DE60114778T3

DE60114778T3 - Behandlung von infektionen in tieren

Info

Publication number: DE60114778T3
Application number: DE60114778T
Authority: DE
Inventors: M-L Baillon; Catriona Julie Giffard
Original assignee: Mars Inc
Current assignee: Mars Inc
Priority date: 2000-03-10
Filing date: 2001-03-09
Publication date: 2012-09-27
Anticipated expiration: 2021-03-10
Also published as: GB0221446D0; WO2001065949A1; AU779710C; EP1261259B1; AU779710B2; GB2377638B; AU3761701A; ATE308895T1; EP1261259A1; GB2377638A; DE60114778D1; EP1261259B2; DE60114778T2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Kokosnussendospermfasern bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung oder Prävention pathogener Bakterien im Dickdarm eines Hundes oder einer Katze.
Das Vorhandensein pathogener Bakterien (einschließlich Infektion) des Dickdarms in einem Haustier ist bedenklich. Besondere pathogene Bakterien, die den Dickdarm infizieren, schließen Campylobacter und pathogene Escherichia coli ein. Die Bakterienspezies, die für den Großteil menschlicher bakterieller gastrointestinaler Infektionen verantwortlich ist, ist Campylobacter jejuni. Diese Spezies ist auch der Hauptgrund für Besorgnis bei Katzen und Hunden. Die Spezies kann als ein Pathogen in jungen Hunden und Katzen wirken und ist in älteren Tieren wahrscheinlich opportunistisch. Klinische Erkrankung bei Hunden manifestiert sich als Diarrhoe, die von milder bis schleimbeladener blutiger Diarrhoe reicht, Tenesmus, Erbrechen, Anorexie und Depression.
Eine Hauptsorge im Hinblick auf Campylobacter-Infektion in Haustieren ist das zoonotische Risiko, dass das Tragen und die Ausscheidung des Organismus darstellt. Es ist geschätzt worden, dass 5% aller menschlichen durch Campylobacter jejuni induzierten Diarrhoe aus der Exposition gegenüber infizierten Katzen oder Hunden resultiert. Eine Reihe neuerer Studien nennen den Besitz von Hunden als einen signifikanten Risikofaktor, durch Campylobacter zu erkranken. Eine in Christchurch, Neuseeland, durchgeführte Studie hat herausgefunden, dass Haushaltskontakt mit Hunden ein 1,25- bis 2-faches Risiko gegenüber normal beträgt, sich Campylobacter zuzuziehen.
E. coli ist ein Gram-negatives fakultatives anaerobes Bacillus. Im allgemeinen führt es ein symbiotisches Leben mit seinem Wirt, wobei es ihm keinen Schaden zufügt. Von spezifischen Gruppen ist jedoch bekannt, dass sie gastrointestinale Erkrankungen verursachen, und diese sind in Kategorien klassifiziert, wie definiert durch ihre Virulenzmechanismen. Enteropathogene und verocytotoxigene Stämme von E. coli sind besonders wichtig bei der Verursachung akuter und chronischer Diarrhoe in Hunden. Der verocytotoxigene E. coli wird für wichtig in diarrhoetischen sowie gesunden Katzen gehalten, und diese Tiere wirken wahrscheinlich als ein Infektionsreservoir für Menschen.
Salmonella-Organismen sind Gram-negative fakultative anaerobe Bakterien, die in der Lage sind, intrazellulär zu überleben. Salmonella kann klinische und subklinische Infektionen in Hunden und Katzen sowie Menschen verursachen. Dies macht sie zu einem Schlüsselorganismus von Interesse.
Verschiedene Studien haben festgestellt, dass Salmonella von zwischen 1 und 30% der gesunden Haushunde und zwischen 1 und 18% der gesunden Hauskatzen getragen wird. Diese Daten sind abhängig von der Erhebung und ob Salmonella aus den Faeces von Tieren sowohl mit als auch ohne Diarrhoe kultiviert werden konnte.
Klinische Infektionen von Salmonella in Tieren zeigen oft Anzeichen von milder bis schwerer Gastroenteritis. Bei Hunden sind die am häufigsten berichteten Symptome Diarrhoe, Erbrechen, Fieber, Unwohlsein, Anorexie, Scheidenausfluß und manchmal Abort. Bei Katzen sind Diarrhoe, Erbrechen, Fieber, Unwohlsein und Anorexie die vorherrschenden berichteten Symptome. Erholung von akuter Salmonellosis tritt typischerweise innerhalb 1 Woche auf, kann aber 3 bis 4 Wochen dauern. Ausscheidung von Salmonella in Faeces kann sich für 3 bis 6 Wochen fortsetzen und kann eine Infektionsquelle für menschliche Familienmitglieder sein.
Aufgrund der Langzeitausscheidung von Salmonella sind Tiere wichtige Vektoren für nicht durch Nahrungsmittel getragene Infektionen bei Menschen. Hunde haben ein größeres zoonotisches Potential als Katzen, obgleich sich gezeigt hat, dass Katzen Organismen oral, konjunktival und fäkal ausscheiden. Kontakt mit Faeces von infizierten Haustieren ist eine wichtige Infektionsquelle für junge Kinder.
Der Ort der Salmonella-Infektion ist im Dünndarm, aber aufgrund des potentiellen zoonotischen Risikos aus Langzeitausscheidung von Salmonella in Faeces von Hunden ist ein Modell des Dickdarms für diese Untersuchung verwendet worden. Wenn die Anzahl an lebensfähigen Salmonella vermindert werden kann, während sie im Dickdarm sind, kann die Dauer der Ausscheidung vermindert werden. Verminderung der Zeit, über die Salmonella in Hundefaeces ausgeschieden wird, vermindert auch die Chance menschlichen Kontakts mit dem Pathogen.
JP 08173055 offenbart die Verwendung von Mannosepolysaccharid, um bakterielle Kontamination mit Salmonella in Zuchttieren zu verhindern.
