KR102072471B1 - 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 벌개미취 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는, 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 약학 조성물을 이용한 파킨슨병의 예방 또는 치료 방법, 파킨슨병의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 벌개미취 추출물 또는 분획물은 파킨슨병의 원인인 도파민 신경세포의 사멸을 예방하는 자가포식에 관여하는 단백질의 양을 특이적으로 촉진시키는 것을 특징으로 하며, 구체적으로 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물은 자가포식소체의 막 단백질인 LC3 단백질의 발현을 증가시키고, 자가포식을 유도하는 p-AMPK와 p-ULK1의 단백질의 발현을 증가시키고, 자가포식을 저해하는 mTOR의 단백질의 발현을 현저히 감소시키는 효과가 뛰어나므로, 파킨슨병의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 천연물로부터 유래한 것으로서, 파킨슨병의 예방, 치료 및 개선에 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있을 것이다.
본 발명의 벌개미취 추출물 또는 분획물은 파킨슨병의 원인인 도파민 신경세포의 사멸을 예방하는 자가포식에 관여하는 단백질의 양을 특이적으로 촉진시키는 것을 특징으로 하며, 구체적으로 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물은 자가포식소체의 막 단백질인 LC3 단백질의 발현을 증가시키고, 자가포식을 유도하는 p-AMPK와 p-ULK1의 단백질의 발현을 증가시키고, 자가포식을 저해하는 mTOR의 단백질의 발현을 현저히 감소시키는 효과가 뛰어나므로, 파킨슨병의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 천연물로부터 유래한 것으로서, 파킨슨병의 예방, 치료 및 개선에 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
최근 노인 인구 비율이 점차 높아져 가는 고령화 현상이 사회적 문제로 대두됨에 따라, 퇴행성 뇌질환(neurodegenerative disorders)에 대한 관심이 높아지고 있다. 퇴행성 뇌질환이란 다양한 원인에 의해 퇴행성으로 변한 신경 때문에 운동 작용, 기억, 인지 작용 등에 장애가 발생하는 질환이며, 그 중에서 파킨슨병(Parkinson's disease)은 알츠하이머 질환 다음으로 가장 발병률이 높은 대표적인 신경 퇴행성 뇌 질환이다. 파킨슨병은 1817년 영국 의학자인 James Parkinson이 "흔들림성 마비"를 처음으로 기술하였으며, 그로부터 60여년 후에 J.Charout에 의해 파킨슨병이라는 용어가 사용되었고, 1912년 Kinner wilson에 의해 파킨슨병이 척수의 중추 경로 중 추체계(pyramidal system)가 아닌 추체외로계(extrapyramidal system) 관련 질환임을 알게 되었다(Habibi et al., 2011).
파킨슨병의 발병 원인의 규명을 위한 연구가 수십년에 걸쳐 진행되어 왔으나, 그 기전에 대해 정확하게 밝혀진 바가 없다. 그로 인해 파킨슨병은 유효적이고 효과적인 장기 치료방법이 없는 점진적인 신경 장애 난치병으로 분류된다(Pan et al., 2008, Habibi et al., 2011). 다만 파킨슨병 환자에게 발생되는 다양한 병리학적인 요인에 의해서 파킨슨병이 발병되는 것으로 추측되고 있다. 그 요인으로서, 중뇌의 흑색질(substantia nigra par compacta)이 파괴되거나 손상되면서 중뇌의 흑색질에 분포하는 신경전달물질 중 도파민을 분비하는 신경세포의 비정상적인 사멸이 가장 대표적이다(Camins et al., 2008, Smith, 2008). 도파민 신경세포의 비정상적인 사멸은 일련의 과정을 통해 일어나는데, 먼저 환경, 유전, 노화와 같은 다양한 요인에 의해 손상을 입은 미토콘드리아가 단백질 분해 시스템의 기능 장애를 야기시키게 되고, 그로 인해 비정상적인 단백질과 세포소기관들이 분해되지 못하고 축적됨으로써 발생하게 된다. 이러한 원인들로 인해 파킨슨병의 치료 및 예방에 있어서, 단백질 분해 시스템의 중요성이 대두되고 있다.
현재까지 임상에서 파킨슨병 환자에게 가장 높은 비율로 처방되는 약제는 L-dopa 제제이며, 이는 도파민 신경세포의 전구체인 Levodopa를 직접 주입하여 혈중 도파민 농도를 증가시켜주는 치료법이다. 직접적인 Levodopa의 주입은 파킨슨병 환자들에게 실질적인 증상 완화를 가져오지만, 장기간 사용하였을 경우 용량의 증가가 필수적이며, 용량의 증가에 따라 예측하지 못했던 다양한 부작용을 초래하는 것으로 알려져 있다(Rock and Peterson, 2006, McGeer and McGeer, 2008). 그러므로 도파민 혈중 농도를 높여주는 L-dopa를 직접 투여하는 치료법 보다는, 도파민 분비를 원활하게 해 주는 신경세포의 보호 및 사멸을 억제할 수 있는 좀 더 근본적인 치료법 및 약제의 개발이 시급하다고 할 수 있다. 이러한 시도 중 하나로 단백질 분해 시스템 중 하나인 자가포식작용을 표적으로 한 치료제 개발 연구가 최근 주목을 받고 있다.
