으로 하는 참취 추출물.
삭제
삭제