Demgemäß besteht ein Bedürfnis nach einem Mittel zur Prävention oder Behandlung pathogener Bakterien im Dickdarm von Haustieren, um die vorgenannten Risiken zu eliminieren. Gegenwärtige Behandlungen für Infektionen mit Campylobacter und pathogenen E. coli und das Vorhandensein von Salmonella involviert die Verabreichung von Antibiotika an die Haustiere. Es gibt Bedenken, dass die fortgesetzte Verwendung von Antibiotika bei der Behandlung von Campylobacter-Infektionen zum Auftreten von antibiotikaresistenten Stämmen des Organismus führen und eine Wirkung auf die Langzeitgesundheit von Haustieren haben könnte (was Behandlungsoptionen verringern oder eliminieren würde). Ein Bedürfnis besteht daher, eine Alternative zu Antibiotikabehandlung für infizierte oder infizierbare Tiere zu finden. Die vorliegende Erfindung stellt solch ein Mittel zur Verfügung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von Kokosnussendospermfaser bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Prävention oder Behandlung pathogener Bakterien im Dickdarm eines Hundes oder einer Katze zur Verfügung gestellt.
Im allgemeinen umfassen nicht-verdaubare Kohlehydrate diejenigen Verbindungen, die von Säugetieren nicht verdaut werden, aber durch Darmbakterienspezies metabolisiert werden können, die zur normalen Mikroflora gehören, zum Beispiel Bifidobakterien und Lactobazillen.
Oligosaccharide sind natürlich vorkommende Verbindungen, die in einer Vielzahl von Früchten und Gemüsen anzutreffen sind, wie etwa Bananen, Tomaten, Artischocken, Zwiebeln, Knoblauch und Getreidearten (z. B. Weizen und Gerste).
Frisches Kokosnussendosperm hat eine typische Nährstoffverteilung aus Wasser (35%), Öl (44%), Protein (6%), Zuckern (7%), Faser (3%) und Asche (1%). Die Form der Kokosnussendospermfaser zur Verwendung gemäß allen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht beschränkt. Die Kokosnussendospermfaser kann frisch sein oder in irgendeiner anderen Form, wie etwa Kopra, entfettetes Kopra (unter anderem auch als Kokoskuchen, Kokospresskuchen oder Kokoskuchenmehl bezeichnet), Kokosnussmehl, entfettetes Kokosnussmehl, vollständige oder entfettete entwässerte Kokosnuss, Kopra.
Kopra ist eine besonders geeignete Quelle für Kokosnussendospermfaser zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung. Kopra ist getrocknetes Kokosnussendosperm (üblicherweise in der Sonne getrocknet). Entfettetes Kopra ist ebenfalls besonders geeignet. Entfettetes Kopra ist das typische Ergebnis von Kokosnussendosperm, das getrocknet worden ist und bei dem das Kokosnussöl mechanisch entfernt wurde. Entfetteter Kokoskuchen wird erhalten, indem man zunächst Kopra erhält, dann das Kopra durch eine Presse oder eine Abpressvorrichtung hindurch zerquetscht, um den Großteil des Öls zu entfernen. Der übrigbleibende Rest wird Kokoskuchen, Kokospresskuchen oder Kokoskuchenmehl genannt.
Eines der Produkte komplexer Kohlehydratfermentation im Dickdarm durch normale Mikroflora sind kurzkettige Fettsäuren (SCFAs). Die Erzeugung von SCFAs durch die Darmmikroflora führt zu einem Absinken des pHs des Lumens des Dickdarms/Enddarms.
Nicht alle Darmbakterien können nicht-verdaubare Kohlehydrate metabolisieren. Studien zeigen, dass pathogene Bakterien nicht in der Lage sind, nicht-verdaubare Kohlehydrate zu verarbeiten. Aus diesem Grund sind diese nicht-verdaubaren Kohlehydrate im Darm bei der selektiven Stimulierung des Wachstums der Darmmikroflora involviert, was eine gesündere gastrointestinale Umgebung schafft.
Die Kokosnussendospermfaser der Erfindung stimuliert das Wachstum und/oder die Aktivität eines nützlichen Bakteriums oder einer begrenzten Anzahl von nützlichen Bakterien im Dickdarm eines Haustieres selektiv. Der Begriff „nützliche Bakterien” bezieht sich auf diejenigen Bakterienspezies, die eine nützliche Wirkung auf den Wirtsorganismus haben.
Die nützlichen Bakterienspezies umfassen typischerweise Bifidobakterien und/oder Lactobazillen.
Die Kokosnussendospermfaser der vorliegenden Erfindung kann ein „Präbiotikum” sein. Ein Präbiotikum ist im Stand der Technik definiert als ein nicht-verdaubarer Nahrungsmittelinhaltsstoff, der den Wirt durch selektive Stimulierung des Wachstums und/oder der Aktivität eines Bakteriums oder einer begrenzten Anzahl von Bakterien im Enddarm, die das Potential haben, die Gesundheit zu verbessern, günstig beeinflußt.
Es ist gezeigt worden, dass Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung das Potential haben, den pH des Dickdarms zu senken. Bei Verwendung eines Oligosaccharids wurde eine Absenkung des pHs im Dickdarm-Modell von 7,25 auf 5,5 beobachtet. Im Dickdarm beeinflußt eine Absenkung des pHs das Überleben pathogener Bakterien. Eine Absenkung des pHs von 7,25 auf 5,5 als ein Ergebnis der Einbeziehung von FOS und/oder GOS ist ausreichend, lebensfähige Campylobacter jejuni-Bakterien zu eliminieren. Im Gegensatz dazu führt die Einbeziehung von Kokosnussendospermfaser im Dickdarm zur Eliminierung lebensfähiger Campylobacter jejuni-Bakterien ohne eine signifikante Veränderung des pHs des Dickdarms (der pH wurde im Dickdarm-Modell von 7,0 auf 6,5 gesenkt).