오토파지(Autophagy), 즉 자가포식작용은 자아, 자신이라는 뜻의 “self”와 먹는다는 의미의 “eating”을 칭하는 그리스어에서 파생된 단어로, 세포의 신진대사 균형을 유지할 뿐만 아니라 세포의 운명에 중요한 역할을 하는 자기 희생의 메커니즘으로 알려져 있다(Eisenberg-Lerner et al., 2009). 이러한 자가포식 작용은 자가포식소체(autophagosome)의 전구체이자 독립된 이중막인 파고폴(phagophore)의 가장자리가 점점 연장되어 세포 내 불필요한 단백질을 완전히 에워싸, 소포체인 자가포식소체를 형성할 수 있는 형태학적으로 특징적인 구조를 가지고 있다. 또한 자가포식소체는 미세소관을 따라 이동하여 세포 내 리소좀(lysosome)과 융합하게 되며 자가포식용해소체(autolysosome)를 형성하게 되며 이때, 리소좀 내부에서 분비되는 단백질분해효소에 의해 단백질을 분해시키는 것으로 보고되었다.
한편 벌개미취(Aster koraiensis Nakai)는 국화과(Compositae) 식물로 Gymnaster koraiensis (Nakai) Kitamura 라고도 불리며 우리나라 자생식물이다. 벌개미취는 주로 제주도, 경기도 이남 지역에서 분포하는 여러해살이풀이며, 특히 습도가 높은 계곡이나 습지에서 잘 생육하는 것으로 알려져 있다. 이러한 벌개미취 추출물 및 단일 성분(compound)의 효능에 대해 지금까지 알려진 것으로는 당뇨 망막 병증이 유도된 마우스의 망막 혈관 손상에 대한 방어 효과, 암 예방 효과를 가진 것으로 알려진 해독 효소의 유도 효과, 벌개미취 추출물의 단일 성분에 대한 단백질 당화 및 알도오스 환원 효소 저해 활성, 당뇨병 마우스 모델에 대하여 항-세포자살(anti-apoptosis) 활성을 통해 당뇨병성 신장증의 발달 억제 등을 비롯하여 대장암 억제, 간 보호, 산화스트레스 방어 효과 등이 있다. 그러나 아직까지 벌개미취를 통하여 구체적으로 파킨슨병을 비롯하여 자가포식작용에 관한 연구가 진행된 바가 없다.
이에 따라, 본 발명자는 자가포식 작용 유도를 통해 파킨슨병의 예방 및 치료제 개발에 관한 연구를 진행하던 중, 벌개미취(Aster koraiensis Nakai) 식물의 추출물이 자가포식 작용을 유도시킴과 동시에 파킨슨병의 예방 및 치료에 매우 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다
본 발명의 또 다른 목적은 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 인비트로(in vitro) 자가포식 유도 효과에 의한 뇌세포 사멸 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 벌개미취(Aster koraiensis Nakai) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "벌개미취"는 학명이 Aster koraiensis Nakai이며, 본 발명에서 상기 식물의 지상부를 추출하여 사용할 수 있으나 보다 구체적으로는 상기 식물의 잎, 줄기를 사용할 수 있으며, 파킨슨병의 예방 또는 치료 효과를 갖는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 벌개미취는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어, "추출물"은 벌개미취를 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
상기 벌개미취를 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비 제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 벌개미취를 추출하는데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, C1 내지 C4의 알코올 및 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 바람직하게는 95% 에탄올이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이들의 조합 등이 있다. 구체적으로, 본 발명의 벌개미취를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 등의 극성 용매; 헥산(Hexan), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(Dichloromethane) 등의 비극성 용매; 또는 이들의 혼합용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로, 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올(butanol) 또는 물이 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 추출물 또는 분획물은 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있지만, 이제 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "파킨슨병"은 도파민 신경세포의 소실로 인해 발생하는 신경계의 퇴행성 뇌 질환을 의미한다. 안정떨림, 경직, 운동완만(운동느림) 및 자세 불안정성이 특징적으로 나타나며, 일반적으로 60세 이후에 임상 증상이 나타나기 시작한다.
본 발명의 용어, "예방"은 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 의해 파킨슨병의 진행을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 파킨슨병이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 "약학적 조성물"은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 "약학적으로 허용가능한"은 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
구체적으로, 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 파킨슨병의 예방 또는 치료용 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
이때, 상기 파킨슨병, 예방 및 치료의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어, "투여"는 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다.
본 발명의 용어, "개체"는 파킨슨병이 발병하였거나, 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 “개체”는 반려동물을 포함할 수 있다. 상기 반려동물은 인간과 함께 더불어 사는 동물을 의미하며, 구체적인 종류로서 개, 고양이, 햄스터, 기니피그 등의 포유류, 앵무새, 카나리아 등의 조류 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명의 파킨슨병의 예방 또는 치료 방법은 개체에 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 고형분을 기준으로 1일 0.0001 내지 500 mg/체중 kg으로, 더욱 구체적으로 0.01 내지 500 mg/체중kg으로 투여할 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 파킨슨병의 예방 또는 치료 방법에서, 상기 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 해당 부위에 상기 조성물을 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
이때, 상기 벌개미취, 추출물, 분획물, 파킨슨병 및 예방의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어, "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 파킨슨병 개선 효과를 기대할 수 있으므로, 건강 증진 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 '기능(성)'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형은 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 천연물을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 파킨슨병 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본 발명의 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
상기 벌개미취, 추출물, 분획물, 예방 및 개선에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명의 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물은 가축, 또는 반려동물과 같이 인간 이외의 개체의 파킨슨병 발병 예방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있으며, 기능성 사료첨가제, 또는 사료용 조성물로 활용할 수 있다.