Die vorliegende Erfindung stellt die Fütterung von Hunden oder Katzen mit einer Zusammensetzung bereit, die eine Kokosnussendospermfaser umfasst, um lebensfähige pathogene Bakterien im Dickdarm zu vermindern oder zu eliminieren.
Die pathogenen Bakterien der vorliegenden Erfindung schließen typischerweise eines oder mehrere von Campylobacter, pathogenem Clostridium, Salmonella und pathogenem Escherichia coli, wie etwa verocytotoxigenes E. coli, zum Beispiel E. coli O157, ein. Von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung sind die Spezies Campylobacter jejuni und Salmonella enterica (einschließlich S. enterica Serotyp Typhimurium). Campylobacter jejuni kann klinische Erkrankungen verursachen, einschließlich Diarrhoe, Tenesmus, Erbrechen, Anorexie, Depression, entzündliche Darmerkrankung und andere Darmstörungen.
Das Haustier ist eine Katze oder ein Hund. Katzen und Hunde gemäß der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise Felis domesticus oder Canis domesticus.
Die Zusammensetzung für die Prävention oder Behandlung eines pathogenen Bakteriums im Dickdarm des Haustieres ist vorzugsweise ein Haustierfutterprodukt. Die Form oder Art des Haustierfutterproduktes ist nicht beschränkend. Es kann abgepackt sein. Auf diese Weise ist der Verbraucher in der Lage, von der Verpackung die Inhaltsstoffe im Nahrungsmittelprodukt zu identifizieren und zu bestätigen, dass es für das fragliche bestimmte Haustier geeignet ist. Die Verpackung kann Metall (üblicherweise in der Form einer Dose oder Flexifolie), Kunststoff, Papier oder Karton sein. Das Haustierfutterprodukt kann ein trockenes, halbfeuchtes oder ein feuchtes (nasses) Produkt sein. Naßprodukt schließt Futtermittel ein, das in Dosen verkauft wird, und hat einen Feuchtigkeitsgehalt von 70 bis 90%. Trockenfutter schließt Futtermittel mit einer ähnlichen Zusammensetzung, aber mit 5 bis 15% Feuchtigkeit und vorgelegt als kleine keksähnliche Kibbles, ein. Halbfeuchte Produkte haben ein Feuchtigkeitsgehalt zwischen Naß- und Trockenprodukten. Der Feuchtigkeitsgehalt liegt im Bereich von 15 bis 70%. Die Feuchtigkeitsmenge in irgendeinem Produkt kann die Verpackungsart beeinflussen, die verwendet werden kann oder erforderlich ist.
In Kombination mit der Kokosnussendospermfaser sind die restlichen Komponenten des Haustierfutterproduktes nicht wesentlich für die Erfindung, und typische Standardprodukte können mit der erforderlichen Kokosnussendospermfaser kombiniert werden. Am bevorzugtesten stellen die kombinierten Inhaltsstoffe des Haustierfutterproduktes gemäß der Erfindung alle empfohlenen Vitamine und Minerale für das fragliche bestimmte Haustier bereit (ein vollständiges und ausgewogenes Futtermittel), zum Beispiel wie beschrieben in National Research Council, 1985, Nutritional Requirements for Dogs, National Academy Press, Washington D. C. (ISBN; 0-309-03496-5); National Research Council, 1986, Nutritional Requirements of Cats, National Academy Press, Washington D. C. (ISBN: 0-309-03682-8) oder Association of American Feed Control Officials, Official Publication 1996.
Das Haustierfutterprodukt umfasst jedes Produkt, das ein Haustier in seiner Ernährung konsumiert. Die Erfindung deckt somit Standardfutterprodukte sowie Haustierfuttersnacks (zum Beispiel Snackriegel, Haustierkauprodukte, knusprige Leckerli, Getreideriegel, Snacks, Kekse und süße Produkte) ab. Das Futterprodukt ist vorzugsweise ein gegartes Produkt. Es kann in der Form einer verkleisterten Stärkematrix vorliegen. Es kann in der Form von Stücken in Sauce, Gelee, Laib oder Wasser vorliegen. Es kann Fleisch oder aus Tieren gewonnenes Material umfassen (wie etwa Rind, Hähnchen, Truthahn, Lamm, Schwein, Fisch, Blutplasma, Knochenmark etc. oder eines oder mehrere davon). Das Produkt kann alternativ fleischfrei sein (wobei es vorzugsweise einen Fleischersatzstoff einschließt, wie etwa Soja, Maiskleber oder ein Sojaprodukt), um eine Proteinquelle bereitzustellen. Das Produkt kann zusätzliche Proteinquellen enthalten, wie etwa Sojaproteinkonzentrat, Milchproteine, Kleber etc. Das Produkt kann auch eine Stärkequelle enthalten, wie etwa ein oder mehrere Getreide (z. B. Weizen, Mais, Reis, Hafer, Gerste etc.), oder kann stärkefrei sein. Ein typisches trockenes Hunde- oder Katzenfutter enthält etwa 20–30% Rohprotein und etwa 10–20% Fett, wobei der Rest Kohlehydrat ist, einschließlich Ballaststofffaser und Asche. Ein typisches nasses, halbfeuchtes oder feuchtes Produkt enthält (auf Trockensubstanzbasis) etwa 40% Fett (von 20 bis 50%), 50% Protein (von 40 bis 60%) und den Rest Faser und Asche.
Das Haustierfutterprodukt ist vorzugsweise ein kommerzielles Haustierfutterprodukt. Solch ein Produkt wird vorzugsweise als ein Produkt zum Verfüttern an ein Haustier, insbesondere eine Hauskatze oder einen Haushund, verkauft.
Das Haustierfutterprodukt kann von 0,1 bis 5 Gew.-% eines Oligosaccharids umfassen, am bevorzugtesten von 0,1 bis 2 Gew.-% (auf einer Trockensubstanzbasis).