본 발명에 따른 사료 조성물 내 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물의 함량은 적용 가축의 종류 및 연령, 적용 형태, 목적하는 효과 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대 1 내지 99 중량%, 바람직하게는 10 내지 90 중량%, 더욱 바람직하게는 20 내지 80 중량%로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 사료 조성물은 투여를 위해서 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물 이외에 추가로 구연산, 푸마르산, 아디프산, 젖산 등의 유기산; 인산칼륨, 인산나트륨, 중합 인산염 등의 인산염; 폴리페놀, 카테친, 토코페롤, 비타민 C, 녹차 추출물, 키토산, 탄니산 등의 천연 항산화제 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 사료 조성물은 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항산화제, 항진균제, 항균제 등과 같은 각종 보조제 및 분쇄 또는 파쇄된 밀, 보리, 옥수수 등의 식물성 단백질 사료, 혈분, 육분, 생선분 등의 동물성 단백질 사료, 동물성 지방 및 식물성 지방 같은 주성분 이외에도 영양 보충제, 성장 촉진제, 소화 흡수 촉진제, 질병 예방제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물을 사료 첨가물로 사용할 경우, 상기 사료 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 사료 조성물의 투여 형태는 비독성 제약상 허용 가능한 담체와 조합하여 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체형 담체의 경우에는 정제, 산제, 토로키제 등의 투여 형태일 수 있으며 액체형 담체의 경우에는 시럽제, 액체 현탁액제, 에멀젼제, 용액제 등의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여제는 보존제, 윤화제, 용액 촉진제, 안정화제를 함유할 수 있으며 다른 염증 질환 개선제 및 바이러스 예방상 유용한 물질을 함유할 수도 있다.
본 발명의 사료 조성물은 포유류, 가금류, 어류 및 갑각류를 포함하는 다수의 동물 식이 즉, 사료에 적용할 수 있다. 상업용으로 중요한 돼지, 소, 염소 등의 포유류, 코끼리, 낙타 등의 동물원 동물, 개, 고양이 등의 가축에게 사용할 수 있다. 상업적으로 중요한 가금류에는 닭, 오리, 거위 등이 포함되며, 송어와 새우와 같은 상업적으로 사육되는 어류 및 갑각류를 포함 할 수 있다.
본 발명에 따른 사료 조성물은 가축사료에 건조 중량 기준으로 1 ㎏ 당 약 10 내지 500 g, 바람직하기로는 10 내지 100 g의 양으로 혼합될 수 있고, 완전히 혼합한 후 매쉬로 공급하거나, 추가 가공 공정을 통하여 팰렛화, 팽창화, 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 벌개미취의 추출물을 도파민성 세포인 SH-SY5Y 세포주에 처리한 결과, 자가포식소체의 막단백질인 LC3 단백질 발현이 증가됨을 확인하였다(실시예 1-2 참조). 또한 인산화된 AMPK 단백질 발현이 증가됨을 확인하였다(실시예 1-3 참조).
본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서는, 벌개미취의 추출물이 인산화된 ULK1 단백질 발현을 증가하는 것을 세포실험을 통하여 웨스턴블롯팅으로 확인하였다(실시예 1-4 참조).
본 발명의 다른 일 실시예에서는, 벌개미취의 추출물이 mTOR 단백질 발현을 감소하는 것을 세포실험을 통하여 웨스턴블롯팅으로 확인하였다(실시예 1-5 참조)
본 발명의 다른 일 실시예에서는, 벌개미취 추출물의 자가포식 작용 유도 효과를 확인하기 위해 autophagy inhibitor인 Bafilomycin A1을 통해 autophagic flux를 억제하는 웨스턴블롯팅으로 확인하였다(실시예 1-6 참조).
본 발명의 또 다른 일 실시예에서는, 벌개미취의 분획물에 의한 LC3 단백질 발현량을 확인한 결과, BuOH 분획물에 의해 LC3 단백질 발현이 증가되는 것을 확인하였다(실시예 2-1, 2 참조).
본 발명의 또 다른 일 실시예에서는, 벌개미취 BuOH 분획물이 mTOR 단백질 발현을 증가하는 것을 세포실험을 통하여 웨스턴블롯팅으로 확인하였다(실시예 2-3 참조).
본 발명의 또 다른 일 실시예에서는, 벌개미취의 추출물이 MPTP를 통해 파킨슨병이 유도된 동물 모델에 투여한 결과, 자가포식작용 유도를 통해 뇌세포 사멸을 효과적으로 억제할 수 있는 활성을 웨스턴블롯팅으로 확인하였다(실시예 3 참조).
이로서 본 발명의 조성물은 도파민성 세포주에서 인산화된 AMPK의 단백질 발현량 증가에 의해 인산화된 ULK1의 단백질 발현량이 증가되고 mTOR 단백질 발현을 억제하며, MPTP를 통해 파킨슨병이 유도된 동물 모델에서 자가포식 작용의 유도를 통해 뇌세포 사멸을 효과적으로 억제할 수 있어 파킨슨병의 예방, 치료 및 개선에 탁월한 효과가 있음을 확인하였다.
즉, 본 발명의 벌개미취 추출물은 자가포식 작용을 유도하여 파킨슨병의 궁극적인 원인으로 알려진 알파-시누클레인(alpha-synuclein) 단백질의 분해를 촉진하는 효과가 매우 우수하여, 파킨슨병의 예방 또는 치료 및 개선에 효과적으로 사용될 수 있는 조성물임을 확인하였다.