Der Gehalt an nicht-verdaubarer Faser, der in ein Haustierfutterprodukt einbezogen wird, wie etwa Kokosnussendospermfaser, ist nicht beschränkend. Vorzugsweise liegt die Faserkomponente im Haustierfutterprodukt in einem Gehalt von ungefähr 0,15 bis 8% auf einer Trockensubstanzbasis, vorzugsweise 0,15 bis 5% auf einer Trockensubstanzbasis vor, gemessen mit der Englyst-Methode (wie definiert in Englyst H. N. und Cumming J. H. (1984), simplified method for the measurement of total non-starch polysaccharides by gas-liquid chromatography of constituent sugars as alditol acetates, Analyst. 109, 937–942, und herein durch Bezugnahme miteinbezogen). Die Gehalte, wie berechnet mit dieser Methode, können von 0,15 bis zu 5%, 6%, 7% oder 8% gehen. Die untere Grenze kann von 1,5%, 2% oder 3% sein. Eine Beschreibung der Englyst-Methode ist in Anhang 1 beschrieben. Im Prinzip wird Stärke nach Löslichmachung enzymatisch entfernt und NSP wird als die Summe der konstituierenden Zucker, die durch Säurehydrolyse freigesetzt werden, gemessen. Die Stärkekomponente der Faserquelle wird durch Kochen in heißem Wasser verkleistert und wird dann mit Alpha-Amylase und Pullulanase entfernt. Stärke und modifizierte oder resistente Stärke werden in DMSO dispergiert. Drei Proben werden dann komplementären Verfahren unterzogen, die (I) Gesamt-NSP, (ii) wasserlösliches NSP und (iii) Cellulose messen. Die Komponenten werden in jedem Falle mit Schwefelsäure hydrolysiert. Die konstituierenden Zucker werden in Alditole überführt und werden als deren Alditolacetate unter Verwendung von Gas-flüssig-Chromatographie (GLC) gemessen. Werte für Gesamt-Ballaststofffaser sowie unlösliche und lösliche Fraktionen können erhalten werden. Cellulose kann getrennt gemessen werden, und die Nicht-Cellulose-Polysaccharide werden durch Messung der einzelnen Monosaccharide charakterisiert.
Die Einarbeitung des Gehaltes an Kokosnussendospermfaser gemäß der Erfindung (die sich entsprechend der Form des Kokosnussendosperms unterscheiden kann, zum Beispiel Kopra oder entwässerte Kokosnuss) kann leicht durch Identifizieren der Menge an Ballaststofffaser in der besonderen Form der Kokosnussendospermfaser bestimmt werden. Gemäß der Englyst-Methode (aaO) enthält entfettetes Kopra zum Beispiel ungefähr 33,5% Gesamt-Ballaststofffaser. Demgemäß liegt die bevorzugte Menge an entfettetem Kopra in einem Haustierfutterprodukt, um einen bevorzugten Fasergehalt von ungefähr 0,15 bis 5% auf einer Trockensubstanzbasis gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung bereitzustellen, bei einem Gehalt von ungefähr 0,5 bis 15% auf einer Trockensubstanzbasis des Haustierfutterproduktes.
Ohne die vorliegende Erfindung zu beschränken, glaubt man, dass die Zugabe von Kokosnussendospermfaser zu einem Haustierfutterprodukt gute Gesundheit des Dickdarms aufrechterhält oder diese verbessert, was im allgemeinen erreicht wird durch Optimieren der Bedingungen für das Wachstum und die Vermehrung unschädlicher Bakterien im Dickdarm und/oder durch Senken des pHs des Lumens des Dickdarms, wodurch die Menge an schädlichen Bakterien im Dickdarm vermindert wird.
Die Zusammensetzung wird vorzugsweise einem Haustier verabreicht, das der Prävention oder Behandlung eines pathogenen Bakteriums in seinem Dickdarm bedarf. Dies kann zum Beispiel ein junges Haustier sein, wie etwa ein Welpe, oder ein älteres Haustier. Wenn die Zusammensetzung ein Haustierfutterprodukt ist, kann das Haustierfutterprodukt in einem Ernährungsregime gemäß dem üblichen Ernährungsregime des Haustieres verabreicht werden. Das Haustierfutterprodukt kann 100% der Ernährung des Haustieres oder einen geringeren Anteil umfassen, abhängig vom erforderlichen Grad der Prävention oder Behandlung. Das Haustierfutterprodukt erlaubt, die Kokosnussendospermfaser leicht zu verabreichen, wodurch die Notwendigkeit vermieden wird, das Futter des Haustieres zu ergänzen. Zusätzlich kann das Haustierfutterprodukt vom Besitzer des Tieres verabreicht werden, wodurch konstante Überwachung durch einen Tierarzt vermieden wird. Das Haustierfutterprodukt kann in jedem Geschäft erhältlich sein, das Haustierfutterprodukte verkauft, oder kann von einem Tierarzt erhältlich sein. Das Haustierfutterprodukt kann, wie oben gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung beschrieben, sein.
Wie hierin verwendet, schließt der Begriff „Verabreichung” auch Fütterung oder jedes andere Verfahren oraler Verabreichung ein. Andere Mittel der Verabreichung können Tabletten, Kapseln, Injektionen, Suppositorien oder jedes andere geeignete Mittel einschließen.
Die Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die folgende nicht-beschränkende Figur beschrieben werden, in der:
1 ein Diagramm von C. jejuni-Zellen nach 0 und nach 24 Stunden Inkubation mit oder ohne Kokosnussendospermfaser ist.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf das folgende, nicht-beschränkende Beispiel beschrieben werden:
BEISPIEL
Die Wirkung von Kokosnussendospermfaser auf das Überleben von Campylobacter jejuni in einem Modell des Hundedarms.
METHODE
Untersuchung der Wirkung von Kokosnussendospermfaser auf das Überleben von Campylobacter im Hundedarm.
Zusammenfassung