본 발명의 벌개미취 추출물은 자가포식소체의 막 단백질인 LC3 단백질의 발현을 증가시키고, 자가포식 작용을 유도하는 인산화된 AMPK와 UK1의 증가 및 자가포식 작용을 억제하는 mTOR의 감소 효과를 통해 자가포식 유도하며, 이로 인해 이를 포함하는 조성물은 자가포식 작용 유도를 통한 파킨슨병의 예방 또는 치료 용도로 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 SH-SY5Y 세포주에서 벌개미취 추출물의 첨가 농도에 따른 자가포식소체 막단백질인 LC3의 발현량의 증가효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군). **는 대조군에 대해 P<0.01인 것을 나타내며, ***는 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 2는 벌개미취 추출물의 첨가 농도에 따른 인산화된 AMPK 단백질의 발현량의 증가효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군). ***는 대조군에 대해 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 3은 벌개미취 추출물의 첨가농도에 따른 인산화된 ULK1 단백질 발현량의 증가효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군). ***는 대조군에 대해 P<0.001인 것을 나타낸다
도 4는 벌개미취 추출물의 첨가 농도에 따른 mTOR단백질 발현량의 감소효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군). *는 대조군에 대해 P<0.05인 것을 나타내며, ***는 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 5는 자가포식작용의 억제제인 Bafilomycin A1을 투여하였을 때, 벌개미취 추출물 처리에 따른 LC3 단백질 발현량의 변화를 확인한 결과이다 (Control: 대조군). ***는 대조군에 대해 P<0.001인 것을 나타내며, ###은 벌개미취 추출물을 50 μg/ml의 농도로 처리한 군에 대해 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 6은 SH-SY5Y 세포주에서 벌개미취 분획물에 따른 자가포식소체 막단백질인 LC3의 발현량의 증가효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군).
도 7은 벌개미취 분획물의 첨가 농도에 따른 mTOR 단백질 발현량의 감소효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군). **는 대조군에 대해 P<0.01인 것을 나타내며, ***는 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 8은 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson’s disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스의 흑질(substantia nigra)에서 벌개미취 추출물 및 분획물 투여에 따른 Tyrosine hydroxylase (TH) 단백질 발현량의 증가효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군; MPTP: MPTP 단독 처리군; 로피니롤(Ropinirole): 로피니롤+MPTP 처리군). ***는 대조군에 비하여 P<0.001인 것을 나타내며, ##는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.01, ###는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 9는 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson’s disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스의 흑질(substantia nigra)에서 벌개미취 추출물 및 분획물 투여에 따른 α-synuclein 단백질 발현량의 감소효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군; MPTP: MPTP 단독 처리군; 로피니롤: 로피니롤+MPTP 처리군). ***는 대조군에 비하여 P<0.001인 것을 나타내며, ##는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.01, ###는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 10은 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson’s disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스의 흑질(substantia nigra)에서 벌개미취 추출물 및 분획물 투여에 따른 LC3 단백질 발현량의 증가 효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군; MPTP: MPTP 단독 처리군; 로피니롤: 로피니롤+MPTP 처리군). #는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.05인 것을 나타낸다.
도 11은 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson’s disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스의 흑질(substantia nigra)에서 벌개미취 추출물 및 분획물 투여에 따른 인산화된 AMPK 단백질 발현량의 증가효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군; MPTP: MPTP 단독 처리군; 로피니롤: 로피니롤+MPTP 처리군). #는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.05인 것을 나타낸다.
도 12는 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson’s disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스의 흑질(substantia nigra)에서 벌개미취 추출물 및 분획물 투여에 따른 인산화된 ULK1 (s555) 단백질 발현량의 증가효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군; MPTP: MPTP 단독 처리군; 로피니롤: 로피니롤+MPTP 처리군). *는 대조군에 비하여 P<0.05인 것을 나타내며, ##는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.01, ###는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 13은 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson’s disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스의 흑질(substantia nigra)에서 벌개미취 추출물 및 분획물 투여에 따른 mTOR 단백질 발현량의 감소효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군; MPTP: MPTP 단독 처리군; 로피니롤: 로피니롤+MPTP 처리군). #는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.05, ##는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.01인 것을 나타낸다.
도 14는 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson’s disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스의 흑질(substantia nigra)에서 벌개미취 추출물 및 분획물 투여에 따른 Beclin-1 단백질 발현량의 증가효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군; MPTP: MPTP 단독 처리군; 로피니롤: 로피니롤+MPTP 처리군). ##는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.01, ###는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 2는 벌개미취 추출물의 첨가 농도에 따른 인산화된 AMPK 단백질의 발현량의 증가효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군). ***는 대조군에 대해 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 3은 벌개미취 추출물의 첨가농도에 따른 인산화된 ULK1 단백질 발현량의 증가효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군). ***는 대조군에 대해 P<0.001인 것을 나타낸다
도 4는 벌개미취 추출물의 첨가 농도에 따른 mTOR단백질 발현량의 감소효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군). *는 대조군에 대해 P<0.05인 것을 나타내며, ***는 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 5는 자가포식작용의 억제제인 Bafilomycin A1을 투여하였을 때, 벌개미취 추출물 처리에 따른 LC3 단백질 발현량의 변화를 확인한 결과이다 (Control: 대조군). ***는 대조군에 대해 P<0.001인 것을 나타내며, ###은 벌개미취 추출물을 50 μg/ml의 농도로 처리한 군에 대해 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 6은 SH-SY5Y 세포주에서 벌개미취 분획물에 따른 자가포식소체 막단백질인 LC3의 발현량의 증가효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군).
도 7은 벌개미취 분획물의 첨가 농도에 따른 mTOR 단백질 발현량의 감소효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군). **는 대조군에 대해 P<0.01인 것을 나타내며, ***는 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 8은 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson’s disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스의 흑질(substantia nigra)에서 벌개미취 추출물 및 분획물 투여에 따른 Tyrosine hydroxylase (TH) 단백질 발현량의 증가효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군; MPTP: MPTP 단독 처리군; 로피니롤(Ropinirole): 로피니롤+MPTP 처리군). ***는 대조군에 비하여 P<0.001인 것을 나타내며, ##는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.01, ###는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 9는 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson’s disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스의 흑질(substantia nigra)에서 벌개미취 추출물 및 분획물 투여에 따른 α-synuclein 단백질 발현량의 감소효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군; MPTP: MPTP 단독 처리군; 로피니롤: 로피니롤+MPTP 처리군). ***는 대조군에 비하여 P<0.001인 것을 나타내며, ##는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.01, ###는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 10은 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson’s disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스의 흑질(substantia nigra)에서 벌개미취 추출물 및 분획물 투여에 따른 LC3 단백질 발현량의 증가 효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군; MPTP: MPTP 단독 처리군; 로피니롤: 로피니롤+MPTP 처리군). #는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.05인 것을 나타낸다.
도 11은 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson’s disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스의 흑질(substantia nigra)에서 벌개미취 추출물 및 분획물 투여에 따른 인산화된 AMPK 단백질 발현량의 증가효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군; MPTP: MPTP 단독 처리군; 로피니롤: 로피니롤+MPTP 처리군). #는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.05인 것을 나타낸다.
도 12는 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson’s disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스의 흑질(substantia nigra)에서 벌개미취 추출물 및 분획물 투여에 따른 인산화된 ULK1 (s555) 단백질 발현량의 증가효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군; MPTP: MPTP 단독 처리군; 로피니롤: 로피니롤+MPTP 처리군). *는 대조군에 비하여 P<0.05인 것을 나타내며, ##는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.01, ###는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.001인 것을 나타낸다.
도 13은 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson’s disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스의 흑질(substantia nigra)에서 벌개미취 추출물 및 분획물 투여에 따른 mTOR 단백질 발현량의 감소효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군; MPTP: MPTP 단독 처리군; 로피니롤: 로피니롤+MPTP 처리군). #는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.05, ##는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.01인 것을 나타낸다.
도 14는 MPTP 투여에 의해 파킨슨 병(Parkinson’s disease)을 유도시킨 C57BL/6 마우스의 흑질(substantia nigra)에서 벌개미취 추출물 및 분획물 투여에 따른 Beclin-1 단백질 발현량의 증가효과를 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과이다 (Control: 대조군; MPTP: MPTP 단독 처리군; 로피니롤: 로피니롤+MPTP 처리군). ##는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.01, ###는 MPTP 단독 처리군에 대해 P<0.001인 것을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 벌개미취 추출물의
자가포식
작용 유도 효과
실시예
1-1: 벌개미취 추출물의 제조
벌개미취는 강원도 정선국 북평면에서 재배한 것으로 세척 후 완전 건조하여 건조 중량 15 kg을 얻었고, 시료를 분쇄기에 분쇄한 후 95% 에탄올로 60~70℃에서 3시간 동안 2회 감압 추출하여 95% 에탄올 추출물 1.7kg을 얻었다.
실시예
1-2: 벌개미취 추출물에 의한 LC3 단백질 발현량 증가 효과
상기 실시예 1에서 수득한 벌개미취 추출물의 LC3 단백질 발현량 증가 효과를 측정하기 위하여, 도파민성 세포주인 SH-SY5Y 세포주를 Gibco사(Grand Island, NY, USA)의 10% heat-inactivated fetal bovine serum (이하 FBS라 함)과 1% penicillin/streptomycin (이하 P/S라 함, Gibco)이 함유된 Dulbecco’s modified eagle medium nutrient mixture F-12 (Ham) 1x; DMEM/F12 (Gibco) 배지에서 배양하여 사용하였다. 이 세포주는 ATCC: The Global Bioresource Center (CRL-2266™)(Manassas, Virgina 20108, USA)로부터 구입하였다.
구체적으로 상기 세포주 (SH-SY5Y)에 실시예 1에서 수득한 벌개미취 추출물을 도 1에 기재된 첨가량으로 첨가한 다음, 5% CO2, 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 포집하여 13,000 rpm에서 6분간 원심분리하여 DPBS (Dulbecco’s phosphate buffered saline)로 2회 세척하였다. 얻어진 세포에 lysis solution (1X lysis buffer, 1X Protease inhibitor cocktail, 1x Phenylmethyl sulfonyl fluoride)를 첨가하여 4℃ 조건에서 30분간 반응시키고, 그 후 동일한 4℃ 조건에서 30분간 진탕하면서 완전히 용해(lysis) 시킨 다음 13,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 단백질이 방출된 상층액을 취하였다. 취한 상층액은 Protein assay dye Reagent concentrate (Bio-Rad)를 이용하여 Bradford method로 단백질을 정량하였다.
동량의 세포파쇄액은 SDS loading buffer와 혼합하여 99℃에서 5분간 가열한 후에 15% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 분리를 하고(Bio-Rad), semi dry transfer 방법을 통해 약 45분간 polyvinylidene fluoride membrane (PVDF)(Millipore)에 이동시켰다. Transfer된 PVDF membrane을 blocking buffer (5% skim milk, 3% bovine serum albumin)를 통해 1시간~1시간 30분 동안 반응시켜 blocking 하였다. blocking buffer에 각 항체를 1,000배로 희석한 후, PVDF membrane을 4℃ 조건에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 본 실험에서 사용된 1차 항체는 LC3, GAPDH (Cell signaling technology)이 있으며, GAPDH는 loading control로 사용하였다. 그 후 다음날 TBST buffer (Trizma base, sodium chloride, Tween 20)를 사용하여 10분/1회, 3회 세척한 후 blocking buffer에 1:2,000의 비율로 희석한 anti-rabbit lgG secondary항체(Cell signaling technology)를 이용하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰으며, 동일한 조건으로 세척하였다. 그 후 ECL 용액(Thermo Fisher Scientific, Bio-Rad, Ab FRONTIRE)을 이용하여 membrane을 형광 발색 시켜 LAS 4000 film (Fujifilm)을 이용해 단백질의 발현 양상을 확인하였다.