• Campylobacter ist eines der vorherrschenden gastrointestinalen Pathogene, das sowohl klinische als auch nicht-klinische Infektionen in Hunden verursacht.
• Ein in-vitro-Modell des Hundedickdarms ist entwickelt worden, um die Wirkung neuartiger Fasern auf das Überleben von Bakterienpathogenen des Hundes zu testen.
• Einbeziehung von Kokosnussendospermfaser in dieses Modell führte zur Eliminierung lebensfähiger Campylobacter jejuni-Zellen aus dem System.

Methoden

1. Campylobacter jejuni-Zellen wurden aus Vorratskulturen gezüchtet und bei 37°C unter mikroaeroben Bedingungen (5% O₂, 10% CO₂ und 85% N₂) kultiviert. Flüssigkulturen wurden in 20 ml-Volumina in konischen 50 ml-Kolben gezüchtet, die auf einem Orbitalrüttler gerüttelt wurden. Übernachtkulturen, gezüchtet in Mueller-Hinton(MH)-Brühe (Oxoid), wurden vor Einbeziehung in den Test auf A₆₀₀ 1,0 eingestellt.
2. Die Kolben wurden angesetzt mit 200 ml MH-Brühe, 1 ml der eingestellten Campylobacter jejuni-Kultur und 2 g frische Faeces. Zu Testkolben wurden 0,7% (w/v) Kokoskuchen zugegeben und für Durchmischung verwirbelt. Kontrollkolben hatten keine weiteren Zusätze.
3. Aus den Kolben wurden zu Beginn (0 Stunden) und am Ende (24 Stunden) des Experimentes Proben entnommen, um lebensfähige Zahlen von Campylobacter jejuni-Zellen durch Reihenverdünnung von Proben aus den Kolben und Aufbringen von Verdünnungen auf Campylobacter-selektives Agar (LabM) zu bestimmen. Die Platten wurden mikroaerob für 48 Stunden inkubiert, woraufhin die lebensfähigen Zahlen bestimmt wurden.
4. Am Ende des Experimentes wurde der pH der Mischung in jedem Kolben unter Verwendung von Multistix (Bayer) bestimmt.
5. Das Experiment wurde sechsmal unter Verwendung einer Fäkalprobe von jeweils einem unterschiedlichen Hund durchgeführt. Alle Hunde wurden für die Dauer der Studie mit einem kommerziell erhältlichen (vollständigen du ausgewogenen) Premium-Trockenfutter gefüttert.

ERGEBNISSE

Nach einer 24-ständigen mikroaeroben Inkubation konnte keine lebensfähigen Campylobacter jejuni-Zellen aus Kolben gewonnen werden, zu denen die Kokosnussendospermfaser zugegeben war. Im Gegensatz dazu wurden Campylobacter jejuni-Zellen aus den Kolben gewonnen, die keine Kokosnussendospermfaser enthielten, mit ungefähr 10⁸ Zellen pro ml. Die Ergebnisse aus den 6 einzelnen Experimenten sind in der Tabelle unten und im Diagramm in 1 dargestellt. Tabelle

Anzahl lebensfähiger Campylobacter jejuni-Zellen (log₁₀), gewonnen aus dem Modell des Hundedickdarms, mit und ohne die Zugabe von Kokosnussendospermfaser
←--- log₁₀ koloniebildende Einheiten von Campylobacter jejuni ---→
Fäkalprobe (Hund Nr.)	0 Stunden < +0,7%	0 Stunden Kokosnuss Keine	24 Stunden Endosperm +0,7%	24 Stunden Fasern > Keine
1	7,76	7,75	0	7,25
2	7,33	7,64	0	8,56
3	7,77	7,75	0	7,17
4	7,72	7,74	0	7,47
5	7,67	7,71	0	8,59
6	7,16	7,38	0	8,97
Durchschnitt	7,57	7,66	0	8
STD	0,26	0,14	0	0,79

1 zeigt ein Diagramm der Wirkung der Einbeziehung von Kokosnussendospermfaser in das Hundedickdarmmodell auf das Überleben von Campylobacter jejuni. Die Buchstaben geben statistisch signifikanten Unterschied an (p < 0,05).
Aufgezeichneter pH nach 24-stündiger Inkubation, wobei Kokosnussendospermfaser in das System einbezogen oder aus diesem weggelassen wurde, für jeden Hund.

Hund Nr. +0,7% Kokosnussendospermfaser Keine Kokosnussendospermfaser

1 6,75 7,5

2 6,25 7,5

3 6,75 7,5

4 6,25 7,5

5 6,25 7,5

6 6,25 7,5
Am Ende der Inkubationsperiode wurde der pH der Lösungen in jedem Kolben gemessen, und es wurde festgestellt, dass er 7,5 betrug, wenn Kokosnussendospermfaser aus dem System weggelassen wurde (SD von 0). Wenn Kokosnussendospermfaser im Modell eingeschlossen war, wurde festgestellt, dass der pH 6,42 betrug (SD von 0,26).
SCHLUSSFOLGERUNG
Einbeziehung von Kokosnussendospermfaser in ein Modell des Hundedickdarms führte zur Eliminierung lebensfähiger Campylobacter jejuni-Zellen. Wenn keine Kokosnussendospermfaser zum System zugegeben wurde, zeigten Campylobacter jejuni-Zellen keinen Verlust an Lebensfähigkeit für die Dauer des Experimentes. Da ein pH-Bereich von 6,5 bis 7,5 für Campylobacter optimal ist, ist es unwahrscheinlich, dass der Unterschied im pH, der zwischen den zwei Bedingungen beobachtet wurde, für den Unterschied verantwortlich war, der für das Überleben beobachtet wurde. Stattdessen ist es wahrscheinlich, dass die nicht-pathogenen, saccharolytischen Bakterien, die in den Faeces vorhanden sind, die Kokosnussendospermfaser metabolisieren. Campylobacter jejuni ist nicht in der Lage, Kohlehydrate zu fermentieren, somit verschafft die Kokosnussendospermfaser, die vorhanden ist, den nicht-pathogenen, saccharolytischen Bakterien einen Vorteil.
Anhang 1

Die Englyst-Methode, von Englyst und Cummings (aaO).