이후 LC3Ⅰ 단백질에서 LC3Ⅱ 단백질로 전이되는 비율을 확인한 결과를 도 1에 기재하였다. 이때 벌개미취 추출물을 첨가하지 않은 경우를 대조군으로 하였다. 그 결과, 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군에 비하여 벌개미취 추출물의 첨가에 의해 LC3 단백질의 발현량이 농도의존적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 추출물을 50 μg/ml 농도로 처리하였을 때, LC3Ⅰ 단백질에서 LC3Ⅱ 단백질로 전이되는 비율이 2.05인 것으로 확인하였다. 이를 통해, 벌개미취 추출물이 도파민성 세포주에 처리되었을 때, 자가포식소폐 막 단백질 중 하나인 LC3 단백질의 발현량을 증가시키고, 자가포식 활성을 나타내는 지표인 LC3 I에서 LC3 II 단백질로의 전이를 증가시켜, 결과적으로 자가포식 유도 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예
1-3: 벌개미취 추출물에 의한 인산화된
AMPK
단백질 발현량 증가 효과
상기 실시예 1에서 수득한 벌개미취 추출물의 인산화된 AMPK 단백질 발현량 증가 효과를 측정하기 위하여, 배양한 SH-SY5Y 세포주에 도 2에 기재된 벌개미취 추출물 첨가량으로 첨가한 다음, 5% CO2, 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 실험하였다. 본 실험에서 사용된 1차 항체는 AMPK, p-AMPK, GAPDH (Cell signaling technology)이 있으며, GAPDH는 loading control로 사용하였다.
이후 전체 AMPK(t-AMPK) 단백질 중 인산화된 AMPK(p-AMPK) 단백질의 상대적 밀도를 나타내는 결과를 도 2에 기재하였고, 벌개미취 추출물을 처리하지 않은 경우를 대조군으로 하였다. 그 결과, 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군에 비하여 벌개미취 추출물에 의해 인산화된 AMPK 단백질의 발현량이 농도의존적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 벌개미취 추출물이 도파민성 세포주에 처리되었을 때, 자가포식을 유도하는 인산화된 AMPK 단백질의 발현량을 증가시켜, 결과적으로 자가포식 유도 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예
1-4: 벌개미취 추출물에 의한 인산화된
ULK1
단백질 발현량 증가 효과
벌개미취 추출물의 인산화된 ULK1 단백질 발현량 증가 효과를 확인하기 위해, 배양한 SH-SY5Y 세포주에 도 3에 기재된 벌개미취 추출물 첨가량으로 첨가한 다음, 5% CO2, 37℃에서 24시간 동안 배양하여 상시 실시예 2와 같은 방법으로 실험하였다. 본 실험에서 사용된 1차 항체는 ULK1, p-ULK1(s555), GAPDH (Cell signaling technology)이 있으며, GAPDH는 loading control로 사용하였다.
이후 전체 ULK1 단백질(t-ULK1) 중 인산화된 ULK1 단백질(p-ULK1)의 상대적 밀도를 나타내는 결과를 도 3에 기재하였고, 벌개미취 추출물을 처리하지 않은 경우를 대조군으로 하였다. 그 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군에 비하여 벌개미취 추출물에 의해 인산화된 ULK1 단백질의 발현량이 농도의존적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 벌개미취 추출물이 도파민성 세포주에 처리되었을 때, 자가포식을 유도하는 인산화된 ULK1 단백질의 발현량을 증가시켜, 결과적으로 자가포식 유도 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예
1-5: 벌개미취 추출물에 의한
mTOR
단백질 발현 증가 효과
벌개미취 추출물의 mTOR 단백질 발현량 억제 효과를 확인하기 위해, 배양한 SH-SY5Y 세포주에 도 4에 기재된 벌개미취 에탄올 추출물 첨가량으로 첨가한 다음, 5% CO2, 37℃에서 24시간 동안 배양하여 상시 실시예 2와 같은 방법으로 실험하였다. 본 실험에서 사용된 1차 항체는 mTOR, GAPDH (Cell signaling technology)이 있으며, GAPDH는 loading control로 사용하였다.
이후 mTOR의 상대적 밀도를 나타내는 결과를 도 4에 기재하였고, 벌개미취 추출물을 처리하지 않은 경우를 대조군으로 하였다. 그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군에 비하여 벌개미취 추출물에 의해 mTOR 단백질의 발현이 농도의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 벌개미취 추출물이 도파민성 세포주에 처리되었을 때, 자가포식을 억제하는 mTOR 단백질의 발현량을 감소시켜, 결과적으로 자가포식 유도 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예
1-6:
자가포식
억제제
Bafilomycin
A를 통한 벌개미취 추출물의
자가포식
작용 유도 효과
벌개미취 추출물의 자가포식 작용 유도 효과가 위양성(false positive)에 의한 비특이적인 결과로 나타난 현상인지, 진정한 자가포식 유도 효과에 의한 것인지를 확인하기 위해, 배양한 SH-SY5Y 세포주에 실시예 1에서 수득한 벌개미취 추출물을 도 5에 기재된 것과 같이 50 μg/ml 농도로 18시간 처리한 뒤 100nM bafilomycin A1 (이하, baf A1)을 처리하고, 6시간 동안 배양하였다. 그 후 실시예 2와 같은 방법으로 웨스턴블롯팅으로 LC3 단백질 발현량을 측정하였다.
Baf A1은 자가포식소체와 리소좀의 융합을 억제함으로써, 자가포식소포(autophagic vacuoles)의 성숙(maturation)을 저해하는 자가포식 억제제(autophagy inhibitor)이다. 구체적으로, 자가포식 경로의 마지막 단계에서 오토파지 플럭스(autophagic flux)가 일어나야 비로소 자가포식 유도가 일어나게 되지만, baf A1을 처리하는 경우에는 오토파지 플럭스가 억제됨에 따라 LC3 단백질 발현이 증가하게 된다.
그 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, Baf A1을 처리한 군의 LC3 단백질의 발현이 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 통해 오토파지 플럭스가 억제된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 벌개미취 추출물과 baf A1을 함께 처리 하였을 때 벌개미취 추출물 단독 처리 군에 비해 LC3 단백질의 발현(LC3 I에 대한 LC3 II의 상대적 밀도)이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해, 벌개미취 추출물의 자가포식 작용 유도 효과가 오토파지 플럭스의 조절을 통한 것임을 알 수 있었다.
실시예
2: 벌개미취
분획물의
자가포식
작용 유도 효과
실시예
2-1: 벌개미취
분획물의
제조
95% 에탄올 추출하여 얻은 벌개미취 에탄올 추출물 1.7 kg 중 1 kg을 H2O로 현탁시킨 다음 동량의 헥산(n-Hexane)을 가하여 진탕 방치하여 헥산 분획(149 g)을 얻고, 수층에 동량의 에틸아세테이트(EtOAc)를 가하여 진탕 방치하여 에틸아세테이트 분획(175 g)을 얻고, 수층에 다시 동량의 부탄올(n-BuOH)을 가하여 진탕 방치하여 부탄올 분획(190 g)을 얻었으며, 수층을 농축하여 물(H2O) 분획을 얻었다.
실시예
2-2: 벌개미취
분획물에
의한 LC3 단백질 발현량 증가 효과
상기 실시예 7에서 수득한 벌개미취 분획물의 LC3 단백질 발현 증가 효과를 측정하기 위하여, 상기 세포주 (SH-SY5Y cell)에 벌개미취 분획물을 분획물 독성에 따라 각각 5, 10, 25, 50, 100 μg/ml로 첨가한 다음, 5% CO2, 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 실시예 2와 같은 방법의 웨스턴블롯팅 실험을 통하여 확인하였다.
상기 LC3 단백질 발현을 확인한 결과를 도 6에 기재하였고, 벌개미취 분획물을 첨가하지 않은 경우를 대조군으로 하였다. 그 결과, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 벌개미취 분획물에 의해 LC3 II 단백질의 발현이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 벌개미취 분획물이 도파민성 세포주에 처리되었을 때, 자가포식 활성을 나타내는 지표인 LC3 I에서 LC3 II 단백질로의 전이를 증가시켰는바, 결과적으로 자가포식 유도 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예
2-3: 벌개미취
분획물에
의한
mTOR
단백질 발현 증가 효과
상시 실시예 7에서 수득한 벌개미취 BuOH 분획물의 mTOR 단백질 발현 감소 효과를 측정하기 위하여, SH-SY5Y 세포주에 벌개미취 분획물을 도 7에 기재된 바와 같이 첨가한 다음, 5% CO2, 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 실시예 2와 같은 방법으로 실험하였다. 본 실험에서 사용된 1차 항체는 mTOR, GAPDH (Cell signaling technology)이 있으며, GAPDH는 loading control로 사용하였다.
상기 mTOR의 상대적 밀도를 나타낸 결과를 도 7에 기재하였고, 벌개미취 분획물을 첨가하지 않은 경우를 대조군으로 하였다. 그 결과, 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 벌개미취 분획물을 처리한 경우 농도의존적으로 mTOR 단백질의 발현이 유의적으로 감소함을 확인 할 수 있었다. 이를 통해, 벌개미취 분획물이 도파민성 세포주에 처리되었을 때, 자가포식을 억제하는 mTOR 단백질의 발현량을 감소시켜, 결과적으로 자가포식 유도 효과를 나타냄을 확인할 수 있다
실시예
3:
MPTP
투여에 의한 파킨슨병 동물모델에서, 벌개미취 에탄올 추출물에 의한
자가포식
작용을 통하여 뇌세포 사멸에 미치는 효과
C57BL/6 웅성 마우스(8주령)를 사용하고, 사료와 물은 자유 섭취하였다. 마우스를 각 군당 6마리씩 7군으로 나누었다. 대조군과 MPTP 단독처리군은 생리식염수를 3일간 단회 경구 투여하였고, 상기 실시예 1-1에서 수득한 벌개미취 추출물(200 mg/kg)군과 상기 실시예 2-1에서 수득한 벌개미취 분획물(25, 50, 100 mg/kg)군은 생리식염수에 각각의 추출물 및 분획물을 용해시킨 뒤 3일간 단회 경구 투여하였다. 양성대조군은 로피니롤을 생리식염수에 용해하여 3일간 단회 경구 투여하였다. 약물 투여 4일째부터 8일째까지는 대조군을 제외한 모든 군에 약물 투여 1시간 후에 생리식염수에 용해한 MPTP(30 mg/kg)를 단회 경구 투여하였으며, 약물 투여 9일째부터 10일째에는 대조군을 제외한 모든 군에 동일한 양의 약물을 단회 경구 투여하였다.