Experimenteller Teil
Apparatur
Das Fraktionierungsverfahren wurde in 50–60 ml-Glaszentrifugenröhrchen mit Schraubverschluß durchgeführt, wie zuvor beschrieben. Gas-flüssig-Chromatographie wurde mit einem Chromatographen Pye Unicam Series 204 durchgeführt, ausgestattet mit einem Flammenionisationsdetektor. Eine Glassäule, 2,1 m × 2 mm Innendurchmesser, gepackt mit Supelcoport (100–200 mesh), beschichtet mit 3% SP 2330, wurde verwendet. Die Säulentemperatur betrug 215°C (isotherm) und die Injektor- und Detektortemperaturen betrugen 250°C. Die Durchflußgeschwindigkeit des Trägergases (Stickstoff) betrug 20 ml·min^–1.
Reagentien
Zertifizierte Reagentien mit hoher Reinheit wurden für alle Analysen verwendet. Enzymzubereitungen waren wie folgt: Schweinepankreas-α-Amylase, E.C.3.2.1.1. (Sigma, Cat. No. A4268); Pullulanase, E.C.3.2.1.41. (Boehringer, Cat. No. 108944).
Methode
Die Abfolge von Schritten im Verfahren ist unten zusammengefaßt.
Vorbehandlung der Probe
Soweit wie möglich sollten Nahrungsmittel ohne irgendeine Vorbehandlung analysiert werden. Wenn es ein Problem bei der Entnahme einer repräsentativen Probe gibt, können Nahrungsmittel mit einem niedrigen Wassergehalt für 2–3 Minuten kugelvermahlen und diejenigen mit einem höheren Wassergehalt homogenisiert oder gefriergetrocknet und kugelvermahlen werden.
Probenmasse
Wiege zwischen 50 und 1000 mg Probe, die nicht mehr als 150 mg Stärke und 50 mg NSP enthält, in ein 50–60 ml-Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluß genau ein und füge einen Rührer hinzu.
Fettextraktion und Trocknung
Proben mit Trockenmasse zwischen 90 und 100% und mit weniger als 203% Fett können direkt analysiert werden. Ansonsten füge 40 ml Aceton hinzu, mische für 30 Minuten durch Verwendung eines Magnetrührers, zentrifugiere und entferne durch Ansaugung soviel des Überstands wie nötig, ohne den Rückstand zu stören. Gebe die Röhrchen in ein Wasserbad bei 65°C auf der heißen Platte eines Magnetrührers und mische den Rückstand für ein paar Minuten, bis er trocken zu sein scheint. Das Becherglas kann abgedeckt und der Acetondampf durch Wasserpumpe abgezogen werden.
Dispersion der Stärke
Gebe 2 ml DMSO hinzu, verschließe das Röhrchen mit einer Kappe und warme es in einem siedenden Wasserbad für 1 Stunde, gezählt von dem Zeitpunkt, wenn der Rücklauf beginnt, unter kontinuierlichem Rühren. Dann füge ohne Abkühlung 8 ml 0,1 M Natriumacetat-Puffer pH 5,2 bei 50°C hinzu und vermische sofort durch Verwirbelung.
Verfahren zur Analyse von Nicht-Stärke-Polysacchariden (NSP)
Enzymhydrolyse der Stärke
Kühle das Röhrchen auf 45°C ab und füge sofort 0,1 ml Enzymlösung hinzu, die 5000 Einheiten α-Amylase und 5 Einheiten Pullulanase pro ml Acetat-Puffer bei pH 5,2 enthält. Inkubiere die Proben bei 45°C für 16–18 Stunden, vorzugsweise unter kontinuierlicher Vermischung, wie zuvor beschrieben.
Füge im Anschluß an die Enzymbehandlung 40 ml absoluten Ethanol hinzu, vermische gut und lasse für 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Zentrifugiere für 10 Minuten oder bis eine klare überstehende Flüssigkeit erhalten wird. Entferne durch Ansaugung soviel der überstehenden Flüssigkeit wie möglich, ohne den Rückstand zu stören, und verwerfe sie. Wasche den Rückstand zweimal mit 50 ml 85% Ethanol durch Mischen, um eine Suspension zu bilden, wobei zentrifugiert wird, bis sie klar ist, und die überstehende Flüssigkeit entfernt wird wie zuvor. Füge 40 ml Aceton zum gewaschenen Rückstand hinzu, rühre für 5 Minuten und zentrifugiere dann. Entferne die überstehende Flüssigkeit durch Ansaugung und trockne den Rückstand, wie unter Fettextraktion und Trocknung beschrieben.
Säurehydrolyse des Rückstandes aus der enzymatischen Verdauung
Dispergiere den getrockneten Rückstand in 1 ml 12M Schwefelsäure, unter Verwendung eines Verwirbelungsmischers. Lasse bei 35°C für 1 Stunde stehen, um die Cellulose löslich zu machen, füge dann schnell 11 ml Wasser hinzu und vermische.
Erhitze die Lösung in einem siedenden Wasserbad für 2 Stunden vom Rückfluß an, unter kontinuierlichem Rühren. Kühle sie auf Raumtemperatur ab, indem das Röhrchen in Wasser gegeben wird, füge 2 ml internen Standard hinzu (2 mg Allose pro ml gesättigter Benzoesäure-Lösung) und vermische die Inhalte des Röhrchens. Verwende 1 ml des Hydrolysats für die Herstellung von Alditolacetaten und behalte den Rest für die Bestimmung von Uronsäuren.
Uronsäuren
Die verwendete Methode ist eine Modifikation von Scott. Vermische 0,3 ml Hydrolysat (falls nötig verdünnt, so dass es zwischen 25 und 100 μg Uronsäuren pro ml enthält) und 0,3 ml einer Mischung aus Natriumchlorid-Borsäure-Lösung (hergestellt durch Hinzugeben von 2 g Natriumchlorid und 3 g Borsäure zu 100 ml Wasser). Füge 5 ml konzentrierte Schwefelsäure hinzu und vermische durch Verwirbelung, gebe dann das Röhrchen in einen Heizblock bei 70°C. Belasse das Röhrchen und die Inhalte für 40 Minuten und kühle sie dann durch Einbringen in Wasser auf Raumtemperatur. Wenn kühl, füge 0,2 ml 3,5 Dimethylphenol-Lösung (0,1 g (CH₃)₂-C₆H₃OH in 100 ml Eisessig) hinzu und vermische sofort. Lese die Extinktion bei 400 und 450 nm in einem Spektrophotometer gegen eine Wasser-Referenz zwischen 10 und 15 Minuten später ab. Subtrahiere die Ablesung bei 400 nm von derjenigen bei 450 nm für jede Probe und trage den erhaltenen Unterschied für Glucuronsäure-Standards auf (über den Bereich 25–125 μf·ml^–1). Lese die Probenkonzentrationen aus dem Diagramm ab.
Herstellung von Alditolacetaten
Füge 0,2 ml 12M Ammoniaklösung und 5 μl Octan-2-ol zu 1 ml Hydrolysat hinzu. Teste, dass die Lösung alkalisch ist, und gebe dann 0,1 ml frisch zubereitete Lösung von 100 mg Natriumtetrahydroborat (III) (Natriumborhydrid) pro ml 3M Ammoniaklösung hinzu. Mische, lasse die Mischung für 1 Stunde bei 40°C stehen und füge 0,1 ml Eisessig hinzu. Füge als nächstes 0,3 ml N-Methylimidazol und 2 ml Essigsäureanhydrid zu 0,2 ml angesäuerter Lösung hinzu und vermische. Lasse sie für 10 Minuten bei 20°C (Raumtemperatur) stehen, füge 5 ml Wasser hinzu, vermische und füge, wenn abgekühlt, 1 ml Dichlormethan hinzu, rühre die Inhalte kräftig auf einem Verwirbelungsmischer und zentrifugiere für ein paar Minuten, um die Mischung in zwei Phasen zu trennen. Entferne den Großteil der oberen Phase durch Ansaugung und verwerfe ihn, überführe dann die untere Phase in eine kleine Ampulle, versiegele und lagere sie bei –20°C. Verwende 1–2 μl für Einspritzung in den Chromatographen.
Alternative Herstellung von Alditolacetaten
Wenn Dichlormethan als ein Lösemittel für die Alditolacetate verwendet wird, ist in einer Reihe von Laboratorien ohne automatische GLC-Einspritzungsvorrichtungen beobachtet wurden, dass die Einspritztechnik kritisch für das Erhalten reproduzierbarer Ergebnisse ist. Eine robustere Methode kann erhalten werden, wenn Dichlormethan durch Ethylacetat als ein Lösemittel für Alditolacetate ersetzt wird. Das Verfahren ist wie folgt:
Füge 0,1 ml 12M Ammoniak-Lösung und 5 μl Octan-2-ol zu 1 ml Hydrolysat hinzu. Teste, dass die Lösung alkalisch ist, füge dann 0,1 ml einer frisch zubereiteten Lösung von 100 mg Natriumtetrahydroborat (III) pro ml 3M Ammoniak-Lösung hinzu. Mische, lasse die Mischung für 1 Stunde bei 40°C stehen und füge 0,1 ml Eisessig hinzu. Füge 0,5 ml N-Methylimidazol, 5 ml Essigsäure zu 0,5 ml der angesäuerten Lösung hinzu und vermische. Lasse für 10 Minuten bei 20°C (Raumtemperatur) stehen, füge dann 0,6 ml Ethanol hinzu und vermische. Füge 5 ml Wasser nach 5 Minuten hinzu, gebe in ein Wassrbad bei Raumtemperatur, füge 5 ml 7,5M KOH und ein paar Minuten später weitere 5 ml 7,5M KOH hinzu. Vermische durch Umdrehen und lasse stehen, um sich in zwei Phasen zu trennen. Überführe die obere Phase in eine kleine Ampulle und lagere sie bei +5°C. Verwende 1–2 μl für Einspritzung in den Chromatographen.

Claims

Verwendung von Kokosnussendospermfaser bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Prävention oder Behandlung pathogener Bakterien im Dickdarm eines Hundes oder einer Katze.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die pathogenen Bakterien Campylobacter, pathogene Escherichia coli oder Salmonella sind.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die pathogenen Bakterien die Spezies Campylobacter jejuni oder die Spezies Salmonella enterica sind.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung ein Haustierfutterprodukt ist.