약물 투여 종료 후 7일째 각 군의 마우스를 치사시킨 후, 뇌 조직을 흑질(substantia nigra)과 선조체(striatum)로 분리하였다. 분리된 뇌 조직을 Phosphatase Inhibitor Cocktail Set I (Sigma-Aldrich, MO, USA)을 보충 한 PRO-PREPTM 용해 완충액(iNtRON, 경기, 한국)으로 균질화하였다. 균질액을 4℃에서 30분 동안 방치한 다음 13,000 rpm, 4℃, 30분간 원심 분리하여 상등액을 취하고, 취한 상층액은 Protein assay dye Reagent concentrate (Bio-Rad)를 이용하여 Bradford method로 단백질을 정량하였다. 그 후 일정량의 SDS loading buffer와 혼합하여 99℃에서 5분간 가열한 후에 상시 실시예 1-2와 같은 방법으로 웨스턴블롯팅을 통해 단백질 발현을 측정하였다. 본 실험에서 사용된 1차 항체는 TH, Beclin-1, p-mTOR, Mtor, p-ULK1(s555), ULK1, p-AMPK, AMPK, LC3, α-synuclein, GAPDH (Cell signaling technology)이 있으며, GAPDH는 loading control로 사용하였다.
상기 단백질들의 발현을 확인한 결과를 도 8 내지 도14에 기재하였고, 벌개미취 추출물, 분획물 및 MPTP를 첨가하지 않은 경우를 대조군으로 하였으며, 로피니롤과 MPTP를 투여한 경우를 양성 대조군으로 하였다. 로피니롤은 파킨슨병 약물 치료에서 사용되는 물질으로, 도파민 수용체의 작용제(dopamine agonist)이다. MPTP는 파킨슨병 동물 모델에서 사용되는 물질으로, 도파민 길항제(dopamine antagonist)이다.
그 결과, 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, MPTP 단독처리군의 TH 발현이 대조군에 비해 감소된 반면에, 벌개미취 추출물 및 분획물을 투여한 군들에서는 농도의존적으로 도파민의 전구체(L-DOPA)를 조절하는 효소인 TH 단백질 발현이 유의적으로 증가하였음을 확인할 수 있다.
그 결과, 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, MPTP 단독 처리군에서 α-synuclein의 응집이 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 반면에, 벌개미취 추출물 및 분획물을 투여한 군에서는 파킨슨병의 원인 단백질로 알려져 있는 α-synuclein 단백질의 응집이 대조군 수준 또는 그 이하로 감소되었음을 확인할 수 있다.
또한, 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군에 비해 벌개미취 추출물 및 분획물을 투여한 군의 자가포식소체 막 단백질인 LC3 단백질 발현이 농도의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, MPTP 단독처리군의 경우, 자가포식 작용을 유도하는 인산화된 AMPK 단백질 발현이 대조군에 비해 감소한 반면에, 벌개미취 추출물 및 분획물을 투여한 군에서는 농도의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다.
그 결과, 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, MPTP 단독처리군의 경우, 자가포식 작용을 유도하는 인산화된 ULK1 단백질 발현이 대조군에 비해 감소한 반면에, 벌개미취 추출물 및 분획물을 투여한 군에서 농도의존적으로 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다.
그 결과, 도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, MPTP 단독처리군의 경우, 자가포식 작용을 억제하는 인산화된 mTOR 단백질의 발현이 대조군에 비해 증가된 반면에, 벌개미취 추출물 및 분획물을 투여한 군에서는 농도 의존적으로 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다.
그 결과, 도 14에서 확인할 수 있는 바와 같이, MPTP 단독처리군의 경우. 자가포식 작용을 유도하는 대표적인 단백질인 Beclin-1 단백질의 발현이 대조군에 비해 감소하는 반면에, 벌개미취 추출물 및 분획물을 투여한 군에서는 농도의존적으로 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과에서, MPTP 독성물질로 파킨슨병을 유도한 동물 모델에서 벌개미취 추출물 및 분획물의 처리는 도파민의 전구체(L-DOPA)를 조절하는 효소인 TH의 양을 촉진시키고(도 8), 파킨슨병에서 비정상적으로 응집된 형태로 나타나는 α-synuclein 단백질의 응집을 억제하고(도 9), 자가포식소페 막 단백질 LC3와 자가포식을 유도하는 p-AMPK, p-ULK1, Beclin-1 단백질의 발현을 증가시키고, 자가포식을 억제하는 p-mTOR 단백질의 발현을 감소시킴(도 10-14)을 확인하였고, 이를 통해, 벌개미취 추출물 및 분획물은 자가포식 작용의 유도를 통해 농도의존적으로 파킨슨병의 치료 및 개선에 활성을 나타냄을 확인할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (9)
- 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 파킨슨병의 예방 또는 치료는 자가포식 유도작용으로 뇌세포 사멸을 억제하는 것인, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 벌개미취는 벌개미취의 잎 또는 줄기에서 추출된 것인, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 벌개미취 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출하여 제조되는 것인, 약학적 조성물.
- 삭제
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료 방법.
- 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 파킨슨병의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
상기 파킨슨병의 예방 또는 치료는 자가포식 유도작용으로 뇌세포 사멸을 억제하는 것인, 식품 조성물. - 삭제
- 벌개미취 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는, 파킨슨병의 예방 또는 개선용 사료 조성물로서,
상기 파킨슨병의 예방 또는 치료는 자가포식 유도작용으로 뇌세포 사멸을 억제하는 것인, 사료 조성물. - 삭제